BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM

PENGEMBANGAN AGENSIA HAYATI

(PNH 1506)

Disusun oleh :
Wagiyana
Suhartiningsih DN

Program Studi Proteksi Tanaman

Fakultas Pertanian
Universitas Jember
2020
 ACARA 1. ISOLASI DAN PEMBUATAN MEDIA PERBANYAKAN

Tujuan: 1. Mengetahui cara isolasi isolat agensia hayati dari serangga hama
2. Isolasi agensia hayati dari dalam tanah
3. Isolasi subkulture.

PENGANTAR
Isolasi mikroorganisme memerlukan penanganan tersendiri terhadap suatu jenis
mikroorganisme tersebut., yang berkaitan dengan media pembiakanya. Isolasi
mikroorganisme dapat dilakukan secara langsung Pada serangga yang menunjukan gejala
serangan suatu penykt, Contoh larva Spodoptera litura yang terserang Beauveria bassiana
dengan myselia yang menuotupi seluruh tubuhnya dapat diisolasi dan dibiakan pada media
PDA. Tidak lansung dilakukan dengan Trap atau baiting pada suatu lahan, dilakukan
pengambilan sampel tanah kemudian dimasukan ulat yang masih hidup yang dibungkus kain
kassa kemudian dimasukan ke dalam sasmpel tanah. Penangkaran dari isolat yang sudah ada,
biasanya disebutkan asal isolat tersebut, praktisi masih mempunyai hipotesis bahwa isolat
APH dari suatu tempat efektif pada daerah asalnya.

A. Isolasi APH dari Tanah

a. Alat dan Bahan :
1. Sampel tanah 200 gr
2. Gelas mineral bekas
3. Ulat hongkong
4. Karet, kertas tissue, plastik.
5. kain kassa dan staples.

b. Metode Praktikum :
1. Persiapkan sampel tanah 200gr
2. Memasukkan sampel tanah ke dalam gelas mineral
3. Memasukkan ulat hongkong ke dalam gelas mineral dan diletakkan pada permukaan tanah.
4. Menutup gelas mineral menggunakan plastik yang telah di lubangi dan di eratkan
menggunakan karet.
5. Pengamatan dilakukan 5 hingga 7 hari (Apabila ulat hongkong berwarna merah karamel,
terindikasi terserang NEP).
 Sampel tanah
200 gr Ulat hongkong dimasukkan
Gelas mineral
dan di letakkan di atas
permukaan tanah

B. Isolasi Nematoda Entomopatogen

a. Metode Praktikum :
1. Persiapkan sampel tanah 200gr dan ulat hongkong
2. Memasukkan ulat hongkong dalam kantong kain kassa.
3. Memasukkan kantong kassa yang berisi ulat hongkong ke dalam gelas mineral dan
diletakkan pada permukaan gelas.
4. Memasukkan sampel tanah kedalam gelas mineral yang berisi kantong kassa.
5. Menutup gelas mineral menggunakan plastik yang telah di lubangi dan di eratkan
menggunakan karet.
5. Pengamatan dilakukan 5 hingga 7 hari (Apabila ulat hongkong berwarna merah karamel,
terindikasi terserang NEP).

Ulat hongkong dimasukkan Kantong kain kassa yang berisi ulat

dalam kantong kain kassa hongkong, dimasukkan dalam gelas
mineral. Kemudian dimasukkan
sampel tanah 200 gr.
ACARA 2. Pembuatan Media Perbanyakan Agensia Pengendali
Hayati (APH)

Tujuan: 1. Mempraktekan cara membuat media dasar pengembangbiakan Agens Pengendali

Hayati EKG,
2. Membuat media padat dan cair pengembangbiakan APH.

PENGANTAR
Media pembiakan merupakan sarana untuk pertumbuhan dan perkembangan APH
yang akan dibiakan padanya mengandung nutrisi yang merupakan kebutuhan mutlak untuk
berkembang biak dan tumbuh, kandungan nutrisi pada media harus memenuhi syarat
diantanya: unsur esensial untuk pertumbuhan APH, karbohidrat untuk jamur dan protein
untuk bakteri merupakan kebutuhan dasar untuk pertumbuhanya, Lemak, daan unsur-unsur
mikro penunjang pertumbuhan dan perkembangan dan air untuk menunjang pertumbuhan
APH. Media in vitro mengcu pada komposisi inangnya yang meruapakan serangga hama,
atau propagule penyakit

Media dasar pembikan APH adalah Ekstrak Kentang Gula (EKG) merupakan media
untuk pengembangbiakan secara cair dengan metode fermentasi, dengan komposisi sebagai
berikut: kentang 1,25 kg, gula 100 gr, air steril 5 liter. Dengan komposisi ini diharapkan
dapat memberikan pertumbuhan dan perkembangan isolat APH yang akan dibiakan. Variasi
media pembiakan dilakukan untuk memudahkan dalam pengadaan bahan dalam komposis
media yg akan dibuat. Pertimbangan lain media mudah didapat dan murah harganya. Idealnya
media pembiakan mikroorganisme digunakan Nutrient Agar (NA) untuk bakteri atau Potato
Dextrosa Agar (PDA) yang mengandung komposisi media yang jelas. Namun harganya
mahal, untuk penerapan Teknologi tepat guna sangat tidak visibel di tingkat petani. Contoh
Media cair dengan : air leri kedelai, tepung kulit udang, ragi, dan glukosa. Sebanyak 20 liter
media disterilisasi pada suhu 1100 C dan tekanan 2 bar, kemudian setelah dingin diinokulasi
dengan 4 tabung reaksi isolat bakteri merah S.marsecens, dalam satu galon biasanya hanya
diisi 18 ltr media.

PEMBUATAN MEDIA PENGEMBANGBIAKAN APH

1. Media Padat (Metharizium anisoplae)
 Gambar 1. Tahapan pembuatan media perbanyakan beras jagung.
a. Metode Praktikum Pembuatan Media Padat untuk jamur entomopatogen.
1. siapkan beras jagung dan beras (masing-masing 1kg)
2. mengukus bahan tersebut hingga setengah matang
3. memasukkan sekitar 100gr bahan ke dalam kantong plastik tahan panas.
4. Mensterilkan bahan tersebut di autoclafe selama 1 hingga 2 jam.
5. Setelah di sterilkan, dan media dingin. Kemudian menginokulasikan M. anisoplae pada
media padat steril secara aseptik di LAF (Laminar Air Flow).
2. Media Cair EKG (Ekstrak Kentang Gula)

Gambar 2. Pembuatan Media Cair EKG.

a. Metode Prakikum Pembuatan media EKG

1. Menyiapkan kentang 1,25 kg, gula 100 gr, air steril 5 liter.
2. Memotong dadu kentang
3. Memasak potongan dadu kentang hingga matang, kemudian meniriskannya.
4. Lautan hasil rebusan dicampur dengan gula.
5. Memasukkan hasil larutan campuran tadi kedalam galon yang berukuran 5 liter.
6. Kemudian, di sterilisasi di dalam autoclafe selama 1-2 jam.
ACARA 3 . BAITING NEMATODA, INOKULASI Corynebacterium KE MEDIA CAIR
EKG, DAN PEREMAJAAN ISOLAT Corynebacterium.

Tujuan: 1. Mempraktekan cara isolasi Nematoda Entomopatogen dari dalam tanah

2. Mengatahi cara membiakan APH NEP secara in vivo
3. Pembiakan APH secara fermentasi.

PENGANTAR
A. Baiting Nematoda
Menurut Bedding dan Akhivist, (1975) metode baiting nematoda di lakukan dengan
nama whitetrap atau metode memancing nematoda secara ekstraksi yang berada di dalam
serangga mati dan telah terindikasi terserang NEP. Gejala serangan pada serangga yang
terserang NEP yakni, apaila tubuh serangga atau kutikula berwarna hitam kecokelatak
(karamel), maka terserang nematoda jenis Steinerma. Sedangkan apabila gejala serangan
pada tubuh serangga bewarna kemerahan maka diserang nematoda Heterorhabtidae.
Isolasi Nematoda Entomopatogen (NEP), setelah dilakukan pembongkaran ulat G.
melonella sebagai baiting seperti tersebut di atas, ulat yang menujukan gejala terserang NEP
terjadi perubahan warna pada kutikula ulat menjadi merah karamel atau kecoklatan,
kemudian disterilisasai dengan larutan Khlorox atau alkohol 10%, selanjutnya dibuat White
Trap, dengan cara meletakan kertas saring pad sisi bahawn petridish kemudian dibalik
menjadi dibagaian atas, kemudian ulat yang mati diletakan diatas kertas saring diatur
melingkar dipinggir petridish, kemudian dimasukan ke dalam petridish besar yang di dalamya
diberi aquades, setelah 7 sapai 10 hari nemtoda entomopatogen akan keluar dari cadaver ulat
dan turun ke bawah di dalam air yang ada di petridish besar.

a. Alat dan Bahan :

1. Ulat hongkong yang mati dan terindikasi terserang NEP di acara 1.
2. Air aquades, cawan petri berukuran besar dan kecil, kertas label dan kertas saring.

b. Metode Praktikum :
1. Meletakkan ulat hongkong yang mati pada permukaan cawan petri kecil yang telah diberi
kertas saring, dan telah di lembabkan.
2. Meletakkan cawan petri kecil ke dalam cawan petri ukuran besar yang telah di beri air
steril.
3. Menutup cawan petri ukuran besar.
4. Pengamatan dilakukan selama 10 hari.

Gambar 3. Baiting Nematoda dengan Ulat Hongkong.

B. Inokulasi Corynebacterium Pada Media EKG

Media pembiakan APH harus memenuhi syarat mengandung nutrisi yang mencukupi untuk
perkembangabiakannya, yakni Karbohidrat, Protein, Lemak, dan Mineral.

Gambar 4. Rangkaian Fermentor Perbanyakan Corynebacterium Pada Media EKG

a. Alat dan Bahan :
1. Rangkaian FSS (aerator dan selang)
2. Larutan KMnO4, Air steril.
3. Botol Plastik bekas ukuran 600 ml (2)

b. Metode Praktikum :
1. Media EKG yang telah steril, kemudian di inokulasikan dengan Corynebacterium (satu
tabung isolat untuk 5 liter media).
2. Merangkai media perbanyakan EKG pada rangkaian fermentor sangat sederhana.
3. Pengamatan dilakukan hingga 14 hari
Ciri-ciri media yang berhasil terfermentasi atau tidak terkontaminasi :
1. Tidak terlalu berbusa
2. Warna tidak keruh atau hitam
3. Memiliki aroma khas seperti tape atau hasil fermentasi / tidak berbau busuk.

C. Subkultur atau Peremajaan Isolat Corynebacterium

Menurut Hefdiyah dan Maya, (2014) bakteri Corynebacterium memiliki ciri
makroskopis yakni bentuk koloni yang tak beraturan, tepi koloni berombak, elevasi koloni
cekung dan berwarna putih tulang. Sedangkan untuk ciri mikroskopisnya yakni merupakan
bakteri gram positif atau bersifat nonpatogen dan berbentuk basil. OPT sasaran yang dapat
dikendalikan dengan jenis bakteri ini yakni Xanthomonas oryzae atau Hawar Daun Bakteri,
Blast atau Pyricularia oryzae dan Cercospora sp.
a. Alat dan Bahan :
1. Media NA instan
2. Tabung reaksi steril
3. Plastik wrap dan kertas label
4. Isolat Corynebacterium

b. Metode Praktikum :
1. Menyiapkan isolat Stock Corynebacterium
2. Memasukkan atau Platting Media NA kedalam tabung reaksi dan dimiringkan.
3. Media agar miring yang sudah siap digunakan, kemudian di menggores media
menggunakan jarum ose yang telah berisi koloni Corynebacterium.
4. Menginkubasi selama 2 hingga 3 hari.
5. Melakukan Pengamatan.
 ACARA 4. EKSPLORASI MIKROBIA ANTAGONIS DARI
TANAH RHIZOSFER

Tujuan: 1. Mengatahui cara eksploarasi mikrobia antagonis dari sistem perakaran tanaman
2. Mempraktekan cara preparasi sistem perakaran untuk diisolasi APH, antagonis.

PENGANTAR
Eksplorasi merupakan suatu teknik yang dilakukan untuk mendapatkan suatu isolat
mikrobia yang di inginkan. Eksplorasi yang dilakukan dari tanah rhizosfer atau perakaran
tanaman bertujuan untuk mendapatkan mikrobia antagonis yang nantinya, hasilnya mampu
dimanfaatkan sebagai agens antagonis dalam mengendalikan patogen penyebab penyakit
pada tanaman.

Alat dan Bahan :

1. Sampel tanah rhizosfer (tanah tanaman jagung, buah naga, padi, gulma)
2. Tabung reaksi dan air steril.
3. Media PDA (Potato Dextrose Agar), NA (Nutrient Agar), KB (Kings B).

Metode :
1. Memasukkan air steril 9 ml pada tabung reaksi, kemudian menambahkan sampel tanah
rhizosfer 1 gr. Lalu memvortex kurang lebih 5 menit, kemudian diamkan agar mengendap.
2. Mengambil 1 ml larutan supensi dari hasil vortex pertama, lalu memasukkannya pada
tabung reaksi ke dua yang berisi air steril 9 ml. Kemudian di vortex atau encerkan kurang
lebih 3 menit. Kemudian diambil 1 ml larutan suspensi dan dilakukan hingga pengenceran
105 (lima kali).
2. Hasil pengenceran 103 , 104, dan 105 kemudian diambil sebanyak 50 µ untuk satu cawan
petri menggunakan mikropipet, kemudian dituangkan pada media buatan lalu kmudian di
ratakan menggunakan L-glass atau glass road.
3. Hasil pengenceran 103 di tuangkan pada media PDA, hasil 104 pada media Kings B, dan
hasil 105 pada media NA.
4. Kemudian di inkubasikan kurang lebih 48 jam untuk media KB dan NA. Serta untuk media
PDA di inkubasikan hingga jamr tumbuh.
 ACARA 5. SCREENING IN-VITRO

Tujuan : Dilakukan screening secara in-vitro bertujuan untuk menguji hasil

eksplorasi dengan berbagai tahapan pengujian agar dapat diketahui
bahwa mikroorganisme tersebut memiliki sifat patogenik atau
nonpatogenik pada tanaman.

Alat dan Bahan :

1. Tanaman tembakau untuk Uji Hipersensitif (HR)
2. Hasil eksplorasi (Bakteri dan Jamur)
3. Patogen Cercospora canescens dan Ralstonia solanacearum.
4. Media agar PDA, KB, NA, Water agar.
5. Mikropipet, Cawan petri, Jarum suntik 1 ml.

Metode Uji Hipersensitif Tembakau

1. Menyiapkan appendave yang telah berisi air steril 2 ml, kemudian
ditambahkan isolat bakteri dari hasil eksplorasi pada media KB dan NA
sebanyak dua ose. Kemudian di vortex selama kurang lebih 5 menit.
2. Mengambil hasil pengenceran sebanyak kurang lebih 1 ml menggunakan
jarum suntik.
3. Menyuntikkan hasil suspensi bakteri tersebut pada daun tembakau bagian
permukaan bawah hingga meresap. Kemudian, diamati perubahan warna atau
terdapat gejala nekrotik atau tidak pada daun tembakau yang telah di
inokulasikan selama kurang lebih 5 hari.
4. Apabila hasil menunjukkan positif atau terdapat gejala nekrotik maka bakteri
tersebut patogenik dan tidak dapat dilakukan pengujian lanjutan, apabila hasil
negatif atau tidak ada gejala nekrotik maka bakteri tersebut nonpatogenik dan
dapat dilakukan pengujian lanjutan.
Metode Screenig Jamur atau Dual Culture :
1. Menyiapkan media PDA, kemudian bagian belakang cawan petri diberi garis
dan dibagi menjadi dua bagian.
2. Hasil eksplorasi berupa jamur pada media PDA, di plong dan ditumbuhkan
pada media PDA baru di bagian sisi sebelahnya.
3. Kemudian, menumbuhkan jamur patogen C.canescens pada media PDA
terebut pada bagian sisi sebelahnya.
4. Kemudian diamati hingga 7 hari (Apakah terjadi kompetisi atau daya hambat
pertumbuhan antara kedua jamur patogen dan jamur hasil eksplorasi
tersebut).

Metode Screening Bakteri atau Dual platting :

1. Menyiapkan isolat bakteri hasil eksplorasi pada media NB dan KB.
2. Mengambil isolat bakteri menggunakan tusuk gigi dengan cara menggores,
kemudian menitikkan tusuk gigi pada media NB dan KB sebanyak kurang
lebih 5 hingga 6 titik. Kemudian di inkubasikan selama 48 jam.
3. Setelah di inkubasikan, kemudian bagian penutup cawan petri di teteskan 1
ml klorofom, yang berfungsi sebagai larutan sterilisasi untuk menonaktifkan
metabolisme bakteri hasil eksplorasi. Kemudian ditutup dan ditunggu hingga
2 jam.
4. Menyiapan isolat bakteri patogen R. Solanacearum umur 48 jam, kemudian
dipanen semuanya pada satu cawan petri tersebut dan dimasukkan pada air
sterik 10 ml. Kemudian, di vortex atau digojog selama kurang lebih 5 menit.
5. Mengambil 200 µ hasil suspensi bakteri R. Solanacearum, lalu di masukan
pada media water agar 4 ml yang telah hangat kuku. Kemudian,
dihomogenka agar bakteri tercampur pada media water agar.
6. Menuangkan media water agar yang telah berisi bakteri R. Solanacearum
pada media NA atau KB yang telah berisi bakteri hasil eksplorasi dan telah di
klorofom selama 2 jam tadi.
7. Melakukan pengamatan hingga terdapat zona bening kurang lebih 48 jam.
ACARA 6. FORMULASI BAKTERI Bacillus subtilis

Tujuan: Mengathui cara formulasi APH bakteri bersifat antagonis yang

diperbanyak dapat tumbuh dan berkembang secara baik. Formulasi
bakteri sendiri dapat dilakukan pada berbagai macam bentuk, baik
secara cair, padat maupun tepung atau powder. Komposisi bahan
formulasi memliki peranan penting dalam keberhasilan perbanyakan
bakteri yang dilakukan.

Alat dan Bahan :

1. Kompos yang telah diayak halus.
2. Sumber gula (Glukose, Sukrose, Laktos, dan Gula pasir halus).
3. Isolat bakteri B. Subtilis.
4. Media YP Cair, Air steril.
5. Tabung reaksi, cawan petri, erlenmeyer, jarum ose, mikro pipet, plastik klip,
corong plastik, LAF.

Metode :
1. Menyiapkan biang bakteri B. Subtilis pada media Yeast Peptone Cair (100 ml
air steril, Yeast 1 gr, dan Peptone 0,5 gr) dengan cara mengambil sebanyak 2
ose bakteri pada isolat bakteri B. Subtilis yang telah berumur 48 jam,
kemudian di inokulasikan pada media YP cair.
2. Media YP cair yang berisi bakteri B. Subtilis dan telah di shaker selama
kurang lebih 48 jam, kemudian di ambil sebanyak 1 ml lalu di masukkan
dalam tabung reaksi yang berisi 9 ml air steril dan divortex selama kurang
lebih 3 menit untuk hasil kerapatan bakteri 1011. Sedangkan untuk hasil
kerapatan bakteri 1012 yakni langsung hasil biang pada media YP cair tadi.
3. Mengambil 10 ml hasil suspensi bakteri tersebut, kemudian di teteskan atau
disemprotkan pada media atau bahan formulasi 50 gr.
4. Setiap 100 gram bahan kompos di campurkan dengan sumber gula (glukose,
sukrose, laktose, dan gula halus) sebanyak 0,5 gram.
5. Kemudian setelah dicampurkan semuanya, di masukkan ke dalam plastik klip
menggunakan corong secara aseptik di LAF.
6. Melakukan pengamatan selama kurang lebih 3 hari atau 72 jam, diamati
perubahan warna, tekstur, dan aroma dari hasil formulasi.
7. Untuk mengetahui atau menghitung kerapatan bakteri pada hasil formulasi,
dapat dilakukan dengan pengenceran secara bertingkat. Dengan mengambil 1
gr hasil formulasi padat dan di eerkan pada 9 ml air steril, lalu dilakukan
sebanyak pengenceran hingga 1012. Lalu, di tumbuhkan pada media NA, dan
di inkubasikan selama 48 jam dan dihitung jumlah koloninya di Collony
counter.