Kata pengantar

Pengukuran Point-of-Care (PoC) didefinisikan sebagai pengujian dekat-pasien yang berguna dalam
pemantauan prognostik berbagai penyakit dengan mengukur biomarker tertentu. Tujuan utama dari
pengujian PoC adalah untuk mendapatkan hasil dengan cepat, sehingga pengobatan dapat segera dimulai
dan dengan biaya yang minimal. Perangkat kecil, cepat, portabel, murah, dan mudah digunakan cocok
untuk pengujian PoC, terutama untuk penggunaan domestik oleh publik.
Osteoporosis merupakan salah satu masalah kesehatan yang paling serius di dunia. Hal ini ditandai
dengan kepadatan tulang yang rendah, menyebabkan tulang menjadi lebih rapuh dan lebih mungkin untuk
patah. Gejala osteoporosis tidak terlihat pada tahap awal, sehingga deteksi dini merupakan faktor kunci
untuk mengelola osteoporosis secara efisien. Hal ini juga penting untuk keberhasilan pengenalan dan
pengobatan orang-orang yang berisiko mengalami patah tulang osteoporosis. Oleh karena itu, deteksi dini
dapat sangat mengurangi risiko patah tulang di masa depan dengan memulai pengobatan pada tahap awal
penyakit ketika lebih menguntungkan. Terapi yang diberikan pada waktu yang tepat dapat mengatasi
osteoporosis hanya jika diketahui pada tahap awal. Pengukuran telopeptide C-terminal kolagen tipe 1
(CTx-I) adalah salah satu metode yang paling dapat diandalkan untuk memantau proses
pergantian tulang. CTx-I adalah penanda sensitif resorpsi tulang yang dilepaskan ke dalam
sirkulasi selama proses remodeling tulang. Oleh karena itu, tingkat keropos tulang dapat dipantau
dengan pengukuran kadar CTx-I yang sering. Semua perangkat yang tersedia untuk pengukuran
kadar CTx-I didasarkan pada enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Terlepas dari akurasi
tinggi dari perangkat ini, mereka mahal, memakan waktu dan membutuhkan pelatihan tingkat tinggi.
Buku ini berisi desain perangkat penginderaan cerdas Point-of-Care (PoC) untuk deteksi dini
keropos tulang. Bab pertama mencakup pengenalan osteoporosis, diagnosisnya, dan pentingnya
perangkat PoC dalam deteksi dini dan pengelolaan osteoporosis. Bab kedua memberikan tinjauan
literatur tentang penanda biokimia yang tersedia dari pergantian tulang dan berfokus pada kemajuan
terkini dalam teknologi biosensing tulang untuk memantau penanda biokimiawi tulang, serta penilaian
biomekanik tulang. Pada bab ketiga, prinsip operasi sensor interdigital planar dijelaskan dan teori dasar
Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) dibahas. Pengaturan eksperimental diperkenalkan yang
dapat mengambil informasi dari sampel uji dan mengubahnya menjadi sinyal listrik untuk analisis lebih
lanjut. Bab 4 menyajikan rincian langkah-langkah yang terlibat dalam desain dan pengembangan
biosensor berbasis antigen-antibodi untuk deteksi dan pengukuran CTx-I dalam serum. Dalam fase kerja
ini, antibodi alami digunakan untuk menginduksi selektivitas dalam sistem penginderaan. Bab 5
menjelaskan prosedur terperinci untuk membuat antibodi buatan menggunakan Molecular Imprinted
Polymers (MIPs). Teknik penginderaan baru untuk pengenalan CTx-I dengan menggabungkan
spektroskopi impedansi elektrokimia dan teknologi MIP juga dijelaskan dalam bab ini. Selain itu,
peran ketebalan lapisan pada sensitivitas sensor interdigital planar diselidiki. Pada bab keenam, dibahas
desain dan implementasi perangkat PoC berbasis mikrokontroler berkemampuan IoT portabel.
Perangkat ini mampu mengukur konsentrasi CTx-I dalam serum dan mentransfer data ke server cloud
berbasis IoT. Bab terakhir memberikan kesimpulan umum dari pekerjaan penelitian dan prospek masa
depan dari pekerjaan yang dilaporkan.
Buku ini berasal dari gelar Ph.D. penelitian yang dilakukan di Macquarie University, NSW, Australia.
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk mengembangkan sistem PoC yang bebas label, berbiaya rendah
dan dapat diandalkan untuk deteksi dini keropos tulang sehingga dapat membantu pasien untuk memulai
pengobatan yang tepat pada tahap awal penyakit, ketika lebih efektif. .
Bab 1
pengantar

Abstrak Bab ini mencakup pengenalan osteoporosis, metode diagnosisnya, dan pentingnya alat point of
care dalam deteksi dini dan pengelolaan osteoporosis.

1.1 Apa itu Osteoporosis?

Osteoporosis secara harfiah berarti “tulang keropos”. Ini adalah kelainan tulang yang menyebabkan
tulang menjadi rapuh, lemah dan lebih mudah patah. Pengeroposan tulang terjadi secara diam-diam dan
terus menerus. Seringkali tidak ada tanda atau gejala osteoporosis sampai terjadi patah tulang. Itulah
sebabnya penyakit ini sering disebut "penyakit diam". Gambar 1.1 menggambarkan status tulang normal
dan tulang osteoporosis. Osteopenia adalah keadaan pengeroposan tulang menengah di mana kepadatan
tulang berada di antara tingkat normal dan osteoporosis.
Osteoporosis dapat memengaruhi tulang apa pun, tetapi paling sering:
• Panggul
• Tulang belakang
• Pergelangan tangan
• Tulang iga
• Panggul
• Lengan atas.

1.2 Fakta dan Statistik Osteoporosis

WHO melaporkan bahwa populasi dunia menua dengan cepat dan memperkirakan bahwa jumlah orang
yang hidup hingga 60 tahun atau lebih akan meningkat dari 900 juta menjadi 2 miliar antara tahun 2015
dan 2050 [2]. Konsekuensi dari peningkatan ini adalah peningkatan jumlah orang yang menderita
gangguan kesehatan serius seperti osteoporosis.
Dalam sebuah artikel yang diterbitkan pada tahun 2015, Odén et al. Diperkirakan 158 juta orang di
dunia, berusia di atas 50 tahun, berisiko terkena osteoporosis, berdasarkan data yang dikumpulkan pada
tahun 2010. Bahkan, mereka memperkirakan jumlah ini akan berlipat ganda pada tahun 2040 [3].
Menurut artikel ini, proporsi (%) pria dan wanita di seluruh dunia di atas ambang fraktur yang diperoleh
pada tahun 2010 diberikan pada Gambar 1.2.
Osteoporosis di Australia—Hampir dua juta orang Australia (hampir 10% dari populasi) memiliki
masalah terkait osteoporosis, dan 75% di antaranya adalah wanita.
1 dari 2 wanita Australia akan mengalami patah tulang yang berhubungan dengan osteoporosis setelah
usia 60 [4]. Di antara semua patah tulang osteoporosis di Australia, hampir setengahnya adalah patah
tulang belakang diikuti oleh patah tulang pinggul dan pergelangan tangan seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 1.3.
Dari segi dampak ekonomi, diperkirakan biaya langsung osteoporosis pada tahun 2008-2009 adalah $306
juta [5]. Sebuah studi yang lebih luas yang dilakukan oleh Osteoporosis Australia memperkirakan
pengeluaran langsung dan tidak langsung untuk osteoporosis di Australia menjadi $2754 juta pada tahun
2012 [6].
Dilaporkan bahwa [6] bahwa 4,74 juta orang di Australia berusia di atas 50 tahun (hampir 66% orang di
atas 50) menderita osteoporosis atau osteopenia, di mana 22% di antaranya menderita osteoporosis dan
78% menderita osteopenia. Diperkirakan, pada tahun 2022, akan ada 6,2 juta orang Australia berusia di
atas 50 tahun dengan osteoporosis atau osteopenia, yang merupakan peningkatan 31% dari tahun 2012.
1.3 Diagnosa Osteoporosis

Dual-energi X-ray absorptiometry (DXA) adalah cara paling andal dan teknik standar emas untuk
mengukur kepadatan mineral tulang (BMD). Pemindaian DXA dapat digunakan untuk mendiagnosis
osteoporosis dan memantau efek terapi. Metode ini menggunakan berkas sinar-X ganda pada energi foton
tinggi dan rendah [7]. Sejumlah transmisi sinar-X diblokir oleh tulang. Tulang padat memungkinkan lebih
sedikit sinar-X untuk melewatinya dan sampai ke detektor. Data ini dikirim ke komputer yang
menghitung skor-T dari kepadatan rata-rata tulang. T-score adalah perbandingan kepadatan tulang
seseorang dengan orang sehat berusia 30 tahun dari jenis kelamin yang sama. T-score yang rendah
menunjukkan bahwa kepadatan tulang kurang dari yang seharusnya [8]. Rentang T-score ditentukan pada
Tabel 1.1 (Gbr. 1.4).
Terlepas dari keandalan metode DXA yang sangat baik, ada batasan utama dalam teknik ini. Karena
perubahan kepadatan mineral tulang (BMD) sangat lambat, dibutuhkan lebih dari dua tahun bagi DXA
untuk dapat mendeteksi perubahan BMD, sementara perubahan penanda biokimia dapat diidentifikasi
setelah hanya beberapa minggu [10]. Dengan demikian, pengukuran BMD bersama dengan deteksi dan
pengukuran penanda biokimia seperti CTx-I dapat membantu dalam memantau penyakit dan
meningkatkan respons terhadap pengobatan.
Ada berbagai jenis penanda biokimia dari pergantian tulang dalam serum dan urin, yang dibahas secara
rinci di Bab. 2. Di antara semuanya, pengukuran CTx-I urin dan serum adalah tes yang paling akurat
dan sensitif [11, 12].

1.4 Tujuan Buku

Dampak osteoporosis jauh lebih besar daripada banyak masalah kesehatan serius lainnya, seperti kanker
payudara dan prostat. Secara statistik, satu dari tiga wanita dan satu dari lima pria berusia di atas 50 tahun
akan mengalami patah tulang osteoporosis dalam hidup mereka. Gejala osteoporosis tidak terlihat pada
tahap awal, sehingga deteksi dini merupakan faktor kunci untuk manajemen osteoporosis yang efisien.
Hal ini juga penting untuk keberhasilan pengenalan dan pengobatan orang-orang yang berisiko
mengalami patah tulang osteoporosis. Dengan demikian, deteksi dini dapat sangat mengurangi risiko
patah tulang di masa depan dengan memulai pengobatan pada tahap awal penyakit ketika lebih
menguntungkan. Terapi yang diberikan pada waktu yang tepat dapat mengelola osteoporosis hanya jika
diidentifikasi pada tahap awal [14, 15].
Catatatan:
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk merancang, membuat dan mengimplementasikan sistem
penginderaan pintar portabel untuk deteksi dini keropos tulang dengan karakterisasi dan
kuantifikasi penanda biokimia (CTx-I) dalam darah yaitu:
• Kuat, efisien dan berbiaya rendah,
• Sangat selektif dan lebih cepat dari teknik yang tersedia,
• Mudah digunakan, dan
• Mudah digunakan di lingkungan titik perawatan dengan pelatihan minimal.
Selektivitas analit CTx-I akan dimasukkan pada area penginderaan dari sensor interdigital berbasis
MEMS. Setelah sampel uji dipipet pada permukaan penginderaan selektif, teknik Electrochemical
Impedance Spectroscopy (EIS) akan digunakan untuk mengukur sifat elektrokimia sampel uji, yang
sebanding dengan konsentrasi molekul target. Untuk mengembangkan perangkat PoC portabel, sistem
tertanam berkemampuan IoT akan dirancang dan dikembangkan, yang dapat mengukur tingkat CTx-I
dalam sampel uji dan mentransfernya ke server cloud berbasis IoT.
1.5 Kontribusi Penelitian

Kontribusi utama dari pekerjaan ini adalah pengembangan sistem penginderaan cerdas yang
mampu mendeteksi molekul CTx-I dalam sampel serum. Sistem penginderaan cerdas bergantung
pada desain dan pengembangan sensor cerdas yang dapat secara selektif mengukur molekul target. Biaya
rendah dan ketahanan sistem yang dikembangkan adalah fitur penting yang membuat sistem menjadi
unik.
Kontribusi utama dari penelitian ini dapat diringkas sebagai berikut:
1. Tentukan sensor yang paling cocok yang memungkinkan kedalaman penetrasi medan listrik tepi, cukup
untuk memungkinkan pengujian sampel massal. Karakterisasi sensor dan temukan rentang frekuensi
optimal.
2. Mengembangkan dan menyesuaikan teknik yang sesuai untuk menginduksi selektivitas molekul CTx-I
dalam sistem penginderaan cerdas.
3. Jelajahi dan terapkan teknik antigen-antibodi untuk menginduksi selektivitas CTx-I ke sistem
menggunakan antibodi alami.
4. Mengembangkan dan menyesuaikan antibodi buatan untuk molekul CTx-I untuk mengatasi
keterbatasan penggunaan antibodi alami.
5. Merancang dan mengimplementasikan sistem berbasis mikrokontroler berkemampuan IoT untuk
mengembangkan perangkat PoC portabel untuk pengukuran CTx-I yang sederhana.
6. Menganalisis kinerja perangkat penginderaan pintar yang dikembangkan dan memvalidasinya
menggunakan metode referensi (ELISA).

Bab 2
Teknologi Sensing Tercanggih untuk Pemantauan Kesehatan Tulang

Abstrak Bab ini memberikan tinjauan literatur lengkap tentang penanda biokimia yang tersedia dari
pergantian tulang dan berfokus pada kemajuan terkini dalam teknologi biosensing tulang untuk memantau
penanda kimia tulang, serta penilaian biomekanik tulang.

2.1 Pendahuluan

Tulang adalah jaringan hidup yang mengalami remodeling terus menerus, proses penggantian jaringan
tulang lama dengan jaringan baru. Aktivitas osteoklas (resorpsi tulang), osteoblas (pembentukan tulang)
dan osteosit dapat sangat mempengaruhi proses ini [1-4]. Selama masa kanak-kanak dan awal masa
dewasa, pembentukan tulang terjadi lebih cepat daripada resorpsi tulang, sehingga tulang menjadi lebih
padat, lebih berat dan lebih besar. Ini
Kondisi ini akan berlanjut sampai usia 30 tahun ketika tulang mencapai kepadatan dan kekuatan
maksimum (massa tulang puncak). Kondisi tulang akan relatif stabil pada usia 30-45 tahun dan setelah itu
resorpsi tulang mulai melebihi pembentukan tulang. Pada wanita, pengeroposan tulang paling cepat
terjadi pada tahun-tahun pertama setelah menopause [5] dan
ini adalah salah satu penyebab utama berkembangnya massa tulang yang rendah atau
osteoporosis. Perubahan hormon yang terjadi pada masa menopause secara langsung mempengaruhi
kepadatan tulang. Hormon wanita, estrogen sangat penting untuk kesehatan tulang. Setelah menopause,
tingkat estrogen turun dan ini dapat menyebabkan penurunan kepadatan tulang yang cepat.
Resorpsi tulang dan pembentukan tulang secara normal berada dalam keseimbangan dan keseimbangan
ini dimodulasi melalui aktivitas hormon steroid dan mediator lokal seperti sitokin [6]. Osteoporosis
biasanya berkembang ketika pengeroposan tulang melebihi pembentukan jaringan tulang baru [7].
Berbagai parameter biomekanik seperti gaya, perpindahan dan penyerapan energi dapat
mempengaruhi kekuatan tulang. Itu juga bisa tergantung pada ukuran tulang, bentuk dan sifat jaringan
tulang. Penilaian biomekanik dari parameter ini mengevaluasi sifat biomekanik tulang, seperti kekuatan,
ketangguhan, kekakuan, kelelahan dan sifat mulur. Uji biomekanik dapat digunakan pada kondisi
pembebanan yang berbeda seperti geser, tegangan dan pengikatan, dan beberapa metode dapat
digunakan untuk mengevaluasi aktivitas biomekanik tulang.

Osteoporosis biasanya didiagnosis dengan mengukur kepadatan mineral tulang (BMD). Saat ini, dual-
energy X-ray absorptiometry (DXA) adalah cara paling akurat untuk memantau BMD dan prosedur
remodeling tulang. Namun, studi BMD memiliki kelemahan yang jelas. Pemindaian DXA mahal dan
membutuhkan sekitar tiga tahun untuk mengamati keropos tulang. Oleh karena itu, penilaian
langsung dari metabolisme tulang fungsionalitas diperlukan. Penanda biokimia dari pergantian
tulang dapat berkontribusi dalam pemantauan waktu nyata dari proses remodeling tulang dan
dapat bermanfaat dalam pengelolaan dan pengobatan gangguan tulang, terutama osteoporosis
[13].

2.2 Struktur Tulang

Tulang terutama terbuat dari sel-sel tulang dan matriks tulang. Sel-sel tulang memiliki tanggung jawab
untuk produksi dan perlindungan tulang, sehingga kinerja sel-sel tulang dapat secara signifikan
mempengaruhi proses remodeling tulang. Osteoblas memiliki tanggung jawab untuk pembentukan
tulang dan mineralisasi lebih lanjut. Setelah matriks tulang terbentuk, osteoblas akan tertutup oleh
matriks mineral dan terkubur dalam substansi tulang. Melalui proses ini, osteoblas berubah menjadi
osteosit. Di sisi lain, osteoklas adalah sel yang sangat besar yang bertanggung jawab untuk resorpsi
tulang dan ditempatkan di permukaan tulang [14].
Kolagen tipe I adalah protein struktural utama tulang yang membentuk hampir 94% matriks tulang
organik. Selama proses remodeling tulang, tulang dipecah menjadi fragmen-fragmen kecil, dilepaskan ke
dalam sirkulasi, dan dapat diukur sebagai biomarker keropos tulang. Gambar 2.1 menunjukkan
representasi grafis dari struktur tulang dan penanda yang dihasilkan selama berbagai tahap remodeling
tulang. Penanda biokimia Pembentukan tulang mengandung enzim osteoblastik atau merupakan
konsekuensi dari osteoblas aktif. Sebagian besar penanda resorpsi tulang adalah konsekuensi dari
kerusakan kolagen tipe I, protein matriks tulang nonkolagen atau enzim osteoklastik.
Selain itu, berbagai pengatur fungsi sel tulang dan pergantian tulang juga dapat digunakan sebagai
biomarker [15].

2.3 Penanda Biokimia Pergantian Tulang

Penanda tulang, diproduksi selama fase yang berbeda dari remodeling tulang, menentukan variasi dalam
remodeling tulang. Penanda biokimia dari bone turnover (BMBT) adalah fragmen enzim atau protein
jaringan tulang, yang biasanya diukur dalam darah atau urin, dan mengevaluasi metabolisme tulang
[16-18]. BMBT secara luas dikategorikan ke dalam dua kelompok utama: penanda biokimia
pembentukan tulang dan penanda biokimia penanda resorpsi tulang.

2.3 Penanda Biokimia Pergantian Tulang

Gambar 2.1 Representasi grafis dari penanda tulang, yang dihasilkan selama berbagai tahap remodeling
tulang. Kotak biru dan panah menunjukkan penanda pembentukan tulang. Kotak oranye dan panah
menunjukkan penanda resorpsi tulang dan kotak hijau menunjukkan pengatur remodeling tulang. Selama
proses remodeling tulang, osteoblas menghasilkan aktivator reseptor ligan NF-kB (RANKL) dan
osteoprotegerin (OPG) yang mengontrol diferensiasi osteoklas. Fungsi osteoklastik dinilai dengan
pengukuran enzim lisosomnya: cathepsin K dan TRAP5b. Degradasi kolagen tulang tipe-I melepaskan
CTx-I dan NTx-I, (PYD, DPD dan Hyp/Hyl). Selama proses resorpsi tulang, kalsium dan enzim dari
matriks tulang seperti BSP dan OP diproduksi. Pembentukan tulang adalah suatu proses yang
berhubungan dengan pelepasan BALP dan enzim-enzim osteoblas spesifik-OC. Osteoblas
mengirimkan kolagen tipe I ruang ekstraseluler sebagai molekul prokolagen tipe-I; kemudian,
terminalnya dibelah melepaskan P1NP dan P1CP. Dengan adanya DDK-1 dan sclerostin, Wnt diatur dan
sebagai hasilnya, diferensiasi osteoblastik tertahan. Dalam metastasis tulang (BM), matriks
metaloproteinase (MMPs) dihasilkan oleh sel-sel stroma tulang dan sel-sel metastatik tulang. Protease ini
dapat mereduksi kolagen tipe-I yang memproduksi karboksi-terminal crosslinked telopeptide of type I
collagen (ICTP) [15]

2.3.1 Penanda Biokimia Pembentukan Tulang

Alkaline Phosphatase (AP)—Alkaline Phosphatases (APs) adalah enzim dalam membran sel osteoblas.
Total AP mencakup beberapa isoform, yang dihasilkan dari jaringan yang berbeda seperti hati, tulang,
usus dan ginjal [19-21]. Bone-specific AP (BAP) dihasilkan oleh osteoblas selama proses pembentukan
tulang dan karenanya, merupakan biomarker penting dari prosedur pembentukan tulang. Secara klinis,
pengukuran BAP semakin disukai karena keandalannya yang tinggi [22-24]. Tingkat BAP pada pria tetap
relatif stabil sepanjang hidup mereka, sedangkan tingkat BAP pada wanita meningkat sekitar menopause
[25]. Tes BAP populer, tersedia secara luas dan umum digunakan dalam evaluasi klinis pengobatan
osteoporosis [26-28]. Osteocalcin (OC)—Osteocalcin (OC) adalah protein non-kolagen yang relatif kecil
termasuk vitamin K dan residu asam glutamat, yang diproduksi oleh osteoblas dan odontoblas [29-31].
Konsentrasi OC terendah pada pria berada di usia pertengahan dan meningkat setelahnya dalam
kehidupan. Konsentrasi OC pada wanita mengikuti pola yang sama dengan tingkat BAP dengan
pertumbuhan yang signifikan pada tahap pramenopause [25, 32]. OC dihitung sebagai biomarker tertentu
dari aktivitas osteoblas [33, 34]. Setelah OC dilepaskan dari osteoblas, sebagian besar OC yang baru
diproduksi berintegrasi ke matriks tulang. Sebuah fragmen kecil dilepaskan ke dalam sirkulasi dan dapat
diukur dengan tes imun.

Propeptida prokolagen tipe I (PICP dan PINP)—Peptida prokolagen tipe I dilepaskan dari kolagen tipe I.
Kolagen tipe I membentuk lebih dari 90% matriks organik tulang dan dihasilkan sebagai molekul
prokolagen. Molekul ini terdiri dari terminal amino serta peptida terminal karboksi (PICP dan PINP).
Peptida ini dipecah dan dilepaskan ke dalam sirkulasi. Oleh karena itu, mereka dapat digunakan sebagai
penanda pembentukan tulang. Gambar 2.2 menunjukkan ilustrasi skema dari propeptida prokolagen tipe I.

2.3.2 Penanda Biokimia Resorpsi Tulang

Seperti ditunjukkan pada Gambar 2.3, sebagian besar penanda resorpsi tulang kecuali asam fosfatase yang
resisten terhadap tartrat, dihasilkan dari kolagen tulang. Baru-baru ini, penanda non-kolagen dari resorpsi
tulang seperti sialoprotein tulang dan turunan osteoklas juga telah dipelajari [6].
Hydroxyproline-Hydroxyproline (OHP) adalah asam amino hasil hidroksilasi pasca-translasi prolin yang
membentuk sekitar 14% dari total kandungan asam amino kolagen dan juga tersedia di beberapa jaringan
lain seperti kulit dan tulang rawan [38]. Bagian maksimum OHP tulang dipecah menjadi asam amino
bebas, yang diproses oleh ginjal dan kemudian dioksidasi oleh hati sehingga,
hanya 10-15% yang dilepaskan ke dalam urin. Hampir 90% OHP dalam bentuk peptida, sebagian kecil
dalam bentuk bebas, dan sisanya dalam bentuk polipeptida.
[39, 40].
Hydroxylysine-Glycosides-Hydroxylysine-Glycosides adalah bentuk lain dari asam amino yang tersedia
dalam kolagen, yang terbentuk selama proses pasca-translasi kolagen dan lebih terkait dengan tulang
daripada OHP. Signifikansi Hydroxylysine-Glycosides atas OHP adalah bahwa hal itu tidak dipengaruhi
oleh diet [38]. Hidroksilisin-glikosida dapat ditemukan dalam dua bentuk, glikosil-galaktosil-hidroksilisin
(GGHL) dan galaktrasil-hidroksilisin (GHL) [41, 42]. Ketika kolagen b, GHL dan GGHL dilepaskan ke
dalam sirkulasi dan dapat diukur dalam urin [43]. Namun, dinyatakan bahwa itu bukan penanda resorpsi
tulang yang valid karena perubahan biologisnya [44].
Molekul ikatan silang kolagen—ikat silang Pyridinoline (PYD) dan Deoxypyridinoline (DPD) diproduksi
pada tahap pematangan kolagen ekstraseluler dan dilepaskan ke dalam sirkulasi selama proses resorpsi
tulang. Molekul-molekul ini mengikat peptida kolagen dan secara mekanis memperkuat molekul kolagen
(Gbr. 2.3) [1, 45]. PYD ditemukan di tulang, tulang rawan, pembuluh darah dan ligamen, sedangkan DPD
hanya ditemukan di tulang dan dentin, dan salah satunya tersedia di kulit dan sumber lainnya. Dengan
demikian, DPD dianggap sebagai penanda yang lebih andal daripada PYD [46]. Karena pergantian tulang
terjadi pada tingkat yang lebih tinggi daripada di tulang rawan, pembuluh darah dan ligamen, PYD dan
DPD yang ada dalam urin dan serum sebagian besar berasal dari tulang. Oleh karena itu, PYD dan DPD
adalah salah satu penanda resorpsi tulang yang paling sensitif [13, 47].
Telopeptida ikatan silang dari kolagen tipe I—Telopeptida ikatan silang dari kolagen adalah penanda
resorpsi tulang yang paling populer [48]. Mereka diproduksi dari aminoterminal (N-terminal) dan
carboxyterminal (C-terminal) kolagen tipe I dan masing-masing dikenal sebagai NTx-I dan CTx-I
[49]. Mereka dibersihkan oleh ginjal, sehingga dapat diukur dalam serum serta urin. Berbagai
immuno assay telah diperkenalkan untuk pengukuran NTx-I dan CTx-I dalam serum dan urin [50].
Penelitian terbaru pada immuno assay yang dikembangkan telah menyarankan bahwa mereka lebih tepat
untuk mengevaluasi resorpsi tulang. Selanjutnya, penyelidikan pada penanda resorpsi tulang
menunjukkan bahwa NTx-I urin dan CTx-I serum lebih akurat daripada DPD dalam memantau
pengobatan anti-osteoklastik [51, 52].
Sialoprotein tulang—Sialoprotein tulang (BSP) adalah glikoprotein terfosforilasi, yang membentuk 5-
10% dari matriks tulang non-kolagen [53]. BSP dapat ditemukan di jaringan yang termineralisasi,
khususnya tulang dan dentin. Hal ini ditemukan dalam osteoblas, odontoblas dan garis sel mirip osteoklas
dan kanker [53, 54]. BSP telah terbukti signifikan dalam prosedur adhesi sel-matriks dan mampu
memperkirakan resorpsi tulang yang dimediasi oleh osteoklas [55].
Fosfatase asam tahan-tartrat—fosfatase asam tahan-tartrat (TRACP) adalah kelompok enzim yang
heterogen yang berasosiasi dengan kelompok fosfatase asam [56]. Dua bentuk TRACP dilepaskan ke
dalam sirkulasi, TRACP5a dan TRACP5b. Isoform-isoform ini memiliki formasi yang mirip tetapi
perbedaannya terletak pada pH optimum dan kandungan karbohidrat. Selain itu, TRACP5a berasal dari
makrofag sedangkan TRACP5b dihasilkan dari osteoklas [38, 46, 57]. Selama proses resorpsi tulang,
TRACP5b dilepaskan dari osteoklas dan menyebabkan degradasi matriks tulang. Dengan demikian, dapat
digunakan untuk mempelajari aktivitas osteoklas [58]. Aktivitas ginjal atau komponen diet tidak
berdampak pada tingkat TRACP5b [59].
Cathepsin K—Tersedia berbagai isoform cathepsin. Cathepsin K adalah bagian dari kelompok sistein
protease yang mampu membelah bagian heliks serta telopeptida dari kolagen tipe I [60, 61]. Cathepsin K
disekresikan dari osteoklas dan memainkan peran yang luar biasa dalam resorpsi tulang [62]. Saat ini,
inhibitor Cathepsin K digunakan sebagai pengobatan untuk osteoporosis [63]. Meskipun, cathepsin K
berpotensi sebagai biomarker resorpsi tulang yang efektif, validasi tambahan diperlukan sebelum dapat
digunakan secara komersial [64].
Penanda biokimia dari bone turnover diringkas dalam Tabel 2.1 [15].

2.4 Metode Analisis untuk Pengukuran Penanda Perputaran Tulang

Saat ini, ELISA, RIA dan HPLC adalah alat analisis yang paling umum dan populer untuk memantau
penanda biokimia dari bone turnover.

2.4.1 Uji Imunosorben Terkait-Enzim

Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah alat analisis yang dapat merasakan
konsentrasi antigen atau antibodi yang sangat rendah dalam sampel cairan biologis melalui variasi
warna. Dalam teknik ELISA, antigen dan antibodi berlabel enzim digunakan untuk mendeteksi
molekul target. Alkaline phosphatase dan glukosa oksidase adalah di antara enzim yang paling
umum digunakan [65, 66]. Salah satu aplikasi utama ELISA adalah dalam deteksi peptida dan
protein [67].
Tes imun enzimatik dapat dibagi menjadi dua kategori utama, homogen dan heterogen. Pada homogenous
immuno assays tidak ada tahap pencucian, sehingga mudah dilakukan, namun mahal dan memiliki tingkat
sensitivitas yang rendah. Dalam teknik heterogen, setelah membentuk kompleks antigen-antibodi, ia
melekat pada dinding pelat mikrotiter. Setelah itu, apa pun kecuali kompleks antigen-antibodi
dicuci. Oleh karena itu, immuno assay heterogen lebih populer daripada metode homogen karena
sensitivitasnya yang tinggi [65, 68]. Untuk meningkatkan spesifisitas pengukuran berbagai jenis
substrat, empat jenis ELISA (langsung, tidak langsung, sandwich dan kompetitif) memiliki
telah dikembangkan (Gbr. 2.4).

2.4.2 Radio immuno assay

Radioimmunoassay (RIA) adalah salah satu teknik yang paling akurat untuk mendeteksi antigen atau
antibodi [69]. RIA bekerja berdasarkan pengikatan kompetitif antigen radiolabeled dan antigen tidak
berlabel ke antibodi.

Antibodi tidak dapat membedakan antara antigen berlabel dan yang tidak berlabel; dengan demikian,
kedua jenis antigen terlibat untuk situs pengikatan antibodi. Karena peningkatan level antigen tidak
berlabel, jumlah antigen berlabel yang menggantikan tempat pengikatan meningkat. Untuk menentukan
tingkat antigen dalam sampel uji, pengurangan tingkat antigen berlabel radio yang terkait dengan antibodi
dalam sampel uji dievaluasi. Isotop pemancar gamma dan beta umumnya digunakan untuk pelabelan
antigen [69]. Sementara teknik RIA sangat akurat dan lebih dapat diandalkan daripada ELISA [70],
namun penggunaan radioaktivitas dalam metode ini membuatnya sangat mahal dan tidak aman bagi
kesehatan manusia dan lingkungan [71]. Prinsip RIA diilustrasikan pada Gambar 2.5.
2.4.3 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) adalah metode pemisahan kuantitatif dan kualitatif yang
populer dan sensitif yang umumnya digunakan untuk merasakan partikel tunggal atau ganda dalam
sampel farmasi dan biologi. HPLC menggunakan kolom yang mencakup fase diam, injektor yang
memasukkan sampel ke dalam fase gerak, pompa yang menjalankan fase gerak melalui kolom dan
detektor, dan detektor yang menentukan waktu retensi partikel.
Waktu retensi adalah waktu di mana molekul tertentu mengekstraksi dari kolom. Spektroskopi UV,
elektrokimia, floresensi dan spektrometri massa adalah detektor yang paling umum digunakan dalam
HPLC [72, 73].
Tergantung pada fase diam, ada berbagai jenis HPLC: fase normal, fase terbalik, ukuran-pengecualian
dan HPLC pertukaran ion.
Gambar 2.6 menunjukkan diagram skema instrumentasi HPLC, yang meliputi pompa, injektor, kolom,
detektor dan sistem akuisisi data. Karena pemisahan terjadi di kolom, ini dianggap sebagai salah satu
bagian terpenting dari sistem HPLC.
Tabel 2.2 memberikan perbandingan metode analisis yang paling umum digunakan untuk deteksi dan
pengukuran penanda biokimia dari bone turnover.

2.5 Kemajuan Saat Ini dalam Biosensor Tulang

Dalam beberapa tahun terakhir, telah terjadi kemajuan yang signifikan dalam teknik biosensor, yang telah
meningkatkan penilaian kondisi biomekanik serta fitur metabolik tulang. Kemajuan dan investigasi ini
telah meningkatkan kinerja biosensor saat ini, dan mengembangkan perangkat perawatan titik yang
murah, cepat, andal, dan sangat akurat [48, 74, 75]. Berdasarkan tinjauan yang tersedia, biosensor
tulang dapat secara luas diklasifikasikan menjadi sensor biomekanik dan sensor berbasis
biomarker.

2.5.1 Sensor Biomekanik

Dual-energi X-ray absorptiometry (DXA) dan sonografi adalah teknik yang paling populer untuk
penilaian BMD [75, 76]. Meskipun metode ini sangat akurat, mereka mahal dan membutuhkan perangkat
besar dan keahlian teknis [77-79]. Selain itu, studi real-time dari kondisi biomekanik tulang tidak
mungkin dilakukan.
Salah satu manfaat utama dari sensor biomekanik tulang adalah bahwa mereka dapat
memberikan indikasi status tulang secara real time, sedangkan teknik yang tersedia mendeteksi
masalah tulang yang sudah terjadi [75].
Oleh karena itu, beberapa sensor biomekanik diperkenalkan untuk menilai kekuatan tulang dalam
pendekatan yang lebih efektif daripada teknik saat ini [80-89]. Proyek IMPACT 3500 mengusulkan
metode untuk mengevaluasi regangan implan. Sistem ini menunjukkan kesesuaian medis untuk
mengenali deformasi implan sebagai parameter penting untuk memperkirakan latihan rehabilitasi, untuk
memantau kelebihan beban fungsional dan
mengevaluasi kegagalan implan dan memantau prosedur penyembuhan. Dalam teknik ini, pengukur
regangan dengan resistivitas 5 kΩ digunakan untuk mengukur regangan implan. Pengukur regangan
dalam susunan jembatan Wheatstone dihubungkan ke penguat untuk menghasilkan output yang sebanding
dengan regangan. Diagram blok dari sistem yang digunakan
dalam proyek ini ditunjukkan Gambar 2.7 [80].
Wen dkk. menyajikan pengukur regangan mikro yang digunakan pada tulang hidup. Dalam karya ini,
mereka menutup pengukur regangan film tipis dalam membran poli-dimetil-siloxane (PDMS). Tujuan
dari pekerjaan ini adalah untuk mengembangkan rangkaian sensor implan yang fleksibel untuk
mengamati regangan permukaan pada tulang hidup. Mereka menggunakan metode baru untuk
meningkatkan ketahanan mekanis sensor. Pada penelitian ini dibuat sebuah sensor miniatur dengan
mengganti lift-off konvensional dengan teknologi wet etching untuk menghasilkan film logam tipis. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa strain gauge yang dikembangkan lebih sensitif daripada yang komersial
[81].

Pada tahun 2012, Pangen dkk. mengembangkan sensor pengukur regangan yang fleksibel dan sangat
sensitif, yang memungkinkan pengenalan tekanan, geser, dan torsi. Dalam sistem ini, dua lapisan rambut
nano silikon ditempatkan di antara dua penyangga PDMS yang fleksibel (ketebalan 500 m). Rambut nano
silikon ditutupi oleh Pt dan susunan serat diulangi pada area seluas 9 13 cm2 (Gbr. 2.8). Perubahan
hambatan listrik disimpan sebagai fungsi regangan untuk tekanan, geser dan torsi. Untuk mengevaluasi
kemampuan sensor untuk bekerja sebagai pengukur regangan, faktor pengukur (GF) perangkat ditentukan
di atas area 4 5 cm2 dengan secara bertahap meningkatkan regangan hingga 2% untuk tekanan, 4% untuk
geser dan 5% untuk torsi. Respon tekanan diselidiki menggunakan antarmuka pengguna berbasis
komputer dan gaya dengan posisi piezoelektrik untuk menerapkan tekanan 550 Pa dengan frekuensi
hingga 10 Hz. Sensor menunjukkan sensitivitas tinggi, pengulangan dan reproduktifitas [82].
Sistem penginderaan regangan film nanotube diusulkan oleh Dharap et al. untuk menghadirkan sensor
baru yang dapat digunakan dalam penginderaan lokasi multi-arah. Perangkat penginderaan ini dirancang
berdasarkan nanotube karbon dinding tunggal (SWCNT) untuk penginderaan regangan pada skala makro.
Hasil menunjukkan hubungan linier antara tegangan melintasi film CNT dan regangan dalam film,
menunjukkan kemampuan film tersebut untuk sensor regangan multi-arah dan multi-lokasi.
Respon getaran jaringan tulang juga diselidiki. Dalam hal ini, NASA mengembangkan OsteoSonic untuk
mendeteksi kerusakan tulang dan sendi menggunakan analisis vibrasi jaringan tulang [91]. Demikian
pula, Nogata et al. menyajikan teknik untuk mengevaluasi kekuatan tulang menggunakan sinyal
ultrasound [92]. Setelah itu, pada tahun 2010, sebuah sensor regangan pasif implan nirkabel berbasis
ultrasound (WIPSS) dikembangkan untuk mempelajari deformasi implan. Sensor beroperasi berdasarkan
efek hidro-mekanis (Gbr. 2.9). Sebuah resolusi regangan 1,7 ± 0,2 10−5 dicapai dengan menggunakan
sensor yang dikembangkan [85].
Sensor piezoelektrik telah menunjukkan kemampuan untuk memberikan hasil yang dapat direproduksi
untuk perubahan sifat mekanik tulang. Bender dkk. melaporkan penggunaan sensor piezoelektrik untuk
memantau pembentukan kapsul di dekat implan jaringan lunak. Kemudian, perangkat biosensing
piezoelektrik keramik (PZT) dikembangkan untuk menilai parameter mekanik tulang. Pada perangkat ini,
dua tambalan PZT dilekatkan pada tulang; satu digunakan sebagai aktuator dan satu lagi sebagai sensor.
Eksitasi aktuator dilakukan dengan menerapkan sinyal ac yang digunakan untuk mengeksitasi aktuator
dan akibatnya mengeksitasi tulang dan perubahannya dideteksi menggunakan sensor patch. Perangkat
yang diusulkan dapat merasakan variasi dalam parameter mekanis tulang menggunakan perubahan fungsi
respons frekuensi (FRF). Diklaim bahwa perangkat tersebut dapat digunakan untuk memantau proses
penyembuhan tulang setelah operasi [86]. Hsieh dkk. merancang biosensor tegangan geser mikro
piezoresistif tipe kontak untuk mengukur tegangan prostesis lutut. Sensor ini dirancang berdasarkan
sistem mikro-elektro-mekanis (MEMS) yang mencakup dua buah X-ducer yang mengubah tegangan
menjadi tegangan.

2.5.3 Uji Multipleks

Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa tes imun multipleks telah dilaporkan untuk pengukuran simultan
dari berbagai biomarker untuk menilai proses remodeling tulang secara lebih akurat [107]. Claudon dkk.
melaporkan uji multipleks otomatis untuk memantau penanda pergantian tulang. Uji multipleks yang
diusulkan memberikan pengukuran simultan CTx-I, PINP, OC dan hormon paratiroid (PTH) dalam 20 L
serum. Immunoassay multipleks otomatis menunjukkan akurasi analitis yang sama dan sensitivitas yang
lebih tinggi daripada tes tunggal. Ini terutama dapat diterapkan ketika volume sampel terbatas tersedia
[108]. Khasyayar dkk. mengembangkan uji multipleks lain yang disebut Osteokit untuk pemantauan
penanda tulang. Dalam karya ini, platform mikofluida dikembangkan untuk memiliki pengukuran
simultan OC dan CTx-I dalam serum. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ada perbandingan sensitivitas
Osteokit dengan metode konvensional, ECLIA. Total waktu untuk melakukan pengujian dilaporkan 10
menit, kurang dari waktu yang dibutuhkan oleh ECLIA [109].

Kesimpulan

Penanda biokimia dari pergantian tulang menyediakan alat yang berguna untuk penilaian metabolisme
tulang. Seiring dengan penilaian kepadatan mineral tulang menggunakan teknologi pencitraan, tes
biokimia memiliki peran penting dalam evaluasi dan diagnosis gangguan tulang metabolik seperti
osteoporosis. Berbagai perangkat dan tes imun dikembangkan untuk pemantauan kesehatan tulang.
Metode konvensional umumnya berbasis laboratorium, memakan waktu, mahal dan rumit. Untuk
mengatasi keterbatasan ini, biosensor tulang sedang dikembangkan. Di sisi lain, sensor biomekanik
memiliki peran penting dalam mendeteksi perilaku jaringan tulang selama perkembangan,
penuaan, menanggapi perawatan dan Teknologi Sensing Tercanggih untuk Pemantauan
memanggil. Biosensor yang berbeda telah ditemukan untuk evaluasi biomekanik tulang, memperkirakan
faktor-faktor seperti kekuatan, ketangguhan, kekakuan, kelelahan dan sifat mulur. Bab ini telah
memberikan tinjauan tentang biomarker tulang yang tersedia, dengan fokus pada teknologi terbaru dari
biosensor tulang.

bagian 3
Sensor Interdigital Planar
dan Spektroskopi Impedansi Elektrokimia

Abstrak Pada bab ini dijelaskan prinsip pengoperasian sensor interdigital planar dan teori dasar
Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS). Pengaturan eksperimental diperkenalkan yang dapat
mengambil informasi dari sampel uji dan mengubahnya menjadi sinyal listrik untuk analisis lebih lanjut.

3.1 Prinsip Operasi Sensor Interdigital

Sensor interdigital planar dirancang dalam struktur periodik seperti sisir atau seperti jari dari
elektroda paralel pada substrat planar. Elektroda dikembangkan untuk membentuk kapasitansi terkait
dengan medan listrik yang menembus ke dalam Material Under Test (MUT) dan berisi informasi penting
tentang sifat-sifat sampel uji [1]. Salah satu keuntungan utama dari sensor interdigital planar adalah
akses satu sisi ke MUT. Fitur ini membantu menembus sampel dengan medan magnet, listrik, atau
akustik hanya dari satu sisi. Intensitas sinyal keluaran dapat dikontrol dengan memvariasikan jumlah
elektroda, area penginderaan sensor, dan celah antara elektroda. Potensi digunakan untuk pengujian non-
destruktif adalah manfaat lain dari sensor interdigital, yang membuatnya lebih cocok untuk pengujian
online dan aplikasi kontrol proses

Pada dasarnya, sensor interdigital planar beroperasi berdasarkan prinsip yang sama seperti
kapasitor pelat paralel. Gambar 3.1 menunjukkan transisi dari kapasitor pelat paralel ke kapasitor
bidang datar, di mana elektroda terbuka untuk memberikan akses satu sisi ke MUT. Pola elektroda
sensor interdigital biasanya diulang beberapa kali untuk meningkatkan kekuatan sinyal [2] dan
menjaga rasio signal-to-noise dalam kisaran yang dapat diterima [3]. Konfigurasi sensor interdigital
konvensional ditunjukkan pada Gambar 3.2.

Dengan menerapkan tegangan eksitasi AC ke elektroda, medan listrik dihasilkan dari terminal
positif ke negatif. Medan listrik ini menembus MUT dari elektroda eksitasi, diterima oleh elektroda
penginderaan, dan berisi informasi yang berguna tentang sifat-sifat MUT seperti impedansi,
densitas dan bahan kimia. Gambar 3.3 menunjukkan medan listrik yang dihasilkan antara elektroda
untuk panjang nada yang berbeda—celah antara dua elektroda berurutan dengan polaritas yang sama.
Seperti yang ditunjukkan pada gambar, panjang pitch yang berbeda (l1, l2 dan l3) menunjukkan
kedalaman penetrasi yang berbeda. Kedalaman penetrasi meningkat dengan meningkatkan panjang pitch,
tetapi medan listrik melemah.

3.2 Sensor Interdigital Planar Novel

Sensor interdigital baru telah dirancang dan dibuat dengan lebih banyak elektroda penginderaan daripada
elektroda eksitasi, untuk meningkatkan kedalaman penetrasi medan listrik tepi. Berbagai geometri telah
dipelajari dalam literatur penelitian yang berbeda [5-7]. Gambar 3.4 mengilustrasikan konfigurasi eksitasi
untuk sensor elektroda multi-penginderaan.
Parameter geometris yang berbeda dipertimbangkan untuk merancang sensor interdigital baru. Tabel 3.1
menyajikan parameter geometris dari empat sensor yang berbeda dan Gambar 3.5 menunjukkan skema
konfigurasi 1-5-25 dan 1-11-25 dari sensor interdigital planar [8].
Fabrikasi Sensor
Sensor dibuat dengan teknologi etsa dan fotolitografi pada kristal tunggal Silicon/Silicon Dioxide
(Si/SiO2) wafer 4 inci (diameter), tebal 525 m. 36 sensor yang bisa diterapkan dipolakan pada satu wafer
(Gbr. 3.6). Masing-masing sensor memiliki dimensi 10 mm 10 mm dengan luas penginderaan 6,25 mm2
(2,5 mm 2,5 mm).
Pola dibuat untuk struktur interdigital periodik termasuk 11 elektroda referensi antara dua elektroda kerja
untuk panjang pitch 25 m dengan lebar elektroda dan area penginderaan yang dirancang untuk nilai 25 m
dan
2,5 mm × 2,5 mm masing-masing. Teknologi MEMS digunakan untuk membuat sensor. Langkah-
langkah yang berbeda termasuk pelapisan photoresist, transfer pola interdigital yang terpapar UV,
deposisi logam etsa plasma oleh sputtering magnetron DC dan pengangkatan digunakan untuk
menerapkan teknologi MEMS. Emas digunakan untuk membuat elektroda karena fleksibilitas dalam
teknik yang tersedia untuk pengendapan emas sebagai elektroda film tipis. 500 nm Emas (Au) tergagap
pada 20 nm Chromium (Cr) untuk membawa adhesi yang tepat dari elektroda pada substrat.
Bantalan ikatan kemudian dibuka menggunakan teknologi plasma-etsa. Gambar 3.7 mengilustrasikan
prosedur fabrikasi sensor interdigital. Sensor ini memiliki beberapa aplikasi dalam proses manufaktur [9],
pemantauan lingkungan [7, 10-13], kelembaban dan sistem penginderaan kelembaban [14, 15], deteksi
fotosensitif [16] dan sensor gas [17].

3.3 Spektroskopi Impedansi Elektrokimia (EIS)

Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) adalah metode pengukuran yang sangat populer
dan kuat dalam penilaian sensor [18, 19]. Metode EIS telah umum digunakan dalam aplikasi yang
berbeda seperti pemantauan korosi pada bahan [20], aplikasi biomedis [21] dan pengukuran kontaminan
dalam makanan dan minuman [11, 22]. Selain itu, EIS adalah teknik yang kuat untuk pengukuran
impedansi listrik dari sel elektrokimia dan sangat sensitif terhadap fenomena antarmuka. Dengan
demikian, sangat cocok untuk karakterisasi bahan biologis setelah mereka diterapkan pada sistem
penginderaan dan membuat sel elektrokimia [23, 24]. Dalam teknik ini, impedansi sistem dinilai sebagai
fungsi frekuensi. EIS sebenarnya adalah respons sistem elektrokimia terhadap sinyal eksitasi AC.
Bagian nyata dan imajiner dari impedansi umumnya digunakan untuk mewakili reaksi sistem terhadap
sinyal yang diterapkan.
Studi impedansi sistem linier jauh lebih sederhana daripada sistem non-linier. Dalam percobaan EIS,
sinyal AC amplitudo kecil diterapkan ke sistem. Dengan tegangan rendah seperti itu, sistem berperilaku
sebagai perangkat pseudo-linear.
Tegangan AC dengan amplitudo kecil umumnya diberikan ke sistem elektrokimia dan responsnya
adalah arus dengan amplitudo tertentu dan pergeseran fasa (h) dengan tegangan input. Impedansi
elektrokimia ditentukan dengan menggunakan tegangan eksitasi yang kecil, sehingga respon sistem
adalah pseudo-linear. Dalam sistem linier, respons arus terhadap tegangan eksitasi sinusoidal akan
menjadi sinusoidal arus pada frekuensi yang sama tetapi bergeser dalam fase seperti yang digambarkan
pada Gambar. 3.8.

3.5 Kesimpulan

Sensor interdigital adalah salah satu struktur elektroda periodik yang paling populer. Beberapa
keuntungan seperti akses satu sisi, kontrol kekuatan sinyal, pemodelan yang disederhanakan
dengan sensitivitas tinggi dan ukuran kecil telah membuatnya cocok untuk aplikasi yang berbeda.
EIS adalah metode serbaguna yang menggambarkan karakteristik kapasitif dan resistif bahan dengan
menggunakan sinyal AC amplitudo kecil yang bergantung pada frekuensi. Karena sensitivitas tinggi dan
kesederhanaan teknik, telah banyak diimplementasikan dalam aplikasi biosensor menggunakan metode
yang berbeda [29]. Sensor interdigital dalam hubungannya dengan metode pengukuran EIS telah
dilaporkan untuk mengevaluasi pemantauan lingkungan [30], deteksi ftalat dalam jus dan air [11], bahan
kimia berbahaya dalam makanan laut [13], kelembaban [31] dan deteksi DNA [32]. Dalam bab ini,
prinsip pengoperasian sensor interdigital planar telah dijelaskan dan teori dasar Spektroskopi Impedansi
Elektrokimia telah dibahas. Pengaturan eksperimental telah diperkenalkan yang dapat mengambil
informasi dari sampel uji dan mengubahnya menjadi sinyal listrik untuk analisis lebih lanjut.

Bab 4
Sensor Berbasis Antigen-Antibodi untuk Deteksi CTx-I

Abstrak Bab ini menyajikan rincian langkah-langkah yang terlibat dalam desain dan pengembangan
biosensor berbasis antigen-antibodi untuk deteksi dan pengukuran CTx-I dalam serum. Dalam fase kerja
ini, antibodi alami digunakan untuk menginduksi selektivitas dalam sistem penginderaan.

4.1 Pendahuluan

Sebuah reseptor yang berperilaku sebagai elemen penginderaan (seperti antibodi, enzim atau asam
nukleat) memainkan peran penting dalam menentukan sensitivitas dan selektivitas sensor
elektrokimia. Sangat penting untuk secara selektif menangkap molekul target menggunakan elemen
pengenalan. Akibatnya, merancang sensor yang sangat efisien sangat bergantung pada pengembangan
bahan selektif untuk meningkatkan kemampuan pengenalan biosensor. Berbagai jenis biosensor telah
diusulkan dengan memanfaatkan enzim, antibodi, membran, karbon nanotube, nanopartikel magnetik
dan rakitan supramolekul untuk berperilaku sebagai pengenalan.
elemen untuk molekul kimia dan biokimia [1–3]. Beberapa biosensor berbasis antigen (Ag)-antibodi (Ab)
telah dibahas dalam literatur [4, 5]. Dalam pekerjaan kami, biosensor berbasis antigen-antibodi
impedometrik telah diusulkan untuk pemantauan pengeroposan tulang oleh Monitoring CTx-I
dalam serum.

4.2 Eksperimen Berbasis ELISA

Eksperimen awal dilakukan dengan menggunakan kit ELISA untuk mendapatkan gambaran tentang
metode berbasis antigen-antibodi. Selain itu, digunakan untuk memvalidasi hasil yang dicapai dari sensor
yang dikembangkan. Seperti yang telah dibahas dalam Bab. 2, sebagian besar metode yang tersedia
untuk penilaian penanda biokimia dari bone turnover berbasis ELISA. ELISA adalah alat analisis
yang akurat dan andal yang umumnya digunakan dalam penelitian biomedis untuk deteksi dan
kuantifikasi molekul tertentu dalam sampel cair. ELISA dapat mendeteksi analit menggunakan
antigen dan antibodi terkait-enzim. Jumlah antigen yang sangat kecil seperti hormon, protein, peptida,
atau antibodi dalam sampel cairan dapat dideteksi dan dikuantifikasi menggunakan ELISA.

Antigen dalam fase cair di imobilisasi ke dalam lubang pelat mikrotiter 96 lubang yang terhubung
dengan antibodi primer. Antibodi sekunder yang terkait enzim kemudian merasakan antigen
dengan mengikat antigen ke antibodi. Substrat kromogenik digunakan untuk memvariasikan warna
dengan adanya antigen. Terakhir, pengukuran selesai menggunakan teknik spektrofotometri [8].
Meskipun teknik ini merupakan metode immunoassay standar, ada beberapa kelemahan dalam
menggunakan ELISA; ini adalah pengujian berbasis laboratorium yang memakan waktu, mahal dan
melibatkan beberapa langkah dan keterampilan teknis. Ini mencakup banyak langkah dan prosedur untuk
inkubasi, pengikatan antibodi dan pengukuran yang tidak hanya membutuhkan layanan profesional yang
sangat terampil dan pengaturan laboratorium yang mahal, tetapi juga melibatkan biaya tinggi untuk
menguji sampel individu, dan oleh karena itu tidak dapat digunakan untuk pemantauan CTx-I yang
sering. konsentrasi untuk memantau variasi resorpsi tulang pada individu.

4.2.1 Bahan dan Bahan Kimia

Kit Serum CrossLaps® ELISA, diproduksi di IDS Company (UK), dibeli dari Abacus ALS, Selandia
Baru. Ini adalah tes khusus untuk mengukur tingkat CTx-I dalam plasma darah. Kit tersebut mencakup
pelat mikrotiter berlapis streptavidin, antibodi terbiotinilasi, antibodi terkonjugasi peroksidase, enam
larutan antigen standar, buffer pencuci, buffer inkubasi, dan larutan penghenti. Larutan standar, antibodi
terbiotinilasi dan antibodi terkonjugasi peroksidase dari kit ELISA juga digunakan untuk melakukan
percobaan menggunakan biosensor yang diusulkan. Streptavidin-agarose disediakan dari Sigma-aldrich,
USA.

4.2.2 Prosedur Pengujian

Larutan antibodi disiapkan 30 menit sebelum memulai pengujian dengan mencampur antibodi
terbiotinilasi, antibodi terkonjugasi peroksidase dan buffer inkubasi dalam rasio volumetrik 1 + 1 + 100.
Setelah itu, larutan standar dan kontrol dipipet ke dalam sumur diikuti dengan menambahkan antibodi
solusi untuk mereka. Pada fase ini, kompleks antara antigen dan antibodi dibuat dan kompleks ini
berikatan dengan permukaan streptavidin melalui antibodi terbiotinilasi. Setelah
120 ± 5 menit inkubasi, sumur dicuci lima kali menggunakan buffer pencuci yang diencerkan.

Kemudian substrat chromogenic dipipet ke dalam sumur dan diinkubasi selama 15 ± 2 menit dalam alat
pencampur gelap. Setelah itu, reaksi warna dihentikan dengan menambahkan asam sulfat pada substrat
kromogenik. Terakhir, pengukuran diselesaikan menggunakan spektrofotometer. Ringkasan prosedur
ELISA ditunjukkan pada Gambar 4.1 dalam bentuk diagram alir.

4.2.3 Hasil

Kurva kalibrasi diperoleh dengan menguji enam larutan standar (nol (kontrol), 0,147, 0,437, 0,798, 1,693
dan 2,669 ng/ml) menggunakan kit Serum CrossLaps® ELISA. Kurva standar yang diperoleh dari ELISA
ditunjukkan pada Gambar 4.2. Semua sampel diuji dalam rangkap dua dan pengujian dilakukan pada suhu
kamar. Setelah kurva standar diplot, percobaan dilakukan untuk dua sampel yang tidak diketahui, yang
diperoleh dari darah domba. Konsentrasi CTx-I pada sampel pertama adalah 0,6514 ng/ml, dan pada
sampel kedua adalah 0,5049 ng/ml.
4.3 Biosensor Berbasis Ag-Ab

Untuk mengembangkan sistem penginderaan cerdas yang efisien untuk deteksi CTx-I, sensor harus
selektif terhadap CTx-I dan harus mampu menangkap molekul CTx-I untuk tujuan deteksi dan
kuantifikasi. Teknik berbasis Ag-Ab digunakan untuk membuat sensor selektif untuk analit
tertentu (CTx-I) menggunakan antibodi alami yang sesuai. Antibodi terbiotinilasi, antibodi
terkonjugasi peroksidase dan antigen standar dari kit ELISA juga digunakan untuk sistem penginderaan
yang dikembangkan dan streptavidin agarose dibeli dari Sigma-Aldrich, AS. Prosedur yang sama seperti
ELISA diikuti untuk menyiapkan larutan antigen-antibodi.
Sensor interdigital telanjang adalah EIS-profil di udara untuk mengkarakterisasi sensor dan untuk
menentukan rentang frekuensi sensitif untuk sensor tertentu. Pada langkah selanjutnya, daerah
penginderaan sensor spin-coated dengan 4 L streptavidin agarose untuk memfungsikan permukaan
penginderaan [9]. Sensor dikeringkan dalam atmosfer nitrogen dan kemudian dikarakterisasi lagi dengan
spektroskopi impedansi untuk menentukan perubahan profil impedansi, yang dibandingkan dengan sensor
yang tidak dilapisi untuk mendapatkan plot referensi untuk masing-masing sensor digital.

Gambar 4.3 menunjukkan gambar SEM dari sensor berlapis agarosa streptavidin. Streptavidin agarosa
bertindak sebagai penghubung silang antara elektroda emas/substrat SiO2 dan antibodi CTx-I
terbiotinilasi yang bertanggung jawab untuk menangkap analit dari sampel serum atau urin.
Pada tahap selanjutnya, larutan antibodi-antigen dibuat dengan mencampurkan antigen, antibodi
terbiotinilasi dan antibodi terkonjugasi peroksidase yang tersedia dalam kit ELISA. Larutan yang
disiapkan kemudian diinkubasi selama satu jam untuk memungkinkan antibodi menjebak molekul CTx-I
dari sampel uji, sebelum memipetkan 8 L larutan pada permukaan sensor interdigital yang dilapisi
streptavidin. Kemudian, inkubasi satu jam pada suhu kamar diizinkan untuk lapisan streptavidin untuk
menghubungkan silang kompleks antibodi-antigen ke elektroda interdigital emas. Sensor dicuci lima kali
menggunakan larutan buffer pencuci dan dikeringkan di bawah nitrogen pada suhu kamar (Gbr. 4.4).

4.3.1 Pengukuran CTx-I pada Sampel yang Diketahui

Sampel dengan empat konsentrasi yang diketahui (0,147, 0,437, 0,798 dan 1,693 ng/ml) diuji dalam
sistem penginderaan yang dikembangkan. Larutan standar dengan konsentrasi nol CTx-I dianggap
sebagai kontrol. Percobaan dilakukan pada suhu kamar (21 °C) pada tingkat kelembaban 31%.
Pengujian pada sampel dilakukan oleh sistem penginderaan yang dikembangkan segera setelah
menyiapkan larutan sampel. Gambar 4.5a menunjukkan reaktansi dalam domain frekuensi untuk keempat
konsentrasi CTx-I. Seperti diilustrasikan dalam gambar ini, reaktansi kapasitif (X) menunjukkan variasi
yang drastis, terutama pada frekuensi yang lebih rendah antara 100 dan 750 Hz. dengan perubahan
konsentrasi CTx-I yang dikaitkan dengan sifat dielektrik sampel. Bagian nyata dari impedansi vs
frekuensi untuk konsentrasi CTx-I yang berbeda diplot pada Gambar 4.5b.
Perubahan bagian resistif dari impedansi (R) terlihat hanya pada frekuensi yang sangat rendah hingga 150
Hz, yang terutama disebabkan oleh sifat ionik dan arus faradik melalui bahan sampel. Sensitivitas yang
diperoleh dari bagian reaktansi juga lebih tinggi dibandingkan dengan bagian resistif. Oleh karena itu,
reaktansi digunakan untuk mengevaluasi konsentrasi CTx-I dalam larutan sampel.
Gambar 4.6 menunjukkan plot Nyquist untuk spektrum impedansi yang diperoleh untuk keempat
konsentrasi CTx-I dalam rentang frekuensi 42 Hz hingga 100 kHz. Diamati bahwa diameter setengah
lingkaran meningkat dengan meningkatkan konsentrasi CTx-I, yang menggambarkan peningkatan
resistensi transfer muatan karena adanya jumlah CTx-I yang lebih tinggi yang melekat pada permukaan
penginderaan.
4.3.2 Analisis Data Menggunakan Pemasangan Kurva Persegi Terkecil Non-linier

Rangkaian ekivalen disimpulkan dengan menerapkan metode kuadrat terkecil non-linier kompleks
(CNLS) yang sesuai dengan spektrum impedansi yang diamati secara eksperimental dengan nilai yang
dievaluasi secara teoritis untuk rangkaian listrik. Ini menafsirkan proses kinetik elektrokimia yang
dijalankan di dalam sel kimia ke dalam rangkaian ekivalen listriknya berdasarkan model Randle [10, 11].
Algoritma EIS Spectrum-analyser digunakan untuk memperkirakan rangkaian ekivalen. Plot Nyquist
yang dipasang dan rangkaian ekivalen yang diusulkan untuk proses elektrokimia diberikan pada Gambar
4.7, di mana titik-titik pada grafik mewakili data yang diamati secara eksperimen dan garis padat
menunjukkan respons yang dipasang secara teoritis untuk rangkaian ekivalen. Rangkaian ekivalen yang
diusulkan oleh pemasangan kurva kuadrat terkecil non-linier kompleks adalah kombinasi paralel elemen
fase konstan (CPE1) dan resistansi transfer muatan (R2) secara seri dengan resistansi larutan (R1).

Tabel 4.1 menampilkan estimasi parameter dan nilai komponen dari rangkaian ekivalen. P1 dan n1 adalah
parameter elemen fase konstan, masing-masing mewakili faktor pra-eksponensial dan eksponen. Nilai pas
n1 menentukan perilaku kapasitif CPE1 seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4.1 [12]. Kesalahan evaluasi
adalah <2,8% untuk parameter rangkaian ekivalen. r2 menunjukkan deviasi dari nilai yang diamati secara
eksperimental dari solusi optimal.

4.3.3 Analisis Kemometrik Multivariat

Hasil pengukuran spektroskopi impedansi menjadi sasaran evaluasi data multivariat. Analisis Komponen
Utama (PCA) digunakan untuk mengidentifikasi kemungkinan outlier dan untuk menemukan pola
multidimensi dari parameter individu, yaitu bagian nyata dari impedansi R (Ohm), reaktansi X (Ohm) dan
Pergeseran fasa (Derajat). Hasil PCA menunjukkan bahwa variasi tertinggi terkait dengan perubahan
konsentrasi CTx-I terjadi pada rentang frekuensi yang lebih rendah untuk ketiga parameter yang diukur.
Oleh karena itu, rentang frekuensi antara 42 dan 5917 Hz digunakan untuk evaluasi kemometrik lebih
lanjut. Model PCA dihitung menggunakan rentang frekuensi terpotong untuk ketiga parameter individu.
Dua komponen utama pertama (PC1 dan PC2) menjelaskan lebih dari 98% dari keseluruhan variasi dalam
ketiga model. Selanjutnya, PC1 dan PC2 menyajikan pemisahan yang baik dari kelompok sampel CTx-I
konsentrasi yang berbeda.
Hasil PCA parameter X (reaktansi) ditunjukkan pada Gambar 4.8a, b. Plot skor PCA (PC1 dan PC2) dari
reaktansi (X) dihitung berdasarkan rentang frekuensi antara 42 dan 5917 Hz. Gambar 4.8a menunjukkan
kecenderungan pemisahan sampel CTx-I dengan konsentrasi berbeda berdasarkan peningkatan
konsentrasinya. Pembebanan model PCA pada Gambar 4.9b menyiratkan pentingnya rentang frekuensi
antara 42 dan sekitar 2000 Hz dalam pemisahan ini.
Mengikuti perhitungan PCA, model regresi dibangun dengan Regresi Kuadrat Terkecil Parsial
menggunakan tiga parameter individu (Rs, X dan sudut Fase), secara terpisah dan menggunakan rentang
frekuensi antara 42 dan 5917 Hz untuk mundur pada konsentrasi CTx-I.
Model regresi terbaik ditemukan untuk data reaktansi (X) seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4.9a, b.
Model PLSR dari parameter reaktansi (X) memberikan korelasi yang relatif dekat dan kesalahan prediksi
yang rendah. Hasil cross-validation menunjukkan konsentrasi sampel CTx-I dapat diprediksi berdasarkan
reaktansi (X) dengan error 0,1941 ng/ml pada rentang konsentrasi antara 0 dan 1,693 ng/ml menggunakan
rentang frekuensi antara 42 dan 5917 Hz. . Vektor regresi model PLSR (Gbr. 4.9b) menekankan
pentingnya 710 Hz untuk regresi konsentrasi CTx-I.

4.4 Kesimpulan
Perangkat biosensing non-invasif, waktu nyata dan bebas label untuk deteksi dini keropos tulang telah
diusulkan. Sensor yang dikembangkan menggabungkan fungsionalisasi berbasis Ag-Ab dengan
menggunakan Streptavidin Agarose sebagai cross-linker untuk mengikat peptida CTx-I. Sensor
interdigital planar berbasis MEMS, berpola dengan jari emas, telah digunakan bersama dengan EIS
untuk mengukur impedansi elektrokimia sampel. Rangkaian ekivalen telah ditentukan dengan menerapkan
teknik pemasangan kurva kuadrat terkecil non-linier yang kompleks. Analisis kemometrik multivariat
telah dilakukan untuk memperkirakan frekuensi optimal tunggal yang dapat memberikan sensitivitas
tertinggi pada sensor. Percobaan kalibrasi telah dilakukan dengan sampel konsentrasi yang diketahui
berbeda untuk mendapatkan kurva kalibrasi yang digunakan untuk menentukan konsentrasi CTx-I dalam
sampel serum yang tidak diketahui yang diperoleh dari darah domba. Akhirnya, hasilnya divalidasi
menggunakan kit ELISA.
Namun, ada beberapa keterbatasan dalam menggunakan sistem yang dikembangkan. Ini memakan waktu,
memerlukan beberapa langkah untuk menyiapkan larutan antigen-antibodi dan membutuhkan lingkungan
berbasis laboratorium untuk melakukan eksperimen. Selain itu, antibodi alami sangat mahal, sensitif
terhadap kondisi lingkungan yang keras dan memiliki stabilitas yang terbatas. Bab berikutnya
menjelaskan pengembangan antibodi buatan untuk molekul CTx-I, untuk mengatasi keterbatasan yang
disebutkan.

Bab 5

Sensor Berbasis MIP untuk Deteksi CTx-I

Abstrak Menjelaskan prosedur rinci pembuatan antibodi buatan menggunakan Molecular Imprinted
Polymers (MIPs). Teknik penginderaan baru untuk pengenalan CTx-I dengan menggabungkan
spektroskopi impedansi elektrokimia dan teknologi MIP juga dijelaskan dalam bab ini. Selain itu, peran
ketebalan lapisan pada sensitivitas sensor interdigital planar diselidiki.

5.1 Pendahuluan

Seperti yang dijelaskan dalam Bab. 4, ada beberapa kelemahan dalam menggunakan antibodi biologis:
langkah imobilisasi antibodi rumit, antibodi biologis mahal dan stabilitasnya terbatas. Selain itu,
persiapan sampel adalah proses yang kompleks dan memakan waktu. Keterbatasan ini dapat diatasi
dengan mengganti antibodi alami dengan antibodi buatan. Teknologi pencetakan molekul adalah
metode yang cepat dan murah untuk membuat polimer yang memiliki selektivitas dan kepekaan terhadap
molekul yang telah ditentukan sebelumnya, yang disebut dengan Molecular Imprinted Polymers
(MIPs). Teknik MIP telah digunakan untuk beberapa jenis molekul template [1-4] dan telah efektif
digunakan dalam berbagai aplikasi seperti bahan ekstraksi fase padat [5], binding assay [6, 7] dan katalis
enzim-mimik [ 8-10], dan mereka semakin banyak digunakan dalam lapisan tercetak untuk merancang
sensor kimia [11, 12].
MIP telah banyak digunakan dalam pengembangan sensor elektrokimia tergantung pada model transduksi
yang berbeda seperti konduktometri [13], potensiometri [14], voltametri [15] dan sensor kapasitif [16].
Penelitian ini bertujuan untuk mengembangkan sistem penginderaan cerdas untuk deteksi dini
keropos tulang yang mudah digunakan, murah, dan cepat serta dapat digunakan sebagai
perangkat Point-of-Care (PoC) di luar laboratorium. Oleh karena itu, pengembangan sistem
penginderaan yang menggabungkan keunggulan antibodi buatan berbasis MIP dengan sensor
elektrokimia yang cepat dan murah tampaknya menjadi pendekatan yang sangat menjanjikan untuk
mencapai tujuan kami.
Sejauh pengetahuan kami, sejauh ini, tidak ada sensor interdigital berbasis MIP yang diperkenalkan untuk
deteksi CTx-I. Bab ini menjelaskan pengembangan biosensor CTx-I impedometrik, yang
menggabungkan teknologi MIP dan teknik EIS untuk pengukuran CTx-I serum yang sensitif dan
cepat.

5.2 Prinsip Umum Teknologi Pencetakan Molekuler

Pencetakan molekuler adalah prosedur murah dan relatif mudah untuk pembuatan polimer yang memiliki
situs pengikatan selektif untuk menyerap molekul yang telah ditentukan dan menggantikan reseptor alami
[17-20]. Molecular imprinted polymer (MIP) dibuat dengan mencampurkan monomer fungsional,
molekul template, cross-linker dan inisiator dalam pelarut yang sesuai. Setelah itu, campuran ini
terkena panas untuk memulai polimerisasi. Kompleks yang terbentuk antara monomer fungsional dan
molekul template difiksasi di dalam polimer yang sangat terikat silang. Selanjutnya, molekul template
akan dikeluarkan dari polimer; Rongga 3D akan tetap berada dalam matriks polimer, yang sesuai dalam
bentuk, ukuran, dan fungsi kimia dengan template. Tingkat ikatan silang yang tinggi membantu rongga
untuk mempertahankan bentuknya setelah mengekstraksi template dan memungkinkan pengikatan ulang
dan pengenalan molekul template [21]. Gambar 5.1 menggambarkan prosedur umum persiapan MIP.
Manfaat utama menggunakan MIP termasuk kemudahan persiapan, biaya produksi rendah,
stabilitas penyimpanan, kekuatan mekanik yang tinggi, daya tahan terhadap tekanan dan panas,
kesesuaian dalam lingkungan kimia yang keras dan mengulangi operasi tanpa merusak aktivitas
[7]. Pencetakan molekuler telah menjadi semakin menarik di berbagai bidang biologi dan kimia, sebagai
metode untuk menciptakan pengenalan buatan. situs nition dengan memori molekul target yang telah
ditentukan. Beberapa area yang paling menguntungkan dari aplikasi MIP adalah untuk sensor [22-25], tes
[26], antibodi buatan [27, 28] dan fase diam kromatografi [29, 30].

.2.1 Kategori MIP

Berdasarkan ikatan kovalen atau non-kovalen antara template dan monomer fungsional, dua jenis strategi
pencetakan molekul telah ditetapkan. Pendekatan non-kovalen telah digunakan secara luas karena banyak
keuntungannya seperti persiapan yang mudah, pelepasan molekul template yang mudah, dan pengikatan
ulang yang lebih cepat.

Pencetakan kovalen
Dalam pendekatan kovalen, molekul template secara kovalen digabungkan ke monomer fungsional
dengan memanfaatkan ikatan kovalen reversibel. Setelah polimerisasi, cetakan cetakan secara kimiawi
dibelah dari matriks polimer. Ikatan kovalen akan terbentuk kembali sambil memasukkan kembali
template ke dalam matriks polimer. Pendekatan kovalen telah digunakan untuk berbagai jenis molekul
template seperti gula [35] dan asam gliserat [36]. Persyaratan untuk pencetakan kovalen berbeda dari
persyaratan untuk pendekatan non-kovalen, terutama berdasarkan rasio template, monomer, dan cross-
linker.
Keuntungan utama dari pendekatan ini adalah bahwa distribusi homogen dari situs pengenalan akan
terbentuk dalam matriks polimer [18, 37]. Namun, teknik ini membutuhkan prosedur hidrolisis asam
untuk memisahkan molekul tercetak dari matriks polimer [18].
Pencetakan non-kovalen
Pencetakan non-kovalen adalah teknik yang paling umum digunakan untuk menyiapkan MIP karena
kesederhanaannya. Dalam metode pencetakan non-kovalen, kompleks template-monomer dibentuk oleh
interaksi lemah non-kovalen (ionik,
hidrofobik dan ikatan hidrogen) antara molekul template dan monomer [38-40]. Monomer fungsional
yang berbeda dapat digunakan dalam metode non-kovalen, tetapi asam metakrilat (MAA) telah
digunakan secara luas sebagai monomer fungsional karena kemampuannya untuk berinteraksi dengan
gugus fungsi yang berbeda [18].
Asam amino biasanya digunakan dalam metode non-kovalen karena interaksinya yang kuat dengan MAA
[41]. Namun, pembentukan ikatan antara template dan monomer dapat dengan mudah terganggu di
lingkungan kutub.

5.2.2 Pengaruh Monomer, Cross-Linker, Pelarut Porogenik dan Inisiator di MIP

Monomer
Monomer memainkan peran yang sangat penting dalam sintesis MIP, untuk memberikan interaksi
komplementer dengan molekul template dan substrat. Dalam metode pencetakan kovalen, tidak ada efek
yang dapat diamati dalam memvariasikan rasio templat terhadap monomer fungsional karena templat itu
sendiri menentukan jumlah monomer fungsional yang harus dilampirkan secara kovalen. Namun, dalam
pendekatan non-kovalen, rasio optimal template terhadap monomer dicapai secara eksperimental dengan
mencoba rasio template/monomer yang berbeda [42].
Sangat penting bahwa fungsionalitas monomer dicocokkan dengan fungsionalitas template secara
komplementer untuk memaksimalkan efek pencetakan. Gambar 5.2 menunjukkan monomer fungsional
umum yang digunakan dalam metode pencetakan molekul non-kovalen.
Penghubung silang
Jumlah dan jenis cross-linker dalam preparasi MIP dapat sangat mempengaruhi selektivitas. Cross-linker
memainkan tiga peran utama dalam sintesis

5.3.2 Persiapan Antibodi Buatan Menggunakan Teknologi Molecular Imprinting

Polimer selektif untuk CTx-I dibuat dengan teknik polimerisasi presipitasi menggunakan MAA
sebagai monomer fungsional, peptida CTx-I sebagai template, AIBN sebagai inisiator dan EGDMA
sebagai cross-linker.
Campuran dibuat dengan melarutkan 450 mg molekul template (CTx-I) dalam 50 ml asetonitril dalam
labu alas bulat 150 ml, dan kemudian menambahkan 260 l monomer fungsional MAA, 3 ml cross-linker
EGDMA, dan 120 mg inisiator. Gas nitrogen (N2) dibersihkan selama 10 menit untuk mengevakuasi
udara seluruhnya dari larutan, karena adanya oksigen menghalangi proses polimerisasi [50, 51]. Labu
ditutup rapat dan disimpan dalam penangas air 60 °C selama 20 jam untuk menyelesaikan proses
polimerisasi. Mikrosfer dikumpulkan dengan sentrifugasi selama 10 menit pada 5000 rpm dan kemudian
dicuci dengan asetonitril untuk mengecualikan peptida dan bahan kimia tambahan. Penghapusan
template dilakukan dengan teknik ekstraksi Soxhlet dengan campuran metanol/asam asetat 50/50 (v/v)
selama 24 jam. Polimer yang tidak dicetak (NIP) juga dibuat menggunakan proses yang sama tetapi
tanpa molekul template. NIP dan MIP dikeringkan di udara pada suhu kamar dan digunakan untuk
percobaan.

5.3.3 Persiapan Permukaan Biosensing yang Difungsikan

Bahan pelapis MIP diimobilisasi pada area biosensing dari sensor interdigital menggunakan self-
assembled monolayer (SAM) dari resin akrilik. 1 g bubuk MIP, 200 l resin akrilik dan 1,5 ml aseton
dicampur bersama untuk membuat suspensi pelapis. Sensor dicelupkan ke dalam bahan pelapis dengan
kecepatan 200 mm/menit dan ditarik keluar dengan kecepatan yang sama untuk membuat lapisan
seragam. Gambar 5.5 adalah representasi ilustratif dari persiapan permukaan biosensing. Ini juga
menggambarkan prosedur deteksi molekul target menggunakan biosensor yang dikembangkan.

5.3.4 Persiapan Sampel CTx-I

Larutan stok 60 ppm CTx-I dibuat dengan mencampur 60 mg CTx-I dalam satu liter air deionisasi dan
disimpan dalam lemari es untuk digunakan lebih lanjut. Teknik pengenceran serial digunakan untuk
menyiapkan sampel dengan konsentrasi yang lebih rendah. Air suling dengan kadar CTx-I nol
diperlakukan sebagai kontrol.

5.3.5 Pengukuran Eksperimental

Teknik EIS digunakan untuk menyelidiki sifat dielektrik dari sampel uji pada konsentrasi yang
berbeda. Meskipun teknik pengukuran ini sangat kuat dan populer, teknik ini sangat sensitif terhadap
kelembaban dan suhu. Oleh karena itu, semua percobaan dilakukan di laboratorium terkontrol di bawah
tingkat kelembaban dan suhu yang sama. Sensor berlapis terhubung ke LCR
meter menggunakan konektor pin emas dan sinyal 10 Hz-100 kHz dengan amplitudo 1 V diterapkan pada
elektroda. Setelah pemipetan sampel uji (50 l) pada Area berlapis MIP, sensor disimpan pada pelat
pengocok selama 30 detik untuk memastikan dispersi sampel yang seragam. Kemudian, penundaan tujuh
menit diberikan untuk menangkap molekul CTx-I oleh MIP. Solusi ekstra kemudian dicuci menggunakan
air deionisasi. Akhirnya, pengukuran EIS dilakukan setelah lima menit, ketika permukaan pelapis
dikeringkan.

5.4 Hasil dan Diskusi

Antibodi buatan CTx-I disiapkan melalui teknik polimerisasi presipitasi, lebih disukai karena
kelebihannya seperti selektivitas tinggi, ketahanan dan stabilitas fisikokimia. Pada langkah pra-
polimerisasi, molekul template berinteraksi dengan monomer fungsional melalui pengikatan non-kovalen,
dan selama prosedur polimerisasi, mereka dicetak secara akurat dalam matriks polimer. Teknik non-
kovalen lebih umum karena mencakup lebih sedikit upaya untuk mengekstrak template dari matriks
polimer, sedangkan ikatan kovalen membutuhkan lebih banyak energi untuk menghilangkan template dari
polimer. Selain itu, MIP yang disintesis dapat digunakan segera setelah pelepasan template, sedangkan
MIP yang dibuat melalui polimerisasi massal perlu dihancurkan dan digiling sebelum digunakan.

5.6 Kesimpulan

Biosensor baru untuk pengenalan dan pengukuran CTx-I dengan menggabungkan teknologi EIS dan MIP
dijelaskan dalam bab ini. Percobaan dilakukan pada sampel serum nyata yang dikumpulkan dari darah
domba. Biosensor yang dikembangkan menunjukkan selektivitas yang baik dan kapasitas rebinding yang
cepat ke molekul target.
0,09 ng/ml adalah konsentrasi terendah yang dapat dideteksi oleh sensor yang diusulkan. Batas deteksi
(LOD) yang dicapai dengan menggunakan teknik standar ELISA adalah 0,02 ng/ml, yang tentunya lebih
kecil dari LOD yang diperoleh dari perangkat biosensing yang diusulkan. Namun demikian, pada titik ini,
harus dipertimbangkan bahwa perangkat yang disarankan menyediakan metode pemantauan CTx-I yang
lebih sederhana, lebih cepat, dan lebih hemat biaya. Selain itu, penggunaan situs pengenalan buatan
secara signifikan meningkatkan stabilitas sistem. Oleh karena itu, hasilnya menunjukkan potensi sistem
biosensing yang dikembangkan untuk digunakan sebagai perangkat Point-of-Care (PoC) untuk aplikasi
prognostik, dan dapat digunakan untuk penilaian keropos tulang yang mudah digunakan dan teratur.
Selain itu, dalam bab ini, dampak ketebalan lapisan pada sensitivitas sensor interdigital planar telah
dinilai, karena selektivitas dan sensitivitas adalah dua fitur terpenting dari sebuah sensor. Sensor telah
dilapisi dengan dua jenis bahan yang berbeda: pernis akrilik sebagai lapisan pelindung dan MIP sebagai
lapisan selektif. Fungsi sensor dilapisi dipelajari dengan menyelidiki sensitivitas sensor dengan ketebalan
lapisan yang berbeda. Sampel CTx-I dengan konsentrasi yang berbeda digunakan untuk penelitian ini.
Disimpulkan bahwa sensor berlapis MIP menunjukkan sensitivitas lebih dari yang dilapisi akrilik
untuk kuantifikasi CTx-I. Metode dip-coating digunakan untuk melapisi sensor. Pengaruh dua
parameter utama, kecepatan penarikan dan waktu perendaman, pada ketebalan lapisan pelapis dinilai.
Penyelidikan ini menunjukkan bahwa semakin cepat penarikan, semakin tebal lapisan pelapis. Selain itu,
ketebalan lapisan pelapis ditingkatkan dengan meningkatkan waktu pencelupan. Namun demikian, hasil
menunjukkan bahwa peningkatan ketebalan meningkatkan tingkat kejenuhan. Berdasarkan aplikasi, Anda
harus memiliki trade-off antara tingkat kejenuhan dan sensitivitas yang diperoleh dengan mengubah
ketebalan lapisan.

Bab 6
Sistem Berbasis Mikrokontroler yang Diaktifkan IoT

Abstrak Pada bab ini dibahas desain dan implementasi perangkat PoC berbasis mikrokontroler
berkemampuan IoT portabel. Perangkat ini mampu mengukur konsentrasi CTx-I dalam serum dan
mentransfer data ke server cloud berbasis IoT. Bab terakhir memberikan kesimpulan umum dari
pekerjaan penelitian dan prospek masa depan dari pekerjaan yang dilaporkan.

6.1 Pendahuluan

Pengujian Point-of-Care (PoC) adalah metode pengujian dekat-pasien yang berguna dalam deteksi
dini berbagai penyakit dengan memantau biomarker spesifik [1–3]. Tujuan utama dari pengujian
PoC adalah untuk mendapatkan hasil dengan cepat, sehingga terapi dapat segera dimulai. Dengan
cara ini, manajemen penyakit dapat ditingkatkan dengan pengurangan biaya.
Perangkat kecil, cepat, portabel, murah, dan mudah digunakan adalah alat yang paling tepat untuk
pengujian PoC, terutama untuk penggunaan rumah tangga [3–5].
Seperti yang dijelaskan dalam bab-bab sebelumnya, hampir semua teknik yang tersedia untuk
pengukuran CTx-I adalah metode berbasis ELISA. Meskipun perangkat berbasis ELISA dapat
diandalkan, sensitif, dan akurat, perangkat tersebut mahal dan memakan waktu. Selain itu, mereka
membutuhkan keahlian teknis untuk melakukan pengujian. Oleh karena itu, pengujian berbasis ELISA
tidak sesuai untuk pengujian PoC biasa. Sistem penginderaan berbiaya rendah, yang berpartisipasi dengan
prinsip ELISA dan memiliki respons yang cepat, sangat dibutuhkan.
Seperti yang dijelaskan dalam Bab. 2, selama beberapa tahun terakhir, beberapa penyelidikan pada desain
sistem penginderaan berbasis ELISA berbiaya rendah telah disajikan untuk pemantauan tingkat CTx-I [6-
8], di mana antibodi alami telah digunakan untuk menjebak analit target , CTx-I. Antibodi biologis
meningkatkan biaya total sistem biosensing dan mengurangi stabilitas sistem di lingkungan yang keras.
Mereka juga melibatkan persiapan sampel yang kompleks, yang meningkatkan waktu percobaan. Seperti
dijelaskan dalam bab sebelumnya, membuat situs pengenalan buatan menggunakan MIP dapat berguna
untuk mengatasi keterbatasan antibodi alami.
Sensor elektrokimia umumnya digunakan untuk mengembangkan perangkat portabel dan lab-on-
a-chip. Mereka telah memainkan peran penting dalam transisi dari perangkat laboratorium yang mahal
dan canggih ke perangkat yang mudah digunakan di rumah.
[9-12]. Biosensor elektrokimia telah banyak digunakan dalam berbagai aplikasi, terutama dalam
diagnostik klinis dan pemantauan lingkungan, karena biaya rendah, kemudahan penggunaan, portabilitas
dan keandalan [13-18]. Sistem penginderaan berkemampuan Internet of Things (IoT) membantu
mentransfer data terukur langsung ke server cloud.
Perangkat yang terhubung dengan IoT menawarkan berbagai aplikasi seperti rumah pintar, rumah sakit
pintar, pengelolaan limbah, industri pintar, dan kota pintar. Salah satu area aplikasi IoT yang paling
populer adalah aplikasi medis dan perawatan kesehatan seperti pemantauan kesehatan, pengukuran
prognostik, dan perawatan lansia untuk memberikan kehidupan yang lebih sehat. Perangkat pintar dan
layanan kesehatan berbasis IoT mengurangi biaya medis, meningkatkan kualitas hidup, dan memberikan
informasi awal kepada tenaga medis, yang dapat membantu mengurangi ancaman kehidupan [19]. Selain
itu, dapat membantu memberikan informasi kesehatan penting tanpa mobilitas pasien.
Tujuan dari pekerjaan ini adalah untuk merancang sistem penginderaan berkemampuan IoT
portabel untuk mengukur konsentrasi CTx-I dalam serum. Tujuannya adalah untuk
mengembangkan sistem pengujian PoC, yang dapat mengukur tingkat CTx-I dan mentransfer
hasilnya ke server cloud berbasis IoT. Data yang dikirimkan akan disimpan dan dikirim ke
penyedia layanan kesehatan untuk studi dan penyelidikan lebih lanjut. Seperti disebutkan dalam
bab sebelumnya, biosensor elektrokimia berkemampuan MIP dikembangkan untuk deteksi
kehilangan tulang, di mana penganalisis impedansi presisi tinggi digunakan untuk menentukan
sifat dielektrik material menggunakan metode EIS. Terlepas dari sensitivitas dan keandalan yang
tinggi, instrumen penganalisis impedansi mahal, besar dan tidak cocok untuk aplikasi domestik.
Dalam pekerjaan yang diusulkan, kami telah mengganti instrumen penganalisis impedansi yang
besar dan mahal dengan yang murah
(*100 USD) sistem genggam yang terhubung ke server cloud berbasis IoT menggunakan koneksi WiFi
terintegrasi.

6.4 Kesimpulan

Singkatnya, sistem penginderaan berbasis IoT diusulkan untuk pengujian PoC kehilangan tulang dengan
deteksi dan pengukuran biomarker CTx-I dalam serum. Perangkat PoC yang diusulkan mampu mengukur
konsentrasi molekul CTx-I serendah 0,9 ppb. Awalnya, penganalisis impedansi digunakan untuk menguji
perilaku biosensor menggunakan teknik EIS. Sistem berbasis mikrokontroler kemudian dikembangkan
untuk mengukur level CTx-I dan mengirimkan data ke server cloud berbasis IoT. Empat sampel serum
yang tidak diketahui yang dikumpulkan dari darah domba diuji dan validasi hasil dilakukan dengan
menggunakan kit ELISA. Hasilnya dalam kesepakatan yang baik, dengan kesalahan 3%.
Biosensor berkemampuan IoT yang dikembangkan menyediakan perangkat yang cepat, sederhana,
murah, dan portabel untuk pengukuran langsung CTx-I dalam serum. ELISA membutuhkan
setidaknya 3 jam untuk menyelesaikan prosedur pengujian, sedangkan perangkat PoC yang
dikembangkan hanya membutuhkan waktu 15 menit untuk menyelesaikan pengukuran. Sistem PoC dapat
digunakan oleh semua orang dengan pelatihan minimum, yang ideal untuk penilaian keropos tulang
secara teratur.
Ada kekurangan tertentu, yang akan menjadi bagian dari pekerjaan di masa depan. Sensitivitas
perangkat PoC perlu ditingkatkan untuk meningkatkan akurasi hasil. Penting juga untuk menyertakan
keamanan, karena sistem PoC berurusan dengan informasi pribadi. Latensi data, waktu transmisi, dan
keamanan data dapat diselidiki di masa mendatang.

7.1 Kesimpulan
Osteoporosis adalah masalah serius di seluruh dunia dan berkembang seiring dengan populasi yang
menua. Pengenalan dini keropos tulang sangat penting untuk mengelola penyakit secara efisien.
Mengamati penanda pergantian tulang dapat berguna dalam deteksi dini dan diagnosis kelainan tulang
dan menentukan pengobatan dan pengobatan. Pengeroposan tulang dapat diidentifikasi dan dipantau
dengan sering mengukur serum atau urin C-terminal telopeptida kolagen tipe 1 (CTx-1). Untuk
tujuan ini, perangkat titik perawatan yang cepat, portabel, dan berbiaya rendah sangat tepat.
Dalam karya ini, kami mengusulkan perangkat selektif, sensitif, cepat, dan murah berbasis IoT untuk
mendeteksi dan mengukur konsentrasi CTx-1 dalam serum. Sebuah sensor interdigital planar dilapisi
dengan antibodi buatan, disiapkan oleh teknologi pencetakan molekul. Situs pengenalan buatan disiapkan
untuk meningkatkan stabilitas sistem dan mengurangi total biaya. Teknik EIS digunakan untuk
mengevaluasi sifat resistif dan kapasitif dari larutan sampel. Sistem berbasis mikrokontroler dirancang
untuk mengukur konsentrasi CTx-1 dalam serum dan untuk mengirimkan data ke server cloud
berbasis IoT. Data dapat diberikan kepada praktisi kesehatan dan penyelidikan lebih lanjut dapat dimulai
untuk deteksi dini dan pengobatan penyakit. Sensor yang diusulkan merespons secara linier dalam a
kisaran 0,1-2,5 ppb, yang mencakup kisaran referensi normal CTx-1 dalam serum, dengan LOD 0,09 ppb.
Hasilnya menunjukkan bahwa porsi yang diusulkan
perangkat penginderaan meja dapat memberikan pendekatan yang cepat, sensitif dan selektif untuk
deteksi CTx-1 dalam serum. Sampel serum domba digunakan sebagai sampel yang tidak diketahui dan
diuji menggunakan perangkat PoC yang dikembangkan dan hasilnya divalidasi menggunakan kit ELISA.