LAPORAN PRAKTIKUM

BIOTEKNOLOGI FARMASI

“ISOLASI DNA DAN ANALISIS DNA

DENGAN ELEKTROFORESIS AGAROSA”

Nama : Charang Sukma Mulyana

NIM : 182210101140
Tgl Prak : Jum’at/ 3 April 2020
Shift / Kel : Cl / 1
Dosen : Dewi Dianasari Sari

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

BAGIAN BIOLOGI FARMASI FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2020
 DAFTAR ISI

1. TUJUAN PRAKTIKUM......................................................................................................1
1.1 Isolasi DNA Plasmid......................................................................................................1
1.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa................................................................1
2. TEORI DASAR...................................................................................................................1
2.1 Isolasi DNA Plasmid......................................................................................................1
2.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa................................................................2
3. ALAT DAN BAHAN..........................................................................................................3
3.1 Isolasi DNA Plasmid......................................................................................................3
3.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa................................................................3
4. PROSEDUR.........................................................................................................................4
4.1 Isolasi DNA Plasmid......................................................................................................4
4.2 Isolasi DNA dengan Elektroforesis Agarosa...................................................................6
4.2.1 Elektroforesis Agarosa............................................................................................6
4.2.2 Penentuan Ukuran DNA.........................................................................................7
5. SOAL LATIHAN.................................................................................................................8
5.1 Isolasi DNA Plasmid......................................................................................................8
5.2 Isolasi DNA dengan Elektroforesis Agarosa...................................................................9
6 HASIL PENGAMATAN...................................................................................................10
7 PEMBAHASAN................................................................................................................13
7.1 Isolasi DNA Plasmid....................................................................................................13
7.1.1 Kondisi Analisis...................................................................................................13
7.1.2 Fungsi Penambahan Setiap Bahan........................................................................13
7.1.3 Interpretasi............................................................................................................13
7.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Protein................................................................14
7.2.1 Pengertian Elektroforesis......................................................................................14
7.2.2 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kecepatan Migrasi Sampel...........................15
7.2.3 Gel yang Digunakan.............................................................................................16
7.2.4 Interpretasi Data...................................................................................................17
8. KESIMPULAN..................................................................................................................18
8.1 Isolasi DNA Plasmid....................................................................................................18
8.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa..............................................................18
9 SARAN..............................................................................................................................18
DAFTAR PUSTAKA................................................................................................................19
 BAB II
ISOLASI DNA PLASMID DAN ANALISIS DNA DENGAN
ELEKTROFORESIS AGAROSA

1. TUJUAN PRAKTIKUM
1.1 Isolasi DNA Plasmid
Mahasiswa mengetahui dan mampu mengisolasi plasmid rekombinan
pET ads dari bakteri Escherichia coli.
1.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa
a) Mahasiswa mampu menganalisis DNA plasmid menggunakan
elektroforesis Agarosa
b) Mahasiswa mampu menentukan ukuran DNA plasmid hasil restriksi

2. TEORI DASAR
2.1 Isolasi DNA Plasmid
Plasmid merupakan materi genetik ekstra kromosom yang memiliki
kemampuan untuk melakukan replikasi secara otonom. Ukuran plasmid sangat
bervariasi (1 kb-200 kb). Berbeda dengan DNA genom, DNA plasmid biasanya
berbentuk sirkuler dan terdapat bebas di dalam sitoplasma bakteri. Pada satu sel
bakteri dapat ditemukan lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat
bervariasi. Pada teknologi DNA rekombinan, plasmid digunakan sebagai vektor
untuk menyisipkan DNA yang diklon, sehingga perlu diperoleh plasmid yang
tidak terkontaminasi dengan komosom agar diperoleh produk yang diinginkan.
Prinsip isolasi plasmid dari komosom dan berbagai komponen sel lainnya
didasarkan pada ukuran dan sifat konformasi yang dimiliki. Plasmid memiliki
ukuran yang jauh lebih kecil dibandingkan kromosom (8% dari DNA komosom)
dan kenyataan bahwa kromosom di sel terikat dengan membran sel sehingga
dengan meletiskan sel dan sentrifugasi maka plasmid dapat dipisahkan dari
DNA kromosom.
Selain itu plasmid di dalam sel memiliki konformasi yang berbeda dengan
kromosom yaitu sirkular, covalently closed circular (ccc) dan linear dimana pada
kondisi basa (pH 12-12,5), kromosom akan terfragmentasi dan ter denaturasi
sedangkan plasmid ter denaturasi dan tidak terfragmentasi. Dengan penambahan
kalium asetat dan asam asetat sampai netral, DNA kromosom akan membentuk

1
 agregat, berupa gumpalan kusut bersama protein dan RNA. Sedangkan DNA
plasmid kembali renaturasi menjadi untai ganda yang terlarut. Dengan proses
sentrifugasi, agregat dan partikel yang tidak larut lainnya (protein dan RNA)
akan mengendap membentuk pelet, sedangkan DNA plasmid terlarut Secara
umum isolasi plasmid dari biakan bakteri dapat dibagi dalam 3 tahap yaitu (1)
pembiakan bakteri, (2) pemanenan dan lisis sel bakteri, dan (3) pemurnian
plasmid DNA.
Pembiakan bakteri dilakukan dengan mengambil 1 koloni bakteri dan
ditanam pada media padat selama 18 jam kemudian dilakukan sub kultur ke
dalam media cair hingga diperoleh bakteri yang cukup banyak untuk dipanen.
Proses lisis dapat dilakukan secara fisik, sel dipecah dengan kekuatan mekanik
atau dengan metode kimia, sel diperlakukan dengan penambahan senyawa
kimia. Dengan metode kimia sel bakteri dipecah pada suasana basa (pH 12-12,5)
untuk mendapatkan plasmid yang tidak terfragmentasi dan dapat larut kembali
dengan penambahan asam (kalium asetat). Pemurnian DNA plasmid dapat
dilakukan dengan ekstraksi dengan pelarut organik (campuran fenol: kloroform
dan isoamil alkohol) atau dengan metode kolom.

2.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa

Keberadaan DNA plasmid hasil isolasi dapat dianalisis menggunakan
elektroforesis, sedangkan kadar DNA plasmid dengan menggunakan
spektrofotometri. Elektroforesis adalah suatu cara untuk memisahkan fraksi-
fraksi suatu zat berdasarkan migrasinya di bawah pengaruh medan listrik.
Migrasi partikel bermuatan tersebut dapat terjadi karena perbedaan ukuran,
muatan, atau sifat kimia molekul. Penggunaan arus listrik pada elektroforesis
mengakibatkan terjadinya panas yang selanjutnya dapat menyebabkan
terjadinya difusi molekul yang akan dipisahkan. Difusi molekul yang akan
dipisahkan dapat dicegah dengan menggunakan matriks penyangga. Ada dua
macam matriks penyangga yang umum digunakan dalam elektroforesis yaitu
pati (agarosa) dan poliakrilamid.
Agarosa merupakan polimer D galaktosa dan 2,4 anhidro L galaktosa
yang diisolasi dari ganggang laut. Gel Agarosa untuk elektroforesis dibuat
dengan melelehkan agarosa konsentrasi tertentu dalam buffer dan didinginkan.
Banyaknya agarosa yang digunakan menentukan kerapatan gel tersebut.

2
 Konsentrasi agarosa yang digunakan berbanding terbalik dengan ukuran DNA
atau bentuk struktur DNA (linear, sirkuler). Semakin pendek ukuran DNA nya
maka konsentrasi gel semakin tinggi. Struktur DNA sirkuler lebih ringan
dibanding DNA linear. Molekul DNA (bermuatan negatif) akan bergerak ke
arah anoda saat diberi medan magnet pada kedua ujung gel. Ukuran DNA,
konformasi DNA, konsentrasi agarosa, dan besarnya tegangan yang digunakan
sangat menentukan kecepatan migrasi molekul DNA, DNA dengan ukuran
yang besar akan berjalan lebih lambat di dalam pori-pori gel agarosa.
Keberadaan DNA dalam gel agarosa dapat dideteksi menggunakan senyawa
berflouresensi, misalnya etidium bromida, akridin oranye, propidium iodide,
SYBR Safe.
Senyawa etidium bromida) akridin oranye, propldlum lodide merupakan
karsinogen yang perlu penanganan hati-hati. Senyawa-senyawa tersebut mampu
berinterkalasi di antara untai DNA, saat diberi sinar UV 254 nm, DNA akan
mengabsorbsi sinar dan ditransmisikan pada senyawa pewarna DNA.
Sedangkan radiasi pada 302 dan 366 nm akan diserap oleh senyawa pewarna
DNA, Pada kedua keadaan ini, energi dipancarkan pada 590 nm pada daerah
jingga- merah.

3. ALAT DAN BAHAN

3.1 Isolasi DNA Plasmid
 Alat : shaker incubator 37 °C, UV transilluminator, mikropipet, ose bulat,
sentrifus, tabung mikrosentrifus 1,5 ml, tip biru (1 ml), tip kuning (100 μl ),
tip putih (10 μl ¿
 Bahan : Bakteri Eschericia coli PET 32b) Medium Luria Bertani,
ampisilin, solution (150 mM glukosa, 25 mM Tris Cl pH 8, 10 mM EDTA
pH 8) solution I(0,2 N NaOH, 1% SDS (dibuat baru), solution III (60 mL
5M potasium asetat, 11,5 ml asam asetat glasial, 28,5 mt akuades), PCI
(phenol/chloroform/isoamilalkohol), bufer TE, etanol pa, Na asetat.
3.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa
 Alat : neraca analitik, erlenmeyer, microwave, mikropipet dan mikrotip,
tabung mikrosentrifus, cetakan gel, mesin elektroforesis, UV
transilluminator

3
  Bahan : loading dye, ekstrak DNA, DNA ladder 1 kb sebagai marker,
agarose, TBE 1 x (tris boric EDTA), SYBR Safe

4. PROSEDUR
4.1 Isolasi DNA Plasmid
4.1.1 Pembiakan dan Pemanenan Bakteri

Koloni tunggal bakteri E, coli pET 30b diambil dari media LB padat
dibiakan dalam 5 ml media LB cair yang telah diberi kanamisin (konsentrasi
akhir 25 ug/mL) dan inkubasi selama 18 jam suhu 37 °C dalam inkubator
goyang dengan kecepatan 150 rpm.

Sebanyak 1,5 mi biakan bakteri dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifus

1,5 ml, dan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm,
supernatan dibuang dengan membalikkan tabung dan diletakkan di atas
kertas tisu dengan posisi terbalik

Prosedur diatas diulangi 2 kali hingga 4,5 ml biakan bakteri yang

disentrifugasi, untuk mendapatkan pelet sel bakteri.

4.1.2 Isolasi Plasmid

Pelet sel diresuspensi dengan 100 ul solution I dengan cara memipet naik
turun beberapa kali hingga benar-benar tersuspensi (jika perlu dengan
voteks)

Solution II (fress solution/rp) ditambahkan sebanyak 200 jil, dihomogenkan

dengan cara membolak-balikan tube secara perlahan selama 6-8 kali,
kemudian didiamkan selama S menit hingga lisat jernih. JANGAN
DIVORTEX Stacking gel) 4
Solution III sebanyak 150 ul dihomogenkan dengan cara membolak-balikkan
tube secara perlahan (6-8 kali). JANGAN DIVORTEX, simpan dalam es
selama 5 menit

Campuran disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit 4 °C. Ulangi

sentrifugasi jika supernatant tidak jernih

Supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifus baru (Hati-hati jangan

sampai ada endapan yang terikut)

Tambahkan PCI sama banyak dengan volume supernatan, kemudian

divoteks 3 menit dan disentrifugasi 12.000 rpm selama 10 menit

Lapisan atas diambil dimasukkan pada tabung mikrosentrifus baru dan

ditambahkan etanol pa dan 3M Na asetat dengan perbandingan (2,5:0,1) dari
volume supernatan. Diamkan pada frezer (-20 °C) selama 1 jam untuk
mempresipitasi plasmid

Setelah 1 jam presipitasi, tabung mikrosentrifus disentrifugasi 12.000 rpm, 1

menit suhu 4 °C

Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% kemudian

disentrifus kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu
4 °C

5
 Pelet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 uL bufer TE dan disimpan pada
suhu 4 °C untuk analisis selanjutnya

4.2 Isolasi DNA dengan Elektroforesis Agarosa

4.2.1 Elektroforesis Agarosa

Agarosa ditimbang 0,4 g dan dilarutkan dalam 40 ml buffer TBE 1x dengan

cara pemanasan sampai semua agarosa larut sehingga diperoleh gel agarosa 1
%, kemudian tambahakan 1 ul SYBR Safe. Larutan didiamkan hingga suhu t
60°C

Cetakan/tray agarosa disiapkan dengan menutup sisi berlubang cetakan

dengan selotip dan menempatkan sisir elektroforesis untuk membentuk
sumur

. Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan dan diblarkan hingga memadat

Setelah gel memadat, penutup cetakan dan sisir dilepaskan, kemudian

cetakan ditempatkan dalam tangki elektroforesis yang berisi buffer TBE 1x

Sampel 5 ul hasil isolasi (DNA genom/DNA plasmid) yang telah dicampur

dengan 2 ul loading buffer (6x) dimasukan ke dalam salah satu sumur dan 6
ul marka DNA 1 kb ke dalam sumur lainnya

Elektroforesis dijalankan pada 80 V, 400 mA selama 60 menit

Gel hasil elekroforesis diamati di bawah sinar UV

6
 4.2.2 Penentuan Ukuran DNA

Dibuat garis regresi antara log BM DNA (X) dengan Jarak migrasi (y)

Jarak migrasi DNA yang akan ditentukan diukur dan diinterpolasikan

kedalam garis regresi yang telah dibuat sehingga dapat diketahui nilai Log
BM dari DNA tersebut

5. SOAL LATIHAN
5.1 Isolasi DNA Plasmid
1) Bagaimana cara mengisolasi DNA plasmid?
Jawab :
Cara Isolasi DNA Plasmid dibai dalam 3 tahap yaitu
a) Pembiakan Bakteri
b) Pemanenan dan Lisis Sel Bakteri
c) Pemurnian Plasmid DNA

2) Bagimana cara memisahkan DNA plasmid dari DNA kromosom?

Jawab :
Dengan cara melisiskan sel dan disentrifugasi maka plasmid dapat
dipisahkan dari DNA Kromosom.

3) Sebutkan fungsi PCI ?

Jawab :
FungsiPCl yaitu memurnikan DNA dengan memotong komponen
pengotornya serta memisahkan kandungan lipid, protein dan DNA.

4) Sebutkan fungsi Solution I, Il dan III!

Jawab :
a) Solution I : Untuk melindungi sel agar tidak lisis dan mengiaktivasi
enzim DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang
diisolasi dan menjaga tekanan osmotik sel.

7
 b) Solution II :Untuk memisahkan DNA Plasmid dari DNA Kromo-
somal dan mendenaturasi protein yang akan di lisis
dengan jalan memutuskan ikatan-ikatan non kovalen
(terutama ikatan hidrogen) pada protein, sehingga
kembali ke struktur primernya sebagai rantai linear
polipeptida.
c) Solution III : Untuk menetralkan suasana basa yang diciptakan oleh
ion hidroksida dari NaOH yang diberikan pada tahap
lisis sebelumnya.

5.2 Isolasi DNA dengan Elektroforesis Agarosa

1) Apakah yang dimaksud dengan elektroforesis?
Jawab :
Elektroforesis ialah proses migrasi molekul bermuatan dalam medium
yang dialiri arus listrik (Hartati, 2007). Menurut Russel (1994), bahwa prinsip
dasar elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke
arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan
listrik. Prinsip kerja dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik
ditempatkan pada medium bertenaga listrik. Molekul-molekul akan bermigrasi
menuju kutub positif atau negatif berdasarkan muatan yang terdapat didalamnya.
Molekul didalam DNA bermuatan negatif, molekul tersebut akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (Magdeldin, 2012).
2) Sebutkan matriks untuk pemisahan DNA menggunakan elektroforesis!
Jawab :
 Pati (Agarosa)
 Pati Akrilamid
3) Bagaimana cara mengamati DNA plasmid menggunakan elektroforesis agarosa?
Jawab :
Keberadaan DNA dalam gel agarosa dapat dideteksi menggunakan
senyawa berfluoresensi, etidium bromida dan senyawa EtBr yang merupakan
bahan karsinogen sehingga perlu penanganan dengan sangat hati-hati. EtBr
mampu berinteraksi diantara untai DNA. Saat diberi sinar UV 254 nm, DNA
akan mengabsorbsi sinar dan ditransmisikan pada EtBr. Sedangkan radiasi paa

8
 302 dan 366 nm akan diserap oleh EtBr. Pada keadaan ini, energi dipancarkan
pada 590 nm pada aerah jingga merah.

6 HASIL PENGAMATAN

DATA HASIL ELEKTROFORESIS

1. Berikut hasil Elektroforesis Agarosa dari DNA plasmid yang diisolasi dari 4
koloni transforman bakteri yang berbeda dan DNA Genom/kromosom yang
diisolasi dari bakteri X.
Berdasarkan gambar tersebut apa yang bisa kalian simpulkan?

1. Plsmid dari
transforman 1
2. Plasmid dar
transforman 2
3. DNA Kromosom
4. Plasmid dari
transforman 3
M : Marka DNA 1 Kb

9
 Pada hasil elektroforesis di atas, plasmid dari transforman 1, transforman
2, transforman 3, dan transforman 4 memiliki pita dengan ketebalan yang
berbeda, ada yang tebal dan ada yang tipis. Perbedaan hasil pada masing-
masing sampel tergantung pada banyaknya konsentrasi DNA yang terekstraksi.
Irmawati (2003) menyatakan bahwa pita DNA yang tebal dan mengumpul
menunjukkan konsentrasi yang tinggi dan DNA total yang diekstrak dalam
kondisi utuh. Sedangkan pita yang terlihat menyebar menunjukkan adanya
ikatan antarmolekul DNA yang terputus pada saat proses ekstraksi
berlangsung, sehingga genom DNA terpotong menjadi bagian-bagian yang
lebih kecil. Terputusnya ikatan antarmolekul tersebut dapat disebabkan oleh
adanya gerakan fisik yang berlebihan yang dpat terjadi dalam proses
pemipetan, pada saat dibolak-balikkan, disentrifus, atau bahkan karena
temperature yang terlalu tinggi dank arena aktivitas bahan-bahan kimia
tertentu. Plasmid dari transforman 2 dan transforman 4 memiliki hubungan
kekerabatan yang sangat dekat dapat dilihat dari pita DNA yang sama.

2. Berikut Elektroforegram plasmid yang direstriksi dengan enzim restriksi

tertentu. Tentukan ukuran dari pita a, b dan c dalam pb (pasangan basa)

M Marka DNA 1 Kb

1. Plasmid utuh
2. Plasmid diporong
dengan enzim
restriksi MluI
3. Plasmid dipotong dg
enzim retriksi NdeI
dan XhoI
4. Plasmid dipotong
dengan enzim XhoI

Jarak
Pb Log pb (x) Migrasi
marka (y)
Pita 1 : 10000 4 1.5

10
 Pita 2 : 8000 3.903 1.65
Pita 3 : 6000 3.778 1.9
Pita 4 : 5000 3.699 2
Pita 5 : 4000 3.602 2.2
Pita 6 : 3000 3.477 2.45
Pita 7 : 2600 3.415 2.65
Pita 8 : 2000 3.301 3
Pita 9 : 1600 3.204 3.45
Pita 10 : 1000 3 4.1
Pita 11 : 750 2.875 4.6

Persamaan regresi y = - 2.748x + 12.238

r = - 0.984

a. Panjang pita A
Jarak marka A = 2.2 cm
y = - 2.748x + 12.238
2.2 = - 2.748x + 12.238
x = 3.652
Antilog x = 4487.433 bp

b. Panjang pita B
Jarak marka B = 3.45 cm
y = - 2.748x + 12.238
3.45 = - 2.748x + 12.238
x = 3.198
Antilog x = 1577.61 bp

c. Panjang pita C
Jarak marka C = 1.7 cm
y = - 2.748x + 12.238
1.7 = - 2.748x + 12.238
x = 3.835
Antilog x = 6839.12 bp

11
 Kesimpulan dari perhitungan di atas adalah panjang pita A = 4487.433 bp,
panjang pita B = 1577.61 bp, dan panjang pita C = 6839.12 bp

7 PEMBAHASAN
7.1 Isolasi DNA Plasmid
7.1.1 Kondisi Analisis
 Analit : Bakteri E-coli
 Kecepatan sentrifus : 1200 rpm , 40C
 pH : < 12,50C
 Metode : Alkali Lisis
7.1.2 Fungsi Penambahan Setiap Bahan
a) EDTA : Sebagai kofaktor yang esensial bagi aktiitas Dnase
dalam memecah molekul DNA
b) Tris HCl : Sebagai buffer Penjaga pH
c) SDS : Mendenaturasi protein yang ada dalam lisis, dengan
jalan memutuskan ikatan ikatan non kovalen sehingga
kembali pada struktur primernya sebagai rantai linear
polipeptida
d) NaOh : Pemisahan DNA Plasmid dari DNA Kromosomal
e) PCl :Pemurnian DNA dengan memotong komponen pengotor-
nya, selain itu memisahkan kandungan lipid, protein dan

12
 DNA.
7.1.3 Interpretasi
Prinsip isolasi DNA plasmid dari kromosom dan berbagi
komponen sel lainnya didasarkan pada ukuran dan sifat konformasi
yang dimiliki. Plasmid punya ukuran yang jauh lebih kecil
dibandingkan kromosom. Selain itu plasmid di dalam sel memiliki
konformasi yang berbeda dari kromosom.. pada kondisi basa.
Kromosom akan terfragmentasi dan terdenaturasi, sedangkan plasmid
hanya terfragmentasi dan tidak terdenaturasi. Penambahan kalium
asetat dan asam asetat sampai kondisi netral akan membuat DNA
plasmid kembali menjadi untai ganda. Proses sentrifugasi akan
menyebabkan pengotor yang menjadi agregat terpisah dari DNA
plasmid yang terlarut. Proses isolasi plasmid pertama kali dilakukan
proses sentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 12.000 rpm,
dimana proses ini berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat lain yang
terdapat dalam sel. Hasil sentrifugasi akan menghasilkan 2 fraksi yang
terpisah yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian
bawah. Setelah supernatant diambil dari pelet sel maka ditambah
solution I yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion
Mg+ yaitu kofaktor yang diperlukan untuk aktivitas berbagai enzim
nuklease. Proses ini bertujuan untuk melisis sel bakteri, memutuskan
ikatan-ikatan peptida dan protein-protein sel bakteri tertentu. Lalu
campuran tersebut divortex untuk memutuskan ikatan peptida semakin
cepat. Solution II yang mengandung SDS berfungsi untuk
pendenaturasi protein agar berbentuk lurus dan bermuatan negatif pada
proses elektroforesis gel. Penambahan PCP (yang berisi kloroform)
berfungsi untuk mendenaturasi protein sehingga dihasilkan 2 lapisan
yang berbeda. Solution III pada praktikum ini berfungsi menetralisasi
pH dan menghentikan proses denaturasi DNA kromosomal sehingga
terbentuk respirat DNA kromosom. Hasil dari proses diatas adalah
plasmid yang mulanya terlarut pada solution III kemudian dipresipitasi
dengan etanol pa dan 3M Na Asetat dan disentrifus beberapa kali, maka
akan terbentuk pellet plasmid yang digunakan untuk analisis
selanjutnya.

13
7.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Protein
7.2.1 Pengertian Elektroforesis
Elektroforesis ialah proses migrasi molekul bermuatan dalam
medium yang dialiri arus listrik (Hartati, 2007). Menurut Russel (1994),
bahwa prinsip dasar elektroforesis adalah molekul dan partikel
bermuatan akan bergerak ke arah elektrode yang memiliki muatan
berlawanan di bawah pengaruh medan listrik. Laju migrasi molekul
bermuatan tersebut menuju elektrode yang bermuatan negatif disebut
elektromobilitas. Prinsip kerja dimulai saat makromolekul yang
bermuatan listrik ditempatkan pada medium bertenaga listrik. Molekul-
molekul akan bermigrasi menuju kutub positif atau negatif berdasarkan
muatan yang terdapat didalamnya. Molekul didalam DNA bermuatan
negatif, molekul tersebut akan bermigrasi melalui matriks gel menuju
kutub positif (Magdeldin, 2012).

7.2.2 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Kecepatan Migrasi Sampel

Sulaiman (2007) mengemukakan beberapa faktor yang
mempengaruhi migration rate elektroforesis selama DNA bergerak
menembus gel agarose, yaitu sebagai berikut:
1. Ukuran molekul DNA
Molekul yang lebih besar akan bergerak lebih lambat, missal DNA
linier lebih cepat dibanding DNA sirkuler. Jarak migrasi molekul DNA
pada gel adalah laju terbalik proporsional log-10 dari jumlah pasangan
basa.
2. Konsentrasi gel agarose
Fragmen DNA yang bervariasi ukuran molekulnya akan berberak
sesuai dengan konsentrasi dari gel agarose yang digunakan. Rumusnya
adalah: log=log-KrT dimana  adalah free electrophoresis
mobility, Kr adalah retardation coefficient, dan T adalah gel
konsentrasi serta  adalahelectrophoretic mobility DNA.
14
3. Konformasi DNA
Laju migrasi juga tergantung pada bentuk atau konformasi DNA,
kita tahu bahwa ada 3 macam bentuk DNA yaitu super-helix circular
(I), circular-opened (II), dan linier (III). Meskipun ketiga bentuk itu
mempunyai berat yang sama tetapi laju migrasi pada gel elektroforesis
berbeda. Perbedaan laju migrasi ini karena:
 konsentrasi gel agarose
 kekuatan arus listrik dan ionik buffer yang digunakan
 densitas kembaran superheliks pada bentuk I
 pada beberapa kondisi bentuk I lebih cepat dibanding bentuk III
 tergantung kenaikan kuantitas EtBr: konsentrasi EtBr meningkat,
pengikatan DNA meningkat pula sehingga mobilitas meningkat
tajam, contoh untuk bentuk I
 konsentrasi EtBr kritis antara 0.1g/ml-0.5l/mg
4. Penggunaan Voltage dan arah dari bidang elektris
Voltage rendah menyebabkan laju migrasi DNA linier proporsional.
A  2kb pada gel agarose bergerak  5v/cm. Arah dari bidang elektris
konstans untuk DNA 50-100kb bergerak dengan laju yang sama, akan
berubah secara periodik sesuai kecepatan pergerakan DNA akan
berubah juga.
5. Komposisi basa DNA atau temperatur
Baik komposisi basa maupun temperature tidak begitu berpengaruh,
mobilitas DNA stabil pada suhu 4-30C dan elektroforesis gel agarose
dilakukan pada suhu kamar.
6. Keberadaan pewarna DNA
Iintercalating agent Ethidium Bromide (EtBr) adalah pewarna
fluoresence untuk deteksi asam nukleat, EtBr ini akan mengikat pada
sela-sela pasangan basa DNA. EtBr dapat mengurangi mobilitas DNA
linier sampai 15%. Hanya sedikit DNA 1ng dapat dideteksi secara
langsung dengan cara gel diletakkan pada media UV-transilluminator.
EtBr dapat digunakan untuk mendeteksi single atau double-stranded
asam nukleat (DNA atau RNA).
7. Komposisi buffer elektroforesis

15
 Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut
yang digunakan untuk pembuatan gel agarose. Misal:
• Tris-acetate; umum dipakai untuk preparatif, kemampuannya
paling rendah, tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose
baik elektroelusi maupun gel ekstraksi.
• Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali
DNA dari agarose kurang efektif, karena ada interaksi dengan
agarose.

7.2.3 Gel yang Digunakan

Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Dengan gel
agarosa dapat dilakukan pemisahan sampel DNA dengan ukuran dari
beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (pb). Molekul DNA
bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi
melalui matriks gel menuju kutub positif (anode).Makin besar ukuran
molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu
fragmen DNA dapat diperkirakan dengan membandingkan laju
migrasinya dengan laju migrasi fragmen- fragmen molekul DNA
strandar (marker) yang telah diketahui ukurannya. Visualisasi DNA
selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah
terlebih dulu gel direndam di dalam larutan etidium bromide.

7.2.4 Interpretasi Data

Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya.
Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan
membandingkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen- fragmen
molekul DNA standar (marker) yang telah diketahui ukurannya.
Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh persamaan regresi y = -
2.748x + 12.238 dan r = - 0.984 . Sehingga didapatkan panjang pita A
= 4487.433 bp, panjang pita B = 1577.61 bp, dan panjang pita C =
6839.12 bp. Dari data sampel, sampel dengan ukuran pita terkecil
mampu mencapai jarak migrasi terjauh. Didapatkan pita terkecil yaitu
1577.61 bp dan pita terbesar yaitu 6839.12 bp. Pada data sampel, jarak
migrasi terjauh dicapai oleh pita B dengan jarak 3,45 cm dan jarak

16
 migrasi terdekat dicapai oleh pita C dengan jarak 1,7 cm. Dapat
disimpulkan bahwa semakin kecil ukuran sampel, maka jarak tempuh
migrasi smakin jauh.

8. KESIMPULAN
8.1 Isolasi DNA Plasmid
Prinsip isolasi DNA plasmid dari kromosom dan berbagi komponen sel
lainnya didasarkan pada ukuran dan sifat konformasi yang dimiliki. Hasil
dari proses diatas adalah plasmid yang mulanya terlarut pada solution III
kemudian dipresipitasi dengan etanol pa dan 3M Na Asetat dan disentrifus
beberapa kali, maka akan terbentuk pellet plasmid yang digunakan untuk
analisis selanjutnya.
8.2 Analisis DNA dengan Elektroforesis Agarosa
Elektroforesis ialah proses migrasi molekul bermuatan dalam medium
yang dialiri arus listrik (Hartati, 2007). Menurut Russel (1994), bahwa prinsip

17
 dasar elektroforesis adalah molekul dan partikel bermuatan akan bergerak ke
arah elektrode yang memiliki muatan berlawanan di bawah pengaruh medan
listrik. Berdasarkan data pada sampel, jarak migrasi terjauh dicapai oleh pita
B dengan jarak 3,45 cm dan jarak migrasi terdekat dicapai oleh pita C dengan
jarak 1,7 cm. Dapat disimpulkan bahwa semakin kecil ukuran sampel, maka
jarak tempuh migrasi smakin jauh.

9 SARAN
 Kepada praktikan agar saat melakukan praktikum menggunakan standar
keselamatan laboratorium seperti handscoon, masker, dan baju lab untuk
menghindari zat yang bersifat karsinogenik.
 Kepada praktikan untuk memiliki ketelitian dan kemampuan penggunaan alat
yang tinggi sehingga hasil yang diperoleh sesuai dan menghindari pecah nya
alat yang digunakan.

DAFTAR PUSTAKA

Calladine, C.R. Horace RD., Ben FL, Andrew A.T. 2004. Understanding DNA.
Amsterdam: Academic Press

Corkill, G., R. Rapley. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and
Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook Second Edition. Ed: Walker,
J.M., Rapley, R. Humana Press, NJ, USA
Girindra, A. (1993). Biokimia. Penerbit Gramedia Pustaka Utama.

18
Hermanto S. et all. (2015). Aplikasi Metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate
Poly Acrylamide Gel Electrophoresis) untuk Mengidentifikasi Sumber Asal
Gelatin pada Kapsul Keras. Jurnal Kimia Valensi: Jurnal Penelitian dan
Pengembangan Ilmu Kimia, 1,(1), Hal. 26-32

Hartati., 2007. Penuntun Praktikum Genetika. Makassar: Jurusan Biologi FMIPA

UNM.

Magdeldin, Sameh. 2012. Get Electrophoresis. Principles and Basics. Rijeka, Croatia:
InTech Publisher.

Promega Corp. 2011. How Does The Stacking Gel Increase Resolution During
SDSPAGE? [Internet]. [di unduh pada 9 Juni 2016]. Tersedia pada:
http://www.promega.com/enotes/faqspeak/0507/fq0043.

Russell, P.J. 1994. Fundamentals of genetics. New York: Harper Collins College
Publishers.

Saputra FR. 2014. Aplikasi metode SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate

Polyacrylamide Gel Elektrophoresis) untuk mengindentifikasi sumber gelatin
pada kapsul keras [Skripsi]. Jakarta (ID): UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Sulaiman,Hardi, A., Kundari, N.A., 2007.Pemisahan dan Karakterisasi Spesi Senyawa

Kompleks YTRIUM-90 DAN STRONSIUM-90 dengan Elektroforesis Kertas.
JFN, Vol.1 No.2.Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka – BATAN

Suryani, Yoni dkk. 2007.Petunjuk Praktikum Biologi Sel dan Molekular.Yogyakarta:

UNY Press

19