MAKALAH

SENTRIFUGASI GRADIEN DENSITAS STRUKTUR BROMIDA,

SESIUM KLORIDA,AMPLIFIKASI PLASMID

(Tugas Kelompok Matakuliah Bioteknologi)

KELOMPOK 12

1. Sintia Ningsih 1713023021

2. Dian Larasati Kartika 1713023023
3. Yogi Subagja 1713023037
4. Salma Nurlia Putri 1613023009

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2020
 PEMBAHASAN

1. Sentrifugasi

Campuran dapat tersusun atas beberapa unsur ataupun senyawa. komponen –

komponen penyusun suatu campuran tersebut dapat dipisahkan berdasarkan
sifat fisika zat penyusunnya. Salah satu metode yang digunakan dalam
pemisahan campuran adalah sentrifugasi. Sentrifugasi ialah proses pemisahan
partikel berdasarkan berat partikel tersebut terhadap densitas layangnya
(bouyant density). Dengan adanya gaya sentrifugal maka akan terjadi
perubahan berat partikel dari keadaan normal pada 1 xg (sekitar 9,8 m/s2)
menjadi meningkat seiring dengan kecepatan serta sudut kemiringan
perputaran partikel tersebut terhadap
sumbunya.

Matthew Meselson, Franklin Stahl, dan Jerome Vinograd, mengembangkan

cesium chloride, atau CsCl, sentrifugasi gradien densitas pada 1950-an di
California Institute of Technology , atau Caltech, di Pasadena, California.
Sentrifugasi gradien densitas memungkinkan para ilmuwan untuk
memisahkan zat berdasarkan ukuran, bentuk, dan kepadatan. Meselson dan
Stahl menemukan jenis spesifik dari sentrifugasi gradien densitas, yang
disebut sentrifugasi isopycnic yang menggunakan larutan cesium klorida
untuk memisahkan molekul DNA berdasarkan kepadatan saja. Ketika
Meselson dan Stahl mengembangkan teknik ini pada pertengahan 1950-an,
para ilmuwan tidak memiliki cara lain untuk memisahkan makromolekul
dengan ukuran yang sama tetapi bervariasi dalam kepadatan. Meselson dan
Stahl menggunakan metode mereka untuk menentukan bagaimana DNA
bereplikasi, dikenal sebagai percobaan Meselson-Stahl. Sentrifugasi gradien
densitas menggunakan garam cesium memungkinkan para ilmuwan untuk
mengisolasi DNA dan makromolekul lainnya hanya dengan kepadatan.
Sentrifugasi gradien densitas memerlukan penggunaan centrifuge, sebuah
instrumen yang memutar campuran dalam rotor untuk berkonsentrasi atau

2
memisahkan bahan. Pemintalan menyebabkan larutan sampel dalam wadah
berbentuk tabung atau botol mengalami gaya sentrifugal yang mendorong
sampel menjauh dari pusat rotor ke bagian bawah tabung. Gaya sentrifugal
menyebabkan komponen campuran terpisah oleh ukuran karena komponen
yang lebih besar mengalami gaya sentrifugal yang lebih besar daripada
komponen yang lebih kecil. Jadi, gaya sentrifugal mendorong komponen
yang lebih besar dari campuran lebih jauh dari rotor dan lebih dekat ke bagian
bawah tabung.
Sementara banyak prosedur laboratorium menggunakan sentrifugal
konvensional, sentrifugasi gradien densitas memerlukan jenis centrifuge
khusus yang disebut ultrasentrifuge analitik atau ultrasentrifuge. Theodor
Svedberg di Universitas Uppsala di Uppsala, Swedia menemukan sentrifugal
analitik pada pertengahan 1920-an, yang berkontribusi padanya
memenangkan Hadiah Nobel Kimia pada tahun 1926. Ultrasentrifugal
analitik dapat memutar sampel sekitar lima kali lebih cepat daripada
sentrifugal standar. Semakin cepat centrifuge berputar, semakin banyak gaya
yang diberikan pada sampel. Peningkatan gaya tidak hanya memberikan
pemisahan yang lebih jelas dengan mengkondensasi komponen campuran,
dan menyebabkan solusi membentuk gradien densitas selama sentrifugasi.
Definisi kerapatan adalah jumlah materi per satuan volume suatu zat. Zat
padat memiliki lebih banyak zat dalam ruang yang diberikan daripada zat
dansa kurang. Selama sentrifugasi, gradien densitas terbentuk dalam larutan
ketika densitas larutan tersebut secara bertahap meningkat bergerak lebih jauh
dari rotor centrifuge. Selain membentuk gradien kepadatan dan zat pemisah,
banyak ultrasentrifugal analitis memungkinkan para ilmuwan untuk
menganalisis sampel mereka selama proses sentrifugasi. Ketika melakukan
sentrifugasi gradien densitas, peneliti menggunakan kemampuan untuk
mengamati sampel mereka selama sentrifugasi dan untuk melihat urutan
komponen-komponen sampel mereka terpisah dari waktu ke waktu.
Para ilmuwan mulai memahami struktur DNA dan tahu bahwa gen dibuat dari
DNA ketika Meselson dan Stahl melakukan penelitian DNA mereka. Namun,
para ilmuwan tidak mengerti bagaimana DNA menyalin dirinya sendiri untuk

3
mewariskan sifat-sifat bawaan yang tersimpan dalam DNA. Meselson dan
Stahl menciptakan metode sentrifugasi gradien densitas untuk mempelajari
DNA dengan lebih baik. Pada tahun 1953, James Watson dan Francis Crick ,
dua ilmuwan di University of Cambridge di Cambridge, Inggris,
mengusulkan suatu mekanisme di mana DNA mereplikasi dirinya sendiri.
Replikasi diri dari DNA itu menjelaskan bagaimana molekul bisa meneruskan
informasi genetiknya. Sepanjang pertengahan 1950-an, para ilmuwan
mengusulkan mekanisme berbeda untuk menjelaskan fenomena replikasi diri
yang sama. Meselson dan Stahl menggunakan sentrifugasi gradien densitas
untuk menganalisis DNA selama replikasi dan menguji mekanisme replikasi
yang berbeda.

Metode sentrifugasi gradien densitas yang dikembangkan oleh Meselson dan

Stahl memisahkan DNA berdasarkan kepadatan saja. Meselson dan Stahl, dua
rekan postdoctoral di Caltech, berhipotesis bahwa mereka dapat menandai
DNA saat direplikasi dan kemudian melacak tag tersebut melalui banyak
siklus replikasi untuk melihat apa peran yang dimainkan oleh molekul DNA
asli dalam replikasi. Para peneliti menyarankan menandai DNA asli dengan
unsur-unsur berat yang tidak akan secara signifikan mengubah sifat kimia
DNA. Sementara unsur-unsur berat akan meningkatkan berat DNA, mereka
tidak akan meningkatkan ukuran molekul, sehingga hanya meningkatkan
kepadatan DNA asli. Meselson dan Stahl berencana untuk berhenti menandai
DNA dalam siklus replikasi berikutnya, yang berarti bahwa setelah DNA
direplikasi, sampel akan berisi beberapa DNA berat asli dan beberapa DNA
ringan. Oleh karena itu, Meselson dan Stahl perlu mengembangkan teknik
pemisahan baru yang mampu memisahkan DNA berdasarkan kepadatan
daripada ukuran atau bentuk.

Sentrifugasi Gradien Densitas Sesium Klorida

Sesium klorida adalah senyawa anorganik dengan rumus CsCl. Senyawa ini
dapat dengan mudah larut dalam air. Sesium klorida memiliki toksisitas
rendah terhadap manusia dan hewan, sedangkan bentuk radioaktif dari

4
senyawa ini dapat dengan mudah mencemari lingkungan karena kelarutan
airnya. Senyawa ini digunakan dalam proses sentrifugasi isopicnik dalam
pemisahan berbagai jenis DNA dan juga digunakan untuk analisis reagen
kimia.

 DNA genom dapat dimurnikan dengan sentrifugasi dengan gradien

densitas cesium klorida (CsCl).

 Sel dilisis menggunakan deterjen, dan lisatnya diendapkan dengan

alkohol. DNA resuspended dicampur dengan CsCl dan etidium bromida
dan disentrifugasi selama beberapa jam.

 DNA dikumpulkan dari tabung sentrifugal, diekstraksi dengan

isopropanol untuk menghilangkan etidium bromida, dan kemudian
diendapkan dengan etanol untuk mengumpulkan DNA.

 Metode ini memungkinkan isolasi DNA berkualitas tinggi, namun

memakan waktu, membutuhkan tenaga kerja besar, dan mahal
(diperlukan ultracentrifuge), sehingga tidak sesuai untuk penggunaan
rutin.

 Metode ini menggunakan bahan kimia beracun dan juga tidak mungkin
untuk mengotomatisasi.

Sentrifugasi Gradien Densitas Struktur Bromida

Metode lain yang lazim digunakan untuk memisahkan DNA plasmid dengan
DNA genom adalah dengan menggunakan cara sentrifugasi gradient
densitas.

a. Dengan teknik tersebut DNA plasmid akan membentuk pita pada titik
tertentu yang terpisah dengan pita genom, dimana protein akan
mengapung pada permukaan gradient, dan RNA akan berada pada dasar
tabung. Posisi pita-pita DNA dalam tabung bisa terlihat melalui pendaran
etidium bromida yang disinari dengan ultra violet.

5
b. DNA plasmid dapat diambil dengan menusukkan jarum suntik pada
dinding tabung dimana pita DNA plasmid terlihat dan menyedotnya.
c. Sedangkan etidium bromida yang terikat pada DNA plasmid dapat
diekstraksi dengan n-butanol, dan
d. CsCl dihilangkan dengan cara dialisis.

Teknik pemisahan ini dapat memperoleh DNA plasmid murni yang dapat
digunakan sebagai vektor kloning

6
2. Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA dapat dilakukan dengan cara :
1. Invivo : dengan teknik rekayasa genetika/cloning dengan sel hidup
(transform)
2. In vitro : teknik cloning gen dalam tabung reaksi (PCR)

PCR (Polimerase Chain Reaction)

Syarat dalam tabung reaksi terdapat :

1. Template (dna yang telah diketahui urutanny)

2. Primer (oligonukleotida, 15-20 pb)
3. Enzim polymerase (termostabil)
4. Prekursor nukleotida

1. Template
 Suatu segmen pada molekul DNA (hasil isolasi dari suatu sumber
dan telah diketahui urutan basa nukleotidanya
 Digunakan untuk menempelkan primer
2. Primer
 Suatu oligonukleotida (15-20 pb)
 Dapat disintesis dengan mesin
 Sebagai pemicu dengan pembuatan rantai DNA
 Primer ini diletakkan dnegan posisi yang berlawanan terhadap rantai
DNA yang akan diperbanyak
3. DNA Polimerase
 Enzim yang memiliki kemampuan menggabungkan nukleotida
 Mengkatalisis pembentukan DNA yang sedang tumbu diawali dari
primer yang berjalan dari ujung 5’ ke arah 3’
 Dapat diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus

Tahapan proses
 Denaturasi DNA ds menjadi DNA ss (94 C,60”)

7
 Annealing (55 C)
 Sintesis (72 C)

Satu siklus :
 Dimulai dari denaturasi. Annealing sp sintesis selama 5 menit
 Proses polimerisasi satu molekul DNA ds menghasilkan 2 copy

Kegunaan PCR
 Selain untuk amplifikasi dapat digunakan untuk menentukan apakah
urutan nukelotida suatu DNA mengalami mutasi
 Untuk bidang kedokteran forensic
 Untuk melacak asal usul seseorang dengan membandingkan “finger
print”

8
 DAFTAR PUSTAKA

Artika IM, Safithri M. 2010. Diktat Kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler.

Bogor:Departemen Biokimia.

Beran, J.A, 1996, Chemistry in The Laboratory, John Willey & Sons.

Bernasconi G. 1995. Teknologi Kimia I. Jakarta: Pradya Paramita.

Hendra Adijuwana. 1989. Teknik pemisahan Dalam Analisis Biologis. Bogor: IPB
Press.

Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed.
Harlow:Prentice. Hal