LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA KLINIS

”Isolasi DNA / RNA , Teknik PCR, dan Elektroforensis GEL Polikrilamid”

Disusun oleh :
Kelompok 2 C
1. Ade Nurhikmah 11171020000003
2. Ghina Syarifah 11171020000056
3. Hasna Dzakiyah M. 11171020000059
4. Rahmah Dinda P. 11171020000060
5. Fatimah Nur Fauziyah 11171020000062
6. Nadya Shafira 11171020000063
7. Aliya Zahra 11171020000065
8. Luna Septie Pramudita 11171020000066
9. Wulan Sari 11171020000069
10. Dili Ridho Amali Ikhsan 11171020000072
11. Listiani Oktaviana 11171020000075

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
OKTOBER/2019
 Daftar Isi
COVER
BAB I PENDAHULUAN .......................................................................................................................... 3
1.1 Latar Belakang ................................................................................................................................ 3
1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................................................... 4
1.3 Tujuan Praktikum .......................................................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................................................... 5

2.1 Isolasi DNA/RNA ............................................................................................................................ 5
2.2 Teknik PCR ..................................................................................................................................... 8
2.3 Elekroforesis GEL Poliakrilamid .................................................................................................. 10

BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM ................................................................................................ 12

3.1 DNA ...................................................................................................................................................... 12

3.2 PCR ...................................................................................................................................................... 13

3.3 Hasil Pengamatan ............................................................................................................................... 13

BAB IV PEMBAHASAN ........................................................................................................................ 14

4.1 DNA/RNA ............................................................................................................................ .........14

4.2 PCR dan Elektroforesis GEL Poliakrilamid ............................................................... .........17

BAB V KESIMPULAN .......................................................................................................................... .21

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................................................ 22
LAMPIRAN
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Isolasi DNA merupakan teknik yang penting dalam pengembangan ilmu ini.
Derajat kemurnian dan ualitas dalam isolasi DNA sangat mempengaruhi hasil yang
Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah polimer asam nukleat yang tersusun akan
diperoleh. Secara umum, prosedur ekstraksi yang baik untuk isolasi DNA mencakup tiga
hal penting, yaitu harus bisa dihasilkan DNA dengan kemurnian yang tinggi, DNAnya
harus utuh, dan jumlahnya mencukupi (konsentrasi tinggi) (Clark, 1997). Isolasi DNA
juga merupakan langkah pertama dalam studi sekuen DNA dari populasi DNA kompleks
dan dalam analisis struktur genom dan ekspresi gen. Kuantitas, kualitas dan integritas
DNA akan mempengaruhi hasil yang diperoleh secara langsung (Surzycki,2000). Dengan
meningkatnya kebutuhan teknik DNA rekombinan dalam penelitian tumbuhan, metode
yang digunakan dalam isolasi DNA menjadi perhatian utama. Metode yang biasa
digunakan saat ini merupakan metode yang membutuhkan biaya dan peralatan yang
sangat mahal, sehingga di tingkat perguruan tinggi lebih banyak diberikan sebatas teori
saja, mahasiswa tidak diberikan pengalaman secara langsung melalui praktikum., hal ini
menyebabkan penelitian di bidang ini belum banyak berkembang.

Dengan adanya teknik isolasi DNA yang lebih murah, mudah dan cepat, seorang
dosen diharapkan dapat memberikan bekal ketrampilan kepada mahasiswa mengenai
suatu teknik dasar yang dapat digunakan untuk mengembangkan sumber daya hayati
negara kita yang sangat kaya, agar mahasiswa tersebut dapat mulai berpikir obyektif dan
benar dalam mengembangkan teknologi, sehingga penelitian di bidang ini dapat
berkembang secara sistematis dan merupakan pembawa informasi genetik yang
diturunkan kepada keturunannya. Informasi genetik disusun dalam bentuk kodon yang
berupa tiga pasang basa nukelotida.
1.2 Rumusan Masalah
1. Bagaimana cara mengisolasi DNA dalam darah?
2. Bagaimana cara mereplikasi DNA dengan teknik PCR?

1.3 Tujuan Praktikum

1. Untuk mengetahui cara mengisolasi DNA dari darah
2. Mempelajari metode amplifikasi/perbanyak/replikasi DNA.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DNA

DNA pertama kali ditemukan oleh F. Miescher (1869) dari sel spermatozoa dan sel
eritrosit burung, selanjutnya dinamakan sebagai nuklein. Penemuan lain dilakukan oleh
Fischer (1880), yaitu tentang adanya zat pirimidin (yang berupa Sitosin dan Timin) dan
dua purin (Adenin dan guanin). Setelah penemuan tersebut, dilengkapi pula dengan
penemuan Levine (1910) tentang gula 5 karbon ribosa, gula deoksiribosa, dan asam fosfat
dalam inti. Keberadaan DNA tersebut sebagian besar di dalam nukleus (inti sel). Tetapi
ada juga yang terdapat pada mitokondria. Pada tahun 1953, Frances Crick dan James
Watson menemukan model molekul DNA sebagai suatu struktur heliks beruntai ganda,
atau yang lebih dikenal dengan heliks ganda Watson-Crick.DNA merupakan
makromolekul polinukleotida yang tersusun atas polimer nukleotida yang berulang-ulang,
tersusun rangkap, membentuk DNA haliks ganda dan berpilin ke kanan. Setiap nukleotida
terdiri dari tiga gugus molekul, yaitu; (1) gula 5 karbon (2-deoksiribosa), (2) basa nitrogen
yang terdiri golongan purin yaitu adenin (Adenin = A) dan guanin (guanini = G), serta
golongan pirimidin, yaitu sitosin (cytosine = C) dan timin (thymine = T), dan (3) gugus
fosfat
Basa pada molekul DNA membawa informasi genetik, sedangkan gula dan gugus
fosfat mempunyai peranan struktural. Gula dalam deoksiribonukleotida merupakan
deoksiribosa. Awalan deoksi menunjukkan bahwa gula ini kekurangan satu atom oksigen
yang ada pada ribosa, senyawa induknya. Basa nitrogen merupakan derivat purin dan
pirimidin. Purin dalam DNA adalah adenin (A) dan Guanin (G), serta pirimidinnya adalah
timin (T) dan sitosin (C).
Sebuah nukleosida terdiri dari basa dan purin atau pirimidin yang berikatan dengan
gula. Keempat unit nukletida dalam DNA disebut deoksiadenosin, deoksiguanosin,
deoksitimidin, dan deoksitidin. Dalam sebuah deoksiribonukleosida, N-9 dalam purin atau
N-1 dalam pirimidin terikat pada C-1 deoksiribosa. Konfigurasi ikatan N-glikosida ini
adalah ikatan  (basanya terletak di atas bidang gulanya). Suatu nukleotida merupakan
sebuah ester fosfat dari suatu ester fosfat dari suatu nukleosida. Tempat esterifikasi yang
paling umum dalam nukleotida yang terdapat di alam secara alamiah adalah gugus
hidroksil C-5 pada gula. Senyawa seperti itu disebut nukleosida 5-fosfat atau 5-nukleotida.
Misalnya, deoksiadenosin 5’-trifosfat (dATP) merupakan prekursor yang diaktifkan pada
sintesis DNA; nukleotida itu diaktifkan kalau ada dua ikatan fosfoanhidrida dalam unit
trifosfatnya. Bilangan dengan tanda menunjukkan atom pada gula, sedangkan bilangan
tanpa tanda menunjukkan bahwa gulanya berupa deoksiribosa untuk membedakan
senyawa ini dari ATP gula dalam bentuk ribosa.
Tulang punggung DNA, yang bersifat tetap di sepanjang molekul, terdiri dari
deoksiribosa yang berikatan dengan gugus-gugus fosfat. Khususnya 3'- hidroksil pada
bagian gula sebuah deoksiribonukleotida disambungkan pada 5’-hidroksil gula yang
berdekatan melalui jembatan fosfodiester. Bagian yang bervariasi pada DNA adalah urutan
keempat macam basa (A, G, C dan T). Unit-unit nukleotida tersebut dinamakan
dioksidenilat, deoksiguanilat, deoksisitidilat, dan deoksitimidilat.

Gambar. Mekanisme kerja DNA.

Gambar. Perbedaan antara Deoxyribonucleotide dan Ribonucleotide.

DNA terutama ditemui dalam inti sel, asam ini merupakan pengemban kode genetik
dan dapat memproduksi atau mereplikasi dirinya dengan tujuan membentuk sel-
sel baru untuk memproduksi organisme itu dalam sebagian besar organisme, DNA suatu
sel mengerahkan sintesis molekul RNA, satu tipe RNA, yaitu messenger RNA(mRNA),
meninggalkan inti sel dan mengarahkan tiosintesis dari berbagai tipe protein dalam
 organisme itu sesuai dengan kode DNA-nya.
Di tahun 1958, Arthur Kornberg dan rekan-rekannya mengisolasi suatu enzim dari
E. Coli yang mengkatalisis sintesis DNA. Mereka menamakan enzim tersebut DNA
polimerase; yang sekarang disebut DNA polimerase 1 karena kemudian ditemukan DNA
polimerase yang lain. Pada replikasi DNA terjadi interaksi yang rumit dan terkoordinasi
lebih dari 20 macam protein. DNA polimerase l merupakan rantai polipeptida tunggal 103-
kd, yang mengkatalisis penambahan-penambahan unit-unit deoksiribonukleotida selangkah
demi selangkah menjadi sebuah rantai DNA

(DNA)n residu + dNTP  (DNA) + PP

(Singkatan dNTP menunjukkan deoksiribonukleotida trifosfat, dan PPi
menunjukkan gugus pirofosfat). DNA polimerase I memerlukan komponenkomponen
berikut untuk mensintesis sebuah rantai DNA:
1. Harus ada keempat prekursor yang telah diaktifkan-deoksiribonukleosida 5'-trifosfat
dATP, dGTP, dTTP dan dCTP. Ion Mg2+ juga diperlukan.
2. DNA polimerase 1 menambahkan deoksiribonukleosida ke ujung 3'- hidroksil pada rantai
DNA yang sudah ada. Dengan kata lain, diperlukan suatu rantai pemula dengan sebuah
gugus 3'-OH bebas.
3. Sebuah cetakan DNA adalah esensial. Cetakan dapat berupa untai DNA tunggal atau
ganda. DNA untai ganda merupakan cetakan yang efektif hanya bila tulang punggung gula
fosfat diputus pada satu atau dua tempat.

Jadi DNA polimerase merupakan enzim yang diarahkan oleh cetakan (template-
directed enzyme). Enzim tersebut mendapat petunjuk dari cetakan dan mensintesis suatu
produk dengan urutan basa yang komplementer terhadap urutan basa pada cetakan.
Memang, DNA polimerase I merupakan enzim yang diarahkan oleh cetakan pertama yang
ditemukan. Sifat mencolok lainnya DNA polimerase I lainnya adalah bahwa enzim
tersebut memperbaiki kesalahan-kesalahan dalam DNA dengan cara mengeluarkan
nukleotida yang salah. Sifat-sifat DNA polimerase I ini turut menyebabkan ketepatan
replikasi DNA tinggi sekali, kesalahan rata ratanya kurang dari 10-8 per pasangan basa.
Deoxyribonucleic acid (DNA) isolasi adalah proses ekstraksi DNA dari berbagaisumber.
Sumber untuk isolasi DNA sangat beragam. Pada dasarnya dapat diisolasi dariorganisme
hidup atau mati. Sumber-sumber umum untuk isolasi DNA meliputi seluruhdarah, rambut,
sperma, tulang, kuku, jaringan, noda darah, air liur, bukal (pipi) kapas, selepitel, urin
(Sadikin, 2002).
 Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau
lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi
atau buffer lisis untuk mencegah DNA rusak. Metode yang digunakan untuk mengisolasi
DNA tergantung pada sumber, umur, dan ukuran sampel. Meskipun berbagai metode
yang digunakan ada beberapa kesamaan di antara mereka. Secara umum, mereka bertujuan
untuk menyajikan DNA terpisah dalam inti sel dari komponen seluler lainnya. Isolasi
DNA biasanya dimulai dengan lisis atau rusaknya jaringan atau sel. Proses ini sangat
penting untuk penghancuran struktur protein dan memungkinkan untuk pelepasanasam
nukleat dari inti. Lisis dilakukan dalam larutan garam, deterjen yang
mengandung protein denaturasi atau protease (enzim mencerna protein), seperti proteinas.
Hal ini mengakibatkan kerusakan sel dan melarutkan membran. Isolasi DNA
adalah sebuah proses yang sederhana (soewoto, 2000).
Isolasi DNA diperlukan untuk analisis genetik, yang digunakan untuk tujuan ilmiah,
medis, atau forensik. Para ilmuan menggunakan DNA di sejumlah aplikasi, seperti
pengenalan DNA ke dalam sel dan binatang atau tanaman atau untuk tujuan diagnostik.
(Sadikin,2002). Keberadaan protein, lipid, polisakarida dan beberapa senyawa
organik atau anorganik lainnya dalam penyusunan DNA dapat mengganggu metode
analisis DNA, khususnya dengan reaksi rantai polimerase. Mereka juga dapat menurunkan
mutu DNA yang mengarah ke penyimpanan yang lebih pendek. Setelah itu, melalui
aplikasi dari deterjen, protein dan lipid selular terpisah jauh dari DNA (Poedjiadi, 2006).

2.2 Teknik PCR

PCR adalah suatu bentuk sintesis dan amplifikasi DNA secara in-vitro. Proses analisis
dengan teknik PCR mampu mengamplifikasi segmen DNA hingga jutaan kali hamya dalam
waktu singkat (Handyono, 2001).
PCR merupakan teknik yang sangat ampuh dalam diagnosis kedokteran, forensik, dan
evolusi molekuler. Dengan penggunaan PCR, pembuatan klona dan penentuan urutan DNA
menjadi jauh lebih sederhana. Selain itu, teknik yang inovatif ini telah sangat mem-perluas
ruang lingkup dan meningkatkan teknologi rekomendasi DNA. PCR dapat mem-berikan
informasi diagnostik yang berguna bagi kedokteran. Bakteri dan virus dapat dideteksi dengan
menggunakan pemula spesifik. Contohnya, PCR dapat mengungkapkan adanya virus
imunodefesiensi manusia-1 (HIV-1) pada individu yang tidak menunjukkan respons imun
terhadap patogen ini, sehingga tak terdeteksi pada uji antibodi. Menemukan kuman
Mycobacterium tuberkolosis pada spesimen jaringan memerlukan waktu dan sulit. Namun
 dengan PCR, 10 kuman tuberkolosis diantara sejuta sel manusia dapat diketahui dengan
mudah.
PCR juga merupakan metode yang menjanjikan untuk deteksi dini kanker tertentu.
Mutasi gen-gen pengendali pertumbuhan tertentu, seperti gen RAS, dapat diidentifikasi
dengan PCR. Kemampuan yang besar untuk memperbanyak daerah DNA tertentu dapat
menjadi sangat penting untuk memantau kemoterapi kanker. Idealnya, pengobatan harus
dihentikan saat sel-sel kanker telah dihilangkan, dan segera dimulai kembali jika kambuh lagi.
PCR ideal untuk mendeteksi leukemia-leukemia yang disebabkan oleh penyusunan kembali
kromosom
Teknik PCR melibatkan beberapa tahap yang berulang (siklus) dan setiap siklus
terjadi duplikasi jumlah terget DNA untai ganda. Komponen yang diperlukan pada proses
PCR meliputi DNA; sepasang pimer; dNTPs (deoxynecleotide triphospahtes); master mix
PCR; MgCl2 dan enzim polymerase DNA. Berikut adalah tahapan proses PCR
a. Denaturasi
Tahap denaturasi adalah tahap pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA
tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan
dibuat. Denaturasi biasanya dilaukan antara suhu 90-95oc selama 60 detik.
b. Annealing (Penempelan)
Tahap annealing merupakan tahap penempelan primer pada daerah DNA target.
Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai
DNA berukuran pendek yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA
yang pendek ini disebut primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target,
diperlukan suhu yang rendah sekita 55oc selama 30-60 detik.
c. Ekstensi (Pemanjangan)
Tahap ekstensi umunya terjadi pada suhu 72oc selama 60 detik. Primer yang telah
menempel tadi akan mengalami pemanjanngan pada sisi 3’nya dengan penambahan dNTP
yang komplemen denan templat oleh DNA polimerase.
 Gambar. Reaksi rantai polimerase (PCR).

Ketiga tahap ini -denaturasi, annealing, dan pemanjangan (elongasi) dapat dilakukan
dengan berulang-ulang hanya dengan mengubah suhu campuran reaksi tersebut.
Termostabilitas polimerase memungkinkan PCR dilakukan dalam suatu wadah tertutup;
tidak ada pereaksi yang ditambahkan setelah siklus pertama. Ciri kunci PCR adalah bahwa
semua untai DNA baru bertindak sebagai acuan pada siklus berikutnya. Jumlah DNA ini
yang terdiri dari sasaran target yang diapit oleh pemula pemula bertambah secara
eksponensial pada siklus-siklus berikutnya. Sedangkan urutan-urutan DNA lainnya dalam
campuran tersebut hanya bertambah secara linier. Karenanya setelah beberapa siklus,
hampir semua DNA adalah BCD. Secara ideal, setelah n siklus, urutan ini diperbanyak 2n
kali. Dalam waktu kurang dari 1 jam, dapat dihasilkan perbanyakkan sejuta kali setelah 20
siklus, dan semilyar kali setelah 30 siklus.
2.3 Teknik Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikel
koloid berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupa
larutan bufer, sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara
teknis,elektroforesis merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang
bermuatan akibat diberikan arus listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik
dari elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik,2004).
Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatansebagai sifat
fisik. Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatanionik (Rouessac
2007). Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan
menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya
aliran medan listrik (Skoog 2002).
Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada padam
akromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatannegatif
dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutubke kutub
yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutubnegatif ke
kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah muatan terhadap
massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.
Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi,
danmemurnikan fragmen DNA. Pergerakan molekul terutama tergantung di muatan yang
ada pada permukaan partikel,tanda dan besarnya muatan pembawa oleh variasi group
ionogenik. Tergantung kepadakekuatan molekul listrik dan pH dari medium dalam
mengkateristik, sehingga pemisahanmolekul dapat terjadi karena efek seleksi dan medium
yang sesuai.
Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya pergerakan komponen
bermuatan positif pada kutub negatif serta komponen bermuatan negatifpada kutub positif.
Pegerakan yang terjadi disebut "elektrokinetik". Hasil yang didapatkan dari elektroforesis
adalah elektroforegram yang memberikan informasi mengenai seberapa cepat perpindahan
komponen (tm) atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran yang digunakan sama dengan
pada proses kromatografi.

Elektroforesis gel secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran fragmen

DNA ,misalnya dalam pemetaan pembatasan DNA kloning. Metode ini juga digunakan
dalam diagnosis genetika molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis PCR.
Elektroforesis gel agarosa juga digunakan untuk menyelesaikan DNA melingkar dengan
perbedaan super koil topologi, dan untuk menyelesaikan fragmen yang berbeda karena
sintesis DNA. Selain menyediakan media yang tepat untuk analisis ukuran fragmen,
gel memungkinkan pemurnian fragmen DNA
 BAB III

METODOLOGI PRAKTIKUM
3.1 DNA
3.1.1 Bahan :
 Sampel darah
 KIT isolasi DNA yang mengandung :
o Larutan pelisis sel darah merah
o Larutan pelisis sel darah putih
o Pereaksi pemisah DNA dari protein
o Pereaksi mengendapan DNA
o Pereaksi melarutkan DNA
o Pereaksi menghitung jumlah DNA
o Pereaksi menentukan kemurnian DNA

3.1.2 Cara Kerja :

1. Lisis sel. Kedalam tabung mikro ukuran 1,5 ml masukan sampel darah. Inkubasi
selama 10 menit lalu sentrifugasi 13.000-16.000x g selama 20 detik. Filtrat yang
diperoleh dibuang, sehingga diperoleh endapan sel darah putih. Vortex lalu
tambahkan larutan pelisis sel darah putih.
2. Perlakuan dengan RNAse. Larutan berisi sel darah putih dengan menambahkan 0,75
mikro liter lautan RNAse, lalu tabung dibolak balik dan inkubasi 37°C selama 15
menit.
3. Pengendapan protein. Setelah sampel dingin tambahkan 50 mikro liter larutan
pengendap protein. Lakukan vortex 20 detik, lalu sentrifugasi 13000-16000x g
selama 3 menit. Menghasilkan endapan berupa protein dan filtratnya adalah DNA.
4. Pengendapan DNA. Ambil 1,5 mikro liter DNA dan tambahkan 150 mikroliter
isopropanol 100%. Lalu balik-balikan tabung 50x, akan terlihat gumpalan benang-
benang putih DNA. Sentrifugasi selama 3 mit, akan terlihat butiran putih DNA.
Filtar dibuang lalu ditambahkan 150 ml etanol 70%. Tabung dibalik-balik untuk
mencusi DNA dan sentrifugasi selama 20 detik. Filtat dibuang lagi, lalu dikeringkan.
5. Hidrasi DNA. DNA yang diperoleh tambahkan 50 mikroliter larutan penghidrasi
DNA, kemudian panaskan pada suhu 65°C selama 1 jam dan ketuk-ketuk agar DNA
menyebar, simpan.
 6. Perhitungan jumlah
7. Menentukan kemurnian DNA.
8. Perhitungan indeks kemurnian.

3.2 PCR
3.2.1 Bahan :
 KIT PCR yang berisi :
o DNA genom
o Buffer PCR 10x
o Primer F1, F2 dan R
o dNTP
o Taq polimerasi
o Akuabides steril
3.2.2 Cara kerja :
a) Siapkan mix solution (DNA+ Taq polymerase+ Buffer+ aquadest+ Dntp ke dalam
mikrotube dengan menggunakan mikropipet, dengan komposisi sesuai prosedur KIT)
b) Masukan campuran mix solution didasar tabung PCR.
c) Masukan sampel DNA yang telah isolasi ke masing-masing tabung PCR
d) Tambahkan maser mix ke dalam tabung PCR lalu tutup
e) Masukan tabung PCR ke dalam ala PCR dimana reaksi akan berlangsung sebanyak 40
siklus untuk amflikasi DNA
f) Lakukan pengamatan hasil amflikasi DNA dengan teknik elektroforesis.

3.3 Hasil Pengamatan

\
 BAB IV
PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA / RNA

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. DNA terdapat
pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara ketiganya adalah: DNA
nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA
mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon.
Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan
sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang
memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya, struktur
DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki
protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan
memiliki protein histon (Klug & Cummings 1994: 315–316; Raven & Johnson 2002: 94).
DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang antiparalel dengan komponen-
komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Pasangan
basa pada DNA terdiri atas dua macam, yaitu basa purin dan pirimidin. ‘Basa purin terdiri
atas adenin (A) dan guanin (G) yang memiliki struktur cincin-ganda, sedangkan basa
pirimidin terdiri atas sitosin (C) dan timin (T) yang memiliki struktur cincin-tunggal. Ketika
Guanin berikatan dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan
ketika Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan hidrogen. Satu
komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu gula pentosa, satu gugus
fosfat dan satu pasang basa yang disebut nukleotida (Lewis 2003: 176–178). Sebuah sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem
kehidupan. Genom adalah set lengkap materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu organisme
dan terorganisasi menjadi kromosom. (Human Genome Project 2005: 1)
Di dalam inti sel suatu organisme, terdapat materi genetik. Materi genetik ini harus
mempunyai kemampuan untuk mengkode suatu informasi secara spesifik dan
menggandakan suatu informasi secara tepat (NCBI-Griffiths dkk: 2000). Contoh dari materi
genetik adalah DNA/RNA, gen dan kromosom. DNA dan RNA dimiliki oleh organisme
prokariotik, sedangkan eukariotik hanya memiliki RNA. DNA/RNA adalah informasi
genetik yang dibentuk oleh asam deoksiribonukleat untuk DNA atau Ribosanukleat untuk
RNA (Solomon dkk 2005: 38).
Isolasi DNA merupakan teknik ekstraksi DNA dari suatu sel sebagai tahap awal
suatu analisis genetik. Secara umum, tahap isolasi DNA dimulai dari pengambilan sampel
sel, pelisisan membran dan/atau dinding sel, ekstraksi DNA, presipitasi DNA, pemurnian
DNA, dan pengawetan DNA (Gaikwad 2010: 2). DNA manusia dan hewan biasanya
diperoleh dari darah dan jaringan dalam. Namun DNA juga dapat diektraksi dari semen,
saliva, akar rambut, urine, dan gigi (Medical Genomics 2004: 1). Isolasi DNA juga
berfungsi sebagai media pembelajaran genetik, dapat mengetahui kelainan genetik yang
diderita (University of Utah 2015: 1). Aplikasi dari isolasi DNA adalah untuk identifikasi
forensik, beberapa gen tertentu dapat diproduksi secara massal untuk mengobati penyakit
tertentu, dan teknologi DNA rekombinan dapat digunakan untuk rekayasa genetika
(University of Utah 2015: 1).
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA darah antara lain mesin
sentrifugasi, vortex, tabung sentrifugasi, mikropipet + tips, pipet transfer, tube, lanset,
gloves, masker, dan inkubator. Bahan-bahan yang digunakan antara lain darah sebanyak
300 µl, larutan pelisis eritrosit, larutan pelisis leukosit, RNAse, larutan presipitasi protein,
isopropanol, etanol 70%, dan tris-EDTA
Mesin sentrifugasi adalah mesin yang didesain untuk memisahkan material bermassa
berat dengan yang ringan. Mesin sentrifugasi berputar dengan kecepatan yang sangat tinggi.
Tabung sentrifugasi berfungsi sebagai tempat diprosesnya darah (TUFTS University 2010:
1). Vortex berfungsi untuk mencampurkan larutan dengan jumlah sedikit (Electron
Microscopy Science 2015:1). Mikropipet dan pipet transfer berfungsi untuk mengambil
larutan yang diperlukan dalam praktikum dalam satuan mikroliter. Tube digunakn untuk
menampung sampel darah. Lanset digunakan untuk melubangi ujung jari tempat
pengambilan darah (Weiner 2010: 443). Inkubator atau waterbath digunakan untuk
mengontrol temperature, keamanan dan goncangan pada status yang tetap (Microguide
2010: 1).
Larutan pelisis sel darah merah mengandung NH4Cl sebagai garam dan berfungsi
sebagai pengoptimalisasi pelisisan sel darah merah tanpa menyebabkan efek yang berarti
pada sel darah putih (Stemcell Technologies 2014: 1), EDTA (Ethylenediaminetetra Acetic
Acid) berfungsi untuk mengikat ion metal yang mempunyai +2 (Mg2+ dan Ca2+) yang dapat
menghambat mereka untuk bereaksi dan mereduksi aktivitas DNAse (Brennan 2010: 1),
KHCO3 berfungsi sebagai laturan penyangga atau buffer (Protocol Online 2006: 1), KOH
digunakan untuk menaikkan pH (Nuansakimia 2009: 1), sedangkan HCl digunakan untuk
menurunkan pH larutan (Ash 2011: 1)
Larutan pelisis sel darah putih mengandung Tris-HCl sebagai larutan buffer, EDTA,
SDS (Sodium DodecylSulfate) sebagai melaarutkan membrane dan protein yang
terdenaturasi, RNAse sebagai penghancur RNA, larutan presipitasi protein (HAc)
mengendapkan protein yang berasosiasi dengan DNA, isopropanol sebagai medium agregasi
plasmid DNA agar DNA terlihat, ethanol sebagai fase pencucian DNA untuk
menghilangkan isopropanol dan garam yang terkandung, dan Tris-EDTA sebagai larutan
isotonis agar DNA tidak rusak (Researchergate 2012: 3-5).
Darah diambil menggunakan lanset steril bertujuan agar darah tidak terkontaminasi
dan menghindari hal-hal yang tidak diinginkan, selanjutnya darah ditempatkan pada tube
lalu tambahkan larutan pelisis sel darah merah yang bertujuan agar sel darah merah hilang,
lalu selanjutnya disentrifugasi agar supernatan yang berisi sel darah merah yang telah terlisis
dan pellet yang berisi sel darah putih terpisah, selanjutnya supernatan dibuang. Lalu
ditambahkan lagi larutan pelisis sel darah merah untuk yang kedua kalinya agar sel darah
merah yang masih ada dapat terlisis dengan sempurna (Researchergate 2012: 4).
Menggunakan larutan pelisis sel darah putih (GB buffer) untuk melisiskan
membrane sel darah putih. Selanjutnya diinkubasi pada waterbath untuk optimalisasi kinerja
GB buffer (DNA Cloning 2004: 1). Lalu selanjutnya tambahkan elution buffer untuk
menghilangkan protein yang telah terdenaturasi sehingga yang tersisa hanya DNAnya
(Cooke 2010 : 1).
Tambahkan ethanol untuk proses pencucian DNA. Lalu tempatkan GD Column pada
tube dan selanjutnya disentrifugasi. Hal ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan
supernatan, sehingga DNA tidak tercampur dengan supernatan yang akan dibuang.
Selanjutnya GD Column diberi wash buffer untuk proses pencucian DNA dan bertujuan
agar DNA yang masih menempel pada GD Column dapat mencapai bawah tabung
(Researchergate 2012: 2). Setelah GD Column dipindahkan kedalam tube yang baru, lalu
diberi TE buffer atau elotion buffer agar DNA tidak terdegradasi saat proses penyimpanan
(Protocol Online 2006:1). Hasil yang akan didapatkan adalah larutan berwarna bening yang
berisi DNA murni, tanpa adanya komponen lain yang tidak diperlukan seperti sel darah
merah maupun protein.

Pada praktikum kali ini dihasilkan rantai DNA yang samar, hal ini dikarenakan
kesalahan pada proses pengisolasian sehingga tidak didapatkan rantai DNA.
 [Gambar 1: Gambar rantai DNA Sumber: dokumen pribadi]

4.2 Teknik PCR dan Elektroforensis GEL Poliakrilamid

PCR (polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan
(replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme untuk mengamplifikasi
nukleotida secara in vitro. Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah besar
dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan
DNA. Metode PCR dapat meningkatkan jumlah urutan DNA ribuan bahkan jutaan kali dari
jumlah semula, sekitar 106-107 kali. Setiap urutan basa nukleotida yang diamplifikasi akan
menjadidua kali jumlahnya (Sambrook & Russel 2001). Teknik PCR banyak dilakukan di
bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah
sampel yang kecil. PCR (Polimerase Chain Reaction) atau reaksi berantai polimerase
digunakan untuk mensintesis sekuens tertentu DNA dengan menggunakan dua primer
oligonukleotida yang menghibridisasi pita yang berlawanan dan mengapit dua target DNA.
Teknik ini sederhana dan memiliki tingkat kesuksesan yang tinggi pada amplifikasi sekuens
DNA yang diperoleh.
Sebelum melakukan PCR pertama ambil larutan mix solution lalu campur dengan
DNA yang sudah diisolasi lalu disentrifugasi. Komponen dari mix solution yaitu Taq DNA
polymerase, dNTPs, MgCl2 and reaction buffer. Kegunaan masing- masing komponen
yaitu, polimerase DNA merupakan enzim yang stabil dalam pemanasan. Enzim ini tetap
stabil mengamplifikasi DNA walaupun amplifikasi berjalan pada suhu mendekati titik didih
air. Umumnya digunakan enzim Taq DNA polimerase (Taq = Thermus aquaticus).
Polimerase DNA berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR
enzim ini juga diperlukan untuk tahap ekstensi DNA (Nicholl 2002: 124). Buffer berfungsi
untuk menjaga keseimbangan pH medium. Umumnya buffer PCR mengandung senyawa
MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA
polimerase. MgCl2 tersebut juga akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang
membentuk komplek larut dengan dNTP (Handoyo & Rudiretna 2000 : 7). dNTPs
merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP (deoksiadenosin trifosfat), dTTP
(deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).
dNTPs bertindak sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA.
dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru
yang komplementer dengan untai DNA template (Kusuma 2010 : 12).
PCR memiliki prinsip yaitu proses yang diulang-ulang antara 20–35 kali siklus.
Setiap siklus terdiri atas tiga tahap yaitu denaturasi, annealing dan ekstensi oleh enzim
DNA polimerase. Tahap pertama yaitu tahap peleburan (melting) atau denaturasi, genetik
(DNA) didenaturasi dengan mengubah untai ganda molekul DNA menjadi untai tunggal
yang berlangsung pada suhu tinggi, 94–96 °C, ikatan hidrogen DNA terputus. Pada tahap
awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas
DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi templat
(“patokan”) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit. Kedua, tahap penempelan
atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan
basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 50–62 °C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu
yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di
sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit. Tahap selanjutnya yaitu tahap pemanjangan
atau elongasi yang memiliki suhu tergantung dari jenis DNA polimerase yang dipakai. DNA
akan digandakan atau diperpanjang oleh DNA polimerase. Dengan Taq-polimerase, proses
ini biasanya dilakukan pada suhu 72°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit.
Pada tahap denaturasi, pasangan untai DNA templat dipisahkan satu sama lain
sehingga menjadi untai tunggal. Pada tahap selanjutnya, masing-masing untai tunggal akan
ditempeli oleh primer. Jadi, ada 2 buah primer yang masing-masing menempel pada untai
tunggal DNA templat. Biasanya, kedua primer tersebut dinamakan primer maju (forward
primer) dan primer mundur (reverse primer). Setelah menempel pada untai DNA templat,
primer mengalami polimerisasi mulai dari tempat penempelannya hingga ujung 5’ DNA
templat (ingat polimerisasi DNA selalu berjalan dari ujung 5’ ke 3’ atau berarti dari ujung 3’
ke 5’ untai templatnya). Dengan demikian, pada akhir putaran reaksi pertama akan diperoleh
2 pasang untai DNA jika DNA templat awalnya berupa sepasang untai DNA. Pasangan-
pasangan untai DNA yang diperoleh pada suatu akhir putaran reaksi akan menjadi templat
pada putaran reaksi berikutnya. Begitu seterusnya hingga pada putaran yang ke n diharapkan
akan diperoleh fragmen DNA pendek sebanyak 2n – 2n. Fragmen DNA pendek yang
dimaksudkan adalah fragmen yang ukurannya sama dengan jarak antara kedua tempat
penempelan primer. Fragmen pendek inilah yang merupakan urutan target yang memang
dikehendaki untuk digandakan (diamplifikasi)

Hasil yang didapatkan dari alat PCR menunjukan gambar siklus PCR yang
merupakan tahap denaturasi terjadi pada suhu yang akan naik 95ºC kemudian tahap
anneling, suhunya akan turun pada 60ºC dan dilanjut dengan tahap ekstensi yaitu suhunya
akan naik lagi menjadi 72ºC dan siklus ini akan diulang sebanyak 35x siklus.

Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan dan purifikasi fragmen pada

DNA, RNA, dan protein. Pemisahan molekul pada fragmen DNA dilakukan dengan
menggunakan muatan listrik. Elektroforesis DNA dipisahkan berdasarkan perbedaan
ukurannya. Pemisahan DNA dapat menggunakan gel agarosa yang merupakan polisakarida
dari rumput laut. Penggunaan agarosa gel pada elektroforesis merupakan cara yang efektif
dan efisien untuk memisahkan fragmen DNA. Pemisahan fragmen DNA menyebabkan
fragmen DNA menjadi potongan beberapa fragmen berdasrkan molekulnya (Lee et a.l,
2012).
Dalam elektroforesis, hasil amplifikasi PCR divisualisasikan dengan elektroforesis
yang distaining dengan ethidum bromida dan akan dilihat di bawah sinar UV dengan
transiluminator. Dari hasil yang didapatkan, DNA dibandingkan dengan senyawa marker
pada elektroforesis. Senyawa marker adalah segmen DNA spesifik yang telah diketahui
ukurannya sebagai acuan untuk mengetahui DNA hasil amplifikasi. Marker DNA pada
elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang
bermigrasi. Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga
23.130 pb (Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).
 Keberhasilan yang dihasilkan dari proses amplifikasi DNA melalui PCR dan proses
visualisasi dengan elektroforesis dibutuhkan DNA yang memiliki kualitas baik sehingga
dapat digunakan dengan sesuai ( Putra dkk., 2013).
Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh
medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju
perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut
bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Pada proses elektroforesis, molekul-molekul
sampel akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub listrik sesuai dengan
muatannya. Pada asam nukleat, arah pergerakannya menuju elektroda positif, disebabkan
asam nukleat bermuatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang dimilikinya.
Hasil yang diperoleh dari penyinaran dibawah lampu UV berupa potongan pita-pita
DNA, yang mempunyai fragmen-fragmen. Pada hasil kelompok kami ditemukancpotongan
fragmen pita DNA yang banyak terurai dan kurang sempurna. Hal tersebut terjadi karena
dalam prosesnya terdapat kesalahan atau kurang ketelitian atau bahkan dapat terjadi
kemungkinan dari untai DNA nya itu sendiri.
 BAB V
KESIMPULAN

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi untuk
mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler. Berdasarkan
hasil praktikum yang telah dilakukan, isolat DNA yang telah melalui proses perbanyakan
DNA dengan metode PCR (polymerase chain reaction) dan elektroforesis, tampak hasil
rantai DNA yang samar, hal ini dikarenakan adanya kesalahan pada proses pengisolasian
sehingga tidak didapatkan rantai DNA.
 DAFTAR PUSTAKA

Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular Cloning: ALaboratory Manual 3rd edition. New York
(USA) :Cold Spring Harbor

Handoyo, D & A. Rudiretna. 2000. General principles and implementation of polymerase chain
reaction. http://repository.ubaya.ac.id/35/1/ART002: Diakses pada tanggal 3 November 2019 pukul
19.00 WIB

Kusuma, S.A.F. 2010. PCR. pustaka.unpad.ac.id/wp.../09/pustaka_unpad_pcr: 16 hlm. Diakses

pada tanggal 3 November 2019 pukul 19.30 WIB

Nicholl, D. S. T. 2002. An Introduction to Genetic Engineering. Ed ke-2. Cambridge University

Press, Edinburgh

Dadan Rosana. Modul 3 Struktur dan Fungsi DNA dan RNA. Yogyakarta: UNY Press
(http://staffnew.uny.ac.id/upload/132058092/pendidikan/modul-3-strukturdan-fungsi-dna-dan-
rna1.pdf) diakses pada 5 November 2019, pukul 21.15 WIB

Freeman. (2004). The Science of Biology, 4th Edition, by Sinauer Associates (www.sinauer.com)
and (www.whfreeman.com).

Handyono, D., & Rudiretna, A. 2001. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction
(PCR). Unitas, 9 (1), 17-29.

Lubert, Styer. (2000). Biokomia. Vol I. Edisi 4. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC.

Muhittin Yilmaz, Cem Ozic dan İlhami Gok. 2013. Principles of Nucleic Acid Separation by
Agarose Gel Electrophoresis. Universitas Brawijaya (http://blog.ub.ac.id/fathulmubin/) diakses
pada 05 November 21.56 WIB

Patnaik Pradyot. 2004. Dean’s Analytical Chemistry Handbook. Second Edition. New York:
McGraw-Hill Comp.
Poedjiadi, A. 2006. Dasar – Dasar Biokimia. Edisi Revisi. Jakarta: UI – Press

K. Murray, Robert, dkk. 2003. Biokimia Harper. Jakarta : EGC

Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim. Jakarta : Widya Medika

Soewoto, Hafiz, dkk. 2000. Biokimia Eksperimen Laboratorium. Jakarta: Widya Medika

Ash, M. 2011. The role of HCl in gastric function and health. 1 hlm.
http://www.clinicaleducation.org/resources/reviews/the-role-of-hcl-in-gastric-function-and-health/.
01 November 2019,pk 21:15

Brennan, J. 2010. Component of lysis buffer. 1 hlm.

http://www.ehow.com/info_8148370_components-lysis-buffers.html. 01 November 2019,pk 21:15

Budelier, K., Schorr, J. 2001. Purification of DNA by anion-exchange chromatography. 1 hlm.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18265181. 01 November 2019,pk 21:20

Campbell, N.A., J.B. Reece, L.A. Urray, M.L. Cain, P.V. Minorsky, R.B Jackson & S.A.
Wasserman. 2008. Biology. 8th ed. Pearson Education Inc, San Fransisco: 1465 hlm.

Cooke, D.J. 2010. Affinity chromathoghraphy. 1 hlm.

http://www.bio.davidson.edu/Courses/Molbio/MolStudents/01dacooke/affinity.html. 01 November
2019,pk 21:22, pk. 00.09

De Las Rivas, J., Lozano J.J., Ortiz, A.R. 2015. Comparative analysis of chloroplast genomes:
functional annotation, genome-based phylogeny, and deduced evolutionary patterns. 1 hlm.
http://genome.cshlp.org/content/12/4/567.long. 01 November 2019,pk 21:30

DNA Cloning. 2004. DNA genome mini kit. 5 hlm. http://shop.dna-cloning.com/download/dbc-

proto.pdf. 01 November 2019,pk 21:37
Electron Microscopy Science. 2015. Vortex mixers, microplate mixers, and magnetic stirrers. 1
hlmhttp://www.emsdiasum.com/microscopy/products/equipment/vortex_stirrers.aspx. 01
November 2019,pk 21:43

Gaikwad, A.W. 2010. DNA extraction: comparison of methodologies. 6 hlm.

http://www.nbpgr.ernet.in/Portals/6/DMX/GENOMIC_RESOURCES/DNA%20extraction-
Comparison%20of%20methodologies.pdf. 01 November 2019,pk 21:55

Ghatak, S., Muthukumaran R.B., Nachimutu S.K. 2013. A simple method of genomic DNA
extraction from human samples for PCR-RLFP analysis. 1 hlm.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3792701/. 01 November 2019,pk 22.39

Genetic Home Refrence. 2015. What is DNA?. 1 hlm. http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/basics/dna.

01 November 2019,pk 23:45
LAMPIRAN