FITOKIMIA II

Dra. Ike Yulia W, M.Farm., Apt.

Yulianita, M.Farm.
Novi Fajar Utami, M.Farm., Apt
Siti Mahyuni, M.Sc.
Maribeth T.R.H., M.Farm.
 MATERI 1

METODE ISOLASI
ALKALOID
Tugas 1

 Interpretasi Jurnal
 Tema : Isolasi Alkaloid
 Judul Jurnal: ……..
 Metode isolasi : ……
 Metode Identifikasi: ………
 Hasil dan Pembahasan : …………
 ALKALOID

Definisi:
Alkaloid: „Alkali-like“
•Senyawa (basa) organik yang mengandung atom N yang berasal
dari asam amino (dan memiliki aktivitas farmakologis dalam
kadar rendah)
•Keberadaan alkaloid: tan tinggi, tan rendah, organisme laut,
binatang, m.o
 CO2 + H2O
h PRIMARY METABOLISM

Photosynthesis Glucose Carbohydrates

SECONDARY SECONDARY
G
METABOLISM L METABOLISM
Building Blocks Y
C
O
Phenyl- L
Y
propanoids Amno Acids S Fatty Acids
Flavonoids I Lipids
Proteins S
Alkaloids synthesis
enzymes Acetyl CoA
regulation Acetogenins
Nucleic
Terpenes
Acids Citric Acid
Steroids
reproduction Cycle
RNA DNA
CO2 + H2O + ATP
SIFAT FISIKA & KIMIA ALKALOID

Sifat fisika
• Umumnya berbentuk kristal/padatan dengan TL yang jelas.
• Kadang amorf atau cairan kental (nikotin, coniine)
• Umumnya tidak berwarna, kec Berberine (poli aromatik)
• Alkaloid basa larut dlm pelarut organic
• Alkaloid garam larut dalam air.
Sifat kimia:
• Basa
• Sifat kebasaan alkaloid tergantung pd substitusi pada atom N
 Klasifikasi Alkaloid

 True-alkaloid:
¤ Berasal dari asam amino

¤ Bersifat basa

¤ Atom N ada pada cincin heterosiklis

¤ Terdapat dalam bentuk garam dengan asam organik

¤ Contoh: atropin, morfin

 Klasifikasi alkaloid
 Pseudo alkaloid:
•Memiliki karakteristik seperti alkaloid tetapi tidak berasal dari
asam amino, misal alkaloid terpen (aconitin: akaloid diterpen) dan
alkaloid dari jalur metabolisme asetat (coniin), sifat kebasaan
rendah
 Klasifikasi alkaloid
 Proto alkaloid:
Amin sederhana dimana atom N nya bukan merupakan
bagian dari cincin heterosiklik, bersifat basa dan berasal
dari asam amino, misal meskalin (kaktus)
Fakta mengenai alkaloid:

Tidak semua senyawa yang mengandung atom N

adalah alkaloid, contoh: asam amino, piridin

Kebasaan alkaloid berbeda-beda bahkan ada yang

bersifat amfoterik misal chepalin dan asam, misal:
kolkhisin
Keberadaan:

Umumnya terdapat dalam bentuk garamnya dengan asam

organik atau anorganik atau dalam kombinasi dengan asam
tertentu.
Ada yang terdapat dalam bentuk glikosida, misal α-chaconin
Umumnya merupakan campuran kompleks dari jalur
biogenesis yang sama, yang didominasi salah satu
konstituen

Kandungan alkaloid dapat bervariasi pada tiap tahap

pertumbuhan tumbuhan
Alkaloid yang tidak mengandung oksigen dalam struktur
kimianya biasanya pada suhu kamar bersifat cair (nikotin,
koniin, spartein)

Alkaloid yang mengandung oksigen akan berbentuk kristal,

umumnya kristal tidak berwarna, pada kasus tertentu
berwarna (berberine), beberapa berupa amorph
Kebasaan

Tergantung pada keberadaan lone pair elektron dari atom N, tipe

heterosiklis dan substitusinya

Electron withdrawing group yang dekat dengan atom N menurunkan

kebasaan

Elektron donating group menaikkan kebasaan

Kebasaan

•Piridin, kuinolin dan isokuinolin: basa

•Pirolidin merupakan basa kuat
•Pirol dan indol, bersifat asam
•Alkaloid basa biasanya terdapat di tanaman dalam bentuk garam
dengan asam mineral seperti HCl, H2SO4, HNO3, atau asam
organik seperti asam tartrat, sulfamat dan maleat, mekonat,
isobutirat dan benzoat, atau dalam kombinasi dengan tanin

•Alkaloid yang non basa adalah alkaloid amida, ammonium

kuartener, laktam, N-oxid
Plant Tissue Culture
ALKALOID BERDASARKAN
BIOGENESIS

A. Alkaloid heterosiklis yang berasal dari asam amino:

1. Ornithin
2. Tirosin
3. Fenilalanin
4. Triptofan
5. Asam antranilat
6. Asam nikotinat
7. Histidin
B. Alkaloid heterosiklis yang berasal dari nukleotid purin
C. Alkaloid yang terbentuk melalui transaminasi: terpenoid
alkaloid
D. Alkaloid yang terbentuk melalui transaminasi dimana N
atom terletak pada eksosiklis
METODE ISOLASI
ALKALOID
 ISOLASI ALKALOID
Isolasi alkaloid dari simplisia pada umumnya dilakukan dengan
cara penyarian menggunakan pelarut organic yang tidak
campur air (CHCl3 , eter).

Dalam tumbuhan Alkaloida biasanya terikat sebagai garam

dengan asam organik.

Maka sebelum dilakukan penyarian dengan pelarut organik,

alkaloida harus dibebaskan dari ikatan garamnya dgn
penambahan basa (alkali).
Skrining Alkaloida
1. Ekstraksi dgn air asam  ekstrak kasar diuji
2. Agak dimurnikan + basa  + pelarut organic yg tak camp.
3. Air + NaCl (salting out)  mengendapkan protein.
 Pemilihan jenis basa:
Sifat kimia alkaloid
Contoh alkaloida NaOH

√
• Mengapa penggunaan basa kuat NaOH sedapat mungkin
dihindari?
– Adanya lemak atau bahan berlemak

• Basa kuat tidak dapat digunakan jika alkaloida terdapat

dalam bahan berlemak  sabun.

Alkaloida yang terikat tannin.

– Alkaloida yang terikat tannin, misalnya alkaloida dalam
kulit pomegranat diperlukan NaOH untuk membebaskan
alkaloida dari ikatan garamnya.
– Alkaloida kinin juga terikat oleh tannin, cara isolasinya
serbuk kulit kina di + HCl encer atau asam format
sehingga terbentuk garam HCl. Selanjutnya dibasakan
dgn NaOH untuk memecah garam kinin-HCl menjadi
kinin basa dan disari dgn pelarut organic (kloroform).
 Serbuk kulit kina
+ HCl encer

Ampas Sari air asam

+ NaOH 5%
+ CHCl3

Sari air basa Sari CHCl3

+ Na2SO4 anh.

(Alkaloid Kinin)
Separation of the Alkaloidal mixtures:
Pemilihan Jenis Pelarut untuk Penyarian alkaloid:
• Kelarutan alkaloid
• Factor koefisien partisi yaitu perbandingan kelarutan alkaloida
dalam pelarut organic dan dalam air basa.
• Sifat dan jumlah senyawa
• Pelarut harus dipilih sedemikian sehingga zat lain yang tidak
dikehendaki sedikit mungkin tersari.

Selektifitas
• Pelarut yang hanya menyari alkaloid tertentu dari campuran
alkaloida yang ada. Misal pada isolasi emetin digunakan eter
sebagai pelarut karena eter hanya melarutkan emetin dan
sefalin, tetapi tidak melarutkan alkaloida psikotrin.
Metode penyarian
• Diantara pelarut organic yang banyak dipakai, CHCl3 mrpk
pelarut pilihan.
• Kelebihan : alkaloida mdh larut dalam kloroform
• Kekurangan : tidak selektif, dapat diuraikan oleh alkaloida
basa kuat menghasikan asam klorid.

Eter : lebih selektif

Kekurangan eter : mdh teroksidasi membtk peroksida, mdh
terbakar, derajat pencampuran dgn air relatif tinggi
 PEMURNIAN ALKALOID

1. Kristalisasi Langsung
2. Destilasi Uap
3. Gradient pH Technique
 1. Kristalisasi langsung

• Mrpk metode paling sederhana

• Jarang memberi alkaloid murni krn
tdk selektif
• Bermanfaat bila didahului dgn
pemisahan lain, mis : TLC
preparative, kromatografi kolom.
 2. Destilasi uap

• Metode ini tdk berlaku untuk alkaloida dgn BM besar.

• Alkaloid dgn BM kecil dapat dipisahkan dgn metode ini.
Destilasi
 3. Gradient pH technique

• Metode didasarkan atas perbedaan pH / kebasaan alkaloid

yang terdapat dalam campuran.
• Dgn mengubah pH larutan alkaloida yang diikuti dgn
ekstraksi dgn pelarut organic, mk alkaloida pd pH tertentu
dapat dipisahkan.
• Metode ini pernah dilakukan dan berhasil baik pada
pemurnian alkaloid antikanker dari Catharanthus roseus
(bunga warna putih).
Larutan NH4OH NH4OH NH4OH NH4OH
garam alk.

PH 6.0 6,5 7,0 7,5 ….. 14

EtOAc EtOAc EtOAc EtOAc

 IDENTIFIKASI ALKALOID

1. Reaksi Pengendapan
2. Reaksi Warna
3. Reaksi pembentukan kristal
4. KLT
5. Spektrum UV
6. Spektrum IR
7. MS
1. Peraksi pengendap
 Larutan Alkaloid netral atau asam dpt diendapkan dg pereaksi
yg berisi logam berat spt Hg, Bi.
 1ml lart alkaloid dlm tb reaksi + 1ml HCl + reagent  hasil

Reagen Kandungan Hasil

Dragendorff K[BiI4] oranye
Mayer K2[HgI4] Kuning-putih
Garam Reinecke (NH4Cr[CNS]4(NH3)2) Pink,
mengambang
Scheiblers Wolframat-asam fosfat Kuning, amorph
Sonnenschein Molibdat-asam fosfat Kuning, lalu
biru hijau
Larutan tanin 5% dalam air Kecoklatan
Hager Asam pikrat jenuh Kuning
Wagner I/KI Merah coklat
 2. Reaksi warna

 Alkaloid dg pereaksi H2SO4 and HNO3 akan memberikan

warna spesifik
 1ml larutan alkaloid dlm cawan porselen + pereaksi waran.
– Pereaksi Marquis : camp. 2 tetes lart formaldehid & 1 ml
H2SO4
– Pereaksi Frohde : camp. Lart 1% ammonium molibdat &
H2SO4
– Pereaksi Mandelin: camp 0,5% ammonium vanadat dlm
H2SO4
– Pereaksi Vitali : 1 tetes larutan uji dibiarkan menguap
residu + HNO3 pekat  panaskan di ta, amati warna
dibasahi dgn uap NH3  warna tertentu.
 Tabel. Reaksi warna alkaloid

Alkaloida Warna yang terbentuk dgn pereaksi

Frohde Mandelin Marquis

Morfin Violet-biru Biru-coklat Violet

Kodein Biru hijau-coklat biru violet

hidromorfin biru - Kuning-violet

Tebain biru Hijau-kuning Kuning-violet

atropin - - merah

Skopolamin Kuning-biru - -

kinin Kuning-kehitaman Hijau kuning kuning

papaverin Biru hijau Biru hijau Merah anggur

 3. Reaksi Kristal
• Alkaloida + lart garam logam berat (emas klorida, platina
klorida, merkuri klorida), asam pikrat atau asam pikrolonat
 endapan kristal  KLT  Kolom
 4. Kromatografi Lapis Tipis
• penggunaan KLT untuk identifikasi alkaloida dan
senyawa lain telah berkembang dan mrpk alat analisis
yang cukup peka, cepat dan terpercaya.
– Fase diam : silica gel G atau silica gel GF 254
– Fase gerak: senyawa yang bersifat basa.
– Campuran methanol & ammonia ( 100 :1,5)
– Campuran benzen, aseton, eter & amoniak 25%
(40:60:10:3)
– Campuran methanol, aseton, trietanolamin (30:30:1)
– Campuran kloroform, aseton & dietilamin (50:40:10)
KLT:

•Silika gel, aluminium oksida, kieselgur, selulosa

•Pada basa kuat, silikagel yang bersifat asam lemah dapat
mengikat alkaloid (pada fase gerak netral)
•TLC: UV, Dragendorff (+NaNO2)
•Alkaloid dengan amina primer dan sekunder negatif palsu
•Kumarin, hidroksiflavon, triterpen dan kardenolida ttt
positif palsu
•Alkaloid purin: mureksid (Kalium perklorat + setetes HCl,
diuapkan, ditambah amoniak = ungu)
•Alkaloid morphin: reagen Marquis (H2SO4 + setetes
formaldehida = ungu)
Deteksi Bercak Alkaloid (KLT) Wagner, 1996

1. Sinar UV 254
• Pemadaman kuat pd alkaloid indol, quinolin, isoquinolin,
purin.
• Pemadaman lemah : alkaloid tropan
2. Sinar UV 365
• Berfluoresensi biru, biru-hijau, violet: akar rauvolfia,
kulit kina, akar ipekak.
• Fluoresensi kuning: colchicine, sanguinarin, berberine
3. Pereaksi Semprot: Dragendorff, iodoplatinat dll
 Identifying the Spots

Commercial TLC plate after Same TLC plate held under a

development UV lamp -
in normal lighting Note the appearance of
additional spots
 Interpreting the Data
The Rf value for each spot should be
calculated. Rf stands for "ratio of
fronts" and is characteristic for any
given compound on the same
stationary phase using the same
mobile phase for development of
the plates. Hence, known Rf values
can be compared to those of
unknown substances to aid in their
identifications.
 5. Spektrum UV dan IR

• Spektrum UV : Memberi petunjuk jenis gugus atau ikatan

kimia yang ada dalam molekul.
• Spektrum IR: jenis gugus dan ikatan kimia
 Kromatografi Kolom
› Untuk isolasi alkaloid skala besar
› Prinsipnya: penempatan campuran alkaloid (lar) di atas
kolom yg berisi serbuk penyerap (selulose, silika, poliamida),
lalu dielusi bertahap dg pelarut yg sesuai.
› Ukuran garis tengah:panjang kolom → 1:10 hingga1:30
› Sampel:fase diam → 1:50 hingga 1:500
› Ukuran fase diam 100-300 mesh
Kolom kromatografi
 CONTOH JURNAL
ISOLASI ALKALOID
 METODE
 Serbuk daun binahong  maserasi  n–heksana hingga
filtratnya jernih  disaring, residu hasil maseras diangin-
anginkan hingga kering  dimaserasi kembali menggunakan
etanol hingga filtratnya jernih.
 Ekstrak yang diperoleh  rotaryevaporator  ekstrak etanol.
 Ekstrak etanol + larutan HCl 2M hingga pH larutan menjadi 3.
 Larutan yang telah bersifat asam kemudian diekstraksi
menggunakan etil asetat.
 Hasil ekstraksi  terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan asam dan
lapisan etil asetat.
 Kedua lapisan dipisahkan, kemudian lapisan asam + NH4OH
hingga pH larutan mencapai 9 kemudian diekstraksi kembali
menggunakan etil asetat.
 Hasil ekstraksi akan terbentuk 2 lapisan yaitu lapisan basa
dan lapisan etil asetat, kemudian dipisahkan.
 Lapisan etil asetat  rotary evaporator  ekstrak alkaloid
total.
 Alkaloid total yang diperoleh Kromatografi Lapis Tipis
(KLT) dengan campuran pelarut etanol, etil asetat dan n-
heksana yang bersifat p.a dengan perbandingan 1:2:30
menggunakan plat silika gel 60GF254  diperoleh noda–
noda isolat.
 Selanjutnya dilakukan pemisahan menggunakan KLT
preparatif.
 Hasil isolat alkaloid kemudian di analisis strukturnya
menggunakan Spektroskopi UVVisible, FTIR dan LC–MS.
 Uji aktifitas senyawa tersebut dilakukan dengan menggunajan
metode Brine Shrimp LethalityTest (BSLT).
 HASIL DAN PEMBAHASAN
 Serbuk daun binahong dimaserasi menggunakan n-heksan
bertujuan untuk mengikat senyawa-senyawa metabolit
sekunder daun binahong yang bersifat non polar seperti
steroid dan triterpenoid.
 Selanjutnya dilakukan penyaringan.
 Residu yang telah kering kemudian dimaserasi kembali
menggunakan etanol hingga filtratnya jernih.
 Maserasi menggunakan etanol karena etanol dapat melarutkan
alkaloid.
 Alkaloid merupakan senyawa yang bersifat polar, sehingga
akan terikat dalam pelarut etanol.
 Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada ekstrak etanol
menunjukkan reaksi positif alkaloid yang ditandai dengan
adanya endapan putih pada penambahan pereaksi Meyer
dan terdapat endapan merah bata pada penambahan pereksi
Dragendorf
 Selanjutnya ekstrak etanol + larutan HCl hingga pH larutan 3
agar  terbentuk garam alkaloid.
 Larutan yang telah bersifat asam kemudian diekstraksi
menggunakan etil asetat.
 Hasil ekstraksi akan terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan bawah
yang merupakan lapisan asam dan lapisan atas merupakan
lapisan etil asetat.
 Kedua lapisan tersebut dipisahkan, kemudian lapisan asam
ditambahkan NH4OH hingga pH larutan mencapai 9.
 Perlakuan tersebut dilakukan agar garam alkaloid membentuk
basa bebas alkaloid
 Reaksi alkaloid dengan basa secara umum dapat dilihat pada
reaksi berikut:
 Hasil KLT menggunakan plat silika gel 60GF254 dan fasa
gerak yang digunakan adalah campuran pelarut etanol, etil
asetat dan n-heksana (1:2:30).
 UV 365 nm yakni dua buah noda yang berwarna biru dan
merah dengan Rf 0,65 dan 0,23.
 Berdasarkan hasil KLT, diketahui noda berwarna biru
merupakan alkaloid.  KLT preparatif  biru (murni
alkaloid).
 Rf: 0,82

Gambar 1. Hasil KLT isolat alkaoid

 Filtrat diuapkan untuk menghilangkan pelarut yang
terkandung di dalamnya sehingga dihasilkan kristal alkaloid.
Terhadap kristal alkaloid tersebut kemudian dianalisis
menggunakan spektrofotometer UV-Vis, FTIR dan LCMS.
 Hasil analisis isolat noda tunggal  panjang gelombang
maksimum (max) sebesar 265 nm 275 nm yang diindikasikan
bahwa senyawa tersebut termasuk dala golongan alkaloid
indol.
Gambar 2. Spektra UV-Vis isolat alkaoid
 Hasil analisis menggunakan spektrofotometer FTIR
menunjukkan gugus fungsi yang terdapat pada isolat murni.
 Senyawa alkaloid yang mengandung gugus O-H, NH, C-N,
C=C, C-O alkohol, C=O karboksilat dan CH2.
 Hasil spektogram MS 
berat molekul senyawa
yang diisolasi sebesar
389 g/mol
 Diduga isolat alkaloid yang telah diisolasi dari daun binahong
mengandung senyawa betanidin (C18H16N2O8).
 Referensi
 Paul M. Dewick, 2002, Medicinal Natural Product A Biosynthetic Approach,
2nd Ed., John Wiley and Sons, Ltd.
 Cannel R.J.P., 1998. How to Approach the Isolation of a Natural Product.
Natural Products Isolation, Totowa: Humana Press.
 Mann, J., et al., 1994, Natural Products: Their Chemistry and Biological
Significance, Longman, UK
 Samuelsson, G., 1999, Drugs of Natural Origin-A Textbook of
Pharmacognosy, 4th revised Ed., Apotekarsocieteten, Sweden
 Bruneton, J., 1999, Pharmacognosy Phytochemistry Medicinal Chemistry, 2nd
Ed., translated by Halton, C.K., Intercept Ltd., New York
 Hänsel, R., Sticher, O. (Eds.), 2007, Pharmakognosie-Phytopharmazie, 8th
Ed., Springer
 Jurnal-jurnal terkait