Manual Pewarnaan KOH

KOH melarutkan jaringan protein, termasuk keratin, dan menjadikannya transparan. Ini
memungkinkan jamur untuk divisualisasikan dengan lebih mudah. Calcofluor berikatan dengan
dinding sel chitinous jamur dan berfluoresensi di bawah sinar UV. Hal ini memungkinkan
sejumlah kecil jamur mudah dideteksi, membantu visualisasi morfologi mikroskopis, dan juga
dapat memfasilitasi pemeriksaan mikroskopis spesimen. Ini juga dapat membantu penyaringan
cepat spesimen oleh operator yang tidak berpengalaman. Sebagian besar spesimen cocok untuk
metode ini. Endapan cair KOH-calcofluor sangat penting untuk spesimen kulit, rambut, kuku,
dan jaringan dan mungkin berguna untuk pemeriksaan swab membran mukosa, urin, sputum
cair, dan spesimen pernapasan lainnya. Spesimen biopsi otak paling baik dievaluasi dengan
pewarnaan Gram, karena KOH menghasilkan artifak yang membingungkan. Karena konsentrasi
KOH yang tinggi bersifat kaustik, perlindungan tangan direkomendasikan. Prosedur KOH
(Potassium hydroxide) adalah metode yang digunakan untuk memeriksa spesimen ragi. KOH
berfungsi sebagai agen enzimatik yang memecah puing-puing dalam spesimen, seperti sel epitel
dan leukosit, untuk melihat ragi atau pseudohifa.
1. Bahan pereaksi ini biasanya 10 sampai 30% (berat/vol) kalium hidroksida dan 0,1%
calcofluor.
2. Tempatkan bahan yang akan diperiksa pada slide kaca, tambahkan setetes KOH, dan
letakkan kaca penutup di atasnya. Menghangatkan kaca objek pada blok pemanas atau di
atas api pilot pembakar Bunsen atau menginkubasinya pada suhu 30 C selama 20 menit
dapat mempercepat pencernaan jaringan dengan KOH (jangan direbus!). Spesimen
jaringan keratin harus dibiarkan pada suhu kamar selama 20 sampai 30 menit untuk
memungkinkan pencernaan dan "pembersihan" dari keratin.
3. Sebelum pemeriksaan, tekan preparat dengan kuat, misalnya dengan jarum pemasangan
atau spidol tertutup, dan buang kelebihan KOH dengan tisu kertas. Ini meningkatkan
tampilan, terutama dalam kasus spesimen kuku; namun, spesimen rambut juga harus
dilihat sebelum ditekan untuk membantu membedakan infeksi endotriks dan ektotriks.
4. Periksa dengan mikroskop fluoresen menggunakan sumber sinar UV dan filter yang
sesuai. Dengan filter emisi, jamur tampak kuning-hijau atau biru-hijau (tergantung filter
yang digunakan); tanpa filter, jamur berpendar putih terang. Periksa terlebih dahulu
dengan perbesaran 100, dengan fokus pada kemungkinan sel jamur pada perbesaran 400.
Dermatofita pada kulit atau kuku terlihat sebagai hifa bercabang atau artrospora.
Kebanyakan hifa akan bersisi sejajar dan lebarnya kira-kira 2 lm. Ragi hadir sebagai sel
tunas, pseudohifa, atau miselium ragi. Artefak, seperti serat, dapat dibedakan dari hifa
dengan kurangnya septa, ujung meruncing, dan perbedaan ukuran.
5. KOH-calcofluor dapat disimpan semalaman, lebih disukai di ruang lembab pada suhu 4C,
tetapi akhirnya hifa jamur pun terdegradasi oleh KOH, dan pengamatan segera
disarankan.
KOH and KOH-DMSO mount
Jika mikroskop fluoresensi tidak tersedia, dudukan KOH sederhana dapat digunakan. Dimetil
sulfoksida (DMSO) kadang-kadang ditambahkan ke reagen KOH untuk meningkatkan
pembersihan spesimen tanpa pemanasan atau inkubasi. Ini biasanya diperlukan hanya untuk
jaringan keratin atau fibrosa.
Yang harus dipersiapkan untuk reagen :
1. KOH
KOH dibuat sebagai 10 hingga 30% (berat/vol) kalium hidroksida dalam air atau dalam
20% (vol/vol) gliserol, yang membantu mencegah agar KOH tidak mengering.
2. KOH-DMSO
KOH-DMSO dibuat sebagai 20% (berat/vol) KOH dalam 40% (vol/vol) DMSO dalam
air suling.
3. Calcofluor white
Calcofluor white terdiri dari 0,1% (wt/vol) calcofluor white, baik M2R (Polysciences
Inc.; dijual juga sebagai Blankophor BA [Bayer]) atau Fluorescent Brightener 28
(Sigma), dalam air suling atau dengan 0,05% Evans blue sebagai counterstain . Persiapan
siap pakai yang dijual juga tersedia. Seringkali mudah untuk membuat larutan KOH 20
sampai 40% dan setiap hari membuat larutan yang berfungsi dengan mencampurkan 1:1
ini dengan 0,1% calcofluor. Ini dapat disaring terlebih dahulu (Whatman no. 1) untuk
menghilangkan kristal calcofluor.
Dibawah ini penjelasan singkat bagaimana cara melakukan manual pewarnaan KOH.
Yang harus disediakan :
1. Alat pelindung diri
2. Wadah benda tajam
3. Wadah dan kantong limbah biologis
4. Slide mikroskop steril
5. Pipet steril
6. Kaca penutup kaca
7. Kalium hidroksida (KOH)
Yang harus dilakukan :
1. Campur spesimen dengan baik.
2. Dengan menggunakan pipet steril, keluarkan satu tetes atau 10 mikroliter spesimen dari
tabung.

3. Teteskan satu tetes (10 µL) spesimen pada slide mikroskop bersih dengan nomor
identifikasi pasien.

4. Tanpa menyentuh spesimen, tambahkan satu tetes (10 µl) Kalium hidroksida (KOH) 10%
langsung ke tetesan spesimen pada slide.

5. Tempatkan kaca penutup pada tetesan pada slide.

6. Tempatkan slide pada mikroskop brightfield, fokus menggunakan daya rendah (10X),
dan pindai setidaknya 10 bidang menggunakan daya kering tinggi (40X).

7. Periksa ragi pemula atau ragi dengan pseudohifa.

8. Catat hasil berdasarkan kriteria laboratorium Anda.

 DAFTAR PUSTAKA

https://www.cdc.gov/labtraining/docs/job_aids/routine_microscopy_procedures/KOH-
Procedure_508.pdf