Imunofluoresensi

Immunofluorescence (IF) adalah teknik laboratorium umum, yang didasarkan pada

penggunaan antibodi spesifik yang secara kimia terkonjugasi dengan pewarna
fluoresen.
Antibodi berlabel ini mengikat secara langsung atau tidak langsung dengan antigen
seluler (lihat di bawah). Teknik ini memiliki sejumlah aplikasi biologis yang
berbeda termasuk evaluasi sel dalam suspensi, sel biakan, jaringan, manik-manik
dan dalam microarray.
Pewarnaan fluorescent dikenakan cahaya pendek, energi tinggi, yang diserap dan
dipancarkan sebagai cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Fluoresensi
yang dipancarkan memiliki energi yang lebih rendah daripada cahaya yang diserap,
sehingga panjang gelombang cahaya yang dipancarkan lebih panjang daripada
cahaya eksitasi. Fluoresensi dapat divisualisasikan menggunakan mikroskop
fluoresensi. Teknik IF memungkinkan untuk visualisasi keberadaan serta distribusi
molekul target dalam sampel.
Jenis imunofluoresensi
Ada dua kelas teknik imunofluoresensi, primer (atau langsung) dan sekunder (atau
tidak langsung).
Primer (langsung)
Imunofluoresensi primer atau langsung menggunakan antibodi tunggal yang secara
kimia terkait dengan fluorofor. Antibodi mengenali molekul target dan berikatan
dengannya, dan fluorofor yang dibawanya dapat dideteksi melalui
mikroskop. Teknik ini memiliki beberapa keunggulan dibandingkan protokol
sekunder (atau tidak langsung) di bawah ini karena konjugasi langsung dari antibodi
ke fluorofor. Ini mengurangi jumlah langkah dalam prosedur pewarnaan membuat
proses lebih cepat dan dapat mengurangi sinyal latar belakang dengan menghindari
beberapa masalah dengan reaktivitas silang antibodi atau non-spesifisitas. Namun,
karena jumlah molekul fluoresen yang dapat terikat pada antibodi primer terbatas,
imunofluoresensi langsung kurang sensitif daripada imunofluoresensi tidak
langsung.
Sekunder (tidak langsung)
Imunofluoresensi sekunder atau tidak langsung menggunakan dua
antibodi; antibodi pertama (primer) yang tidak berlabel secara spesifik mengikat
molekul target, dan antibodi sekunder, yang membawa fluorofor, mengenali
antibodi primer dan mengikatnya. Beberapa antibodi sekunder dapat mengikat satu
antibodi primer. Ini memberikan penguatan sinyal dengan meningkatkan jumlah
molekul fluorophore per antigen. Protokol ini lebih kompleks dan memakan waktu
daripada protokol primer (atau langsung) di atas, tetapi memungkinkan lebih
banyak fleksibilitas karena berbagai antibodi sekunder dan teknik deteksi yang
berbeda dapat digunakan untuk antibodi primer yang diberikan. Prinsip
Imunofluoresensi
Imunofluoresensi adalah uji yang digunakan terutama pada sampel biologis dan
secara klasik didefinisikan sebagai prosedur untuk mendeteksi antigen dalam
konteks seluler menggunakan antibodi. Spesifisitas antibodi terhadap antigennya
adalah dasar untuk imunofluoresensi. Sampel biologis termasuk jaringan dan
sel. Imunofluoresensi memungkinkan para peneliti mengevaluasi apakah sel-sel
dalam sampel tertentu mengekspresikan antigen yang dimaksud. Dalam kasus-
kasus di mana sinyal imunopositif ditemukan, imunofluoresensi juga
memungkinkan para peneliti untuk menentukan kompartemen subseluler mana
yang mengekspresikan antigen. Imunofluoresensi dapat digunakan pada garis sel
yang dikultur, bagian jaringan, atau sel individu.
Imunofluoresensi dapat digunakan untuk menganalisis distribusi protein, glikans,
dan molekul biologis dan non-biologis yang kecil. Imunofluoresensi telah banyak
digunakan dalam penelitian biologi dan hasil penelitian medis dan menjadi salah
satu metode yang paling penting dan efektif
Ada dua uji imunofluoresensi yang berbeda yang meliputi uji imunofluoresensi
tidak langsung dan uji imunofluoresensi langsung. Untuk uji imunofluoresensi
tidak langsung, protokol tersebut terutama meliputi pengaturan jaringan atau
penentuan sel, fiksasi jaringan atau sel, pemblokiran serum, inkubasi antibodi
primer, inkubasi antibodi kedua yang ditandai, pewarnaan, hasil penilaian dan
pencitraan. Untuk uji imunofluoresensi langsung, hanya ada antibodi primer yang
ditandai telah diinkubasi tanpa antibodi kedua dan langkah-langkah lainnya sama.
Diagram langsung Imunofluoresensi / IF / ICC

Diagram langsung Immunofluorescence / IF / ICC

Pusat Teknologi Immunofluorescence / IF / ICC

Immunofluorescence, juga dikenal sebagai teknologi antibodi fluorescent, adalah
penanda perkembangan awal teknologi kekebalan tubuh. Teknik ini adalah teknik
yang didasarkan pada imunologi, biokimia, dan mikroskop.
Ada dua metode imunofluoresensi: metode antibodi imunofluoresensi bahwa
antibodi imunofluoresensi digunakan untuk melacak antigen dan metode antigen
imunofluoresensi yang antigen immunofluoresensi digunakan untuk melacak
antibodi. Kedua metode ini digunakan secara umum. Metode ini digunakan untuk
menentukan hasil mikroskop fluoresensi setelah reaksi antibodi antigen. Metode ini
digunakan untuk melabeli antibodi atau antigen dengan fluorescein. Fluorescein
yang umum digunakan termasuk FITC, RB200, TRITC dan PE.
Imunofluoresensi yang digunakan dalam Sino Biological Inc. adalah teknik ampuh
yang memanfaatkan antibodi berlabel fluoresen untuk mendeteksi antigen target
spesifik. Imunofluoresensi menggunakan antibodi primer tunggal yang secara
kimia terkait dengan fluorofor.Antibodi primer mengenali antigen target dan
berikatan dengan epitop tertentu. Fluorofor terlampir dapat dideteksi melalui
mikroskop fluoresen. Teknik ini sangat sensitif dan serbaguna dan menemukan
banyak aplikasi di bidang imunologi, morfologi sel, genetika, diagnostik dan
histopatologi.
Imunofluoresensi dapat digunakan untuk menganalisis ekspresi protein, glikans,
dan molekul non-biologis lainnya.Imunofluoresensi dapat digunakan untuk
mendeteksi molekul dalam jaringan dan sel. Mikroskop epifluoresensi adalah yang
paling sederhana untuk hasil pembacaan.Mikroskop confocal juga banyak
digunakan.
Diagnosis Laboratorium Infeksi Virus
Dalam Virologi Veteriner Fenner (Edisi Kelima) , 2017
Pewarnaan Imunofluoresensi
Pewarnaan immunofluorescence atau fluorescent antibody adalah tes pendeteksian
antigen yang digunakan terutama pada bagian jaringan beku, “smear” sel, atau sel
yang dikultur;sampel jaringan formalin-fix umumnya tidak berguna dengan
prosedur ini. Antigen dideteksi melalui pengikatan ke matriks sampel dari antibodi
khusus agen yang dimodifikasi secara khusus. Modifikasi adalah “penandaan”
antibodi dengan fluorochrome yang menyerap sinar ultraviolet dari panjang
gelombang yang ditentukan, tetapi memancarkan cahaya pada panjang gelombang
yang lebih tinggi. Cahaya yang dipancarkan terdeteksi secara optik dengan
mikroskop khusus yang dilengkapi dengan filter khusus untuk panjang gelombang
emisi fluorochrome.Fluorokrom dapat diikat langsung ke antibodi spesifik agen
(imunofluoresensi langsung ) atau dapat dilekatkan pada suatumolekul anti-
imunoglobulin yang mengenali antibodi spesifik-agen (tidak
langsungimunofluoresensi) ( Gambar 5.3A ). Metode tidak langsung
meningkatkan sensitivitas tes, tetapi juga dapat meningkatkan latar belakang.

Gambar 5.3 . (A) Imunofluoresensi. Kiri: Metode langsung. Kanan: Metode tidak
langsung. (B) Imunohistokimia. Kiri: Metode langsung. Kanan: Metode tidak
langsung.
Pewarnaan imunofluoresensi memang membutuhkan peralatan khusus, termasuk
cryostat untuk memotong jaringan beku bersama dengan mikroskop fluoresen
untuk mendeteksi antibodi yang terikat. Imunofluoresensi telah terbukti sangat
berharga dalam identifikasi antigen virus dalam sel yang terinfeksi yang diambil
dari hewan atau dalam sel yang dikultur yang diinokulasi dengan spesimen dari
hewan yang terinfeksi. Uji Utama berdasarkan metode
Hasil preparat positif didapatkan
akibat dari reaksi antigen-antibodi kompleks
(WHO 1996) yang berwarna hijau
fluorescence dengan ukuran bervariasi. Hasil
negatif jika tidak memberikan warna
fluorescence
Immunofluorescence tak langsung sebagai
pemeriksaan imunologis guna mendeteksi
adanya antigen atau mencari lokalisasi antigen
dalam jaringan insang dan dalam sel darah (sel
specimen yang merupakan sekumpulan dari
satu bagian atau lebih bahan yang diambil
langsung dari suatu sistem dengan pewarnaan
florescence. Dengan menggunakan metode tak
langsung, imunofluoresensi menggunakan dua
antibodi; yang berlabel pertama (primer)
antibodi khusus mengikat molekul target
setelah proses fiksas, antibodi sekunder yangikonjugasikan dengan zat fluorophore
tersebut akan mengikat antibodi primer
tunggal. Hal ini akan memperkuat pengikatan
jumlah molekul fluorophore per antigen. .
Menurut Kresna, 2011 metode
Immunofluorescence ini memiliki beberapa
keunggulan antara lain bahwa metode ini
merupakan metode yang cukup sederhana dan
cepat untuk dilakukan dengan tingkat
kepercayaan yang tinggi. Uji ini merupakan
suatu metode untuk memeriksa adanya
antibody atau antigen dengan menggunakan
label fluorosence yang akan berpendar jika
dilihat dibawah mikroskop ultraviolet.

1. Huligol SC, Bhogal BS, Black MM. Immunofluorescence of the immunobullous

disorders: Part one: Methodology. Indian J Dermatol Venereol Leprol
1995;61:187-95.

2. Vassileva S. Immunofluorescence in Dermatology. Int J Dermatol 1993;32:153-

61. [PUBMED]

3. Jablonska S, Chlorzelski T, Blaszyk M, Maciejewski W. Pathogenesis of pemphigus

erythematosus. Arch Dermatol Res 1977;258:135-40.

4. Chlorzelski TP, Butneur EH. Factors contributing to occasional failure in

demonstration of pemphigus antibodies by immunofluorescence test. J Invest
Dermatol 1969:53:188-91.

5. Rao R, Shenoi SD. Indirect immunofluorescence to demonstrate lichen planus

specific antigen (LPSA) in Lichen planus. Indian J Dermatol Venereol Leprol
2006;72:350-2.

6. Feliciana C, Pour SM ,Toto P, Coscione G, Amerio P. Direct immunofluorescence

diagnosis of pemphigus without biopsy. J Cutan Med Surg 1998;2:209-11.

7. Brystryn JC, Sabolinski M. Effect of substrate on indirect immunofluorescence tests

for intercellular and basement membrane zone antibodies. J Am Acad Dermatol
1986;15:973-7.
8. Ratnam KV, Pang BK. Pemphigus in Remission: Value of negative Direct
Immunofluorescence in management. J Am Acad Dermatol 1994;30:547-
50. [PUBMED]

9. Bhogal B, Wojnarowska F, Black MM, Xu W, Levene GM. The distribution of

immunoglobulins and the C3 component of complement in multiple biopsies from
the uninvolved and perilesional skin in pemphigus. Clin Exp Dermatol 1986;11:49-
53. [PUBMED]