Judul jurnal : Summary (kesimpulan ) mengenai : Laboratory Methods For The

Diagnosis Of Vibrio Cholerae

Tugas : Bakteriologi II

Nama Mahasiswa : Andi Wafiq Alfiah Muthasyah Wahyudi

Nim : PO713203191002

Dosen pengajar : St. Hadijah, S.Si., M.Kes

Anggota genus Vibrio adalah bakteri batang gram negatif secara fakultatif,
asporogen, motil, melengkung atau lurus. Vibrio membutuhkan NaCl atau
pertumbuhannya dirangsang dengan penambahannya. Semua anggota genus Vibrio,
dengan pengecualian V. metschnikovii dan V. gazogenes, bersifat oksidase positif
dan mereduksi nitrat menjadi nitrit. Dalam Vibrionaceae Ada banyak spesies berbeda. .
Dari lebih dari 30 spesies di dalam Vibrio-Photobacterium kompleks, hanya 12 yang
telah diakui sebagai patogen bagi manusia. Meskipun sebagian besar dari 12 spesies
ini diisolasi dari infeksi usus dan ekstraintestinal saja V. cholerae dikaitkan dengan
epidemi kolera.

1. Identifikasi serologi V.cholerae O1

Penggunaan antisera adalah salah satu metode identifikasi yang paling cepat
dan spesifik V. cholerae O1. Meskipun mengidentifikasi serogrup dan serotipe V.
cholerae isolat tidak diperlukan untuk pengobatan kolera, informasi ini mungkin
penting bagi epidemiologi dan kesehatan masyarakat.
1) Serogrup dari V.cholerae
Saat ini, terdapat lebih dari 130 serogrup V. cholerae, berdasarkan adanya
antigen O somatik. Namun, hanya serogrup O1 yang dikaitkan dengan epidemi
dan pandemi kolera. Serogrup lain mungkin terkait dengan diare berat, tetapi
tidak memiliki potensi epidemi dari isolat O1 dan tidak teraglutinasi dalam
antisera O1. Isolasi dari V.
2) Serotype dari V.cholerae O1
Isolat dari serogrup O1 dari V. cholerae telah dibagi lagi menjadi tiga serotipe,
Inaba, Ogawa, dan Hikojima (sangat jarang). Identifikasi serotipe didasarkan
pada aglutinasi antisera terhadap antigen O spesifik tipe. Identifikasi antigen
ini hanya valid dengan isolat serogrup 1. Oleh karena itu, antisera Inaba dan
Ogawa tidak boleh digunakan dengan strain yang negatif dengan antisera
polivalen O1.
3) Aglutinasi geser
Tes aglutinasi untuk V. cholerae antigen O somatik dapat dilakukan dalam
cawan petri atau pada kaca objek yang bersih. Jarum atau loop inokulasi, atau
tongkat aplikator steril, atau pencabut gigi digunakan untuk menghilangkan
 sebagian pertumbuhan dari permukaan agar infus jantung (HIA), agar besi
Kligler (KIA), agar besi gula triple (TSI), atau media agar nonselektif lainnya.
Emulsi pertumbuhan dalam setetes kecil garam fisiologis dan aduk secara
menyeluruh dengan memiringkan bolak-balik selama sekitar 30 detik. Periksa
suspensi dengan hati-hati untuk memastikan bahwa suspensi tersebut rata
dan tidak menunjukkan penggumpalan karena autoagglutination. Jika terjadi
penggumpalan, biakan disebut "kasar" dan tidak dapat diserotipe. Jika
suspensi halus (keruh dan mengalir bebas), tambahkan sedikit antiserum ke
dalam suspensi.
2. Identifikasi Biokimia V.cholerae
1) Uji oksidase
Lakukan uji oksidase dengan pertumbuhan segar dari kemiringan HIA atau
media yang tidak mengandung karbohidrat. Jangan gunakan pertumbuhan dari
agar-agar tiosulfat sitrat garam empedu sukrosa (TCBS). Tempatkan 2 hingga 3
tetes reagen oksidase (1% tetrametil- p- phenylenediamine) pada selembar
kertas saring dalam cawan petri. Olesi kultur di atas kertas basah dengan
simpul platinum (bukan nichrome), tongkat aplikator kayu steril, atau tusuk
gigi. Dalam reaksi positif, pertumbuhan bakteri menjadi ungu tua dalam 10
detik. Perkembangan warna setelah 10 detik harus diabaikan. Pengendalian
positif dan negatif harus diuji pada waktu yang bersamaan. Organisme dari
genera Vibrio, Neisseria, Campylobacter, Aeromonas, Plesiomonas,
2) Tes tali
Uji tali dapat dilakukan pada slide mikroskop kaca atau cawan petri plastik
dengan menangguhkan pertumbuhan 18 hingga 24 jam dari HIA atau media
non-penghambat lainnya dalam setetes larutan natrium deoksikolat 0,5%. Jika
hasilnya positif maka sel bakteri akan terlarut oleh natrium deoksikolat,
suspensi akan kehilangan kekeruhan, dan DNA akan terlepas dari sel yang
terlisis sehingga campuran menjadi kental. Sebuah "string" mukoid terbentuk
ketika loop inokulasi ditarik perlahan dari suspense. Kebanyakan vibrio positif,
sedangkan Aeromonas strain biasanya negatif.
3) KIA (kligler’s iron agar) dan TSIA (triple sugar iron agar)
KIA dan TSI adalah media skrining yang mengandung karbohidrat yang banyak
digunakan dalam mikrobiologi diagnostik. Meskipun serupa dalam
penggunaannya, kedua media tersebut memiliki variasi karbohidrat yang
dikandungnya. Reaksi V. cholerae di KIA, yang mengandung glukosa dan
laktosa, mirip dengan nonfermentasi laktosa Enterobacteriaceae. TSI yang
mengandung sukrosa selain glukosa dan laktosa memberikan reaksi A / A,
tanpa gas, dan tanpa H. 2 Kemiringan S. KIA atau TSA diinokulasi dengan cara
menusuk pantat dan menggores permukaan medium. Miring harus diinkubasi
pada suhu 35̊ sampai 37̊ C dan diperiksa setelah 18 sampai 24 jam. Penutup
pada semua tabung biokimia harus dilonggarkan sebelum inkubasi, tetapi ini
sangat penting untuk kemiringan KIA atau TSI. Jika tutupnya terlalu rapat dan
 kondisi anaerobik ada di tabung KIA atau TSI, reaksi karakteristiknya adalah V.
cholerae mungkin tidak diperlihatkan reaksi yang tidak pantas akan terjadi

4) Karbohidrat
Kaldu glukosa dan sukrosa harus diinokulasi sedikit dari pertumbuhan segar.
Kaldu harus diinkubasi pada suhu 35̊ sampai 37̊ C dan dibaca pada 24 jam. Jika
tes fermentasi negatif pada 24 jam, mereka harus diinkubasi hingga 7 hari.
V. cholerae memfermentasi glukosa dan sukrosa tetapi tidak menghasilkan gas
dalam salah satu karbohidrat.
5) Reaksi dekarboksilase
Kaldu arginin, lisin, ornitin, dan kontrol (tanpa asam amino) yang dimodifikasi
dengan penambahan NaCl 1% harus diinokulasi secara ringan dari biakan
segar. Kaldu di setiap tabung harus dilapisi dengan 4 sampai 5 mm minyak
mineral steril. Inkubasi pada suhu 35̊ hingga 37̊ C dan baca pada 24 hingga 48
jam, tetapi jika tes negatif maka harus diinkubasi hingga 7 hari. Jika digunakan
indikator warna ungu bromkresol dan merah kresol, maka reaksi basa (positif)
berwarna ungu, sedangkan reaksi negatif atau asam ditunjukkan dengan
warna kuning . Tes ini hanya valid jika tabung kontrol tetap negatif (kuning).
6) Kaldu garam
Kaldu garam 0% dan 1% (basis kaldu nutrisi [Difco Laboratories, Detroit,
Michigan]; lihat Bab XI, “Persiapan Media dan Reagen,” untuk instruksi khusus
untuk persiapan kaldu uji garam) harus diinokulasi dengan sangat ringan dari
kaldu segar pertumbuhan.
7) Tes voges proskauer
Laboratorium rujukan CDC menggunakan modifikasi prosedur uji Voges-
Proskauer yang meningkatkan kepekaannya terhadap vibrios. Dalam
modifikasi ini, media uji (MR-VP broth) menggabungkan 1% NaCl, reagen A
terdiri dari 5% alfa-naftol dalam etanol absolut, dan reagen B adalah larutan
kreatin 0,3% dalam 40% KOH (kalium hidroksida). Organisme uji diinkubasi
dalam kaldu MR-VP selama 48 jam sebelum reagen A dan B ditambahkan.
Warna merah ceri menunjukkan reaksi positif
8) Kerentangan terhadap senyawa vibriostatic O /129
Kerentanan terhadap 2,4-diamino-6,7-diisopropyl-pteridine fosfat (disebut
sebagai O / 129 atau senyawa vibriostatik) telah direkomendasikan dan
digunakan sebagai alat utama untuk membedakan antara Vibrio ( yang sensitif
terhadap O / 129) dan Aeromonas ( tahan terhadap O / 129). Sedangkan
sebagian besar isolat V. cholerae sensitif terhadap O / 129.
3. Pengujian hemolysis
1) Piring hemolysis
Piring agar darah yang mengandung 5% sampai 10% darah domba harus
digores untuk mendapatkan koloni yang terisolasi. Pelat harus diinkubasi pada
suhu 35̊ sampai 37̊ C selama 18 sampai 24 jam. Koloni hemolitik harus memiliki
 zona yang jelas di sekitarnya di mana sel darah merah telah terlarut secara
total, dan dugaan strain hemolitik harus dibandingkan dengan strain kontrol
hemolitik yang kuat (Gambar VI-9). Strain yang menyebabkan hemolisis tidak
lengkap (pembersihan sel darah merah yang tidak tuntas) sebaiknya tidak
dilaporkan sebagai hemolitik.
2) Uji tabung hemolysis
 Cuci 20 ml eritrosit domba dalam 25 ml larutan saline buffer
fosfat (PBS), 0,01 M, pH 6,8-7,2. Ulangi dua kali untuk total 3
kali pencucian. Siapkan suspensi 1% (vol / vol) dari eritrosit
domba yang dikemas dalam PBS.
 Dari pertumbuhan segar, inokulasi strain uji dan kontrol ke
dalam kaldu infus jantung (atau kaldu kedelai Trypticase)
dengan 1% gliserol (pH 7,4) dan diinkubasi pada suhu 35 ˚
hingga 37̊ C selama 24 jam. Setelah inkubasi, sentrifuse ke
sedimen sel bakteri; angkat supernatan dengan pipet Pasteur.
 Membagi supernatan menjadi dua porsi yang sama. Satu
alikuot dipanaskan sampai 56̊ C selama 30 menit. Buat
pengenceran dua kali lipat dari supernatan yang dipanaskan
dan yang tidak dipanaskan dalam PBS (encerkan menjadi 1:
1,024).
 Tambahkan 0,5 ml suspensi 1% eritrosit domba dalam PBS ke
0,5 ml setiap pengenceran supernatan.
 Inkubasi dalam penangas air dengan suhu 37̊ C selama 2 jam.
Lepaskan suspensi dari penangas air, dan tahan semalaman
pada suhu 4̊ C.
 Periksa bukti hemolisis. Sel darah merah yang tidak
terhemolisis akan mengendap di dasar tabung reaksi dan
membentuk “tombol” (Gambar VI-10). Tidak ada tombol yang
akan muncul jika sel dilisis oleh hemolisin. Titer hemolysin
harus dicatat sebagai pengenceran tertinggi di mana hemolisis
lengkap telah terjadi.
 Bandingkan hasil supernatan yang dipanaskan dan yang tidak
dipanaskan. Tabung yang dipanaskan seharusnya tidak
menunjukkan hemolisis, karena hemolysin V. cholerae tidak
tahan panas, dan jika ada, dinonaktifkan dengan inkubasi 56̊ C
(langkah 3, di atas). Titer 2 sampai 8 dianggap sedang, dan
titer 16 atau lebih tinggi sangat positif.

4. Pegujian penentuan biotipe V.cholerae O1

Diferensiasi V. cholerae O1 ke dalam biotipe klasik dan El Tor tidak diperlukan untuk
pengendalian atau pengobatan pasien, tetapi mungkin penting bagi kesehatan
masyarakat atau epidemiologi dalam membantu mengidentifikasi sumber infeksi,
terutama ketika kolera pertama kali diisolasi di suatu negara atau wilayah geografis.
 Biotyping tidak sesuai untuk V. cholerae non-O1, dan tes dapat memberikan hasil
atipikal untuk nontoxigenic V. cholerae O1.
1) Tes Voges-proskauer
Tes Voges-Proskauer telah digunakan untuk membedakan antara El Tor dan
biotipe klasik V. cholerae O1. Biotipe klasik biasanya memberikan hasil negatif;
Isolat El Tor umumnya positif.
2) Sesitivitas polimiksin B
Sensitivitas terhadap agen antimikroba polymyxin B telah digunakan untuk
membedakan biotipe V. cholerae O1
3) Hemaglutinasin (uji langsung)
4) Kerentanan bakteriofag

5. Pengujian kerentanan antimikroba (metode difusi disk agar)

Metode difusi cakram yang disajikan di sini telah distandarisasi dengan cermat oleh
Komite Nasional untuk Standar Laboratorium Klinis (NCCLS) dan jika dilakukan secara
tepat sesuai dengan protokol di bawah ini, akan memberikan data yang dapat
diandalkan untuk memprediksi efektivitas in vivo obat yang dimaksud. Namun, setiap
penyimpangan dari metode ini dapat membuat hasil tidak valid. Untuk alasan ini, jika
laboratorium kekurangan sumber daya untuk melakukan uji difusi cakram persis
seperti yang dijelaskan, mereka harus meneruskan isolat ke laboratorium lain untuk
pengujian kerentanan
1) Pertimbangan khusus untuk pengujian kerentanan V.cholerae
Ketika agen antimikroba digunakan, penting untuk memilih salah satu yang
rentan terhadap organisme. Agen antimikroba yang direkomendasikan oleh
WHO untuk mengobati pasien kolera termasuk tetrasiklin, doksisiklin,
furazolidon, trimetoprim-sulfametoksazol, eritromisin, atau kloramfenikol.
Ciprofloxacin dan norfloksasin juga efektif. Karena resistensi antimikroba telah
menjadi masalah yang berkembang di banyak bagian dunia, kerentanannya V.
cholerae Strain O1 untuk agen antimikroba harus ditentukan pada awal
epidemi dan dipantau secara berkala.
2) Prosedur difusi disk agar
 Agar uji kerentanan Mueller-hinton
Media agar Mueller-Hinton merupakan satu-satunya media uji
kerentanan yang telah divalidasi oleh NCCLS. Agar Mueller-Hinton
harus selalu digunakan untuk pengujian kerentanan difusi cakram,
menurut NCCLS dan pedoman internasional.
 Standar kekeruhan McFarland
Standar McFarland 0.5 harus disiapkan dan kualitasnya dikontrol
sebelum memulai pengujian kerentanan (lihat Bagian 3). Jika ditutup
rapat untuk mencegah penguapan dan disimpan dalam gelap, standar
dapat disimpan hingga 6 bulan. Standar McFarland digunakan untuk
mengatur kekeruhan inokulum untuk uji kerentanan.
 Persiapan inoculum
 Setiap biakan yang akan diuji harus dioleskan ke media agar non-
penghambat (agar darah, agar infus jantung otak, atau agar kedelai
tryptone) untuk mendapatkan koloni yang terisolasi. Setelah inkubasi
pada suhu 35̊ C semalaman, pilih 4 atau 5 koloni yang terisolasi dengan
baik dengan jarum atau loop yang diinokulasi, dan pindahkan
pertumbuhan ke tabung larutan saline steril (lihat Bagian 3) atau kaldu
nonselektif (kaldu Mueller-Hinton, kaldu infus jantung, atau kaldu
kedelai tryptone) dan pusaran secara menyeluruh. Suspensi bakteri
kemudian harus dibandingkan dengan standar 0,5 McFarland.
Perbandingan ini dapat dibuat dengan lebih mudah jika tabung dilihat
dengan selembar kertas putih di mana garis hitam tajam ditarik.
Standar kekeruhan harus digerakkan pada cermin vortex segera
sebelum digunakan. Jika suspensi bakteri tidak memiliki kepadatan
yang sama dengan standar McFarland 0,5
 Prosedur inokulasi
Dalam waktu 15 menit setelah mengatur kekeruhan suspensi
inokulum, celupkan kapas steril ke dalam suspensi. Tekan dengan kuat
ke dinding bagian dalam tabung tepat di atas permukaan cairan, putar
kapas untuk menghilangkan kelebihan cairan. Oleskan kapas ke
seluruh permukaan media tiga kali, putar pelat kira-kira 60 derajat
setelah setiap aplikasi untuk memastikan distribusi inokulum yang
merata. Terakhir, usap di sekitar tepi permukaan agar-agar.
 Disk antimikroba
Pasokan kerja dari disk antimikroba harus disimpan di lemari es (4̊ C).
Setelah disk dikeluarkan dari lemari es, kemasan yang berisi kartrid
harus dibiarkan tidak dibuka pada suhu kamar selama kurang lebih 1
jam agar suhu seimbang. Ini mengurangi jumlah kondensasi pada disk.
Jika peralatan dispensing disk digunakan, peralatan tersebut harus
memiliki penutup yang rapat, disimpan di lemari es, dan dibiarkan
hangat hingga suhu kamar sebelum digunakan. Oleskan disk
antimikroba ke piring sesegera mungkin, tetapi tidak lebih dari 15
menit setelah inokulasi. Tempatkan disk satu per satu dengan penjepit
steril atau dengan alat dispensing mekanis, lalu tekan perlahan ke
bawah agar-agar. Secara umum, letakkan tidak lebih dari 12 disk pada
pelat 150 mm dan tidak lebih dari 4 disk pada pelat 100 mm. Ini
mencegah tumpang tindih zona hambatan dan kemungkinan
kesalahan dalam pengukuran. Difusi obat di dalam cakram segera
dimulai; oleh karena itu, sekali disk menyentuh permukaan agar-agar,
disk tidak boleh dipindahkan.

 Mencatat dan menafsirkan hasil

Setelah disk ditempatkan di atas pelat, balikkan pelat dan inkubasi
pada suhu 35 ˚ C selama 16 sampai 18 jam. Setelah inkubasi, ukur
 diameter zona penghambatan lengkap (termasuk diameter cakram)
dan catat dalam milimeter. Pengukuran dapat dilakukan dengan
penggaris pada permukaan bawah pelat tanpa membuka tutupnya.
Dengan sulfonamida dan trimetoprim-sulfametoksazol, sedikit
pertumbuhan dapat terjadi di dalam zona penghambatan. Dalam hal
ini, pertumbuhan kecil (hambatan 80%) harus diabaikan dan diameter
zona harus diukur dengan margin pertumbuhan yang berat. Zona
hambatan pertumbuhan harus dibandingkan dengan tabel
interpretatif ukuran zona (lihat Tabel VI-8), dan dicatat sebagai rentan,
sedang, atau resisten terhadap setiap obat yang diuji. Koloni yang
tumbuh dalam zona hambat yang jelas mungkin merupakan varian
resisten atau inokulum campuran. Jarak dari koloni yang paling dekat
dengan cakram ke pusat cakram harus diukur dan kemudian
digandakan untuk mendapatkan diameter. Diameter zona bening luar
harus dicatat juga dan interpretasi dicatat untuk setiap diameter.
Koloni di dalam zona harus diambil, diisolasi kembali, diidentifikasi
kembali, dan diuji ulang dalam uji difusi cakram untuk mengkonfirmasi
hasil sebelumnya. Kehadiran koloni dalam zona hambatan dapat
memprediksi resistensi akhirnya terhadap agen tersebut.
 Control kualitas
Untuk memverifikasi bahwa hasil uji kerentanan akurat, penting untuk
memasukkan setidaknya pada organisme kontrol (ATCC 25922 adalah
E. coli regangan kontrol yang digunakan saat pengujian
Enterobacteriaceae dan V. cholerae) dengan setiap tes. Diameter zona
diperoleh untuk ATCC 25922). Jika zona yang dihasilkan oleh regangan
kontrol berada di luar kisaran yang diharapkan, laboratorian harus
mempertimbangkan kemungkinan sumber kesalahan.
3) Persiapan dan control kualitas media dan reagen
 Agar Mualler-Hilton
Ikuti petunjuk pabrik untuk menyiapkan media. Setelah proses
autoklaf, dinginkan medium hingga 50̊ C. Ukur 60 hingga 70 ml media
per piring ke dalam piring 15 x 150 mm, atau ukur 25 hingga 30 ml per
piring menjadi piring 15 x 100 mm. Agar-agar harus dituangkan ke
dalam gelas dengan alas datar atau cawan petri pada permukaan
penuangan yang rata dengan kedalaman seragam 4 mm.
Menggunakan lebih banyak atau lebih sedikit agar-agar akan
mempengaruhi hasil kerentanan. Agar lebih dalam dari 4 mm dapat
menyebabkan hasil resistansi palsu, sedangkan agar dengan
kedalaman kurang dari 4 mm dapat dikaitkan dengan laporan
kerentanan palsu. 63 | P usia Metode Laboratorium untuk Diagnosis
Vibrio cholerae Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit
Identifikasi Laboratorium Vibrio cholerae Piring yang baru disiapkan
dapat digunakan pada hari yang sama atau disimpan di lemari es (2̊
 hingga 8̊ C) hingga 2 minggu. Jika pelat tidak digunakan dalam waktu 7
hari setelah persiapan, pelat tersebut harus dibungkus dengan plastik
untuk meminimalkan penguapan. Tepat sebelum digunakan, jika
kelembapan berlebih ada di permukaan, pelat harus ditempatkan di
inkubator ˚ (̊ 3 t 5 o 37̊ C) sampai uap air menguap (biasanya 10 sampai
30 menit). Jangan biarkan tutupnya terbuka karena medianya mudah
terkontaminasi. Setiap lot baru harus dikontrol kualitasnya sebelum
digunakan dengan menguji E. coli Strain standar ATCC 25922 dan /
atau Staphylococcus aureus ATCC 25923. Strain standar ini digunakan
dengan setiap uji coba untuk Enterobacteriaceae dan aerob gram
positif, masing-masing. PH setiap lot baru Mueller-Hinton harus antara
7,2 hingga 7,4. Jika di luar kisaran tersebut, pH media sebaiknya tidak
disesuaikan dengan penambahan asam atau basa; tumpukan pelat
harus dibuang dan sejumlah pelat baru disiapkan. Jika pH untuk setiap
batch terlalu tinggi atau rendah, seluruh lot media dehidrasi mungkin
harus dikembalikan ke pabrik karena tidak memuaskan

 Standar kekeruhan (McFarland)

Standar kekeruhan McFarland 0.5 tersedia dari berbagai produsen.
Sebagai alternatif, 0,5 McFarland dapat dibuat dengan menambahkan
0,5 ml barium klorida dihidrat 1,175% (wt / vol). (BaCl 2 • 2H 2 O)
larutan ke 99,5 ml asam sulfat 1% (vol / vol). Standar kekeruhan
kemudian dialikuotasikan ke dalam tabung reaksi yang sama dengan
yang digunakan untuk membuat suspensi inokulum. Segel Tabung
standar McFarland dengan lilin, Parafilm, atau cara lain untuk
mencegah penguapan. Standar McFarland dapat disimpan hingga 6
bulan dalam gelap pada suhu kamar (22̊ sampai 25̊ C). Buang setelah 6
bulan atau lebih cepat jika ada volume yang hilang. Sebelum
digunakan, kocok dengan baik, aduk endapan putih halus barium
sulfat di dalam tabung. Keakuratan kerapatan standar McFarland yang
disiapkan harus diperiksa dengan menggunakan spektrofotometer
dengan jalur cahaya 1 cm; untuk standar 0,5 McFarland, absorbansi
pada panjang gelombang 625 nm harus 0,08 sampai 0,1. Bergantian,
keakuratan standar McFarland dapat diverifikasi dengan
menyesuaikan suspensi regangan kontrol (misalnya, E. coli ATCC
25922) ke kekeruhan yang sama, menyiapkan pengenceran 10 kali
lipat serial, dan kemudian melakukan penghitungan pelat. Suspensi
yang disesuaikan harus memberikan hitungan 10 8 unit pembentuk
koloni / ml.

 Saline fisiologis
NaCl Air sulingan Larutkan NaCl dalam air, panaskan jika perlu. Dapat
disterilkan dengan autoklaf atau filtrasi membran. Simpan pada suhu
kamar hingga 6 bulan dengan tutup yang dikencangkan untuk
mencegah penguapan.