Cocos 2

TESIS
AKTIVITAS ANTIINFLAMASI MINYAK KELAPA MURNI

DAN HASIL HIDROLISISNYA SECARA IN VITRO
TERHADAP SEL RAW 264.7
OLEH:
MUHAMMAD AMIN NASUTION
NIM 177014040
PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2020
Universitas Sumatera Utara

AKTIVITAS ANTIINFLAMASI MINYAK KELAPA MURNI
DAN HASIL HIDROLISISNYA SECARA IN VITRO
TERHADAP SEL RAW 264.7
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister

dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
OLEH:
MUHAMMAD AMIN NASUTION
NIM 177014040
PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2020

PERSETUJUAN TESIS
Nama Mahasiswa : Muhammad Amin Nasution
Nomor Induk Mahasiswa : 177014040
Program Studi : Magister Ilmu Farmasi
Judul Tesis : Aktivitas Antiinflamasi Minyak Kelapa Murni dan

Hasil Hidrolisisnya secara In Vitro Terhadap Sel
Raw 264.7
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Komisi Penguji Tesis pada hari
Selasa tanggal tiga puluh bulan Juni tahun dua ribu dua puluh.
Menyetujui:
Komisi Penguji Tesis
Ketua : Prof. Dr. Jansen silalahi, M. App.Sc., Apt
Sekretaris : Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
Anggota : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt
: Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt
iv
PERNYATAAN ORISINALITAS
Saya yang bertanda tangan di bawah ini:
Nama Mahasiswa : Muhammad Amin Nasution
Nomor Induk Mahasiswa : 177014040
Program Studi : Magister Ilmu Farmasi
Judul Tesis : Aktivitas Antiinflamasi Minyak Kelapa Murni dan

Hasil Hidrolisisnya secara In Vitro Terhadap Sel
Raw 264.7
Dengan ini menyatakan bahwa hasil penelitian pada tesis yang saya buat adalah
asli karya saya sendiri bukan plagiat dan apabila dikemudian hari diketahui tesis
saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi
sanksi apapun oleh Program Studi Magister Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas
perbuatan saya tersebut.
Demikian pernyataan ini saya buat dengan sebenarnya dan dalam keadaan sehat.
Medan, 12 Desember 2020

Yang Menyatakan
Muhammad Amin Nasution

NIM 177014040
v
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah SWT, atas limpahan karunia dan rahmat-
Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Penelitian ini bertujuan
untuk melakukan hidrolisis VCO, uji aktivitas sitotoksik, uji produksi Nitric
Oxide dan uji analisis ekspresi gen pada Virgin Coconut Oil (VCO) dan HVCO
terhadap sel RAW 264.7 secara In vitro. Tesis ini diajukan sebagai salah satu
syarat untuk memperoleh gelar magister farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.
Pengobatan gejala inflamasi pada umumnya menggunakan obat Non
Steroid AntiIn flammation Drugs (NSAIDs), yang menurut Food Drug
Administration (FDA) NSIADs mempunyai efek samping yang berbahaya bagi
tubuh. Untuk itu penuliis menyarankan penggunaan Virgin Coconut Oil (VCO)
sebagai pengobatan herbal yang mempunyai manfaat sebagai antiinflamasi dan
tidak mempunyai efek samping berbahaya bagi tubuh.
Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih kepada Bapak
Prof. Dr. Jansen silalahi, M. App.Sc., Apt. dan Bapak Prof. Dr. Urip Harahap,
Apt. atas waktu, arahan, dan bimbingan yang diberikan selama penyelesaian Tesis
ini. Pada kesempatan ini penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Prof.
Dr. Masfria, M. S., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera
Utara dan Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. selaku Ketua Program Studi Magister
Ilmu Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah
memberikan bantuan dan fasilitas selama menjalani pendidikan di Program
Magister Ilmu Farmasi. Kepada kedua orang tua, Ayahanda Alm. Amir Rajab
Nasution dan Ibunda Ennida Hanum Rangkuti tercinta, penulis menyampaikan
terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya atas semua pengorbanan,
doa, dan dorongannya, sehingga Tesis ini dapat diselesaikan.
Medan, 12 Desember 2020

Penulis,
Muhammad Amin Nasution
vi
AKTIVITAS ANTIINFLAMASI MINYAK KELAPA MURNI DAN
HASIL HIDROLISISNYA SECARA IN VITRO TERHADAP
SEL RAW 264.7
ABSTRAK
Minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil = VCO) mengandung asam lemak
rantai sedang terutama asam laurat dan komponen bioaktif lain yang mempunyai
sifat antibakteri dan antiinflamasi.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek toksisitas, penghambatan
produksi Nitric Oxide (NO) dan ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, dan COX-2
dari aktivitas antiinflamasi VCO dan hasil hidrolisisnya (Hydrolized Virgin Coconut
Oil=HVCO) terhadap sel RAW 264.7.
VCO dihidrolisis parsial menggunakan enzim lipase dari Rhizomucor miehei
(aktif pada posisi sn-1,3) untuk menghasilkan VCO terhidrolisis (HVCO) yang terdiri
dari asam lemak bebas dan 2-monogliserida. Pengujian aktivitas antiinflamasi dari
VCO dan HVCO terhadap viabilitas sel RAW 264.7 dengan metode MTT [3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]. Pengujian penghambataan NO
Sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan LPS menggunakan pereaksi Griess dan
pengujian ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, dan COX-2 pada sel RAW 264.7
yang diinduksi dengan lipopolisakarida (LPS) dengan metode Reverse Transcription-
Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Hasil pengujian menunjukkan bahwa viabilitas sel RAW 264.7 VCO dan
HVCO pada konsenterasi (62,5 µg/mL; 31,5 µg/mL) dengan persentase sel hidup
(>90%) secara berurutan sebesar VCO (101,67 ± 0,6; 99,59 ± 0,39) dan HCVO
(97,74 ± 0,31; 102,31 ± 1,21). Hasil pemeriksaan produksi NO menunjukkan bahwa
pemberian VCO dan HVCO pada konsenterasi (62,5 dan 31,25 μg/mL) terhadap sel
RAW 264.7 yang diinduksi dengan LPS menurunkan kadar NO VCO dan HVCO
terbesar pada konsenterasi (62,5 μg/mL) VCO sebesar 5,88±1,11 μg/mL dan HVCO
sebesar 8,11±1,11 μg/mL, efek tidak berbeda signifikan dengan kontrol positif dan
kontrol normal (p>0,05). Hasil analisis statistik pengujian ekspresi gen iNOS, TNF-α,
IL-6, IL-1β, dan COX-2 dari VCO dan HVCO pada sel RAW 264.7 yang diinduksi
dengan LPS menurunkan nilai densitas VCO dan HVCO. Pada ekspresi iNOS dan IL-
1β menghasilkan nilai densitas paling kecil adalah HVCO (0,72±0,010) dan
(2,40±0,015) menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan kontrol normal,
kontrol positif dan kontrol negatif p<0,05, nilai densitas ekspresi TNF-α paling kecil
pada HVCO (0,76±0,7633) menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan
kontrol negatif dan normal p<0,05, kemudian nilai densitas ekspresi IL-6 paling kecil
pada HVCO (1,16±0,010) menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan
kontrol positif p<0,05, dan nilai densitas ekspresi COX-2 paling kecil pada HVCO
(0,98 ± 0,010) yang menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan kontrol
negatif p<0,05.
Berdasarkan hasil penelitian ini VCO dan HVCO tidak menunjukkan efek
toksik pada sel RAW 264.7 dan dapat menghambat produksi NO serta menghambat
ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, dan COX-2 sehingga VCO dan HVCO
efektif memiliki aktivitas Antiinflamasi.
Kata kunci: VCO, HVCO, Sel RAW 264.7, Nitric Oxide, Ekspresi Gen
vii
ANTIINFLAMMATORY ACTIVITY OF VIRGIN COCONUT AND
HYDROLYSIS IN VITRO TOWARDS RAW 264.7 CELL LINES
ABSTRACT
Virgin coconut oil (VCO) contains medium chain fatty acids, especially
lauric acid and other bioactive components that have antibacterial and anti-
inflammatory properties.
This study aims to see the effects of toxicity, inhibition of Nitric Oxide
(NO) production and TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, and COX-2 gene expression
from the anti-inflammatory activity of VCO and its hydrolysis results (Hydrolized
Virgin Coconut Oil = HVCO). ) against RAW cells 264.7.
VCO is partially hydrolyzed using the lipase enzyme from Rhizomucor
miehei (active at position sn-1,3) to produce hydrolyzed VCO (HVCO) which
consists of free fatty acids and 2-monoglycerides. Tests for the anti-inflammatory
activity of VCO and HVCO on the viability of RAW 264.7 cells using the MTT
method [3- (4,5-dimethyltiazol-2-il) -2,5-diphenyl tetrazolium bromide]. Testing
for NO inhibition of RAW 264.7 cells induced with LPS using Griess reagent and
testing for TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, and COX-2 gene expression on RAW 264.7
cells induced with lipopolysaccharide (LPS) by the Reverse Transcription method
-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
The test results showed that the viability of RAW 264.7 VCO and
HVCO cells was concentrated (62.5 µg / mL; 31.5 µg / mL) with the percentage
of living cells (> 90%) in succession of VCO (101.67 ± 0.6; 99, 59 ± 0.39) and
HCVO (97.74 ± 0.31; 102.31 ± 1.21). The results of the NO production
examination show that the administration of VCO and HVCO in the concentration
(62.5 μg / mL) / mL) of RAW 264.7 cells induced by LPS reduces the largest NO
VCO and HVCO levels in the concentration (62.5 μg / mL) VCO of 5.88 ± 1.11
μg / mL and HVCO of 8.11 ± 1.11 μg / mL, the effect was not significantly
different from positive control and normal control (p> 0.05). The results of the
statistical analysis of iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, and COX-2 gene expression
from VCO and HVCO on RAW 264.7 cells induced by LPS decreased the VCO
and HVCO density values. In iNOS and IL-1β expression, the lowest density
value was HVCO (0.72 ± 0.010) and (2.40 ± 0.015) showed significantly different
effects from normal control, positive control and negative control p <0.05, the
value the lowest TNF-α expression density at HVCO (0.76 ± 0.7633) showed a
significantly different effect with negative and normal control p <0.05, then the
lowest IL-6 expression density value at HVCO (1.16 ± 0.010) showed a
significantly different effect with a positive control p <0.05, and the lowest COX-
2 expression value in HVCO (0.98 ± 0.010) which showed a significantly
different effect with a negative control p <0.05.
Based on the results of this study, VCO and HVCO do not show toxic
effects on RAW 264.7 cells and can inhibit NO production and inhibit the
expression of TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, and COX-2 genes so that VCO and
HVCO effectively have anti-inflammatory activity.
Keywords: VCO, HVCO, RAW 264.7 Cells, Nitric Oxide, Gene Expression.
viii
DAFTAR ISI
HALAMAN SAMPUL .................................................................................... i

HALAMAN PENGESAHAN TESIS .............................................................. ii
PERSETUJUAN TESIS .................................................................................. iv
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................. v
KATA PENGANTAR ..................................................................................... vi
ABSTRAK ....................................................................................................... vii
ABSTRACT ....................................................................................................... viii
DAFTAR ISI .................................................................................................... ix
DAFTAR TABEL ............................................................................................ xi
DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xii
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xiii
DAFTAR SINGKATAN ................................................................................. xiv
BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1
1.1 Latar Belakang ....................................................................................... 1
1.2 Perumusan Masalah ................................................................................ 3
1.3 Hipotesis ................................................................................................. 3
1.4 Tujuan Penelitian .................................................................................... 4
1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................. 4
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ....................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 7
2.1 Inflamasi .............................................................................................. 7
2.1.1 Pengertian Inflamasi............................................................................. 7
2.1.2 Mekanisme Inflamasi ........................................................................... 10
2.2 Antiinflamasi ........................................................................................ 12
2.2.1 Antiinflamasi Golongan Steroid .......................................................... 12
2.2.2 Antiinflamasi Golongan Non Steroid .................................................. 13
2.2.3 Uji Efek Antiinflamasi dari Bahan Alam ............................................. 14
2.3 Minyak Kelapa Murni ......................................................................... 18
2.3.1 Efek Antiinflamasi Minyak Kelapa Murni .......................................... 20
2.3.2 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni Secara Enzimatik ............................ 21
2.3.3 Analisis Viabilitas Sel RAW 264 ......................................................... 22
2.3.4 Analisis Aktivitas Antiinflamasi dengan Metode Produksi
Nitric Oxide ......................................................................................... 23
2.3.5 Analisis Aktivitas Antiinflamasi dengan Metode Ekspresi Gen .......... 25
2.3.6 Metode Elektroforesis .......................................................................... 26
2.3.7 Kultur Sel ............................................................................................. 26
2.4 Kerangka Teori Penelitian ................................................................... 27
BAB III METODE PENELITIAN................................................................... 30

3.1 Lokasi Penelitian .................................................................................. 30
3.2 Alat dan Bahan ...................................................................................... 30
3.2.1 Alat ........................................................................................................ 30
3.2.2 Bahan ................................................................................................... 31
3.3 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni .......................................................... 31
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan..................................................................... 32
ix
3.5 Pembuatan Media ................................................................................. 32
3.5.1 Pembuatan Media Pertumbuhan .......................................................... 32
3.5.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap ...................................................... 33
3.6 Penumbuhan Sel ................................................................................... 33
3.6.1 Sub Kultur Sel ...................................................................................... 34
3.6.2 Panen Sel .............................................................................................. 34
3.6.3 Perhitungan Sel .................................................................................... 35
3.7 Pembuatan larutan Uji .......................................................................... 36
3.8 Uji Effek VCO dan HVCO Terhadap Viabilitas Sel RAW 264.7 ....... 36
3.9 Uji Aktivitas Antiimflammasi .............................................................. 37
3.9.1 Uji Produksi Nitric Oxide (NO) ........................................................... 37
3.9.2 Pemeriksaan Ekspresi Gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2,
dan β-actin .......................................................................................... 38
3.9.3 Ekstraksi RNA ..................................................................................... 39
3.9.4 Pembuatan cDNA................................................................................. 40
3.9.5 Analisis Ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β , COX-2,
dan β-actin .......................................................................................... 41
3.9.6 Elektrofosis .......................................................................................... 42
3.10 Analisis Data ........................................................................................ 42
3.11 Definisi Operasional Penelitian............................................................ 43
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 45

4.1 Pengaruh Viabilitas Pada VCO dan HVCO Terhadap
Sel RAW 264.7 ....................................................................................... 45
4.2 Pengaruh Produksi Nitric Oxide (NO) .................................................... 48
4.3 Pengaruh Pengujian Ekspresi Gen .......................................................... 50
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 56

5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 56
5.2 Saran ....................................................................................................... 57
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 58
LAMPIRAN ..................................................................................................... 64
x
DAFTAR TABEL
2.1 Efek Antiinflamasi dari Berbagai Bahan Alam ...................................... 17

3.1 Tabel Ekspresi Gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β dan
COX-2 ..................................................................................................... 41
3.2 Tabel Defenisi Operasional Penelitian .................................................... 43
4.1 Pengaruh rata - rata % sel hidup dari VCO, HVCO
dan Deksametason.................................................................................... 47
4.2 Pengaruh Densitas Ekspresi Gen dari VCO dan HVCO ......................... 51
xi
DAFTAR GAMBAR
1.1.a Kerangka Pikir Penelitian aktivitas sitotoksik VCO, HVCO dan

Deksametason terhadap sel RAW 264. .................................................. 5
1.1.b Kerangka Pikir Penelitian Analisis aktivitas antiinflamasi dengan
menguji produksi Nitric Oxide dan Ekspresi gen .................................. 6
2.1 Reduksi MTT menjadi Formazan .......................................................... 23
2.2 Skema Kerangka Teori Penelitian .......................................................... 29
3.1 Hemositometer ....................................................................................... 35
4.1 Kristal Formazan Pada Sel RAW 264.7 Setelah MTT .......................... 45
4.2 Pengaruh Nilai Viabilitas Sel RAW 264.7 pada VCO,
HVCO dan Deksametason .................................................................... 47
4.3 Pengaruh Produksi Nitric Oxide (NO) Pada Sel RAW 264.7 ................ 49
4.4 Pengaruh Ekspresi Gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS,
terhadap VCO dan HVCO ..................................................................... 51
4.5 Pengaruh nilai densitas ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β,
COX-2 dan iNOS terhadap VCO dan HVCO ......................................... 52
xii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran
1 Gambar Sampel VCO dan HVCO ................................................ 64

2 Bagan Alir Hidrolisis VCO ........................................................... 65
3 Bagan Pembuatan Media DMEM ................................................ 66
4 Bagan Pembuatan Media Komplit (MK) DMEM ........................ 67
5 Bagan Penumbuhan Sel ................................................................ 68
6 Bagan Panen Sel ........................................................................... 69
7 Bagan Perhitungan Sel ................................................................. 70
8 Bagan Pembuatan Larutan Uji ...................................................... 71
9 Bagan Pengujian Viabilitas sel .................................................... 72
10 Bagan Pengujian Produksi NO ..................................................... 73
11 Bagan Ekstraksi RNA ................................................................... 74
12 Bagan Pembuatan cDNA .............................................................. 76
13 Bagan Analisis Ekspresi Gen ....................................................... 77
14 Bagan Pengujian Elektroforesis .................................................... 78
15 Sel RAW 264.7 Dibawah Mikroskop ........................................... 79
16 Microplate-96 Sumuran Pengujiab Viabilitas Sel ........................ 80
17 Microplate-96 Sumuran Pada Uji Produksi NO .......................... 81
18 Microplate-6 Sumuran Pada Uji Ekspresi Gen ............................. 82
19 Perhitungan Pembuatan Larutan Uji ............................................. 83
20 Perhitungan Penanaman Sel .......................................................... 86
21 Perhitungan Viabilitas Sel............................................................. 88
22 Perhitungan Viabilitas Sel Dengan SPSS .................................... 89
23 Perhitungan Pengujian Produksi NO ............................................ 90
24 Perhitungan Pengujian Produksi NO dengan SPSS ...................... 92
25 Perhitungan Pengujian Ekspresi Gen ............................................ 93
26 Perhitungan Analisis Ekspresi Gen Dengan SPSS ....................... 96
27 Gambar Alat .................................................................................. 99
xiii
DAFTAR SINGKATAN
VCO : Virgin Coconut Oil

HVCO : Hydrolized Virgin Coconut Oil
Bp : Base pair
β-actin : Beta actin
COX-2 : Siklooksigenase-2
Dexa : Deksametason
DNA : Deoxyribonucleic Acid
cDNA : Complementary Deoxyribonucleic Acid
IL-1 : Interleukin-1
IL-1β : Interleukin-1 Beta
IL-6 : Interleukin-6
LPS : Lipopolisakarida
NO : Nitric Oxide
NOS : nitric Oxide Synthase
iNOS : Inducible Nitric Oxide Synthase
nNOS : neural Nitric Oxide Synthase
eNOS : endothelial Nitric Oxid Synthase
NSAIDS : Non-Steroidal Anti-Inflammatory Drugs
PCR : Polymerase Chain Reaction
RNA : Ribonucleic Acid
mRNA : Messenger Ribonucleic Acid
RT-PCR : Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction
RNI : Reactive Nitrogen Intermediates
RNS : Reactive Nitrogen Species
ROI : Reactive Oxygen Intermediates
ROS : Reactive Oxygen Species
TNF-α : Tumor Necrosis Factor-α
TNF-β : Tumor Necrosis Factor-β
xiv
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Inflamasi adalah respon pertahanan tubuh yang paling penting terhadap
kerusakan atau infeksi sel yang merupakan proses kompleks dan melibatkan sel-
sel inflamasi yang pada dasarnya akan mengidentifikasi jaringan yang terlibat,
merekrut sel leukosit (fagosit) polimorfonuklear dan sel leukosit mononuklear
yaitu makrofag, menghilangkan penyebab peradangan dan memperbaiki bagian
sel yang rusak (Agita, 2017; Leveti, et al., 2013). Inflamasi berfungsi untuk
menghancurkan, mengurangi, atau melokalisasi (sekuster) baik agen yang
merusak maupun jaringan yang rusak. Tanda terjadinya inflamasi adalah
pembengkakan/edema, kemerahan, panas, nyeri, dan perubahan fungsi (Sumiwi
dan Ramadhani, 2015 ).
Inflamasi dapat dipicu dari berbagai faktor fisika, kimia, atau agen biologi,
istilah "inflamasi molekuler" membedakan perubahan molekuler yang terjadi
akibat perubahan akibat inflamasi itu sendiri. Aktivasi molekuler gen pro-
inflamasi dengan mengubah jalur pensinyalan redoks akhirnya akan
menyebabkan jaringan dan organ peradangan, inflamasi itu sendiri merupakan
hasil kumulatif faktor genetik kerentanan dan beberapa respon meskipun respon
inflamasi dalam berbagai penyakit inflamasi dapat ditandai dengan spektrum
umum gen dan mediator endogen yang terlibat, termasuk faktor pertumbuhan,
seperti sitokin inflamasi (Chung et al., 2002; Kaminska, 2005). Lipopolisakarida (
LPS ) adalah salah satu komponen utama dari bakteri gram negatif, yang
berperanan penting sehingga memicu inflamasi. LPS menyebabkan makrofag
1
mensekresi berbagai molekul sehingga meningkatkan proses pelepasan mediator
inflamasi (Lawrence dan Fong, 2010).
Antiinflamasi adalah sebutan untuk agen atau obat yang bekerja melawan
atau menekan proses peradangan, obat antiinflamasi yang biasa digunakan dibagi
menjadi dua, yaitu antiinflamasi steroid dan antiinflamasi nonsteroid. Namun
kedua golongan obat tersebut memiliki banyak efek samping. Antiinflamasi
steroid dapat menyebabkan tukak peptik, penurunan imunitas terhadap infeksi,
osteoporosis, atropi otot dan jaringan lemak, meningkatkan tekanan intra okular,
serta bersifat diabetik, sedangkan antiinflamasi nonsteroid dapat menyebabkan
tukak lambung hingga perdarahan, gangguan ginjal, dan anemia (Sumiwi dan
Ramadhani, 2015 ).
Upaya untuk mencari obat antiinflamasi yang lebih aman dan tidak
menimbulkan efek samping yang berbahaya telah dilakukan dari berbagai
tumbuhan salah satunya dengan menggunakan Virgin Coconut Oil (VCO). Pada
penelitian sebelumnya disebutkan bahwa VCO mengandung fitosterol yang dapat
memberikan efek sebagai antiinflamasi, analgesik dan antipiretik, bahkan ada juga
penelitian yang menjelaskan bahwa VCO dapat digunakan sebagai pelindung
untuk kulit (skin protective) dengan metode secara invivo dan invitro. Tetapi
belum ada yang menguji secara khusus aktivitas antiinflmasi dari VCO dan
peneliti juga menambahkan hasil dari Hydrolysis Virgin Coconut Oil (HVCO)
untuk melihan manakah yang lebih baik dari keduanya (Silalahi dan Surbakri,
2015; Intahphuak, et al., 2010; Varma, et al., 2019),
Berdasarkan uraian di atas maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui
aktivitas antiinflamasi VCO dan HVCO secara invitro pada kultur sel RAW 264.7
2
secara invitro. Pengujian viabilitas sel menggunakan metode MTT assay,
kemudian aktivitas antiinflamasi diuji dengan mengukur produksi kadar nitric
oxide menggunakan pereaksi Griess, dan analisis ekspresi iNOS dan ekspresi
sitokin (COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, dan β-actin ) menggunakan metode berbasis
reverse trancription-polymerase chain reaction (RT-PCR).
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas, maka perumusan masalah penelitian
ini:
a. apakah pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya bersifat toksik terhadap uji
viabilitas sel RAW 264.7 yang diinduksi LPS?
b. apakah pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya bersifat antiinflamasi dengan
menghambat produksi nitrit oxide (NO) pada sel RAW 264.7?
c. apakah pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya dapat menghambat ekspresi
iNOS, IFN-γ, TNF-α, 1L-1β , IL-6 dan β-actin pada sel RAW 264.7?
1.3 Hipotesis
Berdasarkan perumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian ini
adalah:
a. pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya tidak bersifat toksik terhadap uji
viabilitas sel RAW 264.7 yang diinduksi LPS
b. pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya bersifat antiinflamasi dengan
menghambat produksi nitrit oxide (NO) pada sel RAW 264.7
c. pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya dapat menghambat ekspresi iNOS,
IFN-γ, TNF-α, 1L-1β, IL-6 dan β-actin pada sel RAW 264.7
3
1.4 Tujuan
Berdasarkan perumusan masalah dan hipotesis di atas, maka tujuan dari
penelitian ini untuk:
a. membuktikan apakah pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya bersifat toksik
terhadap uji viabilitas sel RAW 264.7
b. membuktikan apakah pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya dapat
menghambat produksi nitrit oxide (NO) pada sel RAW 264.7 yang diinduksi
LPS
c. membuktikan apakah pemberian VCO dan hasil hidrolisisnya dapat
menghambat ekspresi iNOS, IFN-γ, TNF-α, 1L-1β, IL-6 dan β-actin pada sel
RAW 264.7
1.5 Manfaat
Manfaat penelitian ini adalah memberikan infomasi ilmiah kepada tenaga
kesehatan khususnya farmasi, bahwa minyak kelapa murni dan hasil hidrolisisnya
sebagai antiinflamasi sehingga dapat dimanfaatkan secara klinis sebagai obat.
1.6 Kerangka Pikir Penelitian
Kerangka pikir penelitian terdiri dari dua tahap. Tahap I pengujian
aktivitas sitotoksik VCO, HVCO dan Deksametason terhadap sel RAW 264.7.
Tahap analisis dan penentuan komponen sitotoksik dari VCO, HVCO dan
Deksametason sehingga diperoleh konsenterasi yang aman digunakan (Gambar
1.1.a). Tahap II, analisis aktivitas antiinflamasi dengan menguji produksi Nitric
Oxide dan Ekspresi gen iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β dan IL-6 secara invitro
(Gambar 1.1.b).
4
Tahap analisis dan penentuan komponen sitotoksik dari VCO, HVCO dan
Deksametason sehingga diperoleh konsenterasi yang aman digunakan Gambar
1.1.a.
Variabel Bebas Variabel Terikat Parameter
Kelompok yang diuji:

-VCO
-HVCO
Konsentrasi:
(31,25; 62,5; 125; Sel
250; 500 μg/mL) RAW Viabilitas Viabilitas % sel hidup
Kontrol Positif: 264.7 sel sel
Deksametason
Konsentrasi:
(1,25; 2,5; 5; 10; 20
μg/mL) Diperoleh Konsentrasi
yang aman
31,25; 62,5 μg/mL (VCO
dan HVCO).
1,25; 2,5μg/mL
(Deksametason)
Gambar 1.1.a Kerangka pikir penelitian (tahap pengujian aktivitas sitotoksik

VCO, HVCO dan Deksametason.
5
Tahap Analisis aktivitas antiinflamasi dengan metode Nitric Oxide dan
Ekspresi gen pada Gambar 1.1.b.

-VCO
-HVCO
Konsentrasi:
(31,25; 62,5 μg/mL)
Kontrol Positif: Sel
RAW Produksi Produksi Kadar NO
Deksametason
264.7 NO NO
Konsentrasi:
(1,25; 2,5μg/mL)
Kontrol Negatif:
Lipopolisakarida
Konsentrasi:
(1μg/mL) LPS

- VCO
-HVCO
Konsentrasi: Sel Ekspresi gen Ekspresi gen Densitas
(31,25; 62,5 μg/mL) RAW (iNOS, (iNOS, gambaran
Kontrol Positif: 264.7 TNF-α, IL- TNF-α, IL- pita
Deksametason 1β, IL-6, 1β, IL-6, ekspresi
Konsentrasi: COX-2) COX-2) gen
(1,25; 2,5 μg/mL)
Kontrol Negatif:
Lipopolisakarida
Konsentrasi:
(1μg/mL)
Gambar 1.1.b Kerangka pikir penelitian (Tahap Analisis aktivitas antiinflamasi

dengan metode Nitric Oxide dan Ekspresi gen iNOS, COX-2, TNF-
α, IL-1β dan IL-6 secara invitro).
6
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Inflamasi
2.1.1 Pengertian Inflamasi
Inflamasi adalah proses kompleks yang terjadi melalui beberapa
mekanisme yang menyebabkan perubahan didalam aliran darah lokal dan
pelepasan beberapa mediator inflamasi. Mediator-mediator inflamasi ini
menyebabkan terjadinya vasodilatasi, peningkatan permeabilitas vaskuler, dan
migrasi leukosit menuju tempat terjadinya inflamasi. Inflamasi merupakan respon
dari suatu organisme terhadap invasi akibat benda asing, seperti bakteri, parasit
dan virus. Respon inflamasi merupakan suatu reaksi protektif yang penting
terhadap iritasi, luka, atau infeksi, yang ditandai dengan kemerahan, rasa panas,
bengkak, hilangnya fungsi dan rasa sakit (Hamzah, dkk., 2015; Corwin, 2008).
Inflamasi dimulai saat sel mast berdegranulasi dan melepaskan bahan-
bahan kimia sepeti histamin, serotonin dan bahan kimia lainnya, mengakibatkan
terjadi vasodilatasi pembuluh darah sehingga terjadi peningkatan aliran darah dan
terjadinya peningkatan permeabilitas kapiler pada awal inflamasi. Tanpa
inflamasi, luka dan infeksi tidak akan pernah sembuh dan dapat mengakibatkan
kerusakan jaringan yang berbahaya (Setia dan Tjitaresmi, 2014; Cowin, 2008).
Inflamasi biasanya dibagi dalam 3 fase, yaitu inflamasi akut, respon imun,
dan inflamasi kronis. Inflamasi akut merupakan respon awal terhadap cedera
jaringan, hal tersebut terjadi melalui media rilisnya autakoid yang pada umumnya
didahului oleh pembentukan respon imun. Respon imun terjadi bila sejumlah sel
yang mampu menimbulkan kekebalan diaktifkan untuk merespon organisme
7
asing atau substansi antigenik yang terlepas selama respon terhadap inflamasi akut
serta kronis. Akibat respon imun bagi tubuh mungkin menguntungkan, seperti
menyebabkan organisme penyerang difagositosis atau dinetralisir. Sebaliknya,
akibat respon imun tersebut dapat merusak bila menjurus kepada inflamasi kronis
tanpa penguraian dari proses cedera yang mendasarinya. Inflamasi kronis
melibatkan keluarnya sejumlah mediator yang tidak menonjol dalam respon akut
(Furst dan Munster, 2002).
Respon inflamasi dalam tubuh ditandai dengan adanya berbagai mediator,
seperti proinflamasi sitokin berupa IL-1, Tumor Necrosis Factor (TNF),
Interferon (INF)-c, IL-6, IL-12, dan IL-1β, selain itu Nitric Oxidase dan COX-2
menstimulasi produksi dari mediataor pro-inflamasi. Rasa sakit, kemerahan,
bengkak, dan disfungsi jaringan serta organ merupakan tanda terjadinya inflamasi.
Hal ini merupakan respon protektif yang dilakukan oleh tubuh terhadap kerusakan
jaringan yang disebabkan oleh berbagai stimulus, inflamasi juga merupakan gejala
terjadinya penyakit kronis (Setia dan Tjitaresmi, 2014).
Mediator lain yang dilepaskan selama respon inflamasi faktor kemotaktik
neutrofil dan eusinofil, dilepaskan oleh leukosit yang menarik sel-sel ke daerah
cedera, selain itu dilepaskan juga prostaglandin. Saat membran sel mengalami
kerusakan, fosfolipid akan diubah menjadi asam arakidonat yang dikatalisis oleh
enzim fosfolifase, Asam arakidonat ini selanjutnya akan dimetabolisme oleh
enzim lipooksigenase dan enzim siklooksigenase. Prostaglandin dapat
meningkatkan aliran darah ketempat yang mengalami inflamasi. Sintesis
prostaglandin dapat dihambat oleh golongan NSAID. Leukotrin disintesis pada
jalur lipoksigenase yang berperan dalam meningkatkan permeabilitas kapiler dan
8
meningkatkan adhesi leukosit pada pembuluh kapiler selama cedera atau infeksi
(Corwin, 2008).
Trauma cedera atau infeksi pada jaringan menyebabkan serangkaian reaksi
kompleks terjadi pada tubuh dalam upaya untuk mencegah kerusakan jaringan
yang sedang berlangsung, mengisolasi dan menghancurkan organisme infektif,
dan mengaktifkan proses perbaikan yang diperlukan untuk mengembalikan fungsi
normal. Proses homeostasis ini secara keseluruhan dikenal sebagai respon
reaksiawal atau sebagai acute phase response (APR). Sel yang paling sering
dikaitkan dengan inisiasi proses kaskade selama APR adalah sel makrofag atau
monosit. Makrofag ketika diaktifkan melepaskan beberapa mediator, seperti
sitokin yang diantaranya interleukin-1 (IL-1) dan tumor necrosis factor (TNF),
memainkan peran dalam memicu reaksi berikutnya yang terjadi secara lokal.
Secara lokal sel-sel stroma, misalnya fibroblas dan sel endotel diaktifkan
menyebabkan pelepasan sitokin yang meliputi IL-6, IL-1 dan TNF. Sitokin ini
memperbesar stimulus homeostasis semua sel dalam tubuh (Thurnham dan
McCabe, 2012).
Endotelium memainkan peran penting dalam komunikasi antara situs
peradangan dan leukosit yang beredar. Sitokin IL-1 dan TNF menginduksi
perubahan besar dalam regulasi dan ekspresi gen, termasuk intrasellular adhesi
molekuler (ICAM). Molekul-molekul ini berinteraksi khusus dengan neutrofil dan
leukosit lainnya, memperlambat laju aliran darah, memicu perubahan endotel dan
memungkinkan migrasi molekul-molekul tersebut ke jaringan. Perubahan tonus
vaskular juga merupakan fitur awal dari APR. Jaringan yang meradang
melepaskan mediator molekul rendah hingga berat seperti oksigen reaktif, nitrous
9
oxide dan produk asam arakidonat termasuk prostaglandin. Pelebaran dan
kebocoran dari pembuluh darah terjadi terutama di venula postcapillary, sehingga
terjadi edema dan kemerahan pada jaringan. Agregasi trombosit dapat
merangsang kaskade pembekuan dan pelepasan molekul lebih lanjut seperti
bradikinin yang menyebabkan rasa sakit, inflamasi kronis ditandai dengan
terbentuknya jaringan granular. Jaringan granular merupakan agregasi
mikroskopis makrofag yang berubah menjadi epitel. Respon inflamasi dari
terbentuknya jaringan granular terdiri dari banyak manifestasi seperti kasus
infektif, alergi, keracunan, autoimun, neoplasma dan kondisi etiologi yang tidak
diketahui (Thurnham dan McCabe, 2012).
2.1.2 Mekanisme Inflamasi
Inflamasi dibagi dalam 3 fase, yaitu inflamasi akut (respon awal terhadap
cidera jaringan), respon imun (pengaktifan sejumlah sel yang mampu
menimbulkan kekebalan untuk merespon organisme asing), dan inflamasi kronis
Terjadinya inflamasi dimulai dengan adanya stimulus yang merusak jaringan,
mengakibatkan sel mast pecah dan terlepasnya mediator-mediator inflamasi COX-
2, TNF-α, IL-1β, IL-6, dan β-actin. Mekanisme terjadinya inflamasi secara umum
terjadi karena adanya rangsang iritan atau cidera jaringan akan memicu pelepasan
mediator-mediator inflamasi. Senyawa ini dapat mengakibatkan vasokontriksi
singkat pada arteriola yang diikuti oleh dilatasi pembuluh darah, venula dan
pembuluh limfa serta dapat meningkatkan permeabilitas vaskuler pada
membransel serta mengaktifkan sel makrofag (Abbas, et al., 2016).
Sel makrofag yang diaktifkan melepaskan berbagai mediator yang ikut
berperan dalam reaksi inflamasi. Jaringan makrofag yang diaktifkan akan
10
melepaskan sitokin diantaranya IL-1 (interleukin-1),IL-6 dan TNF-α (tumor
necrosis factor-α) yang menginduksi perubahan lokal dan sistemik. Ketiga sitokin
tersebut menginduksi koagulasi. IL-1 akan menginduksi ekspresi molekul adhesi
pada sel endotel sedangkan TNF-α akan meningkatkan ekspresi selektin-E yang
kemudian menginduksi peningkatan eksresi intraselular adhesi ion molecule-1
(ICAM-1) dan vascular cell adhesi on molecule-1 (VCAM-1). IL-1 danTNF-α
juga berperan dalam memacu makrofag dan sel endotel untuk memproduksi
kemokin yang berperan pada influks neutrofil melalui peningkatan ekspresi
molekul adhesi. IFN-γ (interferon-γ) dan TNF-α akan mengaktifkan makrofag dan
neutrofil yang dapat meningkatkan fagositosis dan pelepasan enzim kerongga
jaringan (Abbas, et al., 2016).
Menurut Chung et al., 2002, adanya faktor-faktor transkripsi seperti redox
sensitive transcription factor, nuclear factor-kappa B (NF-κB), dan fork head box
O (FOXO) memegang peranan penting dalam ekspresi mediator-mediator
proinflamasi. Ekspresi gen proinflamasi IL-1β, IL-6, TNF-α, COX-2,
lipooksigenase dan iNOS ditingkatkan oleh redox-sensitive transcription
factor,NF-κB selama proses degenerasi sel. IL-6 berkontribusi pada atropineural,
arterosklerosis. Mediator mediator proinflamasi lain seperti molekul adhesi
(VCAM-1, ICAM-1, P-selectin ,dan E-selectin) semuanya ditingkatkan oleh
aktivasi NF-κB dalam aorta selama proses tersebut.
Aktivasi NF-κB dapat merangsang ekspresi mediator-mediator
proinflamasi seperti COX-2, TNF-α, iNOS dan molekul adhesi pada aorta dan
ginjal serta menginisiasi terjadinya inflamasi kronis. Penghambatan mediator-
11
mediator proinflamasi dan faktor trankripsinya diperlukan dalam pengobatan
penyakit yang terkait dengan inflamasi (Kim, et al., 2016).
2.2 Antiinflamasi
Antiinflamasi adalah golongan obat yang memiliki aktivitas menekan atau
mengurangi peradangan. Obat-obat antiinflamasi merupakan golongan obat yang
memiliki aktivitas menekan atau mengurangi peradangan. Aktivitas ini dapat
dicapai melalui berbagai cara,yaitu dengan menghambat pembentukan mediator
radang prostaglandin, menghambat migrasi sel-sel leukosit kedaerah radang, dan
menghambat pelepasan prostaglandin dari sel-sel tempat pembentukannya
(Sumiwi dan Ramadhani, 2015 ).
Pada saat terjadi inflamasi, enzim fosfolipase akan diaktifkan dengan
mengubah fosfolipid yang terdapat pada jaringan menjadi asam arakhidonat.
Asamarakhidonat sebagian akan diubah menjadi enzim siklooksigenase dan
seterusnya menjadi prostaglandin. Sebagian lain dari asam arakhidonat diubah
oleh enzim lipooksigenase menjadi leukotrien. Kedua zat tersebut ikut
bertanggung jawab pada sebagian besar gejala inflamasi (Tjay dan Rahardja,
2002).
Secara umum berdasarkan mekanisme kerjanya, obat-obat antiinflamasi
dibagi menjadi dua golongan yaitu golongan steroid dan golongan nonsteroid.
2.2.1 Antiinflamasi Golongan Steroid
Obat antinflamasi steroid bekerja dengan mekanisme penghambatan
sintesis prostaglandin dan leukotrien dengan cara melepas lipokortin yang dapat
menghambat fosfolipase A2 pada sintesis asamarakhidonat sehingga bisa
dikatakan bahwa steroid merupakan obat antiinflamasi yang poten. Steroid pada
12
dasarnya merupakan hormon atau senyawa endogen yang secara alami dapat
dihasilkan oleh tubuh untuk menjaga sistem homeostasis. Ketika terjadi kondisi
stress atau cidera, tubuh akan mensekresi hormon kortisol tetapi terdapat kondisi
tertentu dimana hormon ini tidak cukup untuk mengatasi rasa sakit yang timbul
sehingga diperlukan tambahan dari luar. Contoh obat-obat antiinflamasi golongan
steroid adalah kortison, hidrokortison, prednisolon, deksametason, dan lain-lain
(Rinayanti, dkk., 2015).
Hormon steroid sering disebut juga kortikosteroid karena diproduksi oleh
korteksadrenal yang terletak diatas ginjal. Hormon ini terdiri dari dua macam
yaitu glukokortikoid dan mineral kortikoid. Hormon glukokortikoid dapat memicu
terjadinya apoptosis sel. Hormon ini dapat menurunkan diferensiasi dan
proliferasi sel-sel inflamatori sehingga dapat berperan sebagai immunosupresan
(Rinayanti, dkk., 2015).
2.2.2 Antiinflamasi Golongan Non Steroid
Obat antiinflamasi golongan non steroid bekerja melalui mekanisme lain
seperti isoenzim COX-1 dan COX-2 berperan dalam memacu pembentukan
prostaglandin dan tromboksan dari asamarakhidonat. Prostaglandin merupakan
molekul pembawa pesan pada proses inflamasi. Inhibisi sintesis prostaglandin
dalam mukosa lambung seringkali dapat menyebabkan kerusakan gastrointestinal
(dispepsia, mual, dangastritis). Efeksamping yang paling serius adalah pendarahan
gastrointestinal (Wilmana dan Gan, 2007).
Penghambatan enzim COX juga akan menghambat sintesis tromboksan
sehingga dapat menurunkan agregasi platelet. Pemberian obat pada dosis yang
rendah secara terus-menerus digunakan sebagai terapi pada penderita stroke untuk
13
mencegah terjadinya stroke berikutnya. Selain itu,penghambatan COX juga
berakibat pada peningkatan produksi leukotrien yang berperan dalam proses
kontraksi pada bronkus sehingga dapat memicu terjadinya asma (Tjay dan
Raharja, 2002).
Menurut Tjay dan Raharja (2002), obat-obat antiinflamasi nonsteroid
dapat digolongkan menjadi:
a. Turunan asam salisilat: Aspirin, Salisilamid, Diflunisal.
b. Turunan pirazolidindion: Fenilbutazon, Oksifenbutazon.
c. Turunan asam N-antranilat: Asam mefenamat, Asam flufenamat.
d. Turunan asam aril asetat: Natrium diklofenak, Ibuprofen, Ketoprofen.
e. Turunan hetero aril asetat: Indometasin.
f. Turunanoksikam: Peroksikam, Tenoksikam.
Efek samping terhadap gastrointestinal terjadi karena penghambatan
COX-1 sementara COX-2 diketahui hanya disekresi ketika terjadi reaksi
inflamasi, sehingga dikenallah golongani nhibitor COX-2 selektif untuk
mengatasi masalah efeksamping tersebut. Penghambatan COX-2 sendiri dapat
berakibat pada peningkatan sekresi enzim COX-1 yang dapat mengkatalisis
pembentukan tromboksan yang berperan dalam meningkatkan agregasi platelet
termasuk agregasi platelet pada pembuluh arteri dan memicu terjadinya
arteriosclerosis asma (Tjay dan Raharja, 2002).
2.2.3 Uji Efek Antiinflamasi dari Bahan Alam
Berdasarkan penelitian Hao et al., (2019), pengujian efek anti-inflamasi
dari minyak daun Cinnamomum subavenium secara in vitro terhadap sel RAW
264.7 yang distimulasi LPS dan model edema kaki belakang tikus yang diinduksi
14
karagenan. Hasil yang didapat dengan menganalisis nitric oxide (NO),
prostaglandin E2 (PG E2), TNF-α, IL-6, dan IL-1 secara signifikan dapat menurun
dengan menggunakan minyak daun Cinnamomum subavenium dari hasil yang
sama juga muncul pada NO dan tumor necrosis (TNF-a) setelah di injeksi
karagenan. Sel-sel imunoreaktif iNOS dan COX-2 dari jaringan kaki menurun
secara signifikan dengan pemberian minyak daun Cinnamomum subavenium
dalam pemeriksaan histologis. Temuan ini menunjukkan bahwa minyak daun
Cinnamomum subavenium memiliki sifat anti-inflamasi, dan efeknya dapat
menghambat ekspresi iNOS, COX-2, TNF-, IL-1, dan IL-6 melalui jalur NF-kB
yang memengaruhi, sehingga dapat digunakan sebagai pengobatan penyakit
inflamasi.
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Yuan et al., (2006), kunyit dapat
memberikan efek antiinflamasi dengan menghambat metabolisme asam
arakidonat (AA), cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LOX), cyto-kines
interleukin (IL) dan tumor necrosis factor (TNF) dan faktor nuklir kappa B (NF-
κB). Curcumin diberikan secara oral dengan dosis 375 mg tiga kali sehari selama
6-22 bulan kepada delapan pasien. Pasien dipantau untuk periode 2 tahun dengan
interval tiga bulan. Lima pasien selesai dalam pengobatan, empat pulih
sepenuhnya dan satu pasien pembengkakan dan keterbatasan gerak. Tidak ada
efek samping yang dicatat salah satu pasien yang mengalami pembengkakan.
Berdasarkan hasil ini peneliti menyarankan curcumin bisa digunakan sebagai obat
yang aman dan efektif dalam pengobatan inflamasi.
Huang et al., (2012), melakukan penelitian efek antiinflamasi inotilone
dari jamur dengan menggunakan sel makrofag tikus RAW 264.7 yang distimulasi
15
lipopolysaccharide (LPS) dan diinduksi l-karagenan (Carr) model edema kaki.
Inotilone diuji untuk mengurangi produksi nitric okside (NO) yang dapat di
sintesis (iNOS). Inotilone diuji dalam inhibitor protein kinase teraktivasi mitogen
(MAPK), ekstraseluler signal-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-
terminal kinase (JNK), faktor nuklir kappa B (NF-kB), matrix metallo proteinase
(MMP) -9 ekspresi protein dalam sel RAW264.7 yang distimulasi LPS. Ketika sel
RAW 264.7 dan makrofag berada dengan inotilone bersama-sama dengan LPS,
hambatan signifikan yang bergantung pada konsentrasi produksi NO terdeteksi.
Pada metode Western blotting mengungkapkan bahwa inotilone
memblokir ekspresi protein iNOS, NF-kB, dan MMP-9 yang di stimulasi oleh
LPS terhadap sel RAW264.7. Inotilone juga menghambat fosforilasi ERK, JNK,
dan p38 yang diinduksi LPS. Inotilone mengurangi pembengkakan edema kaki
pada jam ke-4 dan ke-5 setelah pemberian karagenan (Huang et al., 2012).
Inotilone secara signifikan menurunkan tingkat malondialdehyde (MDA)
edema kaki pada jam ke-5 setelah injeksi karagenan. Inotilone menurunkan kadar
NO dan tumor necrosis factor (TNF-a) pada serum pada jam ke 5 setelah injeksi
karagenan. Metode Western blotting mengungkapkan bahwa inotilone
menurunkan ekspresi iNOS yang diinduksi karagenan, cyclooxygenase-2 (COX-
2), NF-kB, dan ekspresi MMP-9 pada jam ke-5 di kaki edema. Dengan demikian
inotilone dapat mengurangi infiltrasi neutrofil ke situs peradangan, seperti yang
dilakukan obat antiinflamasi indometasin. Aktivitas anti-inflamasi inotilone
berhubungan dengan penurunan kadar MDA, iNOS, COX-2, NF-kB, dan MMP-9
dan meningkatkan aktivitas CAT, SOD, dan GPx dalam edema kaki melalui
penghambatan TNF-a dan NO (Huang et al., 2012).
16
Berdasarkan penelitian yang dilakukan Intahphuak et al., (2010),
penelitian tentang efek antiinflmasi minyak kelapa murni, beberapa sifat
farmakologis dari minyak kelapa murni (VCO), VCO yang disiapkan tanpa
menggunakan bahan kimia atau pembuatan dengan panas tinggi. Efek anti-
inflamasi, analgesik, dan antipiretik VCO dinilai dengan melihat efek moderat
pada telinga tikus yang diinduksi etil fenilpropiolat dan edema pada kaki tikus
yang diinduksi asam karakidon dan arakidonat. VCO menunjukkan penghambatan
efek pada peradangan kronis dengan mengurangi berat transudatif, pembentukan
granuloma, dan serum aktivitas alkali fosfatase. VCO juga menunjukkan efek
analgesik moderat pada asam asetat yang diinduksi menggeliat respon serta efek
antipiretik pada hipertermia yang diinduksi ragi. Hasil yang diperoleh
menyarankan sifat anti-inflamasi, analgesik, dan antipiretik VCO.
Hasil penelitian uji efek antiinflamasi dari berbagai bahan alam dapat
dilihat pada Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Efek antiinflamasi erbagai ahan alam
No Sampel Hasil Referensi

1 -Cinnamomum Minyak atsiri dari daun Cinnamomum Hao et al.,
subavenium subavenium dengan uji viabilitas sel (2019)
RAW 264.7 dan tidak mengalami
-In vitro perubahan pada konsenterasi 0, 2,5, 5,
10, 20, dan 40 𝜇g / mL. Hasil ini
menunjukkan bahwa tidak ada efek
toksik pada sel RAW 264.7. pada
pengujian produksi NO yang diinduksi
LPS mengalami penghambatan,
tergantung pada konsenterasi yang
diberikan dalam uji produksi NO. Sama
halnya dengan pengujian yang
dilakukan pada agen proinflamasi
dengan metode elisa juga mengalami
penghambatan tergantung pada
konsenterasinya.
17
2 -Curcumin Diberikan curcumin yang telah diolah Yuan et al.,
dalam bentuk pasta dapat digunakan (2006)
-In vivo sebagai penghilang rasa sakit akibat
peradangan (inflamasi). Aktivitas
antiinflamasi dari curcumin diuji dengan
melakukan perbandingan dengan
fenilbutazon dan plasebo, dihasilkan
curcumin dan fenibutazon memiliki
respon inflamasi yang lebih baik dari
plasebo. Pada penelitian ini curcumin
diberikan secara oral dengan dosis 375
mg selama 3 kali sehari selama 12
minggu.
3 -Phellinus Hasil uji viabilitas sel RAW 264.7 Huang et al.,
linteus dengan metode MTT pada konsenterasi (2012)
(0, 1,56, 3,12, 6,25, 12,5, dan 25 mM)
-In vivo tidak mengalami efek toksisitas. Nilai
IC50 untuk penghambatan nitric oxide
inotilone adalah 10,24 ± 0,35 (26,2–
59,7%), inotilin dapat menghambat level
TNF-α sebesar 10,6-40,3% dan pada
COX-2 sebesar 13,6%.
4 -Virgin VCO dengan dosis 1 mg/20 μL pada Intahphuak et

coconut oil edema telinga tikus yang diinduksi etil al., (2010)
(VCO) fenilpropiola dan kaki belakang tikus
yang diinduksi dengan asam arakidonat
-In vivo menunjukkan efek penghambatan pada
peradangan.
2.3 Minyak Kelapa Murni
Minyak kelapa murni Virgin coconut oil (VCO) merupakan salah satu
hasil olahan dari buah kelapa (Cocos nucifera) yang diperoleh tanpa proses
pemanasan sehingga dapat mempertahankan komponen alami dari minyak kelapa.
Minyak kelapa adalah lemak jenuh, tetapi asam lemak jenuh di dalamnya terdiri
dari asam lemak jenuh rantai sedang lebih dari 80 persen yang terdiri dari 8
sampai 12 atom karbon dalam persentase yang tinggi, asam lemak rantai pendek
18
sekitar 10 persen, dan hanya sedikit asam lemak jenuh rantai panjang seperti asam
palmitat (5 persen) yang bersifat aterogenik (Marina et al., 2009; Bawalan dan
Chapman, 2008).
VCO mengandung komponen bioaktif, seperti: antioksidan (tocopherols,
tocotrienols, polyphenols dan flavonoid) dan lemak. Lemak dari VCO terdiri dari
92 persen saturated fatty acid, 6% monounsaturated fatty acid, 2 persen
polyunsaturated fatty acid. Saturated fatty acid atau asam lemak jenuh dalam
VCO terdiri dari 90 persen medium chain triglyserides (MCT) yang 44-55
persennya adalah asam laurat dan 10 persen long chain triglyserides (LCT). VCO
memiliki kandungan triasgliserol rantai sedang (medium chain
triacylglicerols/MCT) khususnya laurin yang mempunyai koefisien digestibility
maksimum sehingga komponen ini lebih cepat dicerna daripada lemak jenis lain.
Sifat ini disebabkan MCT memiliki ukuran lebih kecil daripada LCT (long chain
triacylglicerols) yang dapat memfasilitasi aksi enzim lipase pankreas dan dibawa
oleh vena porta menuju hepar dan dengan cepat teroksidasi menjadi energi (Fife,
2006).
Beberapa hasil penelitian menunjukkan bahwa VCO memiliki efek yang
baik untuk kesehatan, antara lain sebagai anti-inflamasi, antipiretik, anti analgetik,
menurunkan kolesterol darah total, mempercepat penyembuhan luka, berfungsi
sebagai antioksidan. Komposisi asam lemak VCO dan minyak kelapa biasa tidak
berbeda. Akan tetapi, VCO dibuat dengan tanpa pemanasan, masih mengandung
atioksidan alami dan zat lainnya sehingga sedikit berbeda dengan minyak kelapa
biasa. Maka VCO biasanva tidak digunakan untuk menggoreng tetapi langsung
19
diminum sebagai makanan fungsional/ makanan kesehatan (Bawalan dan
Chapman, 2006; Assah, 2017).
Berbagai penyakit yang berasal dari virus dan belum ditemukan obatnya
dapat dicegah dengan mengonsumsi VCO, seperti flu burung, HIV/AIDS,
hepatitis, dan jenis virus lainnya. Bukan itu saja, VCO dapat juga mengatasi
kegemukan, penyakit kulit, hingga penyakit yang tergolong kronis, misalnya
kanker prostat, jantung, darah tinggi dan diabetes. VCO menurunkan kadar
kolesterol total, trigliserida, fosfolipid, low density lipoprotein (LDL), dan very
low density lipoprotein (VLDL) dan meningkatkan high density lipoprotein
(HDL). VCO juga meningkatkan enzim antioksidan dan menurunkan lipid
peroksidase dan efek antitrombotik (Marina et al., 2009; Mansor et al., 2012;
Badan Standardisasi Nasional, 2008 ).
2.3.1 Efek Antiinflamasi Minyak Kelapa Murni
Minyak kelapa murni mengandung asam laurat yang berfungsi sebagai
prekusor dari monolaurin yang mana dapat memodulasi proliferasi sel imun.
Asam laurat (C-12) merupakan komponen utama dalam minyak kelapa dapat
mencapai 46,64 - 48,80% (Karouw, dkk., 2016). Komponen alami dari minyak
kelapa ini dapat berfungsi sebagai anti inflamasi, analgesik, dan antipiretik, karena
kemampuannya mengurangi pembentukan transudat, pembentukan granuloma,
dan aktivitas serum alkali fosfatase. Proliferasi sel imun, dapat dikatakan bahwa
mampu menekan proses inflamasi yang terjadi di dalam tubuh. Proses inflamasi
ini dapat berupa nyeri dan demam (Intahphuak, et al., 2010).
Minyak kelapa murni mengandung phytosterol yang dapat dianggap
sebagai antiinflamasi. Minyak kelapa sebagai trigliserida tidak memiliki aktivitas
20
antimikroba dan antivirus, tetapi ketika VCO dihidrolisis sebagian, ia akan
menghasilkan asam lemak bebas dan monogliserida, VCO dan hasil dari
hidrolisisnya memiliki aktivitas penyembuhan luka bakar (Silalahi, et al., 2015).
2.3.2 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni Secara Enzimatik
Minyak kelapa memiliki keunikan tersendiri dibandingkan dengan minyak
nabati lain, karena sebagian besar asam lemak yang terkandung di dalamnya
adalah asam lemak rantai sedang). Berdasarkan panjang rantai atom karbonnya,
maka asam laurat termasuk dalam kelompok asam lemak rantai sedang. Asam
laurat (C-12) merupakan komponen utama dalam minyak kelapa dapat mencapai
46,64 - 48,80% (Korauw, 2016). Asam lemak rantai sedang adalah asam lemak
yang memiliki 6-12 atom karbon. Asam lemak rantai sedang dinyatakan oleh
Food and Drug Administrasion sebagai makanan yang aman untuk dikonsumsi
sejak tahun 1994 (Marten et al., 2006).
Proses sintesis untuk menghasilkan asam lemak rantai sedang dari minyak
kelapa melalui beberapa tahap reaksi, yaitu hidrolisis minyak untuk menghasilkan
asam lemak bebas, pemisahakan asam lemak rantai sedang dari asam lemak jenuh
rantai panjang dan asam lemak tak jenuh, serta reaksi re-esterifikasi asam lemak
untuk menghasilkan asam lemak rantai sedang. Proses hidrolisis dapat dilakukan
secara enzimatis dan kimiawi. Hidrolisis enzimatis memiliki beberapa kelebihan,
yaitu suhu yang digunakan relatif rendah < 55°C, bahan kimia yang digunakan
sedikit sehingga produk yang dihasilkan tidak berwarna, aman dikonsumsi dan
proses katalisis enzimatis bersifat regiospesifik (Mer et al., 2000). Karouw et al.,
2016 melaporkan proses hidrolisis trigliserida (stearin sawit) menggunakan lipase
21
dari Rhizomucur miehei. Hidrolisis dilakukan pada suhu yang relatif rendah, yaitu
37ºC dan lama reaksi 24 jam, di-hasilkan asam lemak bebas sekitar 30%.
2.3.3 Analisis Viabilitas Sel RAW 264.7
Viabilitas sel adalah kemampuan dari suatu sel untuk mempertahankan
dirinya dari serangan jejas dan memulihkan kondisinya guna melanjutkan
kehidupannya. Oleh karena itu, viabilitas merupakan faktor yang sangat penting
dalam proses pertahanan tubuh guna merespon adanya bakteri. viabilitas sel
didasarkan pada kemampuan sel untuk bertahan hidup terhadap bahan-bahan yang
bersifat toksik (Kupcsik dan Martin, 2011).
Sel RAW 264.7 merupakan suatu monocyte-machrophage cell line yang
banyak digunakan dalam penelitian tentang antiinflamasi karena mirip dengan
makrofag yang diproduksi sumsum tulang belakang (Kresno 2010). Makrofag
memiliki peranan penting dalam sistem perlindungan tubuh, makrofag terutama
berasal dari sel prekursor sumsum tulang belakang, dari promonosit yang
membelah menghasilkan monosit yang beredar dalam darah. Makrofag juga
menelan (fagosit) antigen dan menyajikan kepada sel-sel berdekatan secara
imunokompeten (limfosit dan sel plasma). Sel RAW 264.7 yang digunakan dalam
penelitian ini berasal dari Mus musculus, mencit atau yang diinduksi oleh virus
leukemia murine Abelson. Strain sel RAW 264.7 adalah BALB/c. Metode kultur
sel RAW 264.7 menggunakan media pertumbuhan lengkap sebagai media dasar
untuk sel ini adalah ATCC-formulated Dulbecco's Modified Eagle's Medium,
Catalog No. 30-2002 (Kresno 2010; ATCC, 2017).
Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]
adalah salah satu uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji sitotoksisitas
22
dengan metode MTT didasarkan pada aktivitas enzim yang dapat diukur secara
kolorimetri. Metode ini cepat, sensitif, akurat dan sejumlah besar sampel dapat
diuji secara otomatis menggunakan spektrofotometer. Metode ini mengukur sel
yang hidup (baik yang masih membelah ataupun tidak membelah)
(Freshney, 2000).
Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi
sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna.
Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim
dehidrogenase. MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase
suksinat tetrazolium (Gambar 2.1), yang termasuk dalam mitokondria dari sel
hidup (Cree, 2011).
Gambar 2.1 Reduksi MTT menjadi Formazan (Kupcsik dan Martin, 2011)
2.3.4 Analisis Aktivitas Antiinflamasi dengan Metode Produksi Nitric Oxide

(NO)
Salah satu uji yang dilakukan untuk mengetahui aktivitas antiinflamasi
adalah dengan melakukan uji produksi NO. Nitric oxide (NO) adalah molekul
biologi yang bisa terdapat di seluruh tubuh, dihasilkan oleh sejumlah tipe sel yang
berkaitan dengan proses penyakit, dan dapat menimbulkan efek di tingkat seluler
dan vaskuler. Ada tiga isoenzim NOS, yaitu, nNOS (konstitutif dalam jaringan
saraf), eNOS (konstitutif pada sel endotel vaskular) dan iNOS (diinduksi oleh
23
sitokin dalam makrofag dan hepatosit). Ekspresi konstitutif eNOS dan nNOS
bertanggung jawab untuk kadar fisiologis rendah NO, sedangkan jumlah yang
lebih besar dari NO diproduksi oleh iNOS, iNOS diinduksi oleh produk mikroba,
seperti lipopolisakarida (LPS) dan sitokin inflamasi seperti interleukin- 1 (IL-1),
tumor necrosis factor-α (TNF-α) dan interferon-γ (INF-γ) dalam makrofag dan
beberapa sel-sel lain. Produksi NO meningkat pada respon terhadap rangsangan
inflamasi dan memediasi efek destruktif, karena pentingnya NO yang berasal dari
iNOS pada respon peradangan, ada beberapa upaya penelitian untuk menemukan
selektif inhibitor iNOS (Giustarini et al., 2008).
Metode yang telah diterapkan untuk deteksi nitrit / nitrat, yaitu kolorimetri
dan fluorometrik uji, chemilumin escence, kromatografi gas / spektrometri massa,
dan elektroforesis kapiler Metode yang umum digunakan adalah uji
spektrofotometri, yang didasarkan pada pembentukan zat warna azo oleh reaksi
NO2 - dengan reagen the Griess (Giustarini et al., 2008).
Reaksi Griess pertama kali dideskripsikan pada tahun 1879 karena
kemudahannya reaksi Griess telah digunakan secara luas pada analisa sampel
biologis seperti plasma, serum, urin, cairan serebrospinal dan saliva. Pada metode
ini, nitrit ditambahkan dengan reagen pendiazotasi seperti sulfanilamid dalam
media asam untuk membentuk garam diazonium sementara. Hasil antara ini
kemudian direaksikan dengan reagen pengkopel, N-naftil-etilendiamin (NED),
untuk membentuk senyawa azo yang stabil. Warna ungu yang dihasilkan
memungkinkan untuk analisa nitrit dengan tingkat sensitivitas yang tinggi (Sun, et
al., 2003).
24
2.3.5 Analisis Aktvitas Antiinflamasi dengan Metode Ekspresi Gen
Pemeriksaan ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, dan COX-2 yang
merupakan sitokin proinflamasi yang berasal dari aktivitas stimulus makrofag.
Sitokin proinflamasi mempercepat progresi inflamasi melalui peningkatan
permeabilitas sel endotel dan rekrutmen leukosit, terutama neutrofil, ke titik
inflamasi. Berkembangnya pengetahuan mengenai peran inflamasi dalam
patofisiologi berbagai penyakit menjadikan mediator inflamasi sebagai target
pengembangan obat (Yuwono, 2006).
Pemeriksaan ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, dan COX-2
dilakukan dengan menggunakan metode Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction (RT-PCR). Analisis ekspresi dengan menggunakan metode biomolekuler
yang canggih untuk perbanyakan segmen DNA spesifik secara in vitro, melalui
suatu proses enzimatik dengan menggunakan enzim DNA polimerase dan primer
nukleotida yang akan berhibridisasi dengan bagian DNA dari dua arah yang
berlawanan. PCR merupakan metode yang sederhana, cepat, dan sangat potensial
dalam proses perbanyakan DNA terutama pada keadaan jumlah sampel yang
sedikit. Teknik ini dikembangkan untuk melakukan analisis terhadap molekul
RNA hasil transkripsi yang terdapat dalam jumlah sangat sedikit di dalam sel. Hal
ini karena PCR tidak dapat dilakukan dengan menggunakan RNA sebagai cetakan
maka terlebih dahulu dilakukan proses transkripsi balik (reverse transcription)
terhadap molekul mRNA sehingga diperoleh molekul cDNA (complementary
DNA). Molekul cDNA tersebut kemudian digunakan sebagai cetakan dalam
proses PCR. Teknik ini digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen, untuk
25
amplifikasi RNA sebelum dilakukan cloning dan analisis, maupun untuk
diagnosis agensia infektif maupun penyakit genetik (Yuwono, 2006).
2.3.6 Metode Elektroforesis
Metode ini sering digunakan sebagai pengganti Ouchterlony Double
Diffusion untuk mendapatkan presipitasi yang murni pada komplek campuran
antigen. Proses ini antigen dielektroforesis melalui gel agrose dan selanjutnya
diberikan kesempatan difusi menuju kedepan pada antiserum untuk membentuk
band presipitasi karena sampel terpisahkan dengan elektroforesis sebelum
berikatan dengan antibodi. Beberapa antigen dapat mengidentifikasi antiserum
polispesifik yang digunakan. Oleh karena itu imunoelektroforesis sering
digunakan untuk pengidentifikasian secara tentatif dari antigen campuran yang
tidak diketahui pada saat purifikasi (Rantam, 2003).
2.3.7 Kultur Sel
Teknik kultur sel adalah salah satu teknik yang digunakan untuk
mengembangbiakkan sel diluar tubuh atau dikenal sebagai salah satu teknik in
vitro. Pada teknik kultur, spesifisitas sel harus diperhatikan karena pada awalnya
didalam tubuh, sel-sel bekerja secara integritas dalam suatu jaringan, sedangkan
dalam kultur, sel terpisah-pisah. Selain itu, teknik ini harus dilakukan dalam
kondisi steril karena sel tumbuh lebih lambat dari pada kontaminan (Freshney,
2000).
Fungsi utama media pada teknik kultur sel adalah untuk mempertahankan
pH dan osmolalitas essensial untuk viabilitas sel serta penyedia nutrisi dan energi
yang dibutuhkan untuk multiplikasi dan pertumbuhan sel. Media untuk
pertumbuhan sel harus mengandung asam amino, vitamin, glukosa, garam,
26
berbagai suplemen organik seperti protein, peptida, nukleosida dan lipid serta
hormon dan faktor pertumbuhan. Kultur sel secara in vitro membutuhkan kondisi
lingkungan yang sama dengan keadaan di dalam tubuh. Kondisi tersebut akan
mempengaruhi proses biologis yang terjadi dalam kultur sel, sehingga dapat
berlangsung mendekati keadaan sebenarnya. Pendekatan terhadap kondisi
lingkungan tubuh tersebut diperoleh dengan aplikasi media pertumbuhan, pH serta
fase gas yang sesuai untuk pertumbuhan sel. Pengamatan terhadap proses
pertumbuhan sel secara in vitro memiliki beberapa kelebihan dibanding metode in
vivo antara lain; keadaan lingkungan pertumbuhan dapat stabil karena diamati
secara langsung, selain itu karakteristik dari sel yang ingin ditumbuhkan dapat
diatur (Harison and Freshney, 2009).
2.4 Kerangka Teori Penelitian
Berdasarkan teori yang telah dipaparkan pada tinjauan pustaka maka dapat
disusun kerangka teori penelitian yang menjelaskan bahwa dengan pemberian
LPS terhadap sel makrofag akan mengalami aktivasi sehingga menghasilkan
makrofag teraktivasi. Makrofag yang teraktivasi akan melepaskan beberapa
mediator inflamasi yaitu TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2 yang dapat merangsang
terjadinya inflamasi. Makrofag yang teraktivasi juga mengalami proses fagositosis
untuk membunuh mikroba dengan menghasilkan ROS dan RNS. ROS akan
merangsang mediator inflamasi sehingga terjadi inflamasi. RNS yang dihasilkan
yaitu NO yang disintesis oleh iNOS. NO yang dihasilkan secara berlebihan akan
mengakibatkan inflamasi. Hal ini secara keseluruhan merupakan respon inflamasi
alami tubuh terhadap antigen tetapi jika aktivasi berlebihan maka akan merespon
sistem imun. Dengan demikian pemberian VCO dan HVCO dapat menghambat
27
ekspresi TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2, dan iNOS dan dapat menurunkan produksi
NO (Gambar. 2.2).
28
LPS
Sel Fagosit
(Neutrofil, Makrofag)
VCO
Makrofag
COX-2 teraktivasi
Hidrolisis
VCO
VCO
Mediator Proses
Inflamasi Fagositosis
Hidrolisis
VCO
IL-1β IL-6 TNF-α ROS RNS
NOS (iNOS)
NO
Membunuh
mikroba
Inflamasi
Gambar. 2.2 Kerangka teori penelitian
Keterangan :
COX-2 : Siklooksigenase 2
LPS : Lipopolisakarida
NO : Nitric Oxide
iNOS : Inducible Nitric Oxide Synthase
IL-6 : Interleukin 6
IL-1β : Interleukin 1 beta
TNF-α : Tumor Necrosis Factor alpha
ROS : Reactive Oxigen Species
RNS : Reactive Nitrogen Species
: Menghambat aktivitas berlebihan
: Mengaktivasi/ Merangsang
: Melepaskan/ Menghasilkan
: Menginduksi pelepasa
29
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara eksperimental untuk mengetahui aktivitas
antiinflamasi minyak kelapa murni dan hidrolisisnya secara in vitro pada sel RAW
264.7. Tahap penelitian meliputi hidrolisis enzimatik minyak kelapa murni
menggunakan enzim lipase dari Rhizomucur miehei dilakukan di laboratorium
Farmakognosi, Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara, Medan. Analisis
viabilitas sel, kadar NO dan penentuan ekspresi iNOS, TNF-α, IL-1β, COX-2 , β-
actin dan IL-6 yang dilakukan di Laboratorium Parasitologi dan Laboratorium
Terpadu Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat laboratorium,
autoclave (Hirayama), blender (Philips), conical tube (Thermo Scientific),
elektroforesis (BioRad), falcon tube, (Thermo Scientific), Gel Doc (Syngene),
inkubator CO2 (Heraceus), Laminar Air Flow (Labconco), microscope inverted
(Olympus), microplate reader (Bio Rad), mikropipet (Eppendorf), microwave
(Panasonic), nanovue plus (fisher scientific), neubauer hemocytometer (Hausser
Scientific), neraca listrik (Vibra AJ), oven (Memmert), penangas air (Yenaco),
PCR (ProFlex, Applied Biosystems), sentrifugator (Eppendorf), rotary evaporator
(Stuart), vortex (IKA), 6-well plate (Iwaki), 96-wells plate (Iwaki).
30
3.2.2 Bahan-bahan
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah VCO dan HVCO
(Lampiran 1, hal 61). Bahan kimia yang digunakan kecuali dinyatakan lain adalah
berkualitas pro analisis, yaitu buffer Tris-HCl, n-heksan. Sel RAW 264.7 yang
merupakan koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM, media
penumbuh Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) (Biowest), Fetal
Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisilin-streptomisin 2% (v/v) (Gibco),
Fungizone (Amphotericin B) (Sigma), Hepes, NaHCO3 HCl, NaOH, NaNO3
(Sigma). Aquabides steril, Pereaksi Griess (Sigma), Deksametason (Harsen),
VCO (Palem Mustika), enzim lipase rhizomucur miehei 0,25% Tripsin-EDTA
(Gibco), Lipopolisakarida (Sigma), MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-
2,5difeniltetrazolium bromida] (Sigma), phosfat buffer saline (PBS) (Irvine
Scientific), natrium dodesil sulfat (SDS) dalam HCl 0,1 N, total RNa kit
(Geneaid), Rever Tra-Ace (Toyobo), wash buffer, DNase, RNase bebas air, primer
iNOS, primer IL-6, primer TNF-α, primer IL-1β, GoTaq®Green Master Mix
(Promega), TBE (Vivantis), agarosa (Promega), FluoroVue (Smobio), DNA
ladder 100 bp (Smobio).
3.3 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni
Sebanyak 30 g minyak dimasukkan ke dalam sebuah erlenmeyer 250 ml
ditambahkan 30 ml akuades, 12,5 ml CaCl2 0,063 M, 25 ml larutan buffer Tris-
HCl 1 M pH 8, dan 3 ml enzim lipase Rhizomucur miehei. Campuran ini diaduk
dengan pengaduk magnet dengan kecepatan 200 rpm selama 19 menit setiap 1
jam, kemudian diinkubasi pada suhu 500C selama 10 jam. Setelah waktu hidrolisis
tercapai kemudian campuran dipindahkan ke corong pisah, ditambahkan 50 ml n-
31
heksan, diekstraksi dan didiamkan beberapa saat hingga terbentuk dua lapisan.
Lapisan atas (fraksi n-heksan) dipisahkan sebagai filtrat I. Lapisan bawah (fraksi
air) dikocok kembali dengan 50 ml n-heksan, setelah didiamkan beberapa saat
diambil lapisan atas (filtrat II). Filtrat I dan II digabung kemudian ditambahkan
250 mg Na2SO4 anhidrat untuk menjerap sisa air yang tertinggal, dibiarkan selama
15 menit dan disaring. Selanjutnya diuapkan diatas penangas air dalam cawan
penguap untuk menghilangkan n-heksan. Minyak non hidrolisis dan hasil
hidrolisis enzimatis yang diperoleh dari proses hidrolisis kemudian digunakan
untuk uji pengaruh terhadap efek antiinflamasi (Margata, dkk., 2018) (lampiran 2,
hal 64).
3.4 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan dalam uji aktivitas ini, disterilkan terlebih dahulu
sebelum dipakai sehingga terhindar dari berbagai kontaminasi pengujian. Alat-alat
gelas dan plastik yang akan digunakan disterilkan di dalam autoklaf pada suhu
121oC selama 15 menit (Lay, 1994).
3.5 Pembuatan Media
Pembuatan media yang dilakukan dalam penelitian ini yaitu pembuatan
media pertumbuhan dan media kultur lengkap.
3.5.1 Pembuatan Media Pertumbuhan.
Komposisi : DMEM sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan L-

glutamine tanpa NaHCO3, netto 10,4 gram.
Hepes 2g
NaHCO3 2g
HCl 1 N secukupnya
NaOH 1 N secukupnya
Aquabides steril ad 1 L
32
Cara pembuatan :
Sebanyak 1 sachet DMEM, 2 gram Hepes, dan 2 gram NaHCO3
dimasukkan ke dalam erlenmeyer, tambahkan 800 mL aquabides steril,
homogenkan dengan menggunakan stirer magnet. Kemudian pH diukur dengan
pH meter (pH yang diinginkan adalah 7,2-7,4); untuk menyesuaikan pH dapat
digunakan HCl 1 N (bila larutan terlalu basa) atau NaOH 1 N (bila larutan terlalu
asam), tambahkan aquabidest steril sampai 1 L, lakukan sterilisasi dengan filter
vaccum didalam LAF (Laminar Air Flow), dipasang filter aparatus steril pada
botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan filter, aliquot media
ditampung dalam botol duran 500 mL, diberi identitas pada botol media (nama
media, tanggal pembuatan, expire date, dan nama pembuat), dan disimpan pada
suhu 2-8ºC (Novycha, et al., 2019) (lampiran 3, hal 65).
3.5.2 Pembuatan Media Kultur Lengkap
Komposisi : Fetal Bovine Serum (FBS) 10%

Penisilin-streptomisin 2%
Fungizone (Amphotericin B) 0,5%
DMEM ad 100 mL
Cara pembuatan :
Campur semua bahan di atas, dan dilakukan di dalam LAF (Laminar Air
Flow), beri identitas pada botol MK (nama media, tanggal pembuatan, expire
date, dan nama pembuat), simpan pada suhu 2-8ºC (Novycha, et al., 2019)
(lampiran 4, hal 64).
3.6 Penumbuhan Sel.
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 mL
media DMEM pada tabung konikel 15 mL, ambil ampul dari freezer -80ºC atau
33
tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul,
masukkan tetes demi tetes kedalam media DMEM yang telah disiapkan,
sentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit, buang supernatant dan tambahkan 4 mL
MK DMEM dan resuspensi hingga homogen. Transfer masing-masing 2 mL ke
dalam flask kultur baru. Ditambahkan 5 mL MK ke dalam masing-masing flask
kultur, dan homogenkan. Diamati kondisi sel dengan menggunakan inverted
microscope. Pastikan sel homogen pada seluruh permukaan flask kultur (tidak
menggerombol pada bagian tertentu). Beri identitas pada flask kultur, kemudian
simpan dalam inkubator CO2 (Novycha, et al., 2019) (lampiran 5, hal 67).
3.6.1 Subkultur Sel
Persiapan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan
pengerjaan pada LAF. Proses panen sel dilakukan dengan cara mengambil 500 μL
panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Ditambahkan 6 mL MK,
homogenkan. Diinkubasi sel pada inkubator CO2, diamati kondisi sel pada
keesokan harinya (Novycha, et al., 2019).
3.6.2 Panen Sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi
sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80% konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada LAF. Dibuang MK dari flask dengan mikropipet atau
pipet Pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 mL PBS (Phosphate Buffer salin),
tambahkan 300-500 μL Tripsin-EDTA 0,025% secara merata, kemudian inkubasi
di dalam inkubator CO2 selama ± 5 menit, dan tambahkan 4 mL MK untuk
menginaktifkan tripsin. Diresuspensi sel dengan mikropipet agar sel terlepas satu-
satu (tidak menggerombol). Diamati keadaan sel pada microscope inverted.
34
Diresuspensi sel kembali jika masih ada sel yang menggerombol lalu dipindahkan
sel ke dalam tabung konikel (Doyle dan Griffith, 2000) (lampiran 6, hal 68).
3.6.3 Perhitungan Sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 μL
panenan sel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel dibawah
mikroskop dengan menggunakan counter. Hemositometer terdiri dari 4 kamar
hitung (A, B, C, dan D), setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak (Gambar 3.1).
Gambar 3.1 Hemositometer.
Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap (mati) dan sel
yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel dibatas
kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel/mL dengan rumus:
∑ ∑ ∑ ∑
∑ = 4
Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misalnya untuk menanam sel
pada tiap susunan 96-well plate, maka jumlah total sel yang diperlukan adalah
5x103/sumuran X 100 sumuran (dibuat lebih) = 1x105 sel.
Hitung volume panenan sel yang diperlukan (dalam mL) dengan rumus:
35
Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan
MK sampai total volume yang diperlukan (Doyle dan Griffith., 2000) (lampiran 7,
hal 69).
3.7 Pembuatan larutan uji
VCO dan HVCO sebanyak 5 mg ditimbang dalam polytube, kemudian
dilarutkan dalam dimetilsulfoksida (DMSO) sebanyak 100 μL, divortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan media kultur MK-DMEM
kemudian di buat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan
konsentrasi 500 μg/mL, 250 μg/mL, 125 μg/mL, 62,5 μg/mL dan 31,25 μg/mL
semua pengenceran dilakukan dengan menggunakan Medium Kultur- Dulbecco’s
Modified Eagle Medium (MK-DMEM) (lampiran 8, hal 70).
Deksametason 0,5 mg dilarutkan dengan 100 μL DMSO, divortex agar
sampel terlarut sempurna kemudian dicukupkan dengan media kultur MK-DMEM
kemudian di buat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh larutan uji dengan
konsentrasi 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2,5 μg/mL dan 1,25 μg/mL semua
pengenceran dilakukan dengan menggunakan MK-DMEM.
3.8 Uji Effek VCO dan HVCO Terhadap Viabilitas Sel RAW 264.7
Sel RAW 264.7 ditumbuhkan dalam media DMEM dengan penisilin,
streptomisin dan fetal bovin serum (FBS). Sel RAW 264.7 (3x103 sel/well)
ditanam dalam 96-well plate dan diinkubasi selama 24 jam untuk mendapatkan
pertumbuhan yang baik. Setelah 24 jam medium diganti dengan yang baru
kemudian ditambahkan larutan uji (minyak kelapa murni dan hasil hidrolisisnya)
dengan konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25 μg/mL dan deksametason (20; 10;
36
5; 2,5; 1,25 μg/mL) dan diinkubasi pada suhu 37 oC dalam inkubator CO2 5%
selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media dan larutan uji dibuang kemudian sel
dicuci dengan PBS. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan 100 μl media
kultur dan 10 μl MTT 5 mg/ml. Untuk mengamati viabilitasnya sel diinkubasi
kembali selama 4-6 jam dalam inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC. Reaksi MTT
dihentikan dengan reagen stopper (SDS 10% dalam HCl 0,1 N), lalu plate
dibungkus dengan aluminium foil agar tidak tembus cahaya pada suhu kamar dan
dibiarkan selama satu malam. Sel yang hidup bereaksi dengan MTT membentuk
warna ungu. Hasil pengujian dibaca dengan microplate reader pada panjang
gelombang 595 nm. Viabilitas sel dihitung dengan rumus:
Persentase viabilitas sel yang tidak diobati dihitung 100% (Nugroho, et al., 2013;
Zheng, et al., 2017) (lampiran 9, hal 69). Untuk percobaan selanjutnya pada uji
Produksi Nitric Oxide dan pengujian ekspresi gen menggunakan VCO dan HVCO
dengan konsentrasi 62,5 dan 31,25 μg/mL dan deksametason (2,5 μg/mL dan 1,25
μg/mL) sebagai kontrol positif, diikuti dengan stimulasi menggunakan LPS
sebagai konrol negatif (1 μg/mL).
3.9 Uji Aktivitas Antiimflammasi
3.9.1 Uji Produksi Nitric Oxide (NO)
Sel RAW 264.7 (3x103 sel/well) ditanam pada 96-well plates yang
diinduksi dengan LPS sebanyak 1 μg/mL (proses penginduksian LPS
mengakibatkan respon sistemik dan meningkatkan produksi mediator – mediator
inflamasi sehingga akan memacu peningkatan produksi NO dalam jumlah besar,
37
sehingga perlu dilakukan pengujian), kemudian diinkubasi selama 24 jam lalu
ditambahkan larutan uji (VCO dan VCO) dengan konsentrasi 62,5 dan 31,25
μg/mL dan deksametason (2,5 μg/mL dan 1,25 μg/mL) sebagai kontrol positif,
diikuti dengan stimulasi menggunakan LPS sebagai konrol negatif (1 μg/mL) lalu
diinkubasi kembali selama 24 jam dalam inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC.
Jumlah nitrit dalam media kultur diukur sebagai indikator produksi NO. Jumlah
nitrit, metabolit NO yang stabil, diukur dengan menggunakan pereaksi Griess
(0,1% naftil etilen diamin dihidroklorida dalam asam fosfat 2,5% dan
sulfanilamida 1%). Kemudian, 100 μL supernatan kultur ditambahkan ke 100 μL
pereaksi Griess, kemudian diinkubasi selama 10 menit di ruangan yang gelap.
Absorbansi diukur pada 595 nm pada microplate reader. Konsentrasi standar
nitrit dihitung dengan menggunakan larutan standar Natrium nitrit (1000 μM),
dibuat pengenceran dengan konsentrasi 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125; 1,5625;
0,78125 μM, lalu direaksikan dengan pereaksi Griess dan dibaca absorbansinya
dengan microplate reader. Bagan uji produksi nitric oxide (NO) dapat dilihat pada
lampiran 10, hal 72 (Yuandani, et al., 2017).
3.9.2 Pemeriksaan Ekspresi Gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2, dan β-
actin
Pemeriksaan ekspresi gen yang merupakan meditor-mediator inflamasi
yaitu iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2 dan β- actin dilakukan dengan
menggunakan metode RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain
Reaction). Sel RAW 264.7 (5x105 sel/well) ditanam pada microplate 6 sumuran
dengan jumlah pada tiap sumuran 2 ml kemudian diinkubasi selama 24 jam dalam
inkubator CO2 5 % pada suhu 37oC. Media lama dibuang dan diganti dengan
media baru lalu diinduksi dengan LPS (1 μg/mL) dan diinkubasi kembali selama 6
38
jam kemudian ditambahkan larutan uji minyak kelapa murni dan hasil
hidrolisisnya dengan konsentrasi 62,5 μg/mL, 31,25 μg/mL dan deksametason 2,5
μg/mL, 1,25 μg/mL kemudian diinkubasi kembali selama 24 jam setelah itu media
dipindahkan dalam tabung konikel dan ditambahkan dengan PBS, kemudian sel-
sel yang mengapung dan melekat dikumpulkan dengan cara memberikan tripsin
0,025% dan kemudian dipindahkan kedalam tabung konikel, sel dicuci sebanyak
dua kali dengan 1 ml PBS dan disentrifugasi 2500 rpm selama 5 menit, lapisan
paling atas dibuang dan endapan dikumpulkan dan diresuspensi dalam PBS dan di
sentrifugasi 3000 rpm selama 3 menit, buang supernatant dan tambahkan dengan
1 mL PBS kemudian dilanjutkan dengan ekstraksi RNA (Noviycha, et al., 2019).
3.9.3 Ekstraksi RNA
RNA total diisolasi menggunakan kit isolasi RNA (Geneaid). Ekstraksi
RNA dilakukan dengan tahap lisis sel, pencucian dan elusi RNA (Noviycha, et al.,
2019). Bagan proses ekstraksi RNA dapat dilihat pada lampiran 11, hal 73.
a. Tahap lisis sel
Sel RAW 264,7 (5x105 sel/well) yang telah dipanen ditambahkan 400 μl
RB buffer dan 4 μl β-mercaptoethanol lalu sel diresuspensikan kembali. Setelah
itu campuran dihomogenkan, inkubasi pada suhu ruangan selama 5 menit.
Tambahkan 400 μl dengan etanol 70% yang telah disiapkan dalam ddH2O (DNase
RNAse free water). Dikocok kuat hingga campuran homogen. Siapkan kolom RB
tube 2mL, pindahkan 500 μl campuran pada kolom RB. Sentrifuge dengan
kekuatan 14-16.000 rpm selama 1 menit, lalu filtrat dibuang. Pindahkan campuran
yang tersisa pada kolom RB yang sama, sentrifuge dengan kekuatan 14-16.000
39
rpm selama 1 menit. Buang filtrat dan tempatkan kolom RB pada tube 2 mL
yang baru (Novycha, et al., 2019).
b. Tahap Pencucian Sel
Ditambahkan 400 μl WI buffer kedalam kolom RB, sentrifuge dengan
kekuatan 14-16.000 rpm selama 30 detik. Filtrat dibuang, lalu tambahkan 600 μL
buffer pencuci (pastikan etanol telah ditambahkan) kedalam kolom RB. Sentrifuge
dengan kekuatan 14-16.000 rpm selama 30 detik, lalu filtrat dibuang. Tempatkan
kembali kolom RB dalam tube 2 mL dan sentrifuge dengan kekuatan 14-16.000
rpm selama 3 menit untuk mengeringkan matriks kolom (Noviycha, et al., 2019).
c. Tahap Elusi RNA
Ditempatkan kolom RB yang telah kering kedalam tube mikrosentrifuge
1,5 mL yang baru. Tambahkan 50 μl RNase bebas air kedalam bagian tengah
kolom matriks. Diamkan selama 1 menit untuk memastikan RNase bebas air telah
diserap. Kemudian sentrifuge dengan kekuatan 14-16.000 rpm selama 1 menit
untuk mengelusi RNA yang dipurifikasi. Hitung konsentrasi RNA yang dihasilkan
(Noviycha, et al., 2019).
3.9.4 Pembuatan cDNA
Total RNA yang dipakai 2000 ng kemudian ditambahkan DNase RNase
free water hingga volume total 12 μL. Sebanyak 8 μL larutan campuran (5x RT-
buffer 4 μL; random primer 1 μL; dNTP 2 μL; Rever Tra-Ace 1 μL) ditambahkan
pada tiap microtube yang berisi RNA, kemudian diresuspensi dan dilakukan PCR
dengan kondisi 300C selama 10 menit, 420C selama 60 menit, dan 990C selama 5
menit. Produk PCR hasil pembuatan cDNA diukur konsentrasi dengan
40
menggunakan alat Nanodrop (Hadiarto, et al., 2015). Bagan Proses pembuatan
cDNA dapat dilihat pada lampiran 12, hal 75.
3.9.5 Analisis Ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β , COX-2, dan β-actin
Ekspresi gen iNOS, TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2 dan β-actin diperiksa
dengan cara mengambil cDNA 100 ng/μL ditambahkan sampai 25 μL PCR
Master Mix (GoTaq®Green 12,5 μL; primer forward 1 μL; primer reverse 1 μL;
DNase RNase free water 9,5 μL). Proses analisis ekspresi gen dapat dilihat pada
lampiran 13, hal 76.
Tabel 3.1 Primer Sequens
Annealing
Gen Primer Sequens Size (bp)
Temp (°C)
F 5’-CGAAACGCTTCACTTCCAA-3’
iNOS 311 60
R 5’-TGAGCCTATATTGCTGTGGCT-3’
F 5’-CCCTGCAGCTGGAGAGTGTGGA-3’
IL-1β 447 62,5
R 5’-TGTGCTCTGCTTGTGAGGTGCTG-3’
F 5’-TGTGCCGCCGCTGTCTGCTTCACGCT-3’
TNF-α 374 55
R 5’-GATGAGGAAAGACACCTGGCTGTAGA-3’
F 5’-GATGCTACCAAACTGGATATAATC-3’
IL-6 269 55
R 5’-GGTCCTTAGCCACTCCTTCTGTG-3’
F 5’- CCTGTGTTCCACCAGGAGT-3’
COX-2 249 58
R 5’- GTCCCTGGCTAGTGCTTCAG-3’
F 5’- TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3’
β-actin 349 55
R 5’- TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3’
PCR terdiri dari 35 siklus amplifikasi dan setiap siklus dilakukan selama
30 detik pada 95°C (denaturasi), 1 menit pada suhu annealing (55°C untuk TNF-
α, IL-6, COX-2 58°C, β-actin dan 60°C untuk iNOS) dan 45 detik pada 95°C
41
(denaturasi), 1 menit pada suhu annealing 62,5°C untuk IL-1β.) dan 1 menit pada
72°C (elongasi) dalam thermal cycler (ProFlexTM 3x32-well PCR System,
Applied Biosystems), β-actin merupakan house keeping gene yang digunakan
sebagai kontrol internal untuk menstandarisasi tingkat ekspresi relatif untuk
semua biomarker. Produk PCR dianalisis dengan elektroforesis pada agarosa 2%
dan Tris-Borate-EDTA (Vivantis), serta flouroVue (Smobio) sebagai pewarna
(Yanti, et al., 2011; Kim, et al., 2016).
3.9.6 Elektroforesis
Gel agarosa 2% dibuat dengan cara menambahkan 2 gram serbuk agarosa
dengan 100 mL TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5x dalam erlenmeyer, kemudian
dipanaskan dalam microwave selama 3-4 menit dan tambahkan flouroVue 4 μL.
Agarosa dituangkan dalam piringan gel dan didinginkan pada suhu ruangan
selama 30-40 menit. DNA ladder 100 bp sebanyak 5 μL sampel dimasukkan ke
dalam sumuran gel. Elektroforesis dilakukan selama 30-45 menit dengan
kecepatan 70 volt. Pengambilan foto gel hasil elektroforesis dengan menggunakan
gel doc. Gambaran band kemudian diukur menggunakan analisis densitometry
dengan software Gel Doc (Amanda dan Cartealy, 2015). Bagan pengujian dengan
elektroforesis dapat dilihat pada lampiran 14, hal 77.
3.10 Analisis data
Semua data dianalisis dengan menggunakan Statistical Package for Social
Sciences (SPSS) versi 22.0. Data disajikan sebagai mean ± standard error means
(SEM). Analisis varians satu arah (ANOVA) untuk beberapa perbandingan
digunakan untuk analisis data P<0,05 dianggap berbeda secara signifikan.
42
3.11 Definisi Operasional Penelitian
Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat dilihat definisi operasional
pada Tabel 3.2 yang meliputi variabel, definisi, alat ukur, cara ukur, hasil ukur
dan skala ukur yang dilakukan dalam penelitian ini.
Tabel 3.2 Tabel Definisi Operasional Penelitian
No Variabel Definisi Alat Ukur Cara Ukur Hasil Ukur Skala

Ukur
1 Hasil Hasil hidrolisis Timbangan Menimbang Berat Kontinu:

Hidrolisis minyak kelapa Ekstrak Rasio
Minyak murni yang
Kelapa diperoleh dari
Murni minyak kelapa
murni
ditambahkan 30
ml akuades, 12,5
ml CaCl2 0,063
M, 25 ml larutan
buffer Tris-HCl 1
M pH 8, dan 3 ml
enzim lipase
Rhizomucor
miehei.
Diinkubasi pada
suhu 500C selama
10 jam.
Diekstraksi
dengan n- heksan
2 Uji viabilitas Melakukan uji Microplate Melakukan Nilai Numerik

sel MTT assay reader pengukuran Absorbansi
menggunakan absorbansi
garam MTT. pada
Garam ini akan panjang
terlibat pada kerja gelombang
enzim 595 nm.
dehydrogenase.
MTT akan
direduksi menjadi
formazan oleh
sistem reduktase
suksinat
tetrazolium yang
termasuk dalam
mitokondria dari
43
Tabel 3.2 (lanjutan)
sel hidup
3 Uji produksi Melakukan Microplate Melakukan Nilai Numerik

Nitric Oxide pengujian dengan reader pengukuran Absorbansi
(NO) melakukan uji absorbansi
reaksi Griess pada pada
analisa sampel panjang
biologis seperti gelombang
plasma, serum, 595 nm
urin, cairan
serebrospinal dan
saliva. Pada
metode ini, nitrit
ditambahkan
dengan reagen
pendiazotasi
seperti
sulfanilamid
dalam media
asam untuk
membentuk
garam diazonium
sementara.
4 Pemeriksaan Melakukan RT-PCR Melakukan Nilai Size Numerik

Reaksi berantai (Reverse pengukuran (BP)
Ekspresi polymerase Transcript
(Reverse ase mengambil
Gen iNOS cDNA 100
Polymerase Chain Polymeras
Reaction, RT- e Chain ng/μL
TNF-α, IL
PCR adalah suatu Reaction) ditambahkan
6,IL-1β, metode enzimatis sampai 25
untuk melipat μL PCR
COX 2, dan gandakan secara Master Mix
eksponensial (GoTaq®Gre
β actin en 12,5 μL;
suatu sekuen
nukleotida primer
tertentu dengan forward 1
cara in vitro μL; primer
reverse 1
μL; DNase
RNase free
water 9,5
μL)
44
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Pengaruh Viabilitas pada VCO dan HVCO Terhadap Sel RAW 264.7
Uji viabilitas sel dilakukan menggunakan MTT assay untuk menentukan
konsentrasi yang bersifat tidak toksik pada VCO dan HVCO terhadap sel RAW
264.7. Hasil pengamatan pembentukan kristal formazan terlihat pada Gambar
4.1.
Kristal Kristal
formazan formazan
a b
Gambar 4.1 Kristal formazan pada sel RAW 264.7 setelah MTT.
a.VCO, b. HVCO
Hanya sel aktif dan secara metabolik aktif yang dapat mereduksi MTT
untuk menghasilkan formazan, maka semakin banyak intensitas warna medium,
semakin banyak sel yang dapat hidup (Yuandani et al., 2016). Metode MTT [3-
(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] merupakan salah satu uji
sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif dan dilakukan untuk mengetahui
konsentrasi aman yang akan digunakan dalam penelitian berikutnya. Uji ini
berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil
metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini
digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase.
MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium
termasuk mitokondria dari sel hidup (Kupcsick and Martin, 2011).
45
Pada Gambar 4.1 menunjukan terbentuknya kristal formazan yang dilihat
menggunakan mikroskop inverted dengan perbesaran 10x40. Aktivitas
dehidrogenase mitokondria sel yang hidup akan mereduksi warna kuning MTT
membentuk warna ungu. Warna gelap dan berserabut yang nampak pada
pengamatan merupakan kristal formazan setelah pemberian MTT. Semakin
banyak sel hidup berarti semakin banyak sel yang aktif melakukan metabolisme
sehingga jumlah kristal formazan yang terbentuk juga semakin banyak. Semakin
banyak kristal formazan yang terakumulasi ini menyebabkan intensitas warna
ungu semakin meningkat dalam plate. Sel yang mati tidak dapat terwarnai oleh
garam MTT sehingga tidak membentuk warna ungu seperti pada sel hidup.
Akibatnya pada sel mati tidak terbentuk formazan yang berwarna ungu, tetapi
warnanya tetap kuning seperti medium (Freshney, 2000).
Perlakuan masing-masing VCO dan HVCO 500; 250; 125; 62,5; 31,25
μg/ml. Menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi larutan uji dengan efek
viabilitas sel yang ditimbulkan pada perlakuan dengan deksametason dengan seri
konsentrasi 20; 10; 5; 2,5; μg/mL. Grafik pengaruh pengujian viabilitas sel pada
masing-masing VCO, HVCO dan deksametason terhadap sel RAW 264.7 dapat
dilihat pada Gambar 4.2 dan pengaruh rata-rata % sel hidup dari VCO, HVCO
dan Deksametason dilihat pada Tabel 4.1.
46
120
31,25 µg/mL
100
62,5 µg/mL
125 µg/mL
80
250 µg/mL
60 500 µg/mL
1,5 µg/mL
40 2,5 µg/mL
5 µg/mL
20 10 µg/mL
20 µg/mL
0
VCO HVCO Deksametason
Gambar 4.2 Pengaruh VCO, HVCO dan Deksametason tehadap Nilai Viabilitas
Sel RAW 264.7
Tabel 4.1 Pengaruh VCO, HVCO dan Deksametason Terhadap % sel RAW 264.7
yang Hidup
Rata-rata %
Konsen Rata-rata % sel hidup ± SEM
Konsen trasi sel hidup ±
NO trasi (n=3)
(μg/mL) SEM
(μg/mL)
1 31,25 99,59±0,39 102,31±1,21 1,25 93,47 ± 1,12
2 62,5 101,67±0,66 97,74±0,31 2,5 92,23 ± 0,13
3 125 98,41±0,18 85,09±0,30 5 90,26 ± 0,44
4 250 97,71±0,26 67,01±0,40 10 82,84 ± 0,52
5 500 85,18±0,37 7,07±0,30 20 74,43 ± 0,31
Hasil uji viabilitas sel pada Gambar 4.2 dan nilai viabilitas sel pada Tabel
4.1 menunjukkan bahwa semakin tinggi konsentrasi maka nilai viabilitas semakin
rendah atau semakin tinggi konsentrasi VCO dan HVCO maka sel yang hidup
semakin sedikit yang berarti semakin tinggi konsentrasi VCO dan HVCO maka
semakin tinggi efek sitotoksiknya terhadap sel kultur yang diuji. Hasil uji
viabilitas sel dari VCO, HVCO dan deksametason sebagai kontrol positif. Hasil
terbaik ditunjukkan pada VCO dengan konsentrasi 31,25; 62,5 dan 125 μg/mL
47
dan memiliki % sel hidup paling tinggi. Pengujian viabilitas sel menunjukkan
bahwa VCO tidak menyebabkan toksik pada sel RAW 264.7 (Susanto, et al.,
2018; Yuandani, et al., 2017). Dengan hasil ini, konsentrasi sampel yang
menghasilkan % sel hidup paling tinggi (>90%) dipilih untuk percobaan
berikutnya (Yuandani, et al., 2016).
4.2 Produksi Nitric oxide (NO)
Uji produksi NO dilakukan dengan menggunakan pereaksi Griess. Pada
metode ini, nitrit ditambahkan dengan reagen pendiazotasi seperti sulfanilamid
dalam media asam untuk membentuk garam diazonium sementara. Hasil antara ini
kemudian direaksikan dengan reagen pengkopel, N-naftil-etilendiamin (NED),
untuk membentuk senyawa azo yang stabil. Warna ungu yang dihasilkan
memungkinkan untuk analisa nitrit dengan tingkat sensitivitas yang tinggi (Sun, et
al., 2003). Pada pengujian produksi NO pada sel RAW 264.7 diinduksi dengan
LPS (1 μg/mL) dan diberikan perlakuan dengan VCO dan HVCO yaitu pada
konsenterasi 31,25 dan 62,5μg/mL serta deksametason dengan konsenterasi 1,25
dan 2,5 μg/mL. Produksi NO diukur sebagai konsentrasi nitrit dalam media kultur,
ketika dibandingkan dengan kontrol yang tidak diberi perlakuan, sel-sel yang
diinduksi dengan LPS melepaskan kadar NO yang lebih tinggi dalam medium dari
pada yang tidak diberi perlakuan (Joo, et al., 2014). Hasil produksi NO dari
berbagai sampel ekstrak dapat terlihat pada Gambar 4.3.
48
120
100
80
60
40
20
0
KS LPS VCO VCO HVCO HVCO DeksaDeksa
31,25 62,5 31,25 62,5 1,25 2,5
Gambar 4.3 Pengaruh produksi nitric oxide (NO) pada sel RAW 264.7 yang
diinduksi oleh LPS pada VCO dan HVCO. *P<0,05 berbeda
signifikan dengan kelompok kontrol normal (KS) #P<0,05 berbeda
signifikan dengan kelompok kontrol negatif (LPS) ^P<0,05 berbeda
signifikan dengan kelompok kontrol positif (deksametason).
Nitric oxide (NO) adalah molekul biologi yang bisa terdapat di seluruh
tubuh, dihasilkan oleh sejumlah tipe sel yang berkaitan dengan proses penyakit,
dan dapat menimbulkan efek di tingkat inflamasi seluler dan vaskuler. NO
mempunyai peran penting dalam patogenesis sepsis, dimana akibat pengaruh dari
iNOS, NO akan diproduksi dalam jumlah besar oleh makrofag (Nugroho, dkk.,
2013).
Hasil pengujian produksi NO pada Gambar 4.3 menunjukkan bahwa sel
yang distimulasi dengan LPS mengalami peningkatan kadar nitrit dan sebaliknya
pada pemberian VCO dan HVCO mengalami penurunan kadar nitrit, terlihat pada
konsentrasi 62,5 μg/mL kadar nitrit lebih besar dan pada konsentrasi 31,25μg/mL
mengalami penurunan yang berarti VCO dan HVCO dapat menghambat produksi
NO. Dari kedua sampel tersebut VCO memiliki efek penghambatan yang paling
49
bagus dibandingkan dengan HVCO. Kedua sampel tersebut secara signifikan
menghambat/menurunkan akumulasi nitrit dalam sel RAW 264.7 (P<0,05) yang
distimulasi dengan LPS dan dibandingkan dengan kontrol sel. Konsentrasi yang
paling bagus terlihat pada konsentrasi 62,5 μg/mL untuk sampel dan 2,5 μg/mL
untuk deksametason. Deksametason digunakan sebagai positif kontrol yang dapat
menurunkan kadar NO terlihat pada grafik yang menghasilkan kadar NO yang
paling rendah. Deksametason merupakan obat non steroid anti-inflamasi
(NSAIDs) dan juga dapat bersifat sebagai imunosupresan (Price, et al., 2010).
4.3 Akativitas Antiimflammasi VCO dan HVCO melelui Ekspresi Gen
Pengujian ekspresi gen dilakukan menggunakan metode RT-PCR Prinsip
kerja metode ini mengamplifikasi RNA. RNA diubah menjadi DNA dengan
menggunakan reverse transcriptase yang dapat mensintesis DNA dengan cetakan
RNA dan menghasilkan DNA yang disebut dengan cDNA. Setelah terbentuk
DNA maka dapat diamplifikasi dengan menggunakan PCR (Sudjadi, 2008). Pada
pengujian ini, sel RAW 264.7 diberi perlakuan dengan VCO dan HVCO dengan
konsentrasi 25 μg/mL yang telah diinduksi dengan LPS (1 μg/mL). Hasil
pengujian ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β, iNOS, COX-2 dan β-actin oleh VCO
dan HVCO yang telah dilakukan elektroforesis sehingga menghasilkan gambaran
pita yang dapat terlihat pada Gambar 4.4 kemudian dikuantifikasi densitas yang
diperoleh menggunakan sistem komputerisasi Gel doc sehingga dapat ditentukan
nilai densitas ekspresi gen yang terlihat pada Tabel 4.2 serta penurunannya
terlihat pada Gambar 4.5.
50
IL-6 269 Bp
COX-2 249 Bp
TNF-α 374 Bp
IL-1β 441 Bp
iNOS 311 Bp
β-actin 349 Bp
a b c d e
Gambar. 4.4. Pengaruh ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β dan iNOS, terhadap
VCO dan HVCO, a. Kontrol Sel; b. Lipopolisakarida; c. VCO 25
μg/mL; d. HVCO 25 μg/mL; e. Deksametason 2,5 μg/mL
Tabel 4.2 Pengaruh densitas ekspresi gen dari VCO dan HVCO
NO Gen Kelompok Perlakuan Rata-rata nilai densitas ± SEM

1. TNF-α VCO 0,91 ± 0,010abc
HVCO 0,76± 0,015ab
Deksametaon 0,70 ± 0,010ab
LPS 1,18 ± 0,010ac
KS 1,00 ± 0,000bc
2. IL-6 VCO 1,23 ± 0,015abc
HVCO 1,16± 0,010abc
LPS 1,16 ± 0,010ac
KS 1,00 ± 0,000bc
3. IL-1β VCO 2,47 ± 0,010ac
HVCO 2,40 ± 0,015abc
Deksametason 1,70 ± 0,010abc
LPS 3,38 ± 0,010ac
KS 1,00 ± 0,000bc
4. COX-2 VCO 1,02 ± 0,015abc
HVCO 0,98± 0,010abc
51
Tabel 4.2 (lanjutan)

LPS 1,22 ± 0,015c
KS 1,00 ± 0,000bc
5. iNOS VCO 0,90 ± 0,015abc
HVCO 0,72± 0,010ac
LPS 1,49 ± 0,015c
KS 1,00 ± 0,000c
Keterangan:
a: Sig (P) <0,05 ada perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol normal
(KS)
b: Sig (P) <0,05 ada perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol negatif
(LPS)
c: Sig (P) <0,05 ada perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol positif
(deksametason)
3.5
2.5 KS
LPS
2
VCO
1.5
HVCO
1 DEKSA
0.5
0
TNF-α IL-6 IL-1β COX-2 iNOS
Gambar. 4.5 Grafik Pengaruh densitas ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2
dan iNOS terhadap VCO dan HVCO. *p<0,05 berbeda signifikan
dengan kelompok kontrol normal (KS) #p<0,05 berbeda signifikan
dengan kelompok kontrol negatif (LPS). ^p<0,05 berbeda
signifikan dengan kelompok kontrol positif (deksametason).
Hasil pengujian ekspresi gen pada Gambar 4.4 menunjukkan bahwa VCO
dan HVCO dapat menurunkan ekspresi TNF-α, IL-6, COX-2, IL-1β dan iNOS
yang dibandingkan dengan LPS yang mengalami peningkatan terbesar. Gambaran
pita dengan perlakuan (VCO, HVCO, Deksametason) terlihat lebih tipis
52
dibandingkan dengan perlakuan dengan LPS yang menghasilkan pita paling tebal.
LPS merupakan inducer utama yang dapat mengaktivasi makrofag sehingga dapat
meningkatkan ekspresi gen (Yu, et al., 2015; Kim, et al., 2016). Pada perlakuan
dengan deksametason, pita terlihat lebih tipis dari perlakuan yang diberikan
sampel karena deksametason merupakan kontrol positif yang dapat menurunkan
ekspresi gen (Yuandani, et al., 2016). Deksametason merupakan obat NSAID
yang juga dapat digunakan sebagai antiinflamasi dan imunosupresan (menurunkan
sistem imun tubuh). β-actin digunakan sebagai kontrol internal dalam analisis
ekspresi gen karena ia merupakan Housekeeping gene, yaitu gen yang terus
menerus diekspresikan selama suatu organisme hidup. Housekeeping gene
memiliki tingkat ekspresi yang stabil diberbagai jaringan pada semua tahapan
perkembangan (Dheda, et al., 2004; Libault, et al., 2008; Yoon, et al., 2009). Hasil
ini menunjukkan bahwa VCO dan HVCO tersebut mempunyai aktivitas
antiinflamasi pada sel makrofag RAW 264.7 yang diinduksi dengan LPS.
Berdasarkan hasil pengukuran ekspresi gen pada Gambar 4.4 dianalisis
secara statistik dengan menggunakan One way anova, kemudian dilanjutkan
dengan Post Hoc Test berupa uji Tuckey HSD memberikan hasil bahwa terdapat
perbedaan yang signifikan antara kelompok perlakuan dengan kontrol sel sebagai
kontrol normal (kontrol yang tidak diberi perlakuan), lipopolisakarida sebagai
kontrol negatif (dapat menaikkan ekspresi gen), dan deksametason sebagai kontrol
positif (dapat menurunkan ekspresi gen). Pengaruh ekspresi gen TNF-α, IL-6, IL-
1β, COX-2, iNOS yang diberikan perlakuan (VCO, HVCO) berbeda nyata secara
signifikan p<0,05 terlihat pada Tabel 4.2
53
Pemberian VCO dan HVCO dapat menurunkan ekspresi TNF-α, iNOS,
IL-1β, COX-2 dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi Lipopolisakarida
dengan nilai densitas ekspresi TNF-α paling kecil pada HVCO (0,76±0,7633)
yang menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan dengan kontrol positif
p>0,05 dan berbeda secara signifikan dengan kontrol negatif dan kontrol normal
p<0,05 sedangkan nilai densitas ekspresi iNOS paling kecil pada HVCO (0,72 ±
0,010) yang menunjukkan efek berbeda secara signifikan dengan kontrol normal,
kontrol positif dan kontrol negatif p<0,05, selanjutnya nilai densitas ekspresi IL-
1β paling kecil pada HVCO (2,40 ± 0,015) yang menunjukkan efek berbeda
secara signifikan dengan kontrol normal, kontrol positif dan kontrol negatif
p<0,05, kemudian nilai densitas ekspresi IL-6 paling kecil pada HVCO (1,16 ±
0,010) yang menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan dengan kontrol
normal dan negatif p>0,05 serta berbeda secara signifikan dengan kontrol positif
p<0,05, dan nilai densitas ekspresi COX-2 paling kecil pada HVCO (0,98 ±
0,010) yang menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan dengan kontrol
normal dan positif p>0,05 serta berbeda secara signifikan dengan kontrol negatif
p<0,05. Hal ini menunjukkan bahwa VCO dan HVCO memiliki efek
penghambatan ekspresi TNF-α, iNOS, IL-1β, COX-2 dan IL-6 pada sel RAW
264.7 yang diinduksi dengan Lipopolisakarida.
Pada Gambar. 4.5 terlihat grafik yang mengalami penurunan yang
signifikan dibandingkan dengan LPS. Pada gen TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2, dan
iNOS dengan pemberian HVCO mengalami penurunan lebih besar dibandingkan
VCO. TNF-α, IL-6, IL-1β, COX-2 dapat diproduksi dari makrofag sebagai
respons terhadap rangsangan LPS yang berasal dari bakteri, infeksi dan
54
rangsangan inflamasi. Sitokin tersebut juga memainkan peran penting dalam
sistem kekebalan tubuh dengan membantu efek sitotoksik dan sitostatik pada sel
yang terinfeksi atau sel ganas. TNF-α adalah salah satu faktor utama yang
mengaktivasi makrofag sebagai kekebalan tumor (Yanti, et al., 2011).
TNF-α, IL-1β, COX-2 dan IL-6 adalah sitokin aktif pro-inflamasi yang
mampu menyebabkan inisiasi peradangan (Adebayo, et al., 2017). Pada makrofag
yang teraktivasi juga menghasilkan NO yang disintesis dengan bantuan enzim
yaitu iNOS. iNOS yang mengalami peningkatan ekspresi maka akan
menghasilkan NO yang berlebih. Dengan demikian penurunan ekspresi iNOS
berpengaruh pada produksi NO yang juga mampu menyebabkan inisiasi
peradangan (Ryu, et al., 2015; Dewi, et al., 2017). Hasil ini menunjukkan bahwa
VCO dan HVCO dapat menghambat ekspresi gen TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2
dan juga menghambat enzim yang menginduksi peradangan yaitu iNOS. Dengan
penghambatan iNOS maka juga akan menghambat produksi NO. Hal ini
merupakan strategi yang kuat untuk manajemen berbagai penyakit inflamasi serta
gangguan sistem kekebalan tubuh sehingga dapat berfungsi sebagai dasar untuk
pengembangan potensi obat-obat antiinflamasi.
55
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian dapat disimpulkan bahwa:
a. Pemberian VCO dab HVCO tidak bersifat toksik terhadap sel RAW 264.7
dengan nilai persentase sel hidup yang paling aman terlihat pada VCO;
HVCO dengan konsentrasi 31,25 dan 62,5 μg/mL dengan persentase sel
hidup > 90 %.
b. Pemberian VCO dan HVCO sebagai antiinflamasi dapat menurunkan
produksi nitric oxide (NO) yang meningkat (terjadinya inflamasi) pada sel
RAW 264.7 yang diinduksi dengan Lipopolisakarida, dimana pengujian
VCO pada konsentrasi 62,5 μg/mL menurunkan kadar NO paling besar
dibandingkan HVCO pada konsentrasi 31,25 dan 62,5 μg/mL dengan nilai
kadar NO VCO sebesar 5,88 μg/mL yang menunjukkan efek tidak berbeda
secara signifikan terhadap kontrol positif dan kontrol normal p>0,05. Hal
ini menunjukkan bahwa VCO dan HVCO memiliki efek penghambatan
produksi NO pada sel RAW 264.7 yang diinduksi dengan
Lipopolisakarida.
c. Pemberian VCO dan HVCO dapat menurunkan ekspresi TNF-α, iNOS,
IL-1β, COX-2 dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi
Lipopolisakarida dengan nilai densitas ekspresi TNF-α paling kecil pada
HVCO (0,76±0,7633) yang menunjukkan efek tidak berbeda secara
signifikan dengan kontrol positif p>0,05 dan berbeda secara signifikan
56
dengan kontrol negatif dan kontrol normal p<0,05 sedangkan nilai densitas
ekspresi iNOS paling kecil pada HVCO (0,72 ± 0,010) yang menunjukkan
efek berbeda secara signifikan dengan kontrol normal, kontrol positif dan
kontrol negatif p<0,05, selanjutnya nilai densitas ekspresi IL-1β paling
kecil pada HVCO (2,40 ± 0,015) yang menunjukkan efek berbeda secara
signifikan dengan kontrol normal, kontrol positif dan kontrol negatif
p<0,05, kemudian nilai densitas ekspresi IL-6 paling kecil pada HVCO
(1,16 ± 0,010) yang menunjukkan efek tidak berbeda secara signifikan
dengan kontrol normal dan negatif p>0,05 serta berbeda secara signifikan
dengan kontrol positif p<0,05, dan nilai densitas ekspresi COX-2 paling
kecil pada HVCO (0,98 ± 0,010) yang menunjukkan efek tidak berbeda
secara signifikan dengan kontrol normal dan positif p>0,05 serta berbeda
secara signifikan dengan kontrol negatif p<0,05. Hal ini menunjukkan
bahwa VCO dan HVCO memiliki efek penghambatan ekspresi iNOS,
TNF-α, IL-1β, COX-2 dan IL-6 pada sel RAW 264.7 yang diinduksi
dengan Lipopolisakarida.
5.2 Saran
Disarankan kepada peneliti berikutnya untuk melakukan analisis
antiinflamasi pada aktivitas fagositosis dan analisis ekspresi protein COX-2 dan
MMP-9 dengan metode q-PCR.
57
DAFTAR PUSTAKA
Abbas, A.K., Lichtman, A.H and Pillai, S. (2016). Cellular and molecular
immunology. Elsevier. 2015; 8:1-12.
Adebayo, S. A., Steel, H. C., Shai, L. J., and Eloff, J. N. (2017). Investigation of
the Mechanism of Anti-Inflammatory Action and Cytotoxicity of a
Semipurified Fraction and Isolated Compounds From the Leaf of
Peltophorum africanum (Fabaceae). Journal of Evidence-based
Complementary and Alternative Medicine, 22(4): 840-845.
Agita, A. dan Thaha, M. (2017). Inflamation, Immunity and Hypertension. Acta
Med Indonesia. 159-161.
Amanda, U.D. dan Cartealy, I.C. (2015). Isolasi RNA dari mesokarp buah Elaeis
guineenssis Jacq. var. Tenera. Pros Sem Nas Masy Biodiv Indon, 1(2):
171-176.
Assah. F.Y. (2017). Variasi Campuran Lemak Padat Dan Virgin Coconut Oil
Pada Pembuatan Mentega Putih. Jurnal Penelitian Teknologi Industri
Vol. 9 No. 2 : 141-148.
ATCC. (2017). Product Sheet. RAW 264.7 (ATCC® TIB71™). American Type
Culture Collection. Manassas. VA 20108 USA. Halaman 6-7.
Badan Standarisasi Nasional. (2008). Minyak Kelapa Virgin (VCO). Jakarta:

Badan Standardisasi Nasional. Halaman 3-5.
Bawalan, D.D. dan Chapman, K.R. (2006). Virgin Coconut Oil Production
Manual for Micro- and Village-Scale Processing. Bangkok: FAO
Regional Office for Asia and the Pacific. Halaman: 3, 10-12, 15.
Chung, H.Y., Kim, H.J., Kim, K.W., Choi, J.S. and Yu BP (2002). Molecular
inflammation hypothesis of aging based on the anti-aging mechanism of
calorie restriction. Microsc Res Tech 59: 264 272.
Corwin, Elizabeth J. (2008). Handbook of Pathophysiology 3th edition.

Philadelphia: Lippincort Williams & Wilkins. Halaman 138-143.
Cree, I. A. (2011). Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Edisi Kedua.
New York: Springer Humana Press. Halaman 237–244.
Dewi, K., Widyarto, B., Erawijantari, P. P., and Widowati, W. (2017). In vitro
study of Myristica fragrans seed (Nutmeg) ethanolic extract and quercetin
compound as anti-inflammatory agent. International Journal of Research
in Medical Sciences, 3(9), 2303-2310.
58
Dheda, K., Huggett, J. F., Bustin, S. A., Johnson, M. A., Rook, G., and Zumla, A.
(2004). Validation of housekeeping genes for normalizing RNA
expression in real-time PCR. Biotechniques, 37(1): 112-119.
Doyle, A. and Griffith, J.B. (2000). Cell and Tissue Culture for Medical
Research. New York: John Willey and Sons. Ltd. Hal: 49.
Fife, B. (2006). Virgin Coconut Oil: Nature’s Miracle Medicine. USA: Piccadilly
Books, Ltd. Halaman: 11-12.
Freshney, I. A. (2000). Culture Of Animal Cells. A Manual of Basic Technique.

Edisi IV. Toronto: Willey-Liss. Halaman 329–344.
Furst, D.E. dan Munster, T. (2002). Obat-obat Antiinflamasi Nonsteroid, Obat-

obbat antireumatik Pemodifikasi Penyakit, Analgesik Nonopioid dan Obat-
obat untuk Pirai. Dalam: Farmakologi Dasar dan Klinik. Bertram G.
Katzung. Jakarta: Salemba Medika. Hal. 449-501.
Giustarini. D., Milzani. A., Rossi. R. dan Bonele. D.I. (2008). Nitrite and Nitrate
Measurement by Griess Reagent in Human Plasma: Evaluation of
Interferences and Standardization. Methods in Enzymology. Volume 44.
Hal: 362.
Hamzah. N., Najib. A., Thahir. N. dan Miqawati. I. (2015). Studi Farmakoter
Reseptor COX-2 Sebagai Antiinflamasi. JK IFIK UNAM. Vol. 2 No.3.
Hal: 99-100.
Hao, X., Sun, W., Ke, C., Wang, F., Xue, Y., Luo, Z., et al. (2019). Anti-
Inflammatory Activities of Leaf Oil from Cinnamomum subavenium In
Vitro and In Vivo. BioMed Research International Volume 2019. 10
pages.
Hadiarto, T., Listanto, E., Eny, I. and Riyanti. (2015). Identification of RB gene
cDNA in Genetically Modified Potato Katahdin SP951. Jurnal
AgroBiogen 11(2): 59-64.
Harison, M.A. and Freshney, I.A. (2009). General Techniques of Cell Culture.
London: Cambridge. Hal: 196.
Huang, G. J., Huang, S.S., and Deng, S.S. (2012). Anti-Inflammatory Activities of
Inotilone from Phellinus linteus through the Inhibition of MMP-9, NF-
kB, and MAPK Activation In Vitro and In Vivo. 7 : 1-12.
Intahphuak, S., Khonsung, P. and Panthong, A. (2010). Anti-inflammatory,

analgesic, and antipyretic activities of Virgin Coconut Oil. Pharmaceutical
Biology. Vol. 48(2): 151–157.
59
Joo, T., Kandhasamy, S., Sunghyun, H., Jaehak, L., Sun, Y.Park., Songmun, K.,et
al. (2014). Inhibition of nitric oxide production in LPS-stimulated RAW
264.7 cells by stem bark of Ulmus pumila L. Saudi Journal of Biological
Sciences 21: 427-435.
Kaminska, B. (2005). MAPK Signalling Pathways as Molecular Targets for Anti‐

inflammatory Therapy From Molecular Mechanisms to Therapeutic
Benefits. Biochimica et Biophysica Acta, 1754(1–2), 253–262.
Karouw. S., Trivanail., Barlina. R. dan Santoso. (2016). Hidrolisis Enzimatis

Minyak Kelapa dengan Lipase dari Rhyzomucor miehei. Buletin Palma
Volume 17 No. 1 : 35 – 40.
Kim, G.T., Tran, N.K.S., Choi, E.H., Song, Y.J., Song, J.H, Shim, S.M. et al.
(2016). Immunomodulatory Efficacy of Standardized Annona muricata
(Graviola) Leaf Extract via Activation of Mitogen-Activated Protein
Kinase Pathways in RAW 264.7 Macrophages. Evidence-Based
Complementary and Alternative Medicine: 1-10.
Kresno, S.B. (2010). Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:

Badan Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Hal: 78, 85.
Kupcsik, L., and Martin, J.S. (2011). Mammalian Cell Viability: Methods and
Protocols. New York: Humana Press. Hal. 13-18.
Laveti, D., Kumar, M., Hemalatha, R., Sistla, R., Naidu, V. G., Talla, V., et al
(2013). Anti‐inflammatory Treatments For Chronic Diseases: A review.
Inflammation & Allergy Drug Targets, 12(5). 349–361.
Lawrence, T. and Fong, C. (2010). The Resolution of Inflammation: Anti‐

Inflammatory Roles for NF‐kappa B. The International Journal of
Biochem-istry & Cell Biology, 42(4). Hal: 519–523.
Lay, B.W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo

Persada. Hal: 57-58.
Libault, M., Thibivilliers, S., Bilgin, D.D., Radwan, O., Benitez, M., Clough, S.J.
et al. (2008). Identification of four soybean reference genes for gene
expression normalization. The plant Genome, Hal: 44-45.
Mansor, T. S. T., Che Man, Y. B., Shuhaimi ,M., Abdul, A.M.J, and Ku,
N.F.K.M. (2012). Physicochemical properties of virgin coconut oil
extracted from different processing methods. International Food Research
Journal. 19 (3): 837-845.
60
Margata, L., Silalahi, J., Harahap, U., dan Satria, D. (2018). The Effect Of Dietary
Oils and Hydrolyzed Coconut Oil On Minerals Absorption In Rats. Asian
J Pharm Clin Res, Vol 11, Issue 1, 2018, Hal: 185-190.
Marina, A.M., Che Man, Y.B., and Amin, I. (2009). Virgin Coconut Oil:
Emerging Functional Food Oil. Trends in Food Sciences & Technology.
20: 481-487.
Marten, B., Pfeuffer, M. and Schrezenmeir, J. (2006). Medium-Chain

Triglycerides: Review. International Dairy Journal16: 1374-1382.
Mer, F., Sant Anna Jr, G.L. and Nobrega, R. (2000). Enzyme hydrolysis of
babassu oil in a membrane bioreactor. Journal of the American Oil
Chemists’ Society77(10): 1043-1048.
Novycha. A., Rosidah., Yuandani., Suryani. S., and Satria. D. (2019). The
Immunomodulatory Activities of Picria Fel-Terrae Lour Herbs towards
RAW 264.7 Cells. Journal of Medical Science. 7(1): 24-28.
Nugroho, A.E., Hermawan, A., Putri, D.D.P., Novika, A. and Meiyanto, E.,
(2013). Combinational Effects of Hexane Insoluble Fraction of Ficus
septica Burm. F. and Doxorubicin Chemotherapy on T47D Breast Cancer
Cells. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2: 1-6.
Price, L.C., Montani, D., Tcherakian, C., Dorfmüller, P., Souza, R., Gambaryan,
N., et al. (2010). Dexamethasone reverses monocrotaline - induced
pulmonary arterial hypertension in rats. European Respiratory Journal.
37: 813-822.
Rantam, F.A. (2003). Metode imunologi. Cetakan I. Surabaya: Airlangga

University Press. Hal: 167-168.
Rinayanti, A., Ema D. dan Melisha A.H. (2015). Uji Efek Antiinflamsi Fraksi Air
Daun Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa (Shecff.) Boerl.) Terhadap
Tikus Putih (Rattus norvegicus L.). Pharm Sci Res 1(2): 78-85.
Ryu, J. H., Park, H. J., Jeong, Y. Y., Han, S., Shin, J. H., Lee, S. J., et al. (2015).
Aged Red Garlic Extract Suppresses Nitric Oxide Production in
Lipopolysaccharide-Treated RAW 264.7 Macrophages Through Inhibition
of NF-κ B. Journal of medicinal food, 18(4): 439-445..
Setia, A.I.D. dan Tjitaresmi, A. (2014). Aktivitas Antiinflamasi Dari Berbagai

Tanaman : Sebuah Review. Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran.
Farmaka . Volume 14 Nomor 3 : 77-86.
Silalahi, J and Surbakti, C. (2015). Burn Wound Healing Activity of Hydrolyzed

Virgin Coconut Oil. USA. IJPRIF. 8 (1): 67-73.
61
Sudjadi. (2008). Bioteknologi Kesehatan. Kanisius, Yogyakarta, Indonesia.
Halaman: 95-98.
Sumiwi, A.S., Ramadhani, N. (2015). Aktivitas Antiinflamasi Berbagai Tanaman

Diduga Berasal Dari flavonoid. Fakultas Farmasi Universitas Padjajaran.
Farmaka Volume 14 No.2. 112.
Sun, J., Zhang, X., Broderick, M. and Fein, H. (2003). Measurement of Nitric
Oxide Production in Biological Systems. Sensors. 3: 276-284.
Thurnham, D.I. and McCabe, G.P. (2012). Influence of Infection and

Inflammation on Biomarkers Nutritional Status with an Emphasis on
Vitamin A and Iron. In: World Health Organization Report: Priorities in
the assessment of vitamin A and iron status in populations. Panama City
15-17 September 2010. Halaman: 110-113
Tjay, T. H., dan Raharja. (2002) Obat Obat Penting. Khasiat, Penggunaan dan
Efek-Efek Samping Edisi V. Jakarta: Penerbit PT. Elex Media
Komputindo Kelompok Gramedia. Halaman: 85-90.
Varma, S.R., Sivaraksam, T.O., Arumugam, I., Dilip, N., Raghuraman., M.,
Pavan, K.B., Rafik, M., and paramesh, R.(2019). In vitro Antiinflamatory
and Skin Protective Properties of Virgin Cocunat Oil. Journal of
Tradisional and Complementary Medicine 9 (2019) : 5-14.
Wilmana, P.F. dan Gan, S.G., (2007). Analgesik-Antipiretik Analgesik Anti-

Inflamasi Nonsteroid dan Obat Gangguan Sendi Lainnya. Dalam: Gan,
S.G., Editor. Farmakologi dan Terapi. Edisi 5. Jakarta: Gaya Baru, Hal:
230-240.
Yanti., Pramudito., E.T., Nuriasari. N. and Juliana. K. (2011). Lemon Pepper

Fruit Extract (Zanthoxylum acanthopodium DC.) Suppresses the
Expression of Inflammatory Mediators in Lipopolysaccharide-Induced
Macrophages In Vitro. American Journal of Biochemistry and
Biotechnology 7 (4): 190-195.
Yoon. J., Park J.M., Jung .S.K., Kim. K.Y., Kim. Y.H. and Min. J. (2009)
Characterization of antimicrobial activity of the lysosomes isolated from
Saccharomyces cerevisiae. Curr Microbiol 59(1): 48-52.
Yu, G. J., Choi, I. W., Kim, G. Y., Kim, B. W., Park, C., Hong, S. H., et al.
(2015). Anti-inflammatory potential of saponins derived from cultured
wild ginseng roots in lipopolysaccharide-stimulated RAW 264.7
macrophages. International journal of molecular medicine, 35(6): 1690-
1698.
62
Yuan, G., Wahlaqvist, M.L., He, G., Yang, M., and Li, D.(2006). Natural
products and anti-inflammatory activity. Asia Pac J Clin Nutr. 15 (2):
143-152.
Yuandani., Jantan, I., Ilangkovan, M., Husain, K., and Chan, K.M. Inhibitory
effects of compounds from Phyllanthus amarus on nitric oxide production,
lymphocyte proliferation, and cytokine release from phagocytes. (2016).
Drug design, development and therapy. 10:1935-1945.
Yuandani., Jantan I. and Husain K. (2017). 4,5,4′-rihydroxychalcone, 8,8′-(ethene-

1,2- diyl)-dinaphtalene-1,4,5-triol and rutin from Gynura segetum inhibit
phagocytosis, lymphocyte proliferation, cytokine release and nitric oxide
production from phagocytic cells. BMC Complementary and Alternative
Medicine. 17: 211.
Yuwono, T. (2006). Teori dan aplikasi Polymerase Chain Reaction. Edisi I.

Yogyakarta: ANDI. Hal: 1, 11.
Zheng, L., Wang, M., Peng, Y. and Li, X. (2017). Physicochemical Characte-
rization of Polysaccharides with Macrophage Immunomodulatory
Activities Isolated from Red Ginseng (Panax ginseng C. A. Meyer).
Journal of Chemistry. 3276430. Hal. 10-14.
63
LAMPIRAN
Lampiran 1. Gambar Sampel VCO dan HVCO
VCO dan HVCO
64
Lampiran 2. Bagan Alir Hidrolisis VCO
30 gr VCO
Ditambahkan 30 ml akuades, 12,5 ml

CaCl2 0,063 M, 25 ml larutan buffer Tris-
HCL 1 M pH 8, dan 10% enzim lipase
Diaduk dengan kecepatan 200 rpm selama
10 menit setiap 1 jam
Diinkubasi pada suhu 50ºC
Dipindahkan ke corong pisah setelah waktu
hidrolisis tercapai
Ditambahkan 50 ml n-heksan
Diekstraksi dan didiamkan beberapa saat
hingga terbentuk dua lapisan
Dipisahkan
Filtrat Ia Filtrat IIa

(lapisan atas) (lapisan bawah)
Ditambahkan 50 ml n-heksan
Dikocok, didiamkan beberapa saat hingga terlihat
dua lapisan
Dipisahkan
Filtrat Ib Filtrat IIb

(lapisan atas) (lapisan bawah)
Digabung dengan filtrat Ia
Ditambahkan 250 mg Na2SO4anhidrat
Dibiarkan 15 menit
Disaring
Filtrat Residu
Diuapkan diatas penangas air untuk
Menghilangkan n-heksan
Hasil Hidrolisis VCO
65
Lampiran 3. Bagan pembuatan media DMEM
DMEM Sachet 2 g Hepes 2 g NaHCO3
Dimasukkan ke dalam erlenmeyer

Ditambahkan 800 mL aquabidest steril
Dihomogenkan menggunakan stirer magnet
Diatur pH 7,2-7,4 (HCL 1 N atau NaOH 1 N)

Ditambahkan aquabidest steril sampai 1 liter
Larutan Media
Dilakukan sterilisasi dengan penyaringan
Ditampung dalam botol steril
Diberi identitas pada botol media
Disimpan pada suhu 2-80C
Media DMEM
66
Lampiran 4. Bagan pembuatan media komplit (MK) DMEM
Fecal Bovine Penisilin- Fungizone DMEM AD

Serum (FBS) Streptomisin (amphotericin B 100 %
(10 %) (2 %) 0,5 %)
Dicampur
Diberi identitas pada botol MK
Disimpan pada suhu 2-80C
Media Komplit (MK)

DMEM
67
Lampiran 5. Bagan penumbuhan sel
Sel RAW 264.7
Diambil dari Freezer

Diambil beberapa tetes
Konikel
Dimasukkan ke dalam konikel yang berisi DMEM
Disentrifuge 6000 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatant
Ditambahkan 4 mL MK DMEM
Diresuspensi hingga homogen
Flask
Dimasukkan ke dalam flask
Ditambahkan 5 mL MK kedalam setiap flask
Dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan mikroskop inverted
Diberi identitas pada flask
Disimpan dalam inkubator CO2
Sel RAW 264.7
68
Lampiran 6. Bagan panen sel
Sel RAW 264.7
Dipersiapkan dan dikondisikan
Diamati apakah sel telah konfluen 80%
Dibuang MK dari flask dengan mikropipet
Sel yang melekat
Dicuci sel 2 x dengan PBS
Ditambahkan 400 µL trypsine-EDTA 0,25%
Diinkubasi dalam incubator CO2 selama 5 menit
Ditambahkan 4 mL MK
Diresuspensi dengan mikropipet
Diamati sel dibawah mikroskop inverted
Diresuspensi kembali jika masih ada sel yang menggerombol
Ditransfer sel ke dalam tabung konikel
Panen Sel RAW 264.7
69
Lampiran 7. Bagan perhitungan sel
Kultur Sel RAW 264.7
Diambil 10 µL panenan sel
Dipipetkan ke dalam hemositometer
Dihitung jumlah sel dibawah mikroskop
Jumlah Sel RAW 264.7
70
Lampiran 8. Bagan pembuatan larutan uji
VCO dan HVCO
Ditimbang sebanyak 5 mg
Dimasukkan ke dalam Polytube
Dilarutkan dalam 100 mL DMSO
Divortex
Dibuat pengenceran sampai diperoleh

konsentrasi 500; 250; 125; 62,5; 31,25
µg/mL
Larutan Uji
71
Lampiran 9. Bagan pengujian viabilitas sel
Sel RAW 264.7
Ditanam dengan Microplate 96-sumuran dengan

kepadatan 3x103 sel/well
Diinkubasi selama 24 jam
Dibuang medium
Ditambahkan medium baru

Ditambahkan larutan uji
Dibuang media dan larutan uji setelah 24 jam
Dicuci dengan PBS
Ditambahkan 100 µL dan 10 µL MTT (0,5 mg/mL)
Diinkubasi selama 4-6 jam
Ditambahkan reagen stoper
Dibungkus dengan aluminium foil
Dibiarkan selama 1 malam
Dibaca serapan dengan Microplate Reader (λ=595 nm)
Absorban
Dihitung % sel hidup
% Sel Hidup
72
Lampiran 10. Bagan pengujian produksi NO
Sel RAW 264.7

Dibuang medium
Ditambahkan medium baru

Ditambahkan LPS 1 µg/µL
Dipindahkan cairan kedalam plate baru
Ditambahkan Pereaksi Griess
Diinkubasi selama ±10 menit pada suhu kamar
Dibaca serapan dengan Microplate Reader (λ =595 nm)
Absorban
Dihitung kadar NO
Kadar NO
73
Lampiran 11. Bagan ekstraksi RNA
Sel RAW 264.7

Dibuang medium dan ditambahkan medium baru

Ditambahkan LPS 1 µg/µL, diinkubasi selama 6 jam

Dipindahkan kedalam tabung konikel
Ditambahkan 2 mL PBS
Dimasukkan kembali kedalam tabung konikel
Ditambahkan Tripsin 200 µL dalam plate tersebut

Diinkubasi selama 3 menit, diamati sel
apakah sudah terlepas semua
Cairan dalam konikel dimasukkan kembali kedalam plate,
diresuspensi dan pindahkan kembali ke tabung konikel
Ditambahkan 2 mL PBS, pindahkan dalam tabung konikel
Disentrifuge selama 5 menit 2500 rpm
Supernatan dibuang, endapan ditambahkan 1 mL PBS
Dipindahkan dalam mikrotube
RNA Sel RAW

264.7
74
Lanjutan Bagan uji ekstraksi RNA
RNA Sel RAW 264.7
Ditambahkan 400 µL RB buffer

Ditambahkan 4 µL β-mercaptoetanol,
campuran dihomogenkan
Diinkubasi 5 menit pada suhu kamar
Ditambahkan 400 µL etanol 70% dalam ddH2O, kocok
kuat sampai endapan larut
Disiapkan kolom RB, di (+) 500 µL RB
Dipindahkan cairan dalam mikrotube tadi

Disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selama 1
menit, filtrate dibuang
Dipindahkan cairan yang tersisa dan disentrifuge
12.000 rpm selama 1 menit, filtrate dibuang
Ditempatkan kolom RB pada mikrotube baru
Ditambahkan 400 µL WI buffer kedalam kolom rb, sentrifuge
12.000 rpm selama 30 detik, filtrate dibuang
Ditambahkan 600 µLWash buffer, disentrifuge 12.000 rpm
selama 30 detik, filtrate dibuang
Ditempatkan kembali kolom RB pada mikrotube, disentrifuge
12.000 rpm selama 3 menit untuk mengeringkan matriks kolom
Ditempat kolom RB pada mikrotube 1,5 mL baru
Ditambahkan 50 µL RNAse free water,
diinkubasi selama 1 menit pada suhu kamar
Disentrifuge 12.000 rpm selama 1 menit
Dihitung konsentrasi RNA yang dihasilkan
Hasil isolasi RNA

Sel RAW 264.7
75
Lampiran 12. Bagan pembuatan cDNA
Hasil isolasi
RNA
Sel RAW 264.7
Ditambahkan DNAse/RNAse free water hingga vol.total 12 µL
Ditambahkan 8 µL Larutan campuran:

- 5x RT buffer 4 µL
- Random primer 1 µL
- dNTP 2 µL
- Rever Tra-Ace 1 µL
Diresuspensikan campuran tersebut
Dimasukkan dalam alat PCR
Diatur kondisinya:
- 30 0C selama 10 menit
cDNA
76
Lampiran 13. Bagan analisis ekspresi gen
cDNA
Ditambahkan PCR master mix dengan total 25 µL :

- GoTaq Green 12,5 µL
- Primer Forward 1 µL
- Primer Reverse 1 µL
- DNAse RNAse free water 9,5 µL
Divortex agar campurannya homogen
Dimasukkan dalam alat PCR
Diatur suhu sesuai kondisi gen (TNFα-, IL-6, β-actin, IL-1β, iNOS):
TNF-α, IL-6, β-actin IL-1β, COX-2 iNOS
D: 95 0C selama 2 menit 95 0C selama 2 menit 95 0C selama 2 menit
95 0C selama 30 detik 95 0C selama 45 detik 95 0C selama 30 detik
A: 55 0C selama 60 detik 62,50C selama 60dtik 60 0C selama 60 detik
0
E: 72 C selama 60 detik 72 0C selama 60 detik 72 0C selama 60 detik
72 0C selama 5 menit 72 0C selama 5 menit 72 0C selama 5 menit
Produk PCR
(TNFα-,IL-6, β-actin,
IL-1β, COX-2
iNOS).
Keterangan : PCR : Polymerse Chain Reaction

D : Denaturasi
A : Annealing
E : Elongasi
77
Lampiran 14. Bagan pengujian elektroforesis
Produk PCR
(TNFα-, IL-6, β-actin,
IL-1β,COX-2 iNOS)
Dimasukkan dalam sumuran gel agarosa 2% yang

telah dicetak pada piringan gel dengan formula :
- 2 gram serbuk agarosa + 100 mL TBE
- Dipanaskan dalam microwave selama 3-4
menit
- Ditambahkan flouroVue 4 µL.
Dimasukkan DNA ladder 100 Bp sebanyak 5 µL
Dilakukan elektroforesis 30-45 menit

dengan kecepatan 70 volt
Diambil foto gel hasil elektroforesis dengan

software gel doc
Gambaran pita
ekspresi gen
Dihitung berapa nilai densitas

gambaran pita ekspresi gen
Nilai densitas
ekspresi gen
Keterangan : PCR : Polymerse Chain Reaction

Bp : Base Pair
78
Lampiran 15. Sel RAW 264.7 dibawah mikroskop
b c
Keterangan : a. Sel RAW 264.7 dalam Hemositometer

b. Sel RAW 264.7 sebelum diberi larutan uji (perbesaran 10x40)
c. Sel RAW 264.7 setelah diberi larutan uji (perbesaran 10x40)
79
Lampiran 16. Microplate-96 sumuran pengujian viabilitas sel

a aa
b bb
c cc
d dd
ee
e
f
h
hh
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji serta
deksametason
a. 500 μg/mL
b. 250 μg/mL
c. 125 μg/mL
d. 62,5 μg/mL
e. 31,25 μg/mL
h. Kontrol sel
aa. 20 μg/mL
bb. 10 μg/mL
cc. 5 μg/mL
dd. 2,5 μg/mL
ee. 1,25 μg/mL
hh. Kontrol media
80
Lampiran 17. Microplate-96 sumuran pada uji produksi NO
(a)
(b)
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

a. Uji produksi kadar NO sampel
b. Uji produksi kadar NO larutan standar nitrit
80
Lampiran 18. Microplate-6 sumuran pada uji ekspresi gen
a b c
d e
Keterangan: microplate-96 sumuran yang berisi sel dan larutan uji

a. Kontrol sel
b. LPS
c. VCO
d. HVCO
e. Deksametason
81
Lampiran 19. Perhitungan pembuatan larutan uji
Perhitungan pembuatan larutan VCO dan HVCO :

 Sampel : VCO, HVCO.
 Konsentrasi : 31,25 ; 62,5; 125; 250; 500 µg/µL
 Sampel 5 mg dilarutkan dengan 100 µL DMSO
V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
C1 : Konsentrasi awal
V2 : Volume yang akan dibuat untuk pengenceran
C2 : Konsentrasi yang akan dibuat untuk pengenceran
 Cara pembuatan pengenceran larutan uji:

Dipipet 10 µl larutan induk (50.000 µg/µL) kemudian diadkan sampai 1000
µl dengan MK DMEM. Selanjutnya dipipet kembali 500 µl (250 µg/µL) lalu
ditambahkan 500 µl MK DMEM dan seterusnya.
82
Perhitungan pembuatan larutan Deksametason :
 Berat bahan aktif deksametason : 0,5 mg

 0,5 mg deksametason dilarutkan dengan 100 µL DMSO
 Cara pembuatan larutan deksametason:

Serbuk tablet deksametason (0,5 mg deksametason) yang telah dihaluskan
lalu dimasukkan kedalam mikrotube dan dilarutkan dengan 100 µL DMSO.
Dihomogenkan dan dilakukan pengenceran sesuai dengan konsentrasi yang
digunakan.
V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
 Konsentrasi : 1,25 ; 2,5; 5; 10; 20 µg/µL
 Cara pembuatan pengenceran larutan deksametason:

Dipipet 4 µL larutan induk deksametason (5000 µg/µL) kemudian diadkan
sampai 1000 µL MK DMEM. Selanjutnya dipipet kembali 500 µL (20
µg/µL) deksametason lalu ditambahkan 500 µL MK DMEM dan seterusnya.
83
Perhitungan pembuatan larutan Lipopolisakarida :
 Konsentrasi Lipopolisakarida : 1 mg
LPS 1 mg dilarutkan dalam 1 ml aquadest
Buat stok, yang dibutuhkan : 0,1 µg/µL

Diambil 1 µL dari stok 1 µg/µL + aquadest 9 µL = 10 µL,
sehingga konsentrasi : 1 µg / 10 µL = 0,1 µg/µL
Jika yang diberikan 10 µl pada masing-masing well (96-well) maka pengenceran

1 µl (1 µg/µL) ad volume 100 µL
= 1 µg/100µL x 10 µL
= 0,1 µg
Dipipet 10 µL LPS dari konsentrasi (1 µg/µL)

+ 990 µL MK DMEM=total volume 1000 µL (10 µg/1000µL = 0,01 µg/µL)
Cara kerja :
Dipipet 10 µL LPS ad 1000 µL MK DMEM lalu dimasukkan kedalam masing-
masing sumuran (96-well) inkubasi 24 jam
 Konsentrasi Lipopolisakarida : 1 mg
LPS 1 mg dilarutkan dalam 1 ml aquadest
Untuk 6-wellplate :
20 µL konsentrasi (1 µg/µL) + 1980 µl MK DMEM = 2000 µL =2 mL
Konsentrasi : 0,01 µg/µL x 200 µL = 2 µg/µL
Cara kerja :
Dipipet 20 µL LPS ad 2000 µL MK DMEM lalu dimasukkan 1 ml kedalam
masing-masing sumuran (6-well) inkubasi 24 jam
84
Lampiran 20. Perhitungan penanaman sel :
Sel dihitung terlebih dahulu dengan menggunakan hemositometer.
Keterangan:
A : Jumlah sel pada bagian A
B : Jumlah sel pada bagian B
C : Jumlah sel pada bagian C
D : Jumlah sel pada bagian D
 Perhitungan sel untuk uji viabilitas sel
lalu dihitung jumlah sel yang akan ditanam pada well yang digunakan (96 well
plate) :
Jumlah well yang digunakan : 96 well 100

Jumlah sel yang akan ditanam : 3000 sel/well
Jumlah sel / mL : 2625000 /mL
Cara kerja :
Dipipet 115 µL sel di ad kan sampai 10 mL dengan MK DMEM lalu dimasukkan
100 µL kedalam masing-masing sumuran (96-well) inkubasi 24 jam.
 Perhitungan sel untuk uji produksi NO
plate) :
Jumlah well yang digunakan : 96 well 100

Jumlah sel yang akan ditanam : 3000 sel/well
Cara kerja :
Dipipet 250 µL sel di ad kan sampai 10 mL dengan MK DMEM lalu dimasukkan
100 µL kedalam masing-masing sumuran (96-well) inkubasi 24 jam.
85
 Perhitungan sel untuk uji ekspresi gen
plate) :
Jumlah well yang digunakan : 6 well

Jumlah sel yang akan ditanam : 500.000 sel/well
Cara kerja :
Dipipet 2,82 mL sel di ad kan sampai 12 mL dengan MK DMEM lalu
dimasukkan 2 ml kedalam masing-masing sumuran (6-well) inkubasi 24 jam
86
Lampiran 21. Perhitungan Viabilitas sel
Rumus perhitungan viabilitas sel :
Sampel VCO
Absorbansi Rata-rata
1 2 3 Absorbansi
Kontrol Sel 1,295 1,282 1,290 1,289
Kontrol Media 0,131 0,142 0,132 0,135
Konsentrasi Absorbansi % Sel Hidup % Sel Hidup

(µg/µL) 1 2 3 1 2 3 Rata-rata
500 1,113 1,121 1,120 84,75 85,44 85,35 85,18
250 1,266 1,260 1,262 98,00 97,48 97,66 97,71
125 1,273 1,270 1,296 98,61 98,35 98,26 98,41
62,5 1,300 1,310 1,315 100,95 101,81 102,25 101,67
31,25 1,289 1,280 1,284 100 99,22 99,56 99,59
Sampel HVCO
500 0,207 0,209 0,210 7,77 7,95 8,04 7,92
250 0,206 0,193 0,192 7,68 6,23 6,41 6,77
125 1,182 1,214 1,093 95,87 98,76 93,61 96,08
62,5 1,305 1,306 1,259 106,98 107,07 102,83 105,63
31,25 1,406 1,361 1,374 116,11 112,02 113,22 113,79
Deksametason
Absorbansi Rata-rata
1 2 3 Absorbansi
Kontrol Sel 1,232 1,217 1,234 1,228
Kontrol Media 0,204 0,215 0,244 0,221

20 1,068 1,113 1,083 84,13 88,60 85,62 88,12
10 1,164 1,165 1,114 93,67 93,77 88,70 92,05
5 1,172 1,142 1,141 94,47 91,49 91,39 92,45
2,5 1,157 1,143 1,223 92,98 91,58 99,53 94,70
1,25 1,196 1,248 1,259 96,85 102,01 103,11 100,66
87
Lampiran 22. Perhitungan Viabilitas sel dengan SPSS
Descriptives
95% Confidence
Std. Interval for Mean Mini
N Mean Std. Error Maximum
Deviation Lower Upper mum
Bound Bound
VCO 31.25 3 199.5956 .39075 .22560 98.6249 100.5663 99.22 100.00
62.50 3 101.3420 .79176 .45712 99.3752 103.3088 100.82 102.25
125.00 3 98.4113 .18039 .10415 97.9632 98.8594 98.27 98.61
250.00 3 97.8683 .33434 .19303 97.0378 98.6989 97.49 98.11
500.00 3 85.1820 .37772 .21808 84.2437 86.1203 84.75 85.44
Total 15 96.4799 5.98856 1.54624 93.1635 99.7962 84.75 102.25
HVCO 31.25 3 113.7952 .2.09269 1.20821 108.5967 93.4600 112.05 116.11
62.50 3 105.6325 2.42636 1.40086 99.6051 91.4846 102.83 107.08
125.00 3 96.0843 2.58177 1.49058 89.6709 86.9210 93.61 98.77
250.00 3 6.7785 .78630 .45397 4.8252 84.2992 6.24 7.68
500.00 3 7.9217 .13803 .07969 7.5788 68.5062 7.77 8.04
Total 15 66.0425 49.96891 12.90192 38.3706 88.9622 6.24 116.11
Deksametason
95% Confidence
Std. Interval for Mean
N Mean Std. Error Minimum Maximum
Deviation Lower Upper
Bound Bound
1.25 3 100.6623 3.34275 1.92994 92.3584 108.9661 96.85 103.11
2.50 3 94.7020 4.24410 2.45033 84.1591 105.2449 91.59 99.54
5.00 3 92.4503 1.74996 1.01034 88.1032 96.7975 91.39 94.47
10.00 3 92.0530 2.89674 1.67243 84.8571 99.2489 88.71 93.77
20.00 3 86.1258 2.27611 1.31412 80.4716 91.7800 84.14 88.61
Total 15 93.1987 5.48524 1.41628 90.1611 96.2363 84.14 103.11
88
Lampiran 23. Perhitungan pengujian produksi NO
Perhitungan pembuatan larutan standar nitrit :

 Konsentrasi lar. Standar nitrit : 1000 µM
 Konsentrasi pengenceran : 0,78125; 1,5625; 3,125; 6,25; 12,5 ; 25; 50; 100 µM
Rumus pengenceran : V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
 Cara pembuatan pengenceran larutan uji:

Dipipet 25 µl larutan induk (1.000 µM) kemudian diadkan sampai 250 µl
dengan Aquabidest steril. Selanjutnya dipipet kembali 125 µl (100 µM) lalu
ditambahkan 125 µl Aquabidest steril dan seterusnya.
89
Hasil nilai absorbansi Larutan standar nitrit :
Konsentrasi (µM) Absorbansi

100 0,118
50 0,077
25 0,056
12.5 0,045
6.25 0,040
3.125 0,036
1.5625 0,033
0.78125 0,029
0.14
0.12
y = 0.0009x + 0.0327
0.1 R² = 0.995
Absorbansi
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 20 40 60 80 100 120
Konsenterasi
Hasil persamaan regresi yang diperoleh : Y= 0,0009 x + 0,0327
Rumus perhitungan kadar NO:
Keterangan : a = Nilai (a) dari persamaan regresi (Y= a x + b)

b = Nilai (b) dari persamaan regresi (Y= a x + b)
Konsentrasi Absorbansi Kadar NO

Sampel
(µg/µL) 1 2 3 1 2 3 Rata2
VCO 62,5 0,037 0,039 0,038 4,77 7,00 5,88 5,88
31,25 0,039 0,040 0,039 7,00 8,11 7,00 7,37
HVCO 62,5 0,040 0,041 0,039 8,11 9,22 7,00 8,11
31,25 0,042 0,043 0,042 10,33 11,44 10,33 10,70
Deksametason 2,5 0,036 0,035 0,035 3,66 2,55 2,55 2,92
1,25 0,038 0,037 0,037 5,88 4,77 4,77 5,14
Kontrol Sel 0,078 0,081 0,080 50,33 53,66 52,55 52,18
LPS 0,125 0,119 0,121 102,55 95,88 98,11 198,88
90
Lampiran 24. Perhitungan pengujian produksi NO dengan SPSS
Descriptives
Kadar NO
95% Confidence
Std. Std. Interval for Mean
N Mean Minimum Maximum
Deviation Error Lower Upper
Bound Bound
VCO 62.5 3 20.7036 2.79628 1.61443 13.7573 27.6499 18.11 23.67
VCO 31.25 3 23.6667 2.93975 1.69727 16.3639 30.9694 20.33 25.89
HVCO 62.5 3 38.8518 .64149 .37037 37.2583 40.4454 38.11 39.22
HVCO 31.25 3 28.8518 .64144 .37033 27.2584 30.4452 28.11 29.22
Deksametason
3 15.5185 .64149 .37037 13.9250 17.1121 14.78 15.89
2.5
Deksametason
3 19.2222 1.92448 1.11110 14.4415 24.0029 18.11 21.44
1.25
LPS 3 98.8520 3.39474 1.95995 90.4190 107.2850 95.89 102.56
KS 3 44.0371 2.56598 1.48147 37.6628 50.4113 42.56 47.00
Total 24 36.2130 26.01150 5.30957 25.2293 47.1967 14.78 102.56
Homogeneous Subsets
Kadar NO
a
Tukey HSD
Subset for alpha = 0.05
Perlakuan N 1 2 3 4 5
Deksametason 2,5 3 15.5185
Deksametason 1.25 3 19.2222 19.2222
VCO 62.5 3 20.7036 20.7036
VCO 31.5 3 23.6667 23.6667
HVCO 31.25 3 28.8518
HVCO 62.5 3 38.8518
KS 3 44.0371
LPS 3 98.8520
Sig. .148 .283 .148 .148 1.000
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
91
Lampiran 25. Perhitungan pengujian ekspresi gen
Konsentrasi RNA yang diperoleh dari hasil ekstrasksi RNA :

KS : 312,8 ng/µL
LPS : 259,6 ng/µL
VCO : 452,8 ng/µL
HVCO : 406,4 ng/µL
Dexa : 359,2 ng/µL
Perhitungan RNA yang digunakan :
Rumus :
Total RNA yang dipakai 2000 ng.
 Cara pembuatan larutan cDNA :

Dipipet masing-masing RNA (hasil ekstraksi RNA) dari KS (6,40 µL), LPS
(7,70 µL), VCO (4,42 µL), HVCO (4,92 µL), Dexa (5,57 µL) dan
dimasukkan dalam mikrotube kemudian diadkan sampai 12 µL dengan
ddH2O. Selanjutnya ditambahkan larutan campuran 8 µL (5x RT buffer 4
µL, random primer 1 µL, dNTP 2 µL, Rever Tra-Ace 1 µL) diresuspensi
dan dimasukkan dalam alat PCR serta diatur kondisi PCRnya.
Konsentrasi cDNA yang diperoleh hasil pembuatan cDNA :

KS : 744 ng/µL
LPS : 880 ng/µL
VCO : 820 ng/µL
HVCO : 991,5 ng/µL
Dexa : 1048 ng/µL
Kemudian cDNA diencerkan untuk mendapatkan konsentrasi 100 ng/µL
Rumus : V1 x C1 =V2 x C2
Keterangan:
V1 : Volume awal
92
 Cara pembuatan pengenceran cDNA :

Dipipet masing-masing cDNA dari KS (6,72 µL), LPS (5,68 µL), VCO (6,10
µL), HVCO (5,04 µL), Dexa (4,78 µL) dan dimasukkan dalam mikrotube
kemudian diadkan sampai 50 µL dengan ddH2O.
Konsentrasi cDNA yang diperoleh :

KS : 100 ng/µL
LPS : 101 ng/µL
VCO : 109 ng/µL
HVCO : 98 ng/µL
Dexa : 99 ng/µL
Keterangan : “ Syarat kadar cDNA : 100 ng/µL ± 10 % ”
Kemudian dilakukan pengujian ekspresi gen dengan campuran sebagai berikut :
GoTaq Green 12,5 µL
Primer Forward 1 µL
Primer Reverse 1 µL
cDNA 1 µL
Nuklease free water 9,5 µL
Jumlah 25 µL
Dipipet GoTaqGreen 12,5 µL lalu dimasukkan dalam mikrotube dan
ditambahkan primer forward (1 µL) dan primer reverse (1 µL) sesuai pengujian
lalu ditambahkan masing-masing cDNA 1 µL dan diadkan sampai 25 µL dengan
Nuklease free water. Total campuran disentrifuge dan dimasukkan dalam alat
PCR dan diatur kondisinya sesuai pengujian ekspresi gen yang dilakukan.
93
Hasil nilai densitas ekspresi gen
Ekspresi Nilai densitas

No Sampel Rata-rata
gen 1 2 3
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,18 1,19 1,17 1,18
1 TNF α VCO 0,91 0,90 0,92 0,91
HVCO 0,76 0,78 0,75 0,76
Dexa 0,70 0,69 0,71 0,70
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,49 1,48 1,51 1,49
2 IL-6 VCO 1,23 1,22 1,25 1,27
HVCO 1,15 1,17 1,16 1,16
Dexa 0,87 0,89 0,86 0,87
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 3,39 3,37 3,38 3,38
3 IL-1β VCO 2,47 2,48 2,46 2,47
HVCO 2,40 2,42 2,39 2,40
Dexa 1,70 1,69 1,71 1,70
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,49 1,51 1,48 1,49
4 NOS VCO 0,90 0,89 0,92 0,90
HVCO 0,73 0,72 0,71 0,72
Dexa 0,48 0,46 0,49 0,47
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,22 1,21 1,24 1,22
5 COX-2 VCO 1,02 1,03 1,01 1,02
HVCO 0,96 0,98 1,00 0,98
Dexa 0,77 0,78 0,76 0,77
KS 1,00 1,00 1,00 1,00
LPS 1,01 1,04 1,02 1,02
β-
6 VCO 1,01 0,99 1,02 1,00
AKTIN
HVCO 1,03 1,02 1,01 1,02
Dexa 0,97 0,95 0,98 0,96
94
Lampiran 26. Perhitungan analisis ekspresi gen dengan SPSS
Descriptives
95%
Confidence
Std. Std. Interval for
N Mean Mean Minimum Maximum
Deviation Error
Lower Upper
Bound Bound
Beta-Actin KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.0233 .01528 .00882 .9854 1.0613 1.01 1.04
VCO 3 1.0067 .01528 .00882 .9687 1.0446 .99 1.02
HVCO 3 1.0200 .01000 .00577 .9952 1.0448 1.01 1.03
Dexa 3 .9667 .01528 .00882 .9287 1.0046 .95 .98
Total 15 1.0033 .02350 .00607 .9903 1.0163 .95 1.04
TNF-Alpha KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.1800 .01000 .00577 1.1552 1.2048 1.17 1.19
VCO 3 .9100 .01000 .00577 .8852 .9348 .90 .92
HVCO 3 .7633 .01528 .00882 .7254 .8013 .75 .78
Dexa 3 .7000 .01000 .00577 .6752 .7248 .69 .71
Total 15 .9107 .17746 .04582 .8124 1.0089 .69 1.19
IL-6 KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.4933 .01528 .00882 1.4554 1.5313 1.48 1.51
VCO 3 1.2333 .01528 .00882 1.1954 1.2713 1.22 1.25
HVCO 3 1.1600 .01000 .00577 1.1352 1.1848 1.215 1.17
Dexa 3 .8733 .01528 .00882 .8354 .9113 .86 .89
Total 15 1.1520 .21932 .05663 1.0305 1.2735 .86 1.51
COX-2 KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.2233 .01528 .00882 1.1854 1.2613 1.21 1.24
VCO 3 1.0200 .01000 .00577 .9952 1.0448 1.01 1.03
HVCO 3 .9800 .02000 .01155 .9303 1.0297 .96 1.00
Dexa 3 .7700 .01000 .00577 .7452 .7948 .76 .78
Total 15 .9987 .14937 .03857 .9159 1.0814 .76 1.24
iNOS KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
LPS 3 1.4933 .01528 .00882 1.4554 1.5313 1.48 1.51
VCO 3 .9033 .01528 .00882 .8654 .9413 .89 .92
HVCO 3 .7200 .01000 .00577 .6952 .7448 .71 .73
Dexa 3 .4767 .01528 .00882 .4387 .5146 .46 .49
Total 15 .9187 .35024 .09043 .7247 1.1126 .46 1.51
IL-1 KS 3 1.0000 .00000 .00000 1.0000 1.0000 1.00 1.00
Beta LPS 3 3.3800 .01000 .00577 3.3552 3.4048 3.37 3.39
VCO 3 2.4700 .01000 .00577 2.4452 2.4948 2.46 2.48
HVCO 3 2.4033 .01528 .00882 2.3654 2.4413 2.39 2.42
Dexa 3 1.7000 .01000 .00577 1.6752 1.7248 1.69 1.71
Total 15 2.1907 .82763 .21369 1.7323 2.6490 1.00 3.39
Homogeneous Subsets
95
TNF-Alpha
Sampel N
1 2 3 4 5
Tukey HSDa Dexa 3 .7000
HVCO 3 .7633
VCO 3 .9100
KS 3 1.0000
LPS 3 1.1800
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
IL-6
Sampel N
1 2 3 4 5
HVCO 3 1.0000
VCO 3 2.4033
KS 3 2.4700
LPS 3 3.3800
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
IL-1Beta
Sampel N 1 2 3 4 5
a
Tukey HSD KS 3 1.0000
Dexa 3 1.7000
HVCO 3 1.8000
VCO 3 2.3333
LPS 3
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000
COX-2
Sampel N
1 2 3 4
HVCO 3 .9800
VCO 3 1.0000 1.0000
KS 3 1.0200 1.2333
LPS 3
Sig. 1.000 .377 .377 1.000
96
iNOS
Sampel N
1 2 3 4 5
a
Tukey HSD Dexa 3 .4767
HVCO 3 .7200
VCO 3 .9033
KS 3 1.0000
LPS 3 1.4933
Sig. 1.000 1.000 1.000 1.000 1.0000
97
Lampiran 27. Gambar alat
b c
d
Keterangan: a. Laminar Air Flow
b. Inkubator CO2
c. Microscope inverted
d. Microplate reader
98
Lanjutan lampriran Gambar alat
a b
Keterangan: a. Nano drop c. Elektroforesis

b. PCR multibox d. Gel Doc
99

Cocos 2

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Cocos 2

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

TESIS

AKTIVITAS ANTIINFLAMASI MINYAK KELAPA MURNI

PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI

Universitas Sumatera Utara

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister

PROGRAM MAGISTER ILMU FARMASI

Universitas Sumatera Utara

Nama Mahasiswa : Muhammad Amin Nasution

Nomor Induk Mahasiswa : 177014040

Program Studi : Magister Ilmu Farmasi

Judul Tesis : Aktivitas Antiinflamasi Minyak Kelapa Murni dan

Komisi Penguji Tesis

Ketua : Prof. Dr. Jansen silalahi, M. App.Sc., Apt

Sekretaris : Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.

Anggota : Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt

: Dr. Aminah Dalimunthe, M.Si., Apt

Saya yang bertanda tangan di bawah ini:

Nama Mahasiswa : Muhammad Amin Nasution

Nomor Induk Mahasiswa : 177014040

Program Studi : Magister Ilmu Farmasi

Judul Tesis : Aktivitas Antiinflamasi Minyak Kelapa Murni dan

perbuatan saya tersebut.

Medan, 12 Desember 2020

Muhammad Amin Nasution

Medan, 12 Desember 2020

Muhammad Amin Nasution

HALAMAN SAMPUL .................................................................................... i

BAB III METODE PENELITIAN................................................................... 30

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 45

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 56

2.1 Efek Antiinflamasi dari Berbagai Bahan Alam ...................................... 17

1.1.a Kerangka Pikir Penelitian aktivitas sitotoksik VCO, HVCO dan

1 Gambar Sampel VCO dan HVCO ................................................ 64

VCO : Virgin Coconut Oil

1.1 Latar Belakang

Inflamasi adalah respon pertahanan tubuh yang paling penting terhadap

merekrut sel leukosit (fagosit) polimorfonuklear dan sel leukosit mononuklear

yaitu makrofag, menghilangkan penyebab peradangan dan memperbaiki bagian

menghancurkan, mengurangi, atau melokalisasi (sekuster) baik agen yang

merusak maupun jaringan yang rusak. Tanda terjadinya inflamasi adalah

pembengkakan/edema, kemerahan, panas, nyeri, dan perubahan fungsi (Sumiwi

dan Ramadhani, 2015 ).

istilah "inflamasi molekuler" membedakan perubahan molekuler yang terjadi

inflamasi dengan mengubah jalur pensinyalan redoks akhirnya akan

menyebabkan jaringan dan organ peradangan, inflamasi itu sendiri merupakan

inflamasi dalam berbagai penyakit inflamasi dapat ditandai dengan spektrum

seperti sitokin inflamasi (Chung et al., 2002; Kaminska, 2005). Lipopolisakarida (

berperanan penting sehingga memicu inflamasi. LPS menyebabkan makrofag

inflamasi (Lawrence dan Fong, 2010).

menjadi dua, yaitu antiinflamasi steroid dan antiinflamasi nonsteroid. Namun

kedua golongan obat tersebut memiliki banyak efek samping. Antiinflamasi

steroid dapat menyebabkan tukak peptik, penurunan imunitas terhadap infeksi,

serta bersifat diabetik, sedangkan antiinflamasi nonsteroid dapat menyebabkan

menimbulkan efek samping yang berbahaya telah dilakukan dari berbagai

penelitian sebelumnya disebutkan bahwa VCO mengandung fitosterol yang dapat

penelitian yang menjelaskan bahwa VCO dapat digunakan sebagai pelindung

2015; Intahphuak, et al., 2010; Varma, et al., 2019),

Berdasarkan uraian di atas maka penelitian ini bertujuan untuk mengetahui

kemudian aktivitas antiinflamasi diuji dengan mengukur produksi kadar nitric

reverse trancription-polymerase chain reaction (RT-PCR).

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka perumusan masalah penelitian

viabilitas sel RAW 264.7 yang diinduksi LPS?