Theses Penyembuhan Luka

TESIS
AKTIVITAS PENYEMBUHAN LUKA DARI KOMBINASI

HASIL HIDROLIS MINYAK KELAPA MURNI DAN
FUCOIDAN SECARA IN VITRO
OLEH:
EVAYANTI MEILIANA SAGALA
NIM 177014002
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2019
123
TESIS

OLEH:
NIM 177014002

FAKULTAS FARMASI
MEDAN
2019
124
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister

dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
OLEH:
NIM 177014002

FAKULTAS FARMASI
MEDAN
2019
125
126
PERSETUJUAN TESIS
Nama Mahasiswa : Evayanti Meiliana Sagala

Nomor Induk Mahasiswa : 177014002
Program Studi : Magister Ilmu Farmasi
Judul Tesis : Aktivitas Penyembuhan Luka dari Kombinasi
Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa Murni dan
Fucoidan Secara In Vitro
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Komisi Penguji Tesis pada hari
Jumat tanggal Dua Puluh Enam bulan Juli tahun Dua Ribu Sembilan Belas.
Menyetujui:
Komisi Penguji Tesis
Ketua : Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.
Sekretaris : Yuandani, S.Farm, M.Si., Ph.D., Apt.
Anggota : Prof. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt.
Dr. Edi Suwarso, SU, Apt.
127
128
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur bagi Tuhan Yesus Kristus atas kasih, penyertaan,
kemurahan dan karunia sehingga penulis dapat menyelesaikan Tesis yang berjudul
“Aktivitas Penyembuhan Luka dari Kombinasi Hasil Hidrolisis Minyak Kelapa
Murni dan Fucoidan Secara In Vitro”. Tesis ini diajukan sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Magister Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara.
Penelitian sebelumnya telah membuktikan aktivitas penyembuhan luka
yang lebih baik dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni. Atas dasar itulah maka
dilakukan penelitian ini dilakukan, dengan melakukan kombinasi dengan
Fucoidan, dengan pengujian secara in vitro. Penelitian ini diharapkan memperoleh
data awal untuk kemudian dikembangkan dalam publikasi ilmiah.
Penulis meyakini pembuatan Tesis ini tidak akan selesai tanpa dukungan
dan bantuan dari banyak pihak. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis
menyampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada:
1. Prof. Dr. Runtung Sitepu, SH, M.Hum selaku Rektor Universitas Sumatera
Utara.
2. Prof. Dr. Masfria, M. S., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas
Sumatera Utara.
3. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. selaku Kepala Program Pendidikan Magister
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
4. Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt. selaku Pembimbing Pertama atas
bimbingan, arahan dan banyaknya waktu dan kesempatan yang telah
diluangkan untuk diskusi. Terima kasih banyak atas nasehat dan pandangan
tentang kehidupan yang telah diberikan. Semoga Bapak senantiasa diberi
kesehatan, panjang umur dan limpahan berkat dari Tuhan.
5. Yuandani, S.Farm, M.Si., Apt. selaku Pembimbing Kedua atas
kesediaannya meluangkan waktu dan memberikan bimbingan, saran, dan
kritik dalam proses penyelesaian Tesis ini.
6. Prof. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt. selaku Penguji Pertama dan Dr. Edi
Suwarso, SU, Apt. selaku Penguji Kedua, atas waktu, ilmu, saran serta
kritikan membangun yang telah diberikan dalam proses penyelesaian tesis
ini.
7. Seluruh dosen Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara atas ilmu,
bimbingan, dan motivasi yang telah diberikan
8. Ibu Rumbiwati dan Mba Juju selaku laboran di Laboratorium Parasitologi
FK UGM dan Bang Denny selaku laboran di Laboratorium Biologi USU
yang telah dengan sabar menyediakan waktu, mendampingi, mengajari
penulis dan teman-teman selama penelitian.
9. Seluruh staf dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara
atas bantuan selama penulis menjalani masa perkuliahan.
vii
10. Pemerintah Daerah Kabupaten Samosir, khususnya Kepala Dinas Kesehatan
yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikuti
Program Tugas Belajar.
11. Kepala Badan Pemberdayaan dan Peningkatan Sumber Daya Manusia
(BPPSDM) Kementerian Kesehatan yang telah memberikan dana sehingga
penulis dapat mengikuti perkuliahan di Program Magister ini.
12. Orang tua yang penulis hormati dan sayangi Alm. Wadin Sagala & Rukia
Situmorang serta Kasmin Silalahi & Nursita Simbolon, atas segala doa dan
dukungan yang tidak pernah putus.
13. Suami tercinta Novenri Lundu Silalahi, atas segala cinta, pengertian, doa
dan dukungan yang luar biasa. Terima kasih untuk memberikan penulis
kesempatan yang sangat berharga ini. Terima kasih banyak.
14. Anak-Anak tersayang Leonel Gior Anugrah Silalahi, Deandra Cresentiano
Silalahi dan Kayla Viyonata Silalahi. Untuk pengertian, pengorbanan, kasih
sayang, pelukan dan ciuman yang memberikan penulis kekuatan terutama
melewati masa-masa sulit. Semoga kalian tumbuh menjadi anak-anak yang
bahagia.
15. Keluarga besar penulis yang tercinta baik keluarga besar Silalahi maupun
keluarga besar Sagala atas doa dan dukungan moral yang telah diberikan
kepada penulis.
16. Rekan penelitian dan seperbimbingan Tesis Bang Hekdin Sipayung, S.Si,
M.Si, Apt yang sudah saling membantu, mendukung, dan menjadi teman
berbagi suka duka selama kuliah dan sepanjang penulisan tesis ini.
17. Teman-teman angkatan 2017 di Program Magister USU yang tidak bisa
disebutkan satu persatu, atas makna kebersamaan dan berbagi ilmu bersama.
18. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan namanya satu persatu yang telah
memberikan bantuan dalam penulisan tesis ini.
Penulis menyadari bahwa Tesis ini masih jauh dari sempurna dan masih
banyak kekurangan dan keterbatasan. Akhir kata, penulis berharap semoga Tesis
ini memberikan manfaat bagi kita semua terutama untuk pengembangan ilmu
pengetahuan.
Medan, 26 Juli 2019

Penulis,
Evayanti Meiliana Sagala

NIM 177014002
viii
AKTIVITAS PENYEMBUHAN LUKA DARI KOMBINASI HASIL
HIDROLISIS MINYAK KELAPA MURNI DAN FUCOIDAN SECARA
IN VITRO
ABSTRAK
Latar belakang: Penelitian sebelumnya telah membuktikan potensi angiogenesis
dan penyembuhan luka dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni (HVCO) baik
secara in vivo maupun secara in vitro. Luka yang diberi minyak kelapa murni
(VCO) mengalami peningkatan kolagen, proliferasi fibroblas, dan
neovaskularisasi. Dengan demikian, VCO telah terbukti mendukung
penyembuhan luka pada kulit manusia. Fucoidan diketahui memiliki aktivitas
penyembuhan luka karena dapat meningkatkan proliferasi sel dengan memodulasi
faktor pertumbuhan transformasi.
Tujuan: Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pengujian aktivitas
penyembuhan luka dari hasil HVCO dikombinasi dengan fucoidan pada kultur
sel NIH 3T3 secara in vitro.
Metode: Hidrolisis VCO dilakukan secara enzimatis dengan menggunakan enzim
Rhizomucor miehei yang spesifik terhadap posisi sn-1 dan sn-3. Pengujian
aktivitas proliferasi sel NIH 3T3 dilakukan dengan metode MTT, pengujian
aktivitas migrasi sel dilakukan dengan metode stratch migration assay, sedangkan
pengujian ekspresi protein yang mengatur proses angiogenesis (COX-2 dan
VEGF) menggunakan metode Imunositokimia.
Hasil : Pengujian aktivitas proliferasi menunjukkan bahwa konsentrasi yang
terbaik adalah pada konsentrasi 31,25 mcg/ml untuk semua bahan uji. Pengujian
kombinasi terbaik dilakukan dengan metode uji migrasi, menunjukkan hasil
bahwa kombinasi HVCO dan fucoidan terbaik adalah pada kombinasi konsentrasi
50:50 dari konsentrasi optimum. Sedangkan dari pengujian ekspresi protein
diperoleh hasil bahwa ekspresi protein COX-2 dan VEGF pada kombinasi lebih
tinggi daripada HVCO tunggal maupun fucoidan tunggal.
Kesimpulan : Kombinasi dari HVCO dan fucoidan memiliki aktivitas
penyembuhan luka yang lebih baik dari pada minyak kelapa murni tunggal
maupun fucoidan tunggal dalam pengujian secara in vitro.
Kata kunci : MTT, viabilitas, proliferasi, migrasi, imunositokimia
ix
WOUND HEALING ACTIVITY FROM THE COMBINATION
OF HYDROLYZED VIRGIN COCONUT OIL AND FUCOIDAN
USING IN-VITRO ASSAY
ABSTRACT
Background : Previous research has proven the potential of angiogenesis and
wound healing from hydrolyzed virgin coconut oil (HVCO). Virgin coconut oil
(VCO) in wounds have increased collagen, fibroblast proliferation, and
neovascularization. Thus, VCO has been shown to support wound healing in
human skin. Fucoidan is known to have wound healing activities because it can
increase cell proliferation by modulating transformation growth factors.
Objective: The aim of this study was to investigate the wound healing activity
of HVCO and fucoidan combination, in the NIH 3T3 cell line using in vitro
assay.
Methods: Hydrolysis of VCO was carried out enzymatically using the enzyme
Rhizomucor miehei which is specific to the sn-1 and sn-3 positions. Proliferation
activity of NIH 3T3 cells were assessed using the MTT method, migration
activity was assessed using sctrach wound healing assays and expression of
COX-2 and VEGF protein were determined using immunocytochemistry (ICC).
Results: The results from the proliferative activity assay show that the effective
concentrations for all sampels were 31.25 µg /ml. NIH 3T3 cells migration
activity assay showed that the best combination of the HVCO and fucoidan was
50:50. From COX-2 and VEGF protein expression test results, the combination
of HVCO and fucoidan has a higher percentage of expression than HVCO or
fucoidan alone.
Conclusion: The results reveal that the combination of HVCO and fucoidan has
better wound healing activity than HVCO or fucoidan alone in in vitro assay.
Keywords: MTT, viability, proliferation, migration, immunocytochemistry
x
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN SAMPUL..................................................................................... i
HALAMAN SAMPUL..................................................................................... ii
HALAMAN JUDUL I ...................................................................................... iii
HALAMAN JUDUL II .................................................................................... iv
HALAMAN PENGESAHAN TESIS .............................................................. v
HALAMAN PERSETUJUAN TESIS.............................................................. vi
HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................. vii
KATA PENGANTAR ...................................................................................... viii
ABSTRAK........................................................................................................ ix
ABSTRACT ..................................................................................................... x
DAFTAR ISI .................................................................................................... xi
DAFTAR TABEL ............................................................................................ viii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ ix
DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... x
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. xi
BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang..................................................................................... 1
1.2 Perumusan Masalah ............................................................................ 5
1.3 Hipotesis Penelitian ............................................................................ 5
1.4 Tujuan Penelitian ................................................................................ 6
1.5 Manfaat Penelitian .............................................................................. 6
1.6 Kerangka Pikir Penelitian ................................................................. 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 8

2.1 Kulit .................................................................................................... 8
2.1.1 Struktur Kulit ...................................................................................... 10
2.1.2 Fungsi Kulit ..................................................................................... 10
2.2 Luka .................................................................................................... 10
2.2.1 Jenis Jenis Luka .................................................................................. 11
2.2.2 Mekanisme Penyembuhan Luka ....................................................... 13
2.2.3 Sel Fibroblas NIH 3T3 ..................................................................... 21
2.2.4 Enzim Siklooksigenase-2 ................................................................. 22
2.2.5 Vascular Endotheliel Growth Factor (VEGF) ................................. 24
2.2.6 Faktor Faktor yang Mempengaruhi Penyembukan Luka ................. 25
2.2.7 Penanganan Luka ............................................................................. 28
2.2.8 Sediaan Farmasi untuk Pengobatan Lokal pada Luka ...................... 28
2.2.9 Obat Tradisional Untuk Penyembuhan Luka ................................... 29
2.2.10 Aktivitas Anti Bakteri dari Minyak Kelapa Murni dan Fucoidan .... 31
2.3 Minyak Kelapa Murni (VCO) ............................................................ 34
2.3.1 Hidrolisis VCO ................................................................................. 37
2.4 Fucoidan ............................................................................................. 38
2.5 Metode Pengujian Aktivitas Penyembuhan Luka Secara In Vitro ... 39
2.6 Kombinasi Farmakologi ..................................................................... 44
2.7 Kerangka teori penelitian.................................................................... 46
xi
BAB III METODE PENELITIAN ................................................................... 48
3.1 Jenis penelitian .................................................................................. 48
3.2 Alat-Alat ............... ............................................................................ 48
3.3 Bahan-bahan ............... ...................................................................... 49
3.4 Sel uji ............... ................................................................................ 49
3.5 Prosedur penelitian ............................................................................ 49
3.5.1 Sterilisasi alat-alat.............................................................................. 49
3.5.2 Pembuatan Pereaksi ........................................................................... 50
3.5.3 Hidrolisis enzimatis minyak kelapa murni ........................................ 50
3.5.4 Penentuan Bilangan Asam ................................................................. 51
3.5.5 Pembuatan media ............................................................................... 52
3.5.6 Penumbuhan Sel NIH 3T3 ................................................................. 53
3.5.7 Pembuatan larutan uji ........................................................................ 56
3.5.8 Pembuatan larutan uji Kombinasi...................................................... 56
3.5.9 Pengujian Aktivitas Proliferasi Sel NIH 3T3 Menggunakan
Metode MTT (Microculture Tetrazolium Tehnique) ....................... 57
3.5.10 Pengujian Migrasi Sel NIH 3T3 Menggunakan
Scratch Wound Healing Assay ................................................... 58
3.5.11 Pengujian Ekspresi Protein COX-2 dan VEGF Menggunakan
Metode Immunositokimia (ICC) ....................................................... 59
3.6 Analisis Data................................................................................. 60
3.7 Jadwal Penelitian............................................................................. 60
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................... 64

4.1 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni ....................................................... 64
4.2 Aktivitas Proliferasi Sel NIH 3T3 .................................................... 66
4.3 Aktivitas Migrasi Sel NIH 3T3 ........................................................ 71
4.4 Ekspresi Protein COX-2 dan VEGF .................................................. 77
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 83

5.1 Kesimpulan ......................................................................................... 83
5.2 Saran ................................................................................................... 83
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 84

LAMPIRAN ............ .... .................................................................................. 91
xii
DAFTAR TABEL
2.1 Sediaan farmasi untuk pengobatan lokal pada luka................................... 29

2.2 Uji aktivitas Penyembuhan Luka VCO dan Fucoidan ............................. 31
2.3 Komposisi asam lemak dari VCO ............................................................. 35
3.1 Defenisi operasional variabel penelitian.................................................... 61
4.1 Bilangan asam hasil hidrolisis minyak kelapa murni ...................... ......... 64
4.2 Aktivitas proliferasi Sel NIH 3T3 dengan pemberian bahan uji pada
berbagai variasi konsentrasi...................... ................................................ 67
4.3 Persentase penyembuhan luka dari bahan uji dengan pengujian
Migrasi sel berdasarkan periode masa inkubasi...................... .................. 73
4.4 Persentase ekspresi protein COX-2 dan VEGF ..................... ................... 79
xiii
DAFTAR GAMBAR
1.1 Diagram kerangka pikir penelitian...…………………………………… 7

2.1 Struktur Kulit…………………………………………………………… 8
2.2 Proses penyembuhan luka ........................................................................ 14
2.3 Luka pada fase inflamasi, warna ungu merupakan serbukan sel-sel
radang................................................................................................. ..... 16
2.4 Fase proliferasi dimana jaringan granulasi mengisi kavitas luka dan
Keratinosit bermigrasi untuk menutup luka ........................................... 17
2.5 Fase maturasi yang terjadi mulai hari ke-21 sampai 1 tahun...………… 20
2.6 Kultur NIH 3T3 Salah Satu Contoh Cell Line Fibroblas dari Embrio
Mencit................................................................................................. ..... 21
2.7 Peran Fibroblas dalam Membentuk dan Meletakkan
Serat - Serat dalam Matriks, Terutama Serat Kolagen .......................... 22
2.8 Struktur enzim COX ................................................................................. 24
2.9 Struktur kimia fucoidan ............................................................................ 38
2.10 Reduksi MTT menjadi Formazan ............................................................. 41
2.11 Ekspresi protein COX-2 pada sel ............................................................. 42
2.12 Aktivitas migrasi sel dengan variasi masa inkubasi yaitu 0 jam, 12 jam
dan 24 jam ............................................................................................... 44
2.13 Kerangka teori penelitian.......................................................................... 47
3.1 Hemositometer (Kamar Hitung) ............................................................... 55
4.1 Aktivitas proliferasi sel NIH 3T3...................... ...................................... 68
4.2 Dokumentasi proses penutupan luka dari bahan uji pada 0 jam,
24 jam, 48 jam dan 72 jam...................... ................................................. 72
4.3 Persentase penyembuhan luka dari bahan uji dengan pengujian
migrasi sel berdasarkan periode masa inkubasi........................................ 73
4.4 Pengamatan ekspresi sel dengan menggunakan mikroskop yang
dilengkapi dengan kamera optilab (perbesaran 40x)...................... .......... 78
4.5 Persentase ekspresi protein (A) ekspresi protein COX-2
(B) ekspresi protein VEGF...................... ................................................. 79
xiv
DAFTAR LAMPIRAN
1. Rekomendasi persetujuan etik penelitian kesehatan ............................... 91

2. Gambar alat-alat ..................................................................................... 92
3. Gambar bahan-bahan .................................................................................. 93
4. Sertifikat analisis fucoidan ...................................................................... 94
5. Gambar Sel NIH 3T3............................................................................... 95
6. Gambar goresan pada sel monolayer pada pengujian migrasi ................... 96
7. Bagan alur penelitian .................................................................................. 97
8. Prosedur pembuatan media kultur .............................................................. 100
9. Prosedur pembuatan media kultur lengkap ................................................ 101
10. Prosedur penumbuhan sel NIH 3T3 ........................................................... 102
11. Prosedur Sub kultur sel ............................................................................... 103
12. Prosedur panen sel ................................................................................... 104
13. Prosedur penghitungan sel .......................................................................... 105
14. Prosedur pembuatan larutan uji .................................................................. 106
15. Prosedur uji aktivitas proliferasi sel ........................................................... 107
16. Prosedur Scratch wound healing ................................................................ 108
17. Prosedur analisa ekspresi COX-2 dan VEGF dengan metode
Immunositokimia ...................... ................................................................. 109
18. Data bilangan asam VCO dan HVCO ........................................................ 110
19. Penghitungan persentase sel hidup pada pengujian proliferasi sel ............. 112
20. Perhitungan persentase penyembuhan luka pada pengujian
Migrasi ...................... ................................................................................ 114
21. Penghitungan ekspresi protein COX-2 dan VEGF ..................................... 115
22. Analisis statistik dari persentase proliferasi sel .......................................... 117
23. Analisis statistik dari persentase persentase penyembuhan luka
pada uji aktivitas migrasi sel ...................... ............................................... 120
24. Analisis statistik dari persentase ekspresi protein COX-2 pada uji
aktivitas ekspresi protein dengan metode immunositokimia..................... . 125
25. Analisis statistik dari persentase ekspresi protein VEGF pada uji
aktivitas ekspresi protein dengan metode immunositokimia..................... . 127
xv
DAFTAR SINGKATAN
bFGF : basic Fibroblast Growth Factor

BHK : Baby Hamster Kidney
COX : Cyclooxygenase
COX-1 : Cyclooxygenase-2
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO : Dimethyl Sulfoxide
ECM : Ekstracellular Matriks
EGF : Epidermal Growth Factor
FGF : Fibroblast Growth Factor
GF : Growth Factor
HDL : High Density Lipoprotein
HIF : Hypoxia Induced Factor
HIV : Human Immunodeficiency Virus
HSV : Herves Simplex Virus
IGF : Insulin-like Growth Factor
KGF : Keratinocyte Growth Factor
LCFAs : Long Chain Fatty Acids
LCT : Long Chain Triglyceride
LDL : Low Density Lipoprotein
MCFA : Medium Chain Fatty Acid
MCT : Medium Chain Triglyceride
MMP-9 : Matrix Metalloproteinases
MTT : Microculture Tetrazolium Tehnique
PBS : Phospate Buffer Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction
PDGF : Platelet Derived Growth Factor
PGs : Prostaglandins
PMN : Polymorphonuclear
RCO : Refined Coconut Oil
ROS : Reactive Oxygen Species
SCFA : Short Chain Fatty Acid
SCT : Short Chain Triglyceride
SDS : Sodium dodesil sulfate
TGF : Transforming Growth Factor
TGF-β : Transforming Growth Factor Beta
VCO : Virgin Coconut Oil
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor
VLDL : Very Low Density Lipoprotein
WHO : World Health Organisation
WHS : Wound Healing Society
xvi
BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Kulit manusia adalah organ terbesar di tubuh yang menutupi lapisan luar,
dan terbagi menjadi tiga lapisan utama yaitu epidermis, dermis, dan hipodermis.
Luka dapat didefinisikan sebagai kejadian rusaknya jaringan hidup atau robeknya
keutuhan epitel lapisan atas kulit.. Menurut WHS (wound healing society), luka
atau cedera fisik dapat menyebabkan hancurnya jaringan kulit, yang
mengakibatkan terjadinya gangguan baik dalam anatomi kulit, fisiologi dan juga
fungsinya. Penyembuhan luka merupakan suatu proses yang kompleks dengan
melibatkan banyak sel yang terdiri dari empat fase yaitu fase hemostasis,
inflamasi, proliferasi, dan remodeling (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013;
Singh, et al., 2017; Guo and DiPietro, 2010; Obolensky, et al., 2017).
Tujuan utama dari penyembuhan luka untuk mengembalikan sifat
fungsional kulit dan mencegah terjadinya infeksi . Povidone Iodine adalah larutan
aseptik spektrum luas yang banyak digunakan dalam dekade terakhir ini untuk
proses penyembuhan luka, akan tetapi povidone iodine mengandung zat yang
bersifat korosif yang dapat menyebabkan iritasi sehingga terbentuk jaringan parut.
Kontaminasi dan atau kolonisasi luka dengan bakteri seperti Staphylococcus
aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), dan streptokokus β-
hemolitik. Banyak tantangan dalam hal perawatan luka yaitu resistensi terhadap
antibiotik dan penurunan penemuan antibiotik baru. Efek samping penggunaan
obat sintetik yang dapat menyebabkan iritasi, sehingga banyak ahli yang
melakukan penelitian terhadap bahan alam sebagai penyembuhan luka. Banyak
1
masyarakat menggunakan bahan alternatif dari alam sebagai pengganti. Minyak
kelapa murni (Virgin Coconut Oil= VCO) juga digunakan sebagai alternatif
penyembuhan luka. Penelitian menunjukkan bahwa pengobatan dengan VCO
menghasilkan efek penyembuhan luka yang lebih cepat (Tsiouris, et al., 2017;
Ghavouri, et al., 2016; Balzer, et al., 2015; Nevin and Rajamohan, 2009).
Minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil =VCO) merupakan salah satu
produk hasil olahan dari buah kelapa (Cocos nucifera). Minyak kelapa murni
mengandung senyawa aktif seperti antioksidan, asam amino, asam lemak esensial,
dan senyawa fenol. VCO adalah minyak yang jenuh dengan asam lemak rantai
sedang (MCFA= Medium Chain Fatty Acid) seperti asam kaprat (7%), asam laurat
(49%), asam miristat (18%), asam palmitat (9%), asam stearat (2%), dan minyak
tidak jenuh dalam jumlah kecil seperti asam oleat (6%), dan asam linoleat (2%).
Asam laurat memiliki aktivitas anti bakteri. VCO merupakan minyak alami yang
kaya akan vitamin dan anti oksidan dan memiliki aktivitas anti bakteri dan anti
virus. Potensi anti bakteri dan anti virus dari VCO ini telah dibuktikan oleh
banyak penelitian sebelumnya (Silalahi, et al., 2016; Nguyen, et al., 2017; Loung,
et al., 2014; Silalahi, et al., 2014; Soliman, et al., 2018; Margata, et al., 2019).
Penelitian sebelumnya telah membuktikan potensi angiogenesis dan
penyembuhan luka dari minyak kelapa murni yang di fermentasi, baik secara in
vivo maupun secara in vitro. Luka yang diberi VCO mengalami peningkatan
kolagen, proliferasi fibroblas, dan neovaskularisasi. Dengan peningkatan kolagen
ini, diharapkan bekas luka pada kulit tidak begitu terlihat. Dengan demikian,
VCO telah terbukti mendukung penyembuhan luka pada kulit manusia (Ibrahim,
et al., 2017; Nevin and Rajamohan, 2010; Perbina, 2019).
2
Hidrolisis minyak kelapa secara enzimatis dengan menggunakan enzim
lipase yang spesifik terhadap posisi sn-1 dan sn-3 pada molekul lemak akan
menghasilkan dua asam lemak bebas dan 2-monogliserida terutama 2-monolaurin
yang mempunyai sifat anti bakteri. Pada penelitian ini ditemukan bahwa sifat anti
bakteri dari VCO hidrolisis lebih baik dari VCO biasa (Nevin and Rajamohan,
2010; Silalahi, et al., 2015; Perbina, 2019; Silalahi, et al., 2014).
Fucoidan adalah jenis kompleks polisakarida sulfat, umumnya
ditemukan pada matriks dinding sel berbagai spesies rumput laut coklat . Selama
dasawarsa terakhir, fucoidan telah banyak sekali diteliti sehubungan dengan
aktivitas biologisnya, diantaranya sebagai imunomodulator, anti oksidan, anti
virus dan anti bakteri. Fucoidan kemungkinan berinteraksi dengan berbagai faktor
pertumbuhan seperti faktor pertumbuhan fibroblas (basic fibroblast growth factor
= bFGF) dan faktor pertumbuhan transformasi (transforming growth factor).
Fucoidan diketahui memiliki aktivitas penyembuhan luka karena dapat
meningkatkan proliferasi sel dengan memodulasi faktor pertumbuhan
transformasi (Transforming Growth Factor (TGF)-β1. Pada penelitian yang
dilakukan oleh Murakami, et al. (2010), dilakukan uji efek penyembuhan luka
dari gabungan hidrogel dari kitosan, fucoidan dan alginat sebagai pembalut luka.
Dari penelitian ini diperoleh hasil bahwa kombinasi dari ketiga biopolimer ini
menghasilkan efek penyembuhan luka yang lebih baik. Fucoidan berperan dalam
absorbsi, stabilisasi dan aktivasi ikatan heparin-sitokin dalam eksudat yang akan
menginduksi angiogenesis dan perbaikan luka. Park, et al. (2017) melakukan
penelitian tentang aktivitas penyembuhan luka dari fucoidan secara in vivo. Dari
hasil penelitian dapat diambil kesimpulan bahwa fucoidan dapat mempercepat
3
penyembuhan luka insisi pada tikus yang ditandai dengan penyempitan luas area
luka dan peningkatan ekspresi TGF- β1, VEGFR dan MMP 9 (Murakami, et al.,
2010; Park, et al., 2017; O’Leary, et al., 2004).
Tampilan visual terakhir dari proses penyembuhan luka sangat penting
bagi pasien dan dokter, dengan efek samping jaringan parut menjadi perhatian.
Tantangan utama yang dihadapi para peneliti saat ini adalah bagaimana
meningkatkan hasil estetika dan fungsional untuk pasien dengan luka dan bekas
luka abnormal (Ashrafi, et al., 2018).
Metode penelitian untuk uji efek penyembuhan luka bisa dilakukan dengan
in vitro maupun in vivo. Uji secara in vitro dilakukan dengan melihat aktivitas
migrasi sel, aktivitas proliferasi sel dan ekspresi dari protein. Migrasi sel
merupakan fenomena yang kompleks yang berhubungan dengan banyak proses
selular. Pengujian migrasi sel untuk penyembuhan luka dilakukan dengan metode
scratch wound healing assay. Pengukuran ini secara langsung memungkinkan
untuk mengetahui efek suatu senyawa dengan konsentrasi yang berbeda terhadap
kemampuan interaksi sel-sel selama melakukan migrasi sel (CCRC, 2009).
Pengujian aktivitas proliferasi sel dilakukan untuk melihat jumlah sel hidup
dengan metode tertentu. Semakin banyak jumlah dan persentasi sel hidup, maka
diharapkan penyembuhan luka akan semakin cepat. Analisis ekpresi protein yang
mengatur angiogenesis dilakukan untuk melihat seberapa besar peningkatan
ekspresi protein tersebut. Peningkatan ekspresi COX-2 dan VEGF akan
mempercepat proses angiogenesis sehingga proses penyembuhan luka juga akan
semakin cepat.
4
Uji aktivitas penyembuhan luka dari VCO secara in vivo dan in vitro
sudah dilakukan, sedangkan uji aktivitas penyembuhan luka untuk kombinasi
hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan belum pernah dilakukan baik
secara in vivo maupun secara in vitro. Tujuan dari penelitian ini untuk melihat
aktivitas penyembuhan luka dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni
dikombinasi dengan fucoidan pada kultur sel NIH3T3 secara in vitro pada luka
terbuka yakni luka goresan. Pengujian aktivitas proliferasi sel dilakukan dengan
metode MTT, sedangkan pengujian aktivitas migrasi sel dilakukan dengan
metode scratch migration assay. Pengujian aktivitas ekspresi protein yang
mengatur proses angiogenesis (COX-2 dan VEGF) dengan menggunakan metode
Imunositokimia.
1.2 Perumusan Masalah
Berdasarkan uraian latar belakang penelitian di atas, maka rumusan
masalah penelitian adalah sebagai berikut:
a. Apakah kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan
memiliki aktivitas penyembuhan luka secara in vitro?
b. Apakah kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan
memiliki aktivitas yang lebih baik dalam penyembuhan luka secara in
vitro dibandingkan dengan hasil hidrolisis minyak kelapa murni tunggal
maupun fucoidan tunggal?
1.3 Hipotesis Penelitian
Hipotesis penelitian ini adalah sebagai berikut:
a. Kombinasi Hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan memiliki
aktivitas penyembuhan luka secara in vitro.
5
b. Kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan memiliki
aktivitas yang lebih baik dalam penyembuhan luka secara in vitro
dibandingkan dengan hasil hidrolisis minyak kelapa murni tunggal
maupun fucoidan tunggal.
1.4 Tujuan Penelitian
Berdasarkan hipotesis diatas, maka tujuan penelitian ini adalah:
a. Untuk mengetahui apakah kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni
dan fucoidan memiliki aktivitas penyembuhan luka secara in vitro?
b. Untuk mengetahui apakah kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni
dan fucoidan memiliki aktivitas yang lebih baik dalam penyembuhan luka
secara in vitro dibandingkan dengan hasil hidrolisis minyak kelapa murni
tunggal maupun fucoidan tunggal?
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi tentang
pengaruh kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan terhadap
aktivitas penyembuhan luka secara in vitro sehingga dapat digunakan sebagai
sediaan topikal untuk meningkatkan penyembuhan luka dan meminimalkan
jaringan parut pada bekas luka.
1.6 Kerangka Pikir Penelitian
Berdasarkan uraian latar belakang di atas penelitian ini menguji efek
kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dengan fucoidan terhadap sel
fibroblast yaitu sel NIH 3T3.
Secara diagramatis kerangka pikir penelitian ini dapat dilihat pada Gambar
1.1.
6
1. Hidrolisis VCO
VCO Hidrolisis Bilangan

Asam HVCO
2. Pengujian aktivitas penyembuhan luka secara in vitro
Variabel bebas Variabel terikat Parameter
HVCO
Sel NIH Aktivitas Persentase

3T3 Proliferasi sel proliferasi sel
NIH 3T3
Fucoidan
Konsentrasi
terbaik:
Kombinasi
HVCO dan
Fucoidan (50:50; Sel NIH Aktivitas Persentase
75:25; 25:75;), 3T3 Migrasi Sel migrasi Sel
HVCO tunggal, NIH 3T3 NIH 3T3
fucoidan
tunggal, kontrol
positif
Kombinasi
terbaik HVCO Jumlah
dan Ekspresi protein ekspresi
Fucoidan, Sel NIH COX-2 dan protein COX-2
Fucoidan 3T3 VEGF dan VEGF
tunggal, HVCO
tunggal, kontrol
positif
Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian
7
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kulit
2.1.1 Struktur Kulit
Kulit adalah organ terbesar manusia, dengan luas permukaan sekitar dua
meter persegi dan berat sekitar 3,6 kg pada orang dewasa. Kulit terdiri dari tiga
lapisan yaitu epidermis, dermis, dan hipodermis. Struktur kulit dapat dilihat pada
Gambar 2.1.
Gambar 2.1 Struktur Kulit (Obolensky, et al., 2017)
1. Epidermis
Epidermis adalah lapisan terluar kulit yang melindungi tubuh dari bahaya
lingkungan luar. Ketebalan epidermis bervariasi di berbagai permukaan
tubuh, mulai dari yang paling tipis dengan ketebalan ±0,05 mm pada kelopak
mata hingga yang paling tebal 1,5 mm pada telapak tangan, dan telapak kaki.
Stratum germinativum adalah lapisan basal epidermis. Bagian atas lapisan
basal adalah stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum, dan
stratum korneum. Epidermis mengandung melanosit (sel-sel yang
memproduksi melanin, pigmen kecoklatan pada kulit), sel-sel langerhans
8
(terlibat dalam sistem kekebalan di kulit), sel-sel merkel, dan saraf sensorik
(Guo and DiPietro, 2010; Obolensky, et al., 2017; Gilaberte, et al., 2016).
2. Dermis
Dermis adalah lapisan kulit yang terletak diantara epidermis (dengan
membentuk kutis) dan jaringan subkutan, yang terdiri dari jaringan ikat dan
bantalan tubuh dari stress dan tegangan. Komponen struktural dari dermis
adalah kolagen, serat elastis, dan matriks extrafibrillar. Lapisan dermis juga
mengandung mechanoreceptors yang memberikan rasa sentuhan, dan panas,
folikel rambut, kelenjar keringat, kelenjar sebaseus, kelenjar apokrin,
pembuluh limfatik, dan pembuluh darah. Kolagen adalah protein khusus
dihasilkan oleh fibroblas. Fibroblas adalah sel kulit yang memberikan
kekuatan dan ketahanan pada kulit (Guo and DiPietro, 2010; Obolensky, et
al., 2017; Gilaberte, et al, 2016).
3. Lapisan hipodermis (sub kutan)
Jaringan sub kutan adalah merupakan lapisan lemak dan jaringan ikat yang
banyak terdapat pembuluh darah dan saraf. Lapisan ini penting untuk
pengaturan temperatur pada kulit. Lapisan ini dibuat dari kelompok jaringan
adiposa (sel lemak) yang dipisahkan oleh fibrous septa. Lapisan ini juga
berfungsi sebagai pelindung tubuh terhadap dingin, serta tempat
penyimpanan lemak (Guo and DiPietro, 2010; Obolensky, et al., 2017;
Gilaberte, et al, 2016).
9
2.1.2. Fungsi Kulit
Fungsi utama kulit adalah sebagai penghalang masuknya patogen asing,
melindungi tubuh dari sinar matahari yang merusak, dan untuk mencegah
kehilangan air dan cairan ekstraseluler. Pengaturan suhu tubuh, persepsi sensorik,
penyerapan beberapa zat, reaksi imunologi, dan sintesis hormon adalah fungsi
lain yang dilakukan oleh kulit (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et
al., 2017; Gilaberte, et al., 2016). Beberapa fungsi utama dari kulit yaitu :
a. Pengaturan Suhu Tubuh
b. Mencegah hilangnya cairan tubuh yang penting, dan melindungi tubuh
terhadap penetrasi zat-zat toksik.
c. Fungsi Imunologis
d. Organ sensori untuk sentuhan, panas, dingin, dan sensasi emosional
e. Fungsi endokrin
(Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et al., 2017; Gilaberte, et
al., 2016).
2.2 Luka
Luka dapat didefinisikan sebagai kejadian terputusnya kontinuitas
struktur anatomi jaringan tubuh yang bervariasi mulai dari yang paling
sederhana seperti lapisan epitel dari kulit, sampai lapisan yang lebih dalam
seperti jaringan subkutis, lemak dan otot bahkan tulang beserta struktur
lainnya seperti tendon, pembuluh darah dan syaraf, sebagai akibat dari
trauma atau ruda paksa atau trauma dari luar. Menurut WHS (wound healing
society), luka atau cedera fisik dapat menyebabkan hancurnya jaringan kulit,
yang mengakibatkan terjadinya gangguan pada kulit baik dalam anatomi,
10
fisiologi dan juga fungsinya (Shrivastav, et al., 2018; Wang, et al.,2017;
Dryden, et al., 2013; Primadina, et al., 2019; Purnama, et al., 2018).
2.2.1. Jenis-Jenis Luka
Berdasarkan bentuknya, luka dibagi 2 jenis, yaitu luka tertutup dan luka terbuka:
a. Luka tertutup
Luka tertutup merupakan luka dimana kulit korban tetap utuh dan tidak
ada kontak antara jaringan yang ada di bawah dengan dunia luar,
kerusakannya diakibatkan oleh trauma benda tumpul. Luka tertutup
umumnya dikenal sebagai luka memar yang dapat digolongkan menjadi 2
jenis yaitu kontusio dan hematoma:
1) Kontusio, kerusakan jaringan di bawah kulit yang mana dari luar hanya
tampak sebagai benjolan.
2) Hematoma, kerusakan jaringan di bawah kulit disertai pendarahan
sehingga dari luar tampak kebiruan (Dorland, 2006).
b. Luka terbuka
Luka terbuka adalah luka dimana kulit atau jaringan di bawahnya
mengalami kerusakan. Penyebab luka ini adalah benda tajam, tembakan,
benturan benda keras dan lain-lain. Macam-macam luka terbuka antara
lain yaitu luka lecet (ekskoriasi), luka gigitan (vulnus marsum), luka
iris/sayat (vulnus scisum), luka bacok (vulnus caesum), luka robek (vulnus
traumaticum), luka tembak (vulnus sclopetinum), luka hancur (vulnus
lacerum) dan luka bakar.
Secara klinis luka dapat dikategorikan sebagai akut dan kronis sesuai
dengan lama proses penyembuhannya.
11
a. Luka akut
Luka ini dapat sembuh sendiri dengan proses normal dengan mengikuti
waktu yang tepat dan jalur penyembuhan yang teratur, dengan hasil akhir
perbaikan anatomi dan perbaikan fungsional pada kulit. Waktu
penyembuhan biasanya berkisar dari 5 hingga 10 hari, atau maksimal 30
hari (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et al., 2017; Velnar,
et al., 2018; Purnama, et al., 2018).
b. Luka kronis
Luka kronis adalah luka yang gagal mengalami kemajuan melalui tahap
penyembuhan normal dan tidak dapat diperbaiki secara teratur dan tepat
waktu. Proses penyembuhan tidak lengkap dan terganggu oleh berbagai
faktor, yang dapat memperpanjang satu atau lebih tahapan dalam fase
hemostasis, peradangan, proliferasi atau remodeling. Faktor-faktor ini
termasuk infeksi, hipoksia jaringan, nekrosis, eksudat dan kadar berlebih
sitokin inflamasi (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et al.,
2017; Velnar, et al., 2018).
c. Luka komplikasi
Luka adalah entitas rumit yang khusus, didefinisikan sebagai kombinasi
infeksi dan cacat jaringan. Infeksi menimbulkan sebuah ancaman konstan
pada luka. Ciri khas infeksi adalah: kemerahan, panas, nyeri, edema dan
kehilangan atau fungsi terbatas pada bagian yang terpengaruh. Frekuensi
infeksi luka tergantung pada jenis atau teknik bedah dan lokasi lukanya
12
(Purnama, et al., 2018; Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et
al., 2017; Velnar, et al., 2018).
2.2.2. Mekanisme Penyembuhan Luka
Penyembuhan luka merupakan suatu proses yang melibatkan respon
seluler dan biokimia baik secara lokal maupun sistemik melibatkan proses
dinamis dan kompleks dari koordinasi serial termasuk pendarahan,
koagulasi, inisiasi respon inflamasi akut segera setelah trauma, regenerasi,
migrasi dan proliferasi jaringan ikat dan sel parenkim, serta sintesis protein
matriks ekstraselular, remodeling parenkim dan jaringan ikat serta deposisi
kolagen. Penyembuhan luka dimulai segera setelah terjadinya cedera yang
mengakibatkan vasokonstriksi dan koagulasi. Selanjutnya terjadi pelepasan
sitokin oleh keratinosit dan trombosit mengarah ke peradangan awal, dengan
berbagai sel kekebalan, termasuk neutrofil dan monosit, bermigrasi ke dalam
tempat terjadinya luka. Pelepasan faktor pertumbuhan oleh makrofag
menstimulasi angiogenesis, sel epitel berproliferasi, dan infiltrasi fibroblast
terjadi, sehingga akhirnya membantu penutupan luka. Suatu luka dikatakan
sembuh secara sempurna jika luka telah kembali ke struktur anatomi
jaringan, fungsi jaringan, dan penampakan secara normal dalam periode
waktu yang sesuai (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et al., 2017;
Guo and DiPietro, 2010; Obolensky, et al., 2017; Shrivastav, et al., 2018).
Proses penyembuhan luka terdiri dari empat fase yaitu fase
hemostasis, inflamasi, proliferasi, dan remodeling, dapat dilihat pada Gambar
2.2 (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013; Singh, et al., 2017; Ashrafi, et al.,
2018).
13
Gambar 2.2 Proses Penyembuhan Luka (Borena, et al., 2015)
1. Fase hemostatis
Setelah cedera jaringan, proses penyembuhan dimulai dengan hemostasis
sebagai mekanisme tubuh untuk membatasi perdarahan. Selaput sel yang
dilukai melepaskan vasokonstriktor, tromboksan A2 dan prostaglandin,
meningkatkan pembentukan bekuan dan hemostasis. Pembuluh darah akan
menyempit, trombosit sirkulasi menjadi aktif oleh kolagen dan pelepasan
mediator kimia. Kolagen yang terbuka juga akan memicu kaskade pembekuan
untuk membentuk matriks fibrin, yang berfungsi dalam pembekuan trombosit
dan sel penyerang lainnya (yaitu, leukosit, sel endotel, fibroblas). Trombosit
dan protein perekat (fibronektin, vitronektin, dan thrombospondin)
membentuk matriks sementara, atau bekuan fibrin. Matriks sementara ini
sangat penting untuk hemostasis awal karena mencegah terjadinya
pendarahan hingga berhari-hari setelah cedera (Dryden, et al., 2013, Velnar, et
al., 2009, Pratsinis, et al., 2018).
14
2. Fase inflamasi
Mengikuti hemostasis awal, membran sel yang terluka akan melepaskan
mediator kimia. Fase inflamasi berlangsung selama 4 hingga 6 hari. Mediator
inflamasi (yaitu prostaglandin) menyebabkan vasodilasi pembuluh proksimal,
sehingga memungkinkan untuk meningkatkan respons seluler. Fase inflamasi
ditandai dengan gejala klinis utama yakni kemerahan karena kapiler melebar
(rubor), suhu hangat (kalor), rasa nyeri (dolor), dan pembengkakan (tumor).
Setelah luka terjadi, jaringan pembuluh darah segera mengalami
vasokonstriksi disertai reaksi hemostasis karena agregasi trombosit yang
bersama serat fibrin akan membekukan darah. Komponen hemostasis ini
akan melepaskan dan mengaktifkan sitokin yang meliputi Epidermal Growth
Factor (EGF), Insulin-like Growth Factor (IGF), Plateled-derived Growth
Factor (PDGF) dan Transforming Growth Factor beta (TGF-β) yang berperan
untuk terjadinya kemotaksis netrofil, makrofag, mast sel, sel endotelial dan
fibroblas. Pada fase ini kemudian terjadi vasodilatasi dan akumulasi lekosit
Polymorphonuclear (PMN). Agregat trombosit akan mengeluarkan mediator
inflamasi Transforming Growth Factor beta 1 (TGF b1) yang juga
dikeluarkan oleh makrofag. Adanya TGF b1 akan mengaktivasi fibroblas
untuk mensintesis kolagen. Keadaan luka pada fase inflamasi dapat dilihat
pada Gambar 2.3 (Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al.,
2018).
15
Makrofag M2 merupakan penghasil sitokin dan growth factor yang
menstimulasi proliferasi fibroblast, produksi kolagen, pembentukan pembuluh
darah baru, dan proses penyembuhan lainnya.
Gambar 2.3 Luka pada fase inflamasi, warna ungu merupakan serbukan
sel-sel radang (Primadina, et al., 2019)
Makrofag akan menggantikan peran polimorfonuklear sebagai sel
predominan. Platelet dan faktor-faktor lainnya menarik monosit dari
pembuluh darah. Ketika monosit mencapai lokasi luka, maka ia akan
dimatangkan menjadi makrofag. Peran makrofag adalah:
a. Memfagositosis bakteri dan jaringan yang rusak dengan
melepaskan protease.
b. Melepaskan growth factors dan sitokin yang kemudian menarik
sel-sel yang berperan dalam fase proliferasi ke lokasi luka.
c. Memproduksi faktor yang menginduksi dan mempercepat
angiogenesis
d. Menstimulasi sel-sel yang berperan dalam proses reepitelisasi
luka, membuat jaringan granulasi, dan menyusun matriks
ekstraseluler.
16
Fase inflamasi sangat penting dalam proses penyembuhan luka karena
berperan melawan infeksi pada awal terjadinya luka serta memulai fase
proliferasi ((Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018;
Primadina, et al., 2019).
3. Fase proliferasi
Transisi dari fase inflamasi menjadi proliferasi terjadi pada sekitar hari ke 4,
dan berlanjut hingga hari ke 14. Perubahan utama selama fase proliferasi
termasuk epitelisasi, angiogenesis, dan granulasi. Kondisi luka pada fase
proliferasi dapat dilihat pada Gambar 2.4.
Gambar 2.4 Fase proliferasi dimana jaringan granulasi mengisi kavitas

luka dan keratinosit bermigrasi untuk menutup luka
(Gutner, 2007)
Proses kegiatan seluler yang penting pada fase ini adalah memperbaiki dan
menyembuhkan luka dan ditandai dengan proliferasi sel. Tahap proliferasi ini
disebut juga fase fibroplasias karena yang menonjol adalah proses proliferasi
fibroblast (Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018;
Gutner, 2007). Terdapat tiga proses utama dalam fase proliferasi, antara lain:
17
a. Neoangiogenesis
Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru yang
terjadi secara alami di dalam tubuh, baik dalam kondisi sehat maupun
patologi (sakit). Kata angiogenesis sendiri berasal dari kata angio yang
berarti pembuluh darah dan genesis yang berarti pembentukan. Pada
proliferasi terjadi angiogenesis disebut juga sebagai neovaskularisasi,
yaitu proses pembentukan pembuluh darah baru, merupakan hal yang
penting sekali dalam langkah-langkah penyembuhan luka. Jaringan di
mana pembentukan pembuluh darah baru terjadi, biasanya terlihat
berwarna merah (eritem) karena terbentuknya kapiler-kapiler di
daerah itu. Selama angiogenesis, sel endotel memproduksi dan
mengeluarkan sitokin. Beberapa faktor pertumbuhan terlibat dalam
angiogenesis antara lain Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF),
angiopoetin, Fibroblast Growth Factor (FGF) dan TGF-β. Setelah
pembentukan jaringan cukup adekuat, migrasi dan proliferasi sel-sel
endotelial menurun, dan sel yang berlebih akan mati dalam dengan
proses apoptosis (Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et
al., 2018; Gutner, 2007). Angiogenesis meliputi urutan peristiwa
sebagai berikut :
1) Degradasi lokal lamina basal pada kapiler yang telah ada.
2) Migrasi sel-sel endotel ke tempat pertumbuhan baru.
3) Proliferasi dan diferensiasi untuk membentuk kuncup kapiler.
4) Penyusunan kembali sel-sel endotel untuk membentuk lumen.
18
5) Anastomosis kuncup-kuncup yang berdekatan untuk
membentuk jalinan pembuluh darah.
6) Pengaliran darah melalui pembuluh darah baru (Dryden, et al.,
2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018; Gutner, 2007).
b. Fibroblasias
Fibroblas memiliki peran yang sangat penting dalam fase ini.
Fibroblas memproduksi matriks ekstraselular yang akan mengisi
kavitas luka dan menyediakan landasan untuk migrasi keratinosit.
Matriks ekstraselular inilah yang menjadi komponen yang paling
nampak pada skar di kulit. Makrofag memproduksi growth factor
seperti PDGF, FGF dan TGF-β yang menginduksi fibroblas untuk
berproliferasi, migrasi, dan membentuk matriks ekstraselular. Faktor
proangiogenik yang diproduksi makrofag seperti vascular endothelial
growth factor (VEGF), fibroblas growth factor (FGF)-2, angiopoietin-1,
dan thrombospondin akan menstimulasi sel endotel membentuk
neovaskular melalui proses angiogenesis (Dryden, et al., 2013;
Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018; Gutner, 2007).
c. Re-epitelisasi
Secara simultan, sel-sel basal pada epitelium bergerak dari daerah
tepi luka menuju daerah luka dan menutupi daerah luka. Sel
keratinosit yang telah bermigrasi dan berdiferensiasi menjadi sel
epitel ini akan bermigrasi di atas matriks provisional menuju ke
tengah luka, bila sel-sel epitel ini telah bertemu di tengah luka,
migrasi sel akan berhenti dan pembentukan membran basalis dimulai
19
(Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018;
Gutner, 2007).
4. Fase Maturasi
Fase ini terjadi dari sekitar hari ke 21 hingga sekitar 1 tahun, seperti terlihat
pada Gambar 2.5. Fase maturasi bertujuan untuk memaksimalkan kekuatan dan
integritas struktural jaringan baru pengisi luka, pertumbuhan epitel dan
pembentukan jaringan parut. Segera setelah kavitas luka terisi oleh jaringan
granulasi dan proses re-epitelisasi usai, fase ini pun segera dimulai.
Gambar 2.5 Fase maturasi yang terjadi mulai hari ke-21 sampai sekitar 1
tahun (Gutner, 2007)
Pada fase ini terjadi kontraksi dari luka dan remodeling kolagen.
Kontraksi luka terjadi akibat aktivitas fibroblas yang berdiferensiasi
akibat pengaruh sitokin TGF-β menjadi myofibroblas, yakni fibroblas yang
mengandung komponen mikrofilamen aktin intraselular. Myofibroblast
akan mengekspresikan α-SMA (α-Smooth Muscle Action) yang akan
membuat luka berkontraksi. Matriks intraselular akan mengalami
maturasi dan asam hyaluronat dan fibronektin akan di degradasi. Pada
fase ini terjadi keseimbangan antara proses sintesis dan degradasi kolagen
20
serta matriks ekstraseluler. Kolagen yang berlebihan didegradasi oleh
enzim kolagenase dan kemudian diserap. Sisanya akan mengerut sesuai
tegangan yang ada. Hasil akhir dari fase ini berupa jaringan parut yang
pucat, tipis, lemas, dan mudah digerakkan dari dasarnya. Terdapat tiga
prasyarat kondisi lokal agar proses penyembuhan luka dapat berlangsung
dengan normal, yaitu:
a. semua jaringan di area luka dan sekitarnya harus vital,
b. tidak terdapat benda asing,
c. tidak disertai kontaminasi eksesif atau infeksi
Luka dikatakan sembuh jika terjadi kontinuitas lapisan kulit dan kekuatan
jaringan kulit mampu atau tidak mengganggu untuk melakukan aktivitas yang
normal (Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018;
Gutner, 2007; Primadina, et al., 2019).
2.2.3. Sel Fibroblas NIH 3T3
Sel fibroblas (L. fibra, serat: Yunani. blatos, benih: Latin)
merupakan sel yang paling umum ditemui pada jaringan ikat, dan mensintesis
beberapa komponen matriks ekstraseluler (kolagen, elastin, retikuler), beberapa
makromolekul anionik (glikosaminoglikans, proteoglikans) serta glikoprotein
multiadhesiv, laminin, dan fibronektin yang dapat mendorong perlekatan sel pada
substrat. Kultur sel fibroblas terutama cell line fibroblas banyak digunakan dalam
pengembangan teknik kultur sel. Sel fibroblas embrio mencit (NIH 3T3)
merupakan salah satu contohnya. Kultur NIH 3T3 salah satu contoh cell line
fibroblas dari embrio mencit dapat dilihat pada Gambar 2.6.
21
Gambar 2.6 Kultur NIH 3T3 salah satu contoh Cell Line Fibroblas dari Embrio
Mencit (Harlystiarini, 2010).
Fibroblas Baby Hamster Kidney (BHK-21) banyak digunakan dalam
produksi vaksin, L yaitu cell line fibroblas dari tumor jaringan ikat mencit banyak
digunakan dalam pengembangan teknik kultur sel selama tahun 1950-an, MRC-5
dan WI-38 yaitu sel fibroblas dari paru-paru embrio manusia banyak
dimanfaatkan dalam produksi vaksin untuk manusia. Selain itu, Mouse embryonic
fibroblast (MEFs) sering digunakan sebagai feeder cells pada penelitian stem sel
embrionik manusia (Harlystiarini, 2010).
Sel fibroblas akan mensekresikan sitokin dan beberapa faktor
pertumbuhan (growth factors) yang akan menstimulasi proliferasi sel dan
menghambat proses diferensiasi (Kaiin & Djuwita, 2016). Peran fibroblas dalam
membentuk dan meletakan serat-serat dalam matriks, terutama serat kolagen dapat
dilihat pada Gambar 2.7.
22
Gambar 2.7 Peran Fibroblas dalam Membentuk dan Meletakkan Serat-serat
dalam Matriks, Terutama Serat Kolagen (Kaiin & Djuwita, 2016).
2.2.4. Enzim Siklooksigenase-2
Enzim siklooksigenase (cyclooxigenase/ COX) merupakan enzim yang
mengatalisis pembentukan prostaglandin, suatu mediator inflamasi, produk
metabolisme asam arakidonat. Enzim siklooksigenase terdiri atas 2 isoenzim
yaitu, siklooksigenase-1 (COX-1) dan siklooksigenase-2 (COX-2). COX-1
memiliki 576 asam amino sementara COX-2 memiliki 581 asam amino. COX-1
memiliki tiga oligosakarida, salah satu oligosakarida berperan dalam pelipatan
protein. COX-2 memiliki empat oligosakarida, dimana satu oligosakarida
berperan dalam pelipatan protein dan oligosakarida keempat berperan dalam
degradasi protein ini.
Regulasi mRNA pada COX-1 bersifat konstitutif sedangkan pada COX-2
bersifat indusibel yang induktornya berupa sitokinin. Lokasi kedua enzim tersebut
sama-sama berada di membran inti dan sama-sama memerlukan kofaktor berupa
heme. Awal tahun 1990 ditemukan bahwa enzim siklooksigenase terdapat dalam
dua bentuk (isoform), yaitu siklooksigenase-1 (COX-1) dan siklooksigenase-2
(COX-2). Kedua isoform berbeda distribusinya pada jaringan dan juga memiliki
23
fungsi regulasi yang berbeda. COX-1 merupakan enzim konstitutif yang
mengkatalisis pembentukan prostanoid regulatoris pada berbagai jaringan,
terutama pada selaput lendir traktus gastrointestinal, ginjal, platelet dan epitel
pembuluh darah. Berbeda dengan COX-1, COX-2 tidak konstitutif tetapi dapat
diinduksi, antara lain bila ada stimuli radang, mitogenesis atau onkogenesis.
Setelah stimulasi tersebut lalu terbentuk prostanoid yang merupakan mediator
nyeri dan radang. Proses inflamasi dimulai dari stimulus yang akan
mengakibatkan kerusakan sel, sebagai reaksi terhadap kerusakan sel maka sel
tersebut akan melepaskan beberapa fosfolipid yang diantaranya adalah asam
arakidonat yang merupakan prekursor dari sejumlah besar mediator inflamasi.
Setelah asam arakidonat tersebut bebas akan diaktifkan oleh beberapa enzim,
diantaranya siklooksigenase dan lipooksigenase. Enzim siklookseigenase merubah
asam arakidonat ke dalam bentuk yang tidak stabil (hidroperoksid dan
endoperoksid) yang selanjutnya dimetabolisme menjadi leukotrin, prostaglandin,
prostasiklin, dan tromboksan. Bagian prostaglandin dan leukotrin bertanggung
jawab terhadap gejala-gejala peradangan. Struktur enzim COX dapat dilihat pada
Gambar 2.8 (Sceineider, et al., 2007; Katzung, 2002; Rouzer & Marnett, 2009).
Gambar 2.8 Struktur enzim COX. Warna merah adalah gugus heme di tempat
aktif peroksidase. Warna hijau adalah asam arakidonat yang
berikatan dengan tempat aktif oksigenase (Sceineider, et al., 2007)
24
2.2.5 Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)
Vascular endothelial growth factor (VEGF), faktor pertumbuhan
angiogenik paling kuat, menstimulasi pembentukan pembuluh darah baru. VEGF
berikatan dengan reseptor sel endothelial permukaan, hasilnya pada pertumbuhan
mereka, proliferasi dan migrasi. Efek fisiologis termasuk meningkatnya
angiogenesis, peningkatan permeabilitas pembuluh darah dan vasodilatasi
(Ferrara, 2004; Primadina. et al., 2019).
Vascular Endhothelial Growth Factor (VEGF) diproduksi oleh banyak
jenis sel, seperti sel endotel, fibroblast, platelet, netrofil, dan makrofag yang
berhubungan dengan proses penyembuhan luka. Sitokin diinduksi di dalam
keratinosit dan makrofag tepi luka, dan diregulasi oleh sel endotel pada
lokasi trauma. Peningkatan kadar VEGF selama proses penyembuhan luka
yang normal akan menstimulasi pembentukan neoangiogenesis dan secara
langsung akan meningkatkan sekresi MMP-1, TIMP dan MMP-2 dari sel
endotel dan sekresi MMP-1, MMP-2, MMP-9 dari otot halus pembuluh darah.
Bersamaan dengan proses tersebut, akan terbentuk pembuluh darah baru
diikuti dengan proses anastomosis. Penyembuhan luka normal sangat
dipengaruhi oleh pertumbuhan kapiler baru atau neoangiogenesis, karena
hal ini akan memberi nutrisi dan mediator untuk proses penyembuhan luka.
Hal ini ditandai dengan adanya pembentukan jaringan granulasi seperti
jaringan fibrovaskular yang terdiri dari fibroblast, kolagen dan pembuluh
darah (Hariani, 2017; Ferrara, 2004; Primadina, et al., 2019).
25
2.2.6 Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Penyembuhan Luka
Beberapa faktor penting yang menentukan proses penyembuhan luka
diantaranya :
1. Nutrisi
Ada banyak nutrien penting untuk penyembuhan luka, termasuk vitamin A
(terlibat dalam pertumbuhan epidermal), karbohidrat (untuk sintesis kolagen)
dan asam lemak omega-3 (memodulasi jalur asam arakidonat) (Pratsinis, et al.,
2018; Eberlein, et al., 2016; Singh, et al., 2017).
2. Hipoksia
Semua luka akan mengalami hipoksia sampai batas tertentu karena pasokan
vaskular lokal terganggu. Walaupun hipoksia diperlukan untuk memfasilitasi
re-epitelisasi pada batas tertentu, akan tetapi oksigen yang cukup merupakan
persyaratan penting untuk menyembuhkan luka (Pratsinis, et al., 2018; Singh,
et al., 2017; Eberlein, et al., 2016).
3. Merokok
Merokok merusak penyembuhan luka karena efeknya pada kemotaksis, fungsi
migrasi dan mekanisme oksidatif pada fase inflamasi. Selain itu, merokok
juga mengurangi migrasi dan proliferasi fibroblast. Selanjutnya merokok
mempengaruhi fungsi kekebalan tubuh, menurunkan sintesis dan deposisi
kolagen (Singh, et al., 2017; Pratsinis, et al., 2018).
4. Infeksi
Antibiotik profilaksis sebelum membuat sayatan bedah terbukti mengurangi
risiko infeksi luka pertama pada babi guinea yang diteliti pada tahun 1958 dan
selanjutnya pada manusia pada tahun 1960. Penutupan tertunda primer, atau
26
penutupan tertunda tersier, harus dipertimbangkan saat menjahit luka yang
sangat terkontaminasi. Hal ini terbukti mengurangi tingkat infeksi luka (Singh,
et al., 2017; Pratsinis, et al., 2018; Eberlein, et al., 2016).
5. Imunosupresi
Pasien dengan HIV, kanker dan kekurangan gizi semuanya memiliki derajat
imunosupresi yang dapat menyebabkan penyembuhan luka yang tertunda.
Selain itu, semua obat yang merusak respon inflamasi dapat menghambat
kecepatan penyembuhan (Singh, et al., 2017; Pratsinis, et al., 2018).
6. Penyakit kronis
Setiap penyakit kronis yang mempengaruhi sistem pernapasan kardio dapat
mempengaruhi pasokan oksigen dan nutrisi lainnya diperlukan untuk
penyembuhan luka (Singh, et al., 2017; Pratsinis, et al., 2018; Eberlein, et al.,
2016).
7. Manajemen luka
Lingkungan luka yang sehat merupakan prasyarat untuk proses keberhasilan
penyembuhan luka. Rekomendasi terbaru dan pendekatan modern canggih
menganjurkan lingkungan penyembuhan luka yang lembab karena
memfasilitasi penyembuhan luka (Eberlein, et al., 2016; Singh, et al., 2017).
8. Usia
Pasien usia lanjut memiliki lapisan epidermis yang lebih tipis dan mengalami
respon inflamasi, migrasi dan proliferasi yang lebih lambat. Mereka juga lebih
cenderung memiliki penyakit kronis, yang menyebabkan komplikasi sehingga
pasien-pasien ini memiliki proses penyembuhan luka yang lebih lambat dan
27
risiko komplikasi luka menjadi lebih tinggi (Eberlein, et al., 2016; Singh, et
al., 2017).
9. Genetika
Bekas luka keloid terjadi ketika ada pertumbuhan jaringan parut yang berlebih
yang melampaui ujung luka. Keloid bisa menyakitkan dan gatal dan memiliki
tingkat kekambuhan yang tinggi. Keloid paling sering terjadi pada bahu,
lengan atau dada bagian atas dan jarang di bawah pinggang. Ada komponen
genetik yang kuat untuk pengembangan keloid, secara signifikan lebih sering
pada pasien kulit hitam, Hispanik atau ras Asia (Singh, et al., 2017; Eberlein, et
al., 2016; Pratsinis, et al., 2018).
10. Teknik pembedahan
Teknik bedah jelas penting dalam mengoptimalkan penyembuhan luka.
Penanganan jaringan yang hati-hati, teknik aseptik yang ketat, penghindaran
ketegangan di seluruh luka dan pilihan jahitan. Hal-hal tersebut akan
berkontribusi untuk meminimalkan komplikasi luka (Singh, et al., 2017;
Eberlein, et al., 2016; Pratsinis, et al., 2018).
2.2.7 Penanganan Luka
Beberapa dekade terakhir ini, metode konvensional sudah tidak
digunakan lagi, walaupun masih ada rumah sakit tertentu terutama di daerah yang
jauh dari kota masih menerapkannya. Penanganan luka yang lama diganti dengan
penanganan luka terbaru yang memiliki tujuan salah satunya yaitu menciptakan
lingkungan luka yang lembab untuk mempercepat proses penyembuhan luka
(moist wound healing). Lingkungan luka yang kering menghalangi sel epitel yang
migrasi di permukaan luka, sedangkan dengan lingkungan lembab sel-sel epitel
28
lebih cepat migrasinya untuk membentuk proses epitelisasi (Dryden, et al., 2013;
Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et al., 2018; Eberlein, et al., 2016).
Moist wound healing merupakan suatu metode yang mempertahankan
lingkungan luka tetap lembab untuk memfasilitasi proses penyembuhan luka.
Lingkungan luka yang lembab dapat diciptakan dengan occlusive dressing/ semi-
occlusive dressing. Dengan perawatan luka tertutup (occlusive dressing) maka
keadaan yang lembab dapat tercapai dan hal tersebut telah diterima secara
universal sebagai standar baku untuk berbagai tipe luka (Cutting, et al., 2017;
Eberlein, et al., 2016).
2.2.8 Sediaan Farmasi untuk Pengobatan Lokal pada Luka
Proses penyembuhan luka dibutuhkan adanya suatu zat dalam obat yang
dapat mempercepat regenerasi sel serta antibiotik topikal (Adam dan Alexander,
2008). Obat-obatan yang digunakan dalam pengobatan luka dilihat Tabel 2.1.
Tabel 2.1 Sediaan Farmasi untuk Pengobatan pada untuk Luka
Nama Kandungan Indikasi Mekanisme kerja Produsen

Obat
Burnazin® Silver sulfadiazine membantu Merupakan golongan Darya
antibiotika yang bekerja
10 mg/g mencegah dan membunuh bakteri yang dapat
Varia
mengobati menginfeksi luka terbuka Laboratoria
infeksi pada
pasien dengan
luka bakar serius
Bioplacent Neomycin sulfat Perawatan luka Neomisin merupakan Kalbe
antibitika golongan
on® 0,5%, ekstrak bakar, luka aminoglikosida yang bekerja
Farma
placenta 10%, jelly disertai nanah, menghambat sintesa protein
base luka yang lambat sehingga menghambat
menutup, dan pertumbuhan bakteri.Ekstrak
plasenta bekerja memicu
luka yang pembentukan jaringan baru
disebabkan dan untuk penyembuhan luka.
karena tekanan
yang terlalu lama
Aloclair® Aqua, Luka pada mulut Kandungan dalam gel akan Alliance
polyvinylpyrrolidone membentuk suatu film
plus gel (PVP), maltodextrin,
karena pelindung yang akan menutupi
Pharma Srl
propilen glikol, PEG-40, penggunaan ujung persyarafan dari luka
hydrogenated castor oil, kawat gigi dan sehingga akan terhindar dari
xantan gum, potassium gigi palsu, iritasi dan rasa nyeri.
sorbate, sodium benzoat, Kandungan asam hialuronat
sodium hyaluronate,
sariawan. dan aloe vera membantu
29
aroma, benzalkonium terbentuknya jaringan baru
chloride, disodium sehingga membantu proses
EDTA, sodium penyembuhan luka
saccharin, dipotassium
glycyrrhizae, aloe vera
Cerplast® Aluminium silikat Luka akut , luka Menyerap kelebiham eksudat Gracia
di permukaan luka dengan
kronis daya hisap kapilernya.
Pharmindo
Centabio® Neomisin sulfat 5 Luka bakar, Neomisin merupakan Sanbe
antibitika golongan
mg/g, Ekstrak tukak kronik, aminoglikosida yang bekerja
plasenta 100 mcg luka-luka yang menghambat sintesa protein
sulit sembuh, sehingga menghambat
eksim pertumbuhan bakteri.Ekstrak
plasenta bekerja memicu
pembentukan jaringan baru
dan untuk penyembuhan luka.
Cetricillin® Setrimida 0,5% Antiseptik untuk Antiseptik topikal yang efektif Erlimpex
melawan bakteri dan fungi
luka ringan, luka
bakar ringan
Sumber: (IAI, 2017)
2.2.9 Obat Tradisional untuk Penyembuhan Luka
Salah satu tanaman yang paling umum digunakan untuk pengobatan luka
adalah lidah buaya. Lidah buaya adalah tanaman seperti kaktus yang mudah
tumbuh dalam kondisi panas dan kering. Gel lidah buaya diperoleh dari bagian
mucilaginous dari tengah daun. Gel ini telah digunakan selama berabad-abad
dalam berbagai produk perawatan kulit dan luka komersial (Yang, et al., 2017;
Sukur, et al., 2011; Topman, et al., 2013; Dorai, 2012).
Bahan alami lain yang sering dipakai adalah madu. Madu adalah
kombinasi berbagai gula yang menghasilkan larutan manis yang sangat kental
yang diperoleh dari nektar bunga atau sekresi tumbuhan lainnya. Lebah madu
(Apis mellifera) berperan dalam campuran gula tersebut di samping berbagai
enzim lain yang berasal dari lebah. Madu telah digunakan untuk mengobati luka,
luka bakar, katarak, ulkus kulit dan diare. Berbagai laporan mendokumentasikan
penggunaan madu dalam luka bakar dan telah mengkonfirmasi keuntungan
menggunakan obat alami ini untuk luka. Namun, dengan munculnya antibiotik
dan prosedur bedah lainnya, obat-obatan barat menggantikan penggunaan madu.
30
Karena meluasnya penggunaan antibiotik, resistensi terhadap berbagai antibiotik
telah berkembang dan banyak terjadi mikro-organisme multi-resistan (Dorai,
2012; Yang, et al., 2017; Sukur, et al., 2011; Topman, et al., 2013).
VCO mengandung senyawa aktif seperti polifenol, tokoferol, sterol, dan
squalen. Senyawa aktif tersebut bersifat anti bakteri dan anti oksidan. VCO juga
mengandung asam laurat yang berfungsi sebagai anti mikroba, anti virus, anti
fungi, dan anti bakteri. MCT dapat berfungsi dalam penyembuhan luka karena
MCT dapat membentuk suatu lapisan kimia yang dapat melindungi luka dari
debu, udara, dan mikroba. MCFA memiliki sifat anti mikroba karena memiliki
ikatan yang tidak terkoordinasi. Hidrolisis parsial minyak kelapa artinya hanya
dua gugus yang dihirolisis maka akan dihasilkan campuran asam lemak bebas,
dan monogliserida yang akan didominasi oleh asam laurat dan 2-monogliserida.
Kombinasi dari kedua komponen ini bersifat sinergistik sebagai anti bakteri dan
anti virus sehingga dapat menyembuhkan infeksi luka khususnya luka bakar
(Abujazia, et al., 2012; Ariffin, and Hasyam, 2016; Hanczakowska, 2017; Silalahi,
et al., 2016). Beberapa penelitian tentang aktivitas penyembuhan luka dari VCO
dan fucoidan dapat dilihat pada Tabel 2.2.
Tabel 2.2 Aktivitas Penyembuhan Luka VCO dan Fucoidan

Bahan Metode Parameter Hasil Sumber
Uji
VCO In Vivo Persentase Persentase sel hidup Ibrahim,
dan In penyembuhan meningkat 15 %, migrasi et al.
Vitro luka, aktivitas sel meningkat 17%, (2017)
proliferasi sel, angiogenesis meningkat
aktivitas migrasi 14%, penyembuhan luka
sel, aktivitas lebih cepat 14%
angiogenesis
VCO In Vivo Waktu Penyembuhan luka lebih Silalahi
penyembuhan cepat 6 hari dari kontrol &
luka positif Surbakti
(2015)
31
Fucoidan In Vitro Aktivitas Persentase sel hidup O’Leary,
proliferasi meningkat 15 % et al.
(2004)
Fucoidan In Vivo Persentase Persentase penyembuhan Jun-
penyembuhan luka > 4 % dibandingkan Hyeong
luka, ekspresi kontrol positif . Ekspresi Park,
faktor TGF- β1, VEGFR dan dkk
pertumbuhan MMP 9 masih ada sampai (2017)
(TGF- β1, hari ke-7, pada kontrol
VEGFR dan tidak ada lagi pada hari ke-
MMP 9). 4.
2.2.10 Aktivitas Anti Bakteri dari Minyak Kelapa Murni dan Fucoidan
Insidensi kejadian infeksi pada luka tercatat sebesar 5 – 10 %. Apabila
luka terpapar oleh >105 mikroorganisme, maka kemungkinan besar akan terjadi
infeksi pada luka tersebut. Organisme yang sering menginfeksi luka berdasarkan
frekuensinya dari yang paling sering adalah Staphylococcus sp., Streptococus sp.,
dan Escherichia coli. Sekitar 75% kejadian infeksi pada luka merupakan infeksi
superfisial. Sebagian besar pasien dengan sistem pertahanan tubuh yang normal
akan menunjukkan manifestasi lokal berupa rubor, kalor dan dolor, ditambah
terjadinya manifestasi sistemik seperti peningkatan suhu tubuh, peningkatan
jumlah lekosit, takikardia, dan takipnea. Infeksi pada luka tetap menjadi masalah
utama, karena infeksi akan memperlambat penyembuhan luka dan juga
memperlama waktu perawatan di rumah sakit, sehingga pada akhirnya akan
menyebabkan meningkatnya biaya perawatan (Eberlein, et al., 2016; Susanto, et
al., 2015; Margata, et al., 2019).
Komponen kimia asam lemak yang terkandung dalamVCO adalah asam
lemak jenuh rantai sedang dan pendek, asam lemak jenuh rantai sedang dan
pendek mudah dicerna dan diserap tubuh. Adapun senyawa asam lemak jenuhnya
32
adalah asam laurat (41-52 %), asam lemak miristat (13-19%), asam lemak
palmitat (7,5-10,5%), asam lemak kaprilat (5-10 %), asam lemak kaprat (4-5,8%),
asam lemak stearat (1-3%). Di dalam istilah kesehatan, asam lemak jenuh tersebut
lebih dikenal dengan nama Medium Chain Fatty Acid (MCFA). Sementara asam
lemak tak jenuh terdiri dari asam oleat (omega9) (5-8%), asam linoleat (omega 6)
(1,5-2,5%), dan asam palmitoleat (1,3%). Sedangkan komposisi kimia minyak
kelapa murni diantaranya ± 66% minyak, protein 6-7% dari berat keringnya, air
48%, serat kasar 5%, kadar abu ±2%. Selain asam lemak, beberapa komponen
kimia lain yang telah diketahui terkandung dalam virgin coconut oil adalah sterol,
vitamin E dan fraksi polifenol (asam fenolat). Komponen kimia tersebut telah
dilaporkan mempunyai aktifitas antioksidan pada berbagai bahan tanaman, produk
makanan dan pada sistem biologis (Daydrit, 2014; Silalahi, et al., 2016; Susanto,
et al., 2015; Pulung, et al., 2016; Silalahi, et al., 2014).
Hasil penelitian Pulung, et al. (2016) menunjukkan bahwa VCO
fermentasi (VCOF) dan VCO pemanasan (VCOP) dapat menghambat
pertumbuhan bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus. VCO
pemanasan (VCOP) dapat menghambat pertumbuhan bakteri Eschericia coli
dibandingkan VCO fermentasi (VCOF), sedangkan VCO fermentasi (VCOF)
lebih kuat dalam menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococcus aureus.
Penelitian Susanto, et al. (2015) membuktikan bahwa pemberian terapi VCO
topikal menunjukkan efek antibakteri yang bermakna terhadap luka yang
terinfeksi bakteri Methicillin Resistant Staphylococus aureus (MRSA) (Pulung, et
al., 2016; Susanto, et al., 2015).
33
Pengujian aktivitas anti bakteri dari HVCO yang dibandingkan dengan
VCO pada bakteri Propionibacterium acne, Bacillus subtilis, Staphylococcus
epidermidis dan METHICILLIN-RESISTANT Staphylococcus aureus dilakukan
oleh Margata, et al. (2019). Hasilnya menunjukkan adanya perbedaan yang
signifikan antara HVCO dengan VCO, dimana aktivitas anti bakteri HVCO lebih
baik dari pada VCO. Penelitian aktivitas anti bakteri oleh Silalahi, et al. (2014)
yang membandingkan aktivitas anti bakteri antara HVCO yang dihidrolisis
dengan NAOH dan HVCO yang dihidrolisis dengan enzim lipozim. Uji dilakukan
pada bakteri Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermis dan Propionibacterium acnes. Hasil pengujian menunjukkan bahwa
aktivitas anti bakteri dari HVCO hasil hidrolisis dengan enzim lebih baik
dibandingkan dengan HVCO hasil hidrolisis dengan NaOH. Penelitian aktivitas
anti bakteri dari HVCO yang dikombinasi dengan kitosan yang dilakukan oleh
Silalahi, et al. (2016) dilakukan terhadap bakteri Bacillus cereus dan Eschericia
coli. Hasilnya menunjukkan aktivitas anti bakteri dari kombinasi lebih baik dari
pada pada tunggal baik HVCO maupun kitosan (Silalahi, et al., 2016; Margata, et
al., 2019; Silalahi, et al., 2014).
Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa aktivitas antimikroba dari
fucoidan terkait dengan struktur kimianya dan gugus ester sulfat. Resistensi
terhadap infeksi bakteri diperkirakan meningkat dengan pemberian fucoidan,
misalnya pada infeksi Pseudomonas, penambahan ekstrak yang kaya akan
fucoidan dari Ascophylum nodosum dapat meningkatkan angka bertahan hidup
pada organisme, dan peningkatan motilitas dari Pseudomonas. Helicobacter
pylorus, agen penyebab ulkus pada lambung, juga dapat dihambat oleh fucoidan
34
(Thangapandi, 2013; Wijesinghe & Jeon, 2012; Li, et al., 2008; Fitton, et al.,
2015). Hasil penelitian Yunhai (2016) menunjukkan adanya efek penghambatan
fucoidan yang diuji terhadap bakteri gram positif, terutama pada Staphylococcus
aureus pada pengujian secara in vitro. Berdasarkan penelitian dari Liu, et al.
(2017) diperoleh hasil adanya aktivitas antibakteri dari fucoidan yang diisolasi
dari Laminaria japonica pada bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus.
Penelitian Thangapandi (2013) menunjukkan adanya efek anti bakteri dari
fucoidan yang berasal dari Sargassum wightii pada bakteri Vibrio cholera dan
Salmonella typhi (Thangapandi, 2013; Yunhai, 2016; Liu, et al., 2017).
2.3 Minyak Kelapa Murni
Minyak kelapa murni (Virgin coconut oil= VCO) merupakan salah
satu hasil olahan dari buah kelapa (Cocos nucifera). VCO terbuat dari kelapa
parut yang segar dan kering, diproses dengan cara enzimatis maupun fermentasi.
Pada umumnya tanaman yang mengandung minyak biasanya mengandung Asam
lemak rantai panjang (long chain fatty acids = LCFAs), akan tetapi pada VCO
terdapat pengecualian, dimana VCO mengandung asam lemak rantai pendek
(short chain fatty acid = SCFAs) dan asam lemak rantai sedang (medium chain
fatty acids = MCFAs), yang kemudian digolongkan menjadi trigliserida rantai
sedang (medium chain triglicerydes = MCTs). Komposisi asam lemak dari VCO
dapat dilihat pada Tabel 2.3 (Nasir, et al., 2017; Dayrit, 2014).
Tabel 2.3 Komposisi asam lemak dari VCO
Nama umum Jumlah atom karbon Kadar (%)

Asam kaproat C6:0 0,80 – 0,95
Asam kaprilat C8:0 8,00 – 9,00
Asam kaprat C10:0 5,00 – 7,00
35
Asam laurat C12:0 47,00 – 50,00
Asam miristat C14:0 17,00 -18,50
Asam palmiat C16:0 7,50 – 9,50
Asam palmitoleat C16:1 Tidak terdeteksi
Asam stearate C18:0 2,50 – 3,50
Asam oleat C18:1 4,50 – 6,00
Asam linoleat C18:2 0,70 – 1,50
Asam linolenat C18:3 Tidak terdeteksi
(Sumber: Nasir, et al., 2017)
MCT adalah ester gliserol dari MCFA, dan MCT yang dapat dimakan
biasanya dibuat melalui fraksinasi lemak dari lemak yang dapat dimakan seperti
minyak kelapa dan coklat. MCFA (medium chain fatty acid) larut dalam air dan
merupakan elektrolit lemah yang terionisasi pada pH netral sehingga
meningkatkan kelarutannya dalam cairan biologis. Sifat-sifat ini mempengaruhi
sifat MCT yang mudah diabsorbsi, dimetabolisme, dan berguna dalam bahan-
bahan untuk produk makanan bayi dan kesehatan. MCFA dari VCO terdiri atas
campuran asam kaproat (C6), asam kaprilat (C8), asam kaprat (C10), dan asam
laurat (C12). Walaupun tersusun dari asam lemak jenuh, MCT memiliki sifat-sifat
yang unik sehingga membedakannya dengan lemak jenuh atau rantai panjang
lainnya. MCT memiliki molekul yang lebih kecil dan titik leleh yang lebih rendah
sehingga MCT berwujud cair pada temperature ruangan. Asam lemak paling
banyak dalam VCO adalah asam laurat, dimana terdapat kira-kira 45-53 % (Nasir,
et al., 2017; Dayrit, 2014; Mansor, et al., 2012).
Berbagai penyakit yang berasal dari virus dan belum ditemukan obatnya
dapat ditangkal dengan mengonsumsi VCO, seperti flu burung, HIV/AIDS,
hepatitis, dan jenis virus lainnya. Bukan itu saja, VCO dapat juga mengatasi
36
kegemukan, penyakit kulit, hingga penyakit yang tergolong kronis, misalnya
kanker prostat, jantung, darah tinggi dan diabetes. VCO menurunkan kadar
kolesterol total, trigliserida, fosfolipid, LDL (low density lipoprotein), dan VLDL
(very low density lipoprotein) dan meningkatkan HDL (high density lipoprotein).
Dalam serum dan jaringan dibanding dengan minyak kopra, VCO juga
meningkatkan enzim antioksidan dan menurunkan lipid peroksidase dan efek
antitrombotik (DebMandal & Mandal, 2011; Marina, et al., 2009; Mansor, et al.,
2012; Roopan & Elango, 2015; Nasir, et al., 2017).
Berbagai manfaat tersebut tidak ditemukan pada minyak jagung, minyak
sawit, minyak kanola, maupun minyak hewan. Dalam minyak kelapa murni
terdapat MCFA (medium chain fatty acid) dan 48- 53% asam laurat. MCFA
merupakan komponen asam lemak berantai sedang yang memiliki banyak fungsi,
antara lain mampu merangsang insulin sehingga proses metabolisme glukosa
berjalan normal. Asam laurat dan asam lemak jenuh berantai pendek, seperti asam
kaprat, kaprilat, dan miristat yang terkandung dalam VCO dapat berperan positif
dalam proses pembakaran nutrisi makanan menjadi energi. Fungsi lain dari zat ini,
antara lain sebagai anti virus, anti bakteri dan anti protozoa (Raghavendra and
Raghavarao, 2011; Sutarmi, Rozaline dan Hartin, 2005; Mansor, et al., 2012).
2.3.1 Hidrolisis minyak kelapa murni
Lemak atau trigliserida dapat dihidrolisis untuk menghasilkan gliserol dan
asam lemak, dengan menggunakan katalis asam maupun basa. Hidrolisis
minyak/ lemak oleh basa (NaOH atau KOH) biasanya disebut sebagai
saponifikasi. Ketika lemak disaponifikasi dengan basa, terbentuk sabun dan
gliserol. Reaksi bersifat reversibel, derajat hidrolisis yang tinggi diperoleh dengan
37
menggunakan air berlebih dan secara tetap menarik fase gliserol yang digantikan
dengan air. Suhu dan tekanan yang tinggi mempercepat hidrolisis. Enzim lipolitik
mempercepat hidrolisis dalam keadaan suhu normal (Talwar, et al., 2016; NIR
Board, 2013; Dayrit, 2015).
Hidrolisis minyak dan lemak dalam tubuh terjadi secara enzimatik dengan
bantuan enzim lipase yang terdapat dalam mulut (lingual lipase), lambung
(gastric lipase), dan usus halus (pancreatic lipase). Ketiga enzim tersebut akan
menghidrolisis trigliserida pada posisi s-1 dan sn-3. SCT dan MCT dapat
dihidrolisis oleh lingual dan gastric lipase sedangkan LCT tidak dihidrolisis di
mulut dan lambung, namun diemulsikan dahulu oleh asam empedu, kemudian
dihidrolisis oleh pancreatik lipase (Talwar, et al., 2016; NIR Board, 2013; Dayrit,
2015).
Aktivitas enzim lipase dalam menghidrolisis lemak bergantung pada
faktor-faktor seperti jumlah air, pH, suhu, dan waktu inkubasi. Lipase dapat
diperoleh dari berbagai organisme seperti tumbuh-tumbuhan dan hewan, namun
sumber lipase yang paling tinggi adalah pada bakteri, fungi, dan jamur. Masing-
masing enzim lipase yang berasal dari sumber yang berbeda mempunyai
spesifikasi yang berbeda dalam menghidrolisis posisi asam lemak dalam molekul
trigliserida. Hidrolisat kemudian dipisahkan dengan pelarut non polar yang terikat
dengan asam lemak bebas, ataupun disentrifuge pada kecepatan tertentu.
Hidrolisis trigliserida secara enzimatik dengan enzim lipase (triasilgliserol
asilhidrolase) akan menghasilkan 2-monogliserida dan asam lemak bebas
terutama asam laurat yang memiliki aktivitas biologis sebagai anti bakteri
38
sehingga sangat berperan dalam penyembuhan luka (Nevin and Rajamohan, 2010;
Silalahi, et al., 2015; Perbina, 2019; Silalahi, et al., 2014; Nguyen, et al., 2018).
2.4. Fucoidan
Fucoidan merupakan jenis polisakarida sulfat kompleks, terutama
ditemukan pada matriks dinding sel berbagai spesies rumput laut coklat. Struktur
kimia Fucoidan dapat dilihat pada Gambar 2.9.
Gambar 2.9 Struktur kimia fucoidan (Wijesinghe & Jeon, 2012)
Selama dasawarsa terakhir, fucoidan telah banyak sekali diteliti sehubungan
dengan aktivitas biologisnya. Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa struktur
fucoidan telah diisolasi, dan banyak aspek dari aktivitas biologis mereka telah
dijelaskan. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan dengan jelas bahwa
komposisi dan kompleksitas fucoidans dari rumput laut coklat yang berbeda dapat
bervariasi (Wijesinghe & Jeon, 2012; Li, et al., 2008).
Rumput laut merupakan sumber dari berbagai polisakarida aktif dengan
kandungan zat aktif yang memiliki aktivitas biologis yang beragam. Sulfat
polisakarida ini memungkinkannya menjadi bahan fungsional yang sangat
penting dalam berbagai aplikasi industri. Secara umum rumput laut coklat
mengandung 31-72% fukosa, 5-31% galaktosa, 3-29% xylosa. Aktivitas biologis
yang menonjol dari polisakarida sulfat diperkirakan karena adanya gugus sulfat
dengan jumlah yang bervariasi. Fucoidan terkenal memiliki beragam aktivitas
39
biologis, diantaranya imunomodulator, anti virus, anti bakteri, dan anti oksidan
(Wijesinghe & Jeon, 2012; Li, et al., 2008; Vo & Kim, 2013; Fitton, et al., 2015).
Secara komersial, fucoidan tersedia sebagai suplemen makanan untuk
kesehatan di Amerika Serikat, Inggris dan Jepang. Di Indonesia, sediaan fucoidan
digunakan untuk pengobatan tukak lambung. Produk yang tersedia di pasaran
diantaranya adalah Colidan kapsul (PT.Pharos,Tbk) mengandung fucoidan 100
mg. Produk lainnya yaitu Fucohelix 100 (PT. Kalbe Farma, Tbk) tersedia dalam
dua bentuk sediaan yaitu kapsul yang mengandung fucoidan 100 mg dan sirup
yang mengandung fucoidan 100 mg/15 ml (Wijesinghe & Jeon, 2012; Li, et al.,
2008; Park, et al., 2018).
2.5 Metode Pengujian Aktivitas Penyembuhan Luka Secara In Vitro
Uji aktivitas penyembuhan luka dapat dilakukan secara metode in vivo
dan in vitro. Metode in vivo dapat menggunakan hewan tikus atau kelinci.
Hewan tersebut dilukai, kemudian diobati, serta diukur penyembuhan luka dalam
kurun waktu tertentu. Penelitian dengan metode ini diantaranya dilakukan oleh
Silalahi dan Surbakti (2015) untuk melihat aktivitas penyembuhan luka VCO pada
luka bakar. Metode ini juga digunakan oleh Park, et al. (2011) untuk melihat
aktivitas penyembuhan luka dari fucoidan pada luka insisi, serta oleh Ibrahim, et
al. (2017) untuk melihat potensi angiogenesis dan penyembuhan luka dari VCO
hasil fermentasi. Zhang , et al. (2018) juga menggunakan metode ini dengan
menggunakan tikus jantan Sprague Dawley untuk melihat efek penyembuhan
luka dari hidrogel campuran dari kitosan, heparin dan poli γ-asam glutamat
(Silalahi & Surbakti, 2015; Park, et al., 2011; Ibrahim, et al., 2017; Zhang, et al.,
2018).
40
Metode in vitro dilakukan dengan menggunakan kultur sel. Pengujian
dengan metode ini dapat dilakukan dengan metode MTT (Microculture
Tetrazolium Tehnique) assay, Imunositokimia (ICC), scratch wound healing
assay (uji migrasi sel) dan Polymerase Chain Reaction (PCR).
a. MTT (Microculture Tetrazolium Tehnique) assay
Metode MTT (Microculture Tetrazolium Tehnique) menggunakan reagen
[3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] adalah salah satu
uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Metode ini cepat, sensitif, akurat
dan sejumlah besar sampel dapat diuji secara otomatis menggunakan
spektrofotometer. Metode ini mengukur sel yang hidup (baik yang masih
membelah ataupun tidak membelah). Uji ini berdasarkan pengukuran
intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu
substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna. Pada uji ini digunakan
garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase
(Kupcsik dan Martin, 2011; Freshney, 2000).
MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat
tetrazolium seperti terlihat pada Gambar 2.10.
Gambar 2.10 Reduksi MTT menjadi Formazan (Kupcsik & Martin,

2011)
41
Pengujian dengan metode ini dapat dilakukan untuk melihat viabilitas
sel, aktivitas proliferasi sel dan aktivitas sitotoksis bahan tertentu pada
sel. Pengujian dengan metode ini banyak digunakan pada penelitian,
diantaranya pada penelitian yang dilakukan oleh Oshima, et al. (2013)
untuk melihat efek dari Imatinib menginduksi apoptosis pada sel
fibroblast NIH3T3. Penelitian lainnya yaitu penelitian untuk melihat
potensi angiogenesis dan penyembuhan luka pada VCO hasil fermentasi
yang dilakukan oleh Ibrahim, et al. (2017). Uji aktivitas penyembuhan
luka dari fucoidan yang dilakukan oleh O’Leary, et al. (2004) juga
dilakukan dengan metode MTT. Metode ini juga digunakan oleh
Premarathna, et al. (2019) untuk penentuan viabilitas sel dengan
pemberian bahan uji ekstrak Sargassum illicifolium pada pengujian
secara in vitro (Premarathna, et al., 2019; Oshima, et al., 2013; Ibrahim,
et al., 2017; O’Leary, et al., 2018).
b. Imunositokimia
Imunositokimia (ICC) merupakan suatu metode yang digunakan untuk
mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel
dengan menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein
atau antigen. Imunositokimia melibatkan inkubasi sel dengan antibodi.
Antibodi akan berikatan dengan antigen atau protein spesifik di dalam sel.
Antibodi yang tidak berikatan dipisahkan dengan pencucian, sedangkan
antibodi yang berikatan dideteksi secara langsung dengan antibodi sekuder
42
berlabel enzim atau fluoresen (Stites, et al., 1997; Abbas and Lichtman,
2003; Oostra, 1996). Ekspresi protein tertentu (misal COX-2) akan
ditunjukkan dengan warna coklat pada sitoplasma (bukan inti sel). Warna
biru pada sitoplasma menunjukkan tidak adanya ekspresi pada sel atau level
ekspresi yang rendah sehingga tidak terdeteksi, contohnya dapat dilihat
pada Gambar 2.11 (CCRC, 2009).
(A) (B)
Gambar 2.11 Ekspresi protein COX-2 pada sel (A) Kontrol sel; (B) dengan
perlakuan (CCRC,2009)
Penelitian dengan metode ini diantaranya dilakukan oleh Oshima, et al.
(2013) untuk melihat efek Imatinib menginduksi apoptosis pada sel fibroblas
NIH3T3, dan juga oleh Harahap, et al. (2018) yang meneliti aktivitas anti
migrasi dari fraksi etil asetat buah Zantholinum acanpodium pada kultur sel
kanker payudara 4T1 (Oshima, et al., 2013; Harahap, et al., 2018).
c. Uji Migrasi sel
Migrasi sel merupakan fenomena yang kompleks yang berhubungan dengan
banyak proses selular. Pengujian migrasi sel untuk penyembuhan luka
dilakukan dengan metode scratch wound healing assay. Metode ini
dilakukan dengan membuat goresan pada sel monolayer yang digambarkan
sebagai pengganti luka, lalu dilakukan kuantifikasi lebar goresan pada jam
43
ke-0 dan pada interval waktu tertentu hingga sel bermigrasi untuk menutupi
goresan. Pengukuran ini secara langsung memungkinkan untuk mengetahui
efek suatu senyawa dengan konsentrasi yang berbeda terhadap kemampuan
interaksi sel-sel selama melakukan migrasi sel (CCRC, 2009).
Penelitian dengan metode ini dilakukan oleh Ibrahim, et al. (2017) untuk
melihat potensi angiogenesis dan penyembuhan luka dari VCO hasil
fermentasi. Penelitian lainnya adalah penelitian oleh Harahap, et al. (2018)
yang meneliti aktivitas anti migrasi dari fraksi etil asetat buah Zantholinum
acanpodium pada kultur sel kanker payudara 4T1. Penelitian lainnya
dilakukan oleh Justus, C.R, et al. (2014) yang melakukan pengujian aktivitas
migrasi dan invasi dari sel melanoma B16F10. Penelitian dengan
menggunakan metode ini juga dilakukan oleh Premarathna, et al. (2019)
yang melihat efek penyembuhan luka dari ekstrak cair Sargassum
illcifolium, dimana proses migrasi sel dapat dilihat dari Gambar 2.12
(Ibrahim, et al., 2017; Harahap, et al., 2018; Justus, C.R., 2014,
Premarathna, A.D., et al., 2019).
(A) (B) (C)

Gambar 2.12 Aktivitas migrasi sel dengan variasi masa inkubasi yaitu
(A)0 jam, (B)12 jam dan (C)24 jam (Premarathna, et al.,
2019)
d. Polimerase Chain Reaction (PCR)
44
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang
dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan
sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang
urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip
dengan proses replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif.
Penelitian dengan menggunakan metode PCR ini digunakan oleh Bando, et
al. (2017) untuk melihat perbedaan pemakaian COX-1 dan COX-2 pada
produksi prostaglandin oleh sel mast dan sel basofil menggunakan
quantitative real-time PCR. Penelitian lainnya adalah penelitian oleh
Harahap, et al. (2018) yang meneliti aktivitas anti migrasi dari fraksi etil
asetat buah Zantholinum acanpodium pada kultur sel kanker payudara 4T1
(Siebert, 2016; Bando, et al., 2017; Harahap, et al., 2018).
2.6 Kombinasi Farmakologi
Interaksi farmakodinamik berbeda dengan interaksi farmakokinetik. Pada
interaksi farmakokinetik teradi perubahan kadar obat obyek oleh karena
perubahan pada proses absorbs, distribusi, metabolism, dan ekskresi obat. Pada
interaksi farmakodinamik tidak terjadi perubahan kadar obat obyek dalam darah ,
tetapi yang terjadi adalah perubahan efek obat obyek yang disebabkan oleh obat
presipitan karena pengaruhnya pada tempat kerja obat, artinya ada perubahan
tindakan obat tanpa perubahan konsentrasi serum melalui factor – factor
farmakikinetik.
a. Efek adisi terjadi ketika dua obat atau lebih dengan efek yang sama
digabungkan dan hasilnya adalah jumlah efek secara tersendiri sesuai
45
dosis yang digunakan. Efek aditif ini mungkin bermanfaat atau berbahaya
terhadap klien.Hal ini dinyatakan dengan 1 +1= 2. Salah satu contohnya
barbiturate dan obat penenang yang diberikan secara berasamaan sebelum
bedah untuk membuat pasien rileks.
b. Efek sinergis terjadi ketika dua obat atau lebih, dengan atau tanpa efek
yang sama digunakan secara bersamaan untuk mengombinasikan efek
yang memiliki outcome yang lebih besar dari jumlah komponen aktif satu
obat Saja.
c. Potensiasi mengambarkan efek sinergistik tertentu; suatu interaksi obat
dimana hanya satu dari dua obat yang tindakannya diperbesar oleh
keberadaan obat kedua
d. Reaksi antagonis memiliki efek sinergisme yang sebaliknya dan
menghasilkan suatu efek kombinasi yang lebih rendah dari komponen
aktif secara terpisah ( protamine yang diberikan sebagai antidotum
terhadap aksi antikoagulan dari heparin).
2.7 Kerangka teori penelitian
Berdasarkan teori yang telah dipaparkan pada tinjauan pustaka, dapat
disusun kerangka teori penelitian yang menjelaskan bahwa ketika terjadi luka
maka akan terjadi keadaan hipoksia. Luka akan merangsang keluarnya platelet,
HIF, dan COX-2. Ketika terjadi luka, maka akan terjadi kerusakan membran,
sehingga membran akan menghasilkan fosfolipid. Fosfolipid dengan bantuan
fosfolipase akan berubah menjadi asam arakidonat, yang dengan bantuan enzim
COX-2 akan terjadi pembentukan prostaglandin yang berperan dalam
46
angiogenesis (Zhou, et al., 2015). Mediator-mediator inflamasi melalui proses
kemotaksis merangsang neutrofil dan makrofag untuk menghasilkan PDGF dan
TGF-β secara kemotaksis menarik fibroblas untuk berproliferasi dan bermigrasi
ke daerah luka. Fibroblas menghasilkan faktor-faktor pertumbuhan. Faktor–faktor
pertumbuhan seperti VEGFR adalah kontributor regulator positif angiogenesis.
Asam laurat dan monolaurin yang merupakan produk utama dari hasil hidrolisis
minyak kelapa murni akan mempengaruhi meningkatkan aktivitas fibroblas
berprolifersi dan bermigrasi. Asam laurat dan monolaurin juga meningkatkan
aktivitas ekspresi VEGFR dan COX-2 dalam mempengaruhi proses angiogenesis.
Proses angiogenesis, migrasi dan proliferasi fibroblas berperan penting dalam
proses penyembuhan luka.
47
Luka
Platelet HIF Fosfolipid

Kemotaksis
Fospolipas
e
Neutrofil Makrofag Asam arakidonat
COX-2
PDGF
Prostaglandin
TGF-β Kemotaksis
Fibroblas Asam Laurat,
monolaurin
GF dan fucoidan
VEGF
Angiogenesis Angiogenesis
Penyembuhan luka
Keterangan:
HIF : Hypoxia Induced Factor
COX : Cyclooxygenase
PGs : Prostaglandins
PDGF : Platelet Derived Growth Factor
TGF-β : Transforming Growth Factor Beta
MMP-9 : Matrix Metalloproteinases
GF : Growth Factor
VEGF : Vascular Endothelial Growth Factor
:Mengaktivasi, menghasilkan, mempengaruhi
Gambar 2.13 Kerangka Teori Penelitian
48
BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Jenis Penelitian
Jenis penelitian yang dilakukan adalah penelitian eksperimental yaitu
untuk mengetahui pengaruh atau hubungan variabel bebas dan variabel terikat.
Variabel bebas adalah kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni (HVCO)
dan fucoidan, sedangkan variabel terikatnya adalah aktivitas proliferasi sel,
aktivitas migrasi sel, dan ekspresi protein COX-2 dan VEGF.
3.2 Alat-alat
Alat-alat yang digunakan pada penelitian ini adalah alat-alat gelas
laboratorium, autoclave (Hirayama HV-25 020585175, Hirayama Manufacturing
Co., Jepang), Labconco purifier class II biosafety cabinet (Delta Series,
Labconco Corporation, Missouri, USA), inkubator CO2 (Heraeus), mikroskop
inverted (Olympus seri CKX41), tissue culture flask/dish diameter 10 cm (Iwaki),
96-well plate (Iwaki), 24-well plate (Iwaki), neraca analitik (Sartorius),
mikropipet (Pipetman R neo Gilson, France), mikroskop cahaya (Nikon YS 100,
Japan), yellow tip (Brand), blue tip (Brand), konikal 15 ml steril (Falcon), tissue,
alat-alat gelas, coverslip diameter 13 mm (Thermanox), slide, haemocytometer
(Nebauer improved 0,100 mm Tiefe Depth Profondeur 0,0025 mm2 , Germany) ,
cell counter, Microplate reader (Bio-Rad microplate reader Benchmark serial
no.11565, Jepang), shaker (MRK- RETAC), vortex (Maxi Mix II, Thermolyne
type 37600 mixer, Iowa, USA) , eppendorf steril (Plasti Brand), kamera digital
(Canon IXY Digital 25 IS 10,0 mega pixels, Japan). Gambar beberapa alat yang
digunakan dapat dilihat pada Lampiran 2 Halaman 92.
49
3.3 Bahan-bahan
Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah minyak kelapa
murni (Palem Mustika Produksi PT. Siti Nurbaya Indonesia), fucoidan (PT. Kalbe
Farma Tbk), Aloclair® Plus Gel (PT. Kalbe Farma Tbk) sebagai kontrol positif,
enzim lipase Rhizomucor miehei 20.000U/g (Sigma), buffer Tris (Vivantis),
NaOH, HCl pekat, aquades, n-heksan p.a, kalsium klorida dan natrium sulfat
anhidrat. Media Dulbecco’s Modified Eagle medium (DMEM), Fetal Bovine
Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penicillin–streptomisin 2% (v/v) (Gibco), dan
Fungizon (amfoterisin B) 0,5%. Selain bahan-bahan diatas juga digunakan 0,25 %
tripsin-EDTA (Gibco), Phospate Buffer Saline (PBS), MTT (3-(4,5- dimetiltiazol-
2-il)-2,5 difeniltetrazolium bromide) (Sigma), dengan konsentrasi 5 mg/ml,
natrium dodesil sulfat (SDS) dalam HCl 0,1 N, beta mercapthoethanol, etanol
70%, primer VEGFR-2, primer COX-2, dan TBE (Vivantis). Gambar beberapa
bahan yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3 Halaman 93.
3.4 Sel Uji
Sel uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah Sel NIH3T3 yang
disediakan di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM. Gambar sel
NIH 3T3 yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 5 Halaman 95.
3.5 Prosedur Penelitian
3.5.1 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat- alat yang digunakan, disterilkan terlebih dahulu sebelum dipakai.
Alat-alat gelas dan plastik yang akan digunakan disterilkan di dalam autoklaf pada
suhu 1210C selama 15 menit (Lay, 1994).
50
3.5.2 Pembuatan Pereaksi
1. Larutan kalsium klorida 0,063 M
Sebanyak 0,3496 g kalsium klorida dilarutkan dalam air suling sampai 50
mL (Depkes, 1995).
2. Larutan buffer tris HCl 1 M pH 8
Sebanyak 15,764 g tris HCl dilarutkan dalam air suling sampai 100 mL
kemudian diatur pH 8 dengan natrium hidroksida (Depkes, 1995).
3. Larutan natrium hidroksida 0,5 N
Sebanyak 8 g natrium hidroksida dilarutkan dalam air suling bebas
karbon dioksida sampai 400 mL (Depkes, 1995).
4. Pembakuan larutan natrium hidroksida
Sebanyak 200 mg kalium biftalat dilarutkan dalam 25 mL air suling bebas
karbon dioksida, ditambahkan 2 tetes indikator fenolftalein dan diaduk sampai
homogen. Kemudian dititrasi dengan larutan natrium hidroksida hingga terjadi
warna merah muda mantap (Depkes, 1995).
3.5.3 Hidrolisis Enzimatis minyak kelapa murni
Sebanyak 30 g minyak dimasukkan ke dalam sebuah erlenmeyer 250 ml
ditambahkan 30 ml akuades, 12,5 ml CaCl2 0,063 M, 25 ml larutan buffer Tris-
HCl 1 M pH 8, dan 3 ml enzim lipase Rhizomucor miehei. Campuran diinkubasi
pada suhu 500C selama 10 jam dan selama inkubasi setiap 1 jam diaduk dengan
pengaduk magnet dengan kecepatan 200 rpm selama 10 menit. Setelah waktu
hidrolisis tercapai campuran dipindahkan ke corong pisah, ditambahkan 50 ml n-
heksan, diekstraksi dan didiamkan beberapa saat hingga terbentuk dua lapisan.
Lapisan atas (fraksi n-heksan) dipisahkan sebagai filtrat I. Lapisan bawah (fraksi
51
air) dikocok kembali dengan 50 ml n-heksan, setelah didiamkan beberapa saat
diambil lapisan atas (filtrat II). Filtrat I dan II digabung kemudian ditambahkan
250 mg Na2SO4 anhidrat untuk menjerap sisa air yang tertinggal, dibiarkan selama
15 menit dan disaring. Selanjutnya diuapkan diatas penangas air dalam cawan
penguap untuk menghilangkan n-heksan. Minyak hasil hidrolisis enzimatis yang
diperoleh kemudian digunakan untuk uji aktivitas penyembuhan luka. Bagan alir
penelitian dapat dilihat pada Lampiran 7 Halaman 97 (Loung, et al., 2014;
Silalahi, et al., 2016).
3.5.4 Penentuan Bilangan Asam
Hasil hidrolisis enzimatis VCO ditimbang 5 gram ke dalam erlenmeyer
250 ml, ditambahkan 25 ml alkohol 95% netral, kemudian dipanaskan selama 10
menit di atas penangas air sambil diaduk. Kemudian ditambahkan 3-5 tetes
indikator fenolftalein, lalu dititrasi dengan NaOH 0,5 N sampai tepat terlihat
warna merah jambu tetap (tidak berubah selama 15 detik). Setelah itu dihitung
nilai bilangan asam atau kadar asam lemak bebas dalam hasil hidrolisis enzimatis
VCO. Penetapan bilangan asam dilakukan pengulangan sebanyak 3 (tiga) kali
(Ketaren, 2005; Badan Standarisasi Nasional, 2008).
Berikut ini rumus yang digunakan dalam penentuan bilangan asam:
Keterangan:
A = Volume NaOH untuk titrasi (ml)
N = Normalitas larutan NaOH
G = Berat minyak (gram)
BM NaOH = 40
52
Bilangan asam yang diperoleh dalam mg NAOH/ g minyak kemudian dikonversi
menjadi mg KOH/ g minyak dengan rumus :
Bilangan asam KOH = Bilangan Asam NaOH x BM KOH

BM NaOH
BM KOH = 56
3.5.5 Pembuatan Media
1. Pembuatan media DMEM
Komposisi:DMEM sachet, spesifikasi: GIBCO Lot No. 921956, dengan
L-glutamine tanpa NaHCO3, netto 10,4 gram
Hepes 2 gram
NaHCO3 2 gram
HCl 1N secukupnya
NaOH 1N secukupnya
Aquabides steril ad 1liter
Cara Pembuatan:
Sebanyak 1 sachet DMEM, 2 gram Hepes NaHCO3 dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer, tambahkan 800 ml aquabides steril, homogenkan dengan
menggunakan stirrer magnet, kemudian pH diukur dengan pH meter (pH yang
diinginkan adalah (7,2 -7,4); karena terlalu basa maka digunakan HCl 1N untuk
menyesuaikan pH. Kemudian ditambahkan aquabides steril sampai 1L, lakukan
sterilisai dengan filter vakum didalam LAF (Laminar Air Flow), dipasang filter
apparatus steril pada botol duran 1 L steril, lakukan proses penyaringan dengan
filter, aliquot media ditampung dalam botol duran 500 ml, diberi identitas pada
botol media (nama media, tanggal pembuatan, expire date dan nama pembuat),
53
dan disimpan pada suhu 2-80C. Bagan alir pembuatan media dapat dilihat pada
Lampiran 8 Halaman 100 (CCRC, 2009).
2. Pembuatan Media Kultur Lengkap (MK)
Komposisi: Fetal Bovine Serum (FBS) 10%
Penisilin-streptomisin 2%
Fungizone (Amphothericin B) 0,5%
DMEM ad 100 mL
Cara Pembuatan:
Campur semua bahan diatas, dan dilakukan di dalam LAF (Laminar Air
Flow), beri identitas pada botol MK (nam media, tanggal pembuatan, expire date,
dan nama pembuat), simpan pada suhu 2-80C. Bagan alir pembuatan media kultur
lengkap (MK) dapat dilihat pada Lampiran 9 Halaman 101 (CCRC, 2009).
3.5.6 Penumbuhan Sel NIH-3T3
Persiapan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 ml
media DMEM pada tabung konikel 15 mL, ambil ampul dari freezer -800C atau
tangki nitrogen dan cairkan pada suhu kamar, ambil suspensi sel dalam ampul,
masukkan tetes demi tetes kedalam media DMEM, sentrifuge pada 600 rpm
selama 5 menit, buang supernatan dan tambahkan 4 ml MK DMEM. Transfer
masing-masing 2 ml ke dalam flask kultur baru. Tambahkan 5 ml MK ke dalam
masing-masing flask kultur dan dihomogenkan. Amati kondisi sel dengan
menggunakan inverted microscope. Pastikan sel homogen pada seluruh
perrmukaan flask kultur (tidak menggerombol pada bagian tertentu). Beri identitas
pada flask kultur, kemudian simpan dalam inkubator CO2. Bagan alir
penumbuhan sel dapat dilihat pada Lampiran 10 Halaman 102 (CCRC, 2009).
54
1. Subkultur sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, lakukan
pengerjaan pada LAF. Lakukan proses panen sel dengan cara mengambil 500 µL
panenan sel dan masukkan ke dalam flask kultur. Tambahkan 6 ml MK-DMEM,
homogenan. Inkubasi sel pada inkubator CO2. Amati kondisi sel pada keesokan
harinya. Bagan alir subkultur sel dapat dilihat pada Lampiran 11 Halaman 103
(CCRC, 2009).
2. Panen sel
Persiapkan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, amati kondisi
sel. Panen dilakukan apabila sel telah dalam kondisi 80% konfluen, semua
pekerjaan dilakukan pada ruangan dengan LAF. Buang MK-DMEM dari flask
dengan mikropipet atau pipet Pasteur, cuci sel 2 kali dengan 5 ml PBS
(Phosphate Buffer Saline), tambahkan 300 -500 µL tripsin-EDTA 0,25% secara
merata, kemudian diinkubasi di dalam inkubator CO2 selama ± 5 menit dan
ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan tripsin. Resuspensi sel dengan
mikropipet agar sel terlepas satu-satu (tidak menggerombol). Amati keadaan sel di
inverted microscope. Resuspensi sel kembali jika masih ada sel yang
menggerombol. Transfer sel ke dalam tabung konikel. Bagan alir panen sel dapat
dilihat pada Lampiran 12 Halaman 104 (CCRC, 2009).
55
3. Perhitungan Sel
Persiapan alat dan kondisikan bahan pada suhu ruangan, ambil 10 µL
panenan sel dari konikel dan pipetkan ke dalam hemositometer. Hitung jumlah sel
di bawah mikroskop dengan menggunakan counter. Hemositometer terdiri dari 4
kamar hitung (A, B, C, dan D), setiap kamar hitung terdiri dari 16 kotak, seperti
terlihat pada Gambar 3.1.
Gambar 3.1 Hemositometer (kamar hitung)
Hitung sel pada 4 kamar hemositometer, sel yang gelap (mati) dan sel
yang berada dibatas luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung. Sel di batas
kanan dan bawah ikut dihitung. Hitung jumlah sel per ml dengan rumus:
Hitung jumlah total sel yang diperlukan. Misalnya untuk menanam sel
pada tiap sumuran 96-well plate, maka jumlah total sel yang diperlukan adalah
1x104/ sumuran x 100 sumuran (dibuat lebih) = 1x 106 sel
56
Hitung volume panenan sel yang diperlukan (dalam ml) dengan rumus:
104
Ambil volume panenan sel, transfer ke tabung konikel baru kemudian tambahkan
MK sampai total volume yang diperlukan. Bagan alir perhitungan sel dapat
dilihat pada Lampiran 13 Halaman 105 (CCRC, 2009).
3.5.7 Pembuatan larutan uji
Bahan uji ditimbang sebanyak 50 mg dalam politube, kemudian
dilarutkan dalam dimetilsulfoksida (DMSO) sebanyak 1000 µL, divortex agar
sampel terlarut sempurna. Selanjutnya dilakukan pengenceran sampai diperoleh
larutan uji dengan konsentrasi 500 µg/ml; 250 µg/ml; 125 µg/ml; 62,5 µg/ml, dan
31,25 µg/ml dan 15,625 µg/ml; semua pengenceran dilakukan dengan
menggunakan MK-DMEM. Prosedur pembuatan larutan uji ini digunakan untuk
pembuatan larutan uji masing-masing untuk HVCO maupun Fucoidan. Bagan alir
pembuatan larutan uji dapat dilihat pada Lampiran 14 Halaman 106 (CCRC,
2009).
3.5.8 Pembuatan larutan uji kombinasi
Berdasarkan konsentrasi terbaik yang telah ditentukan, dibuat larutan uji
dengan konsentrasi dua kali lipat dari konsentrasi terbaik yang telah ditentukan
untuk masing masing HVCO maupun Fucoidan.
a. Larutan uji kombinasi 50:50
Dipipet 250 µL larutan bahan uji HVCO lalu ditambahkan dengan 250 µL larutan
bahan uji Fucoidan.
b. Larutan uji kombinasi 25:75
57
bahan uji Fucoidan.
c. Larutan uji kombinasi 75:25
bahan uji Fucoidan.
3.5.9 Pengujian Aktivitas Proliferasi Sel NIH 3T3 Menggunakan Metode

MTT (Microculture Tetrazolium Tehnique)
Prosedur ini menggunakan metode yang mengacu pada protokol pada
Cancer Chemoprevention Research Center (CCRC, 2009) dan penelitian oleh
Harahap, et al. (2018), dan disesuaikan dengan penelitian yang dilakukan (CCRC,
2009; Harahap, et al., 2018).
Sel NIH 3T3 ditanam pada microplate 96 sumuran sehingga
diperoleh kepadatan 1 x 104 sel/sumuran dan diinkubasi dalam inkubator
CO2 selama 24 jam untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik. Setelah itu
medium diganti dengan larutan uji yang telah diencerkan dengan MK DMEM
dengan berbagai variasi konsentrasi, lalu diinkubasi kembali dalam
inkubator CO2 selama 24 jam. Pada masing-masing sumuran, ditambahkan
100 µL MTT 10 % dalam media MK DMEM (Sigma) . Sel diinkubasi kembali
selama 4-6 jam dalam inkubator CO2 5%, 370C. Reaksi MTT dihentikan
dengan reagen stopper (SDS 10% dalam HCl 0,01 N), plate dibungkus
dibiarkan selama satu malam. Serapan dibaca dengan microplate reader
(Biorad) pada panjang gelombang 595 nm. Pengujian dilakukan dengan
pengulangan tiga kali untuk masing-masing sampel. Persen sel hidup
dihitung menggunakan rumus:
58
Konsentrasi dari masing-masing bahan uji dengan persentase proliferasi yang
paling tinggi dianggap sebagai konsentrasi terbaik dan akan digunakan sebagai
konsentrasi pada pengujian migrasi sel untuk penentuan kombinasi terbaik. Bagan
alir prosedur pengujian aktivitas proliferasi sel dapat dilihat pada Lampiran 15
Halaman 107.
3.5.10 Pengujian Migrasi Sel NIH 3T3 Menggunakan Strach Wound Healing
Assay
Untuk penentuan konsentrasi kombinasi dengan aktivitas terbaik,
dibuat seri konsentrasi HVCO dan fucoidan sebanyak 3 seri dengan perbandingan
antara HVCO : Fucoidan dengan perbandingan 50:50; 75:25; 25:75 persen dari
nilai konsentrasi terbaik masing-masing bahan uji. Sel ditanam pada microplate
24 well sejumlah 5 x 104 sel/mL diinkubasi selama 24 jam dalam media kultur
lengkap. Setelah inkubasi 24 jam, microplate diambil dari inkubator, lalu media
dibuang dan sumuran dicuci dengan PBS masing-masing 500 µl. PBS dibuang,
lalu ditambahkan FBS masing-masing 500 µl untuk setiap sumuran, kemudian
diinkubasi kembali selama 24 jam dalam inkubator CO2. Setelah inkubasi
kembali 24 jam, goresan dibuat pada permukaan dasar sumuran dengan
menggunakan ujung yellow tip, lalu FBS di buang. Kemudian dilakukan
pengambilan gambar dari tiap kelompok dengan menggunakan inverted
microscope. Sel kemudian diberikan larutan uji, lalu dilakukan pengambilan
gambar dengan menggunakan inverted microscope pada jam ke 0, 24, 48, dan 72
jam setelah perlakuan. Citra mikroskopis dipindahkan dalam format JPEG. Pixel
59
jarak goresan awal dengan pixel area yang kosong diukur dengan menggunakan
software ImageJ. Persentase penyembuhan luka dihitung dengan rumus:
(CCRC, 2009).
Bagan alir prosedur pengujian aktivitas migrasi sel dapat dilihat pada Lampiran
16 Halaman 108.
3.5.11 Pengujian Ekspresi Protein COX-2 dan VEGF Sel NIH 3T3
Menggunakan Metode Immunositokimia (ICC)
Pemeriksaan ekspresi protein COX-2 dan VEGF dilakukan pada
kombinasi terbaik dilakukan dengan menggunakan metode Immunositokimia.
Kultur sel NIH 3T3 sebanyak 5x104 sel/ sumuran ditransfer ke dalam 24-well
plate yang telah diisi dengan cover slip, kemudian sel diinkubasi semalam pada
suhu 37oC dalam inkubator CO2 5%. Setelah sel pulih kembali, diberi perlakuan
dengan pemberian bahan uji dan diinkubasi kembali selama satu malam. Pada
akhir waktu inkubasi, sel dicuci PBS kemudian ditambahkan metanol dingin dan
diinkubasi di dalam suhu ruang selama 10 menit. Sel yang telah difiksasi
kemudian dicuci dengan aquades 2 kali kemudian diinkubasi dalam larutan
hidrogen peroksidase selama 10 menit. Selanjutnya, sel ditetesi dengan prediluted
blocking serum dan diinkubasi 10 menit. Kemudian ditetesi dengan Antibodi
Monoklonal primer untuk masing-masing COX-2 dan VEGF (pengenceran 1:50),
diinkubasi selama 10 menit, dan dicuci dalam PBS sebanyak 3 kali. Preparat
diinkubasi dalam biotin selama 10 menit dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali
selama 5 menit. Setelah dicuci dengan PBS, sel ditetesi dengan antibodi sekunder
60
(biotinylated universal secondary antibody ) dan diinkuba si kembali selama 10
menit. Kemudian preparat diinkubasi dalam streptavidin-peroksidase selama 10
menit dan dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali selama 5 menit. Selanjutnya,
preparat dicuci kembali dengan PBS lalu diinkubasi dalam DAB selama 10 menit
dan dicuci dengan aquades. Preparat kemudian direndam dalam larutan Mayer-
Haematoxylin selama 3-4 menit untuk counterstain dan dicuci dengan aquades.
Cover slip kemudian diangkat dan dicelupkan ke dalam xylol, kemudian
dicelupkan ke dalam alkohol. Setelah kering, cover slip diletakkan di atas kaca
obyek dan ditetesi dengan lem (mounting media). Cover slip ditutup dengan
slide kemudian dilakukan pengamatan dengan mikroskop cahaya. Pengamatan
dilakukan dengan mikroskop yang dilengkapi dengan optiLab, masing-masing
sediaan diamati pada lima lapang pandang dengan sebaran merata. Hasil
dokumentasi kemudian dilakukan analisa data dengan menggunakan Software
Optilab Viewer Image Raster untuk melihat jumlah sel yang mengekspresikan
protein tersebut (CCRC, 2009). Persentase ekspresi protein dihitung dengan
rumus:
(Nurani, L.H., 2011).
Bagan alir prosedur pengujian ekspresi protein dapat dilihat pada Lampiran 17
Halaman 109.
3.6 Analisis Data
Data yang diperoleh pada penelitian ini dinyatakan dengan rata-rata ±
standar deviasi dari tiga kali replikasi pengujian. Data hasil penelitian dianalisis
61
dengan menggunakan program SPSS versi 22 menggunakan uji one way anova-
post-hoc tukey.
3.7 Jadwal Penelitian
Hidrolisis minyak kelapa murni dilakukan di Laboratorium Farmakognosi
Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara, pada bulan Januari 2019. Pengujian
secara in vitro meliputi aktivitas proliferasi sel, aktivitas migrasi sel, dan
pemeriksaan ekspresi protein COX-2 dan VEGF dilakukan di Laboratorium
Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada pada bulan Maret
sampai April 2019.
Defenisi operasional dari variabel variabel penelitian dapat dilihat pada
Tabel 3.1.
Tabel 3.1 Defenisi operasional variabel penelitian

No Variabel Defenisi Alat ukur Hasil Skala
Ukur ukur
1 Hasil Hasil hidrolisis Timbangan Gram Numerik
hidrolisis minyak kelapa murni
minyak yang digunakan
kelapa merupakan minyak
murni kelapa murni yang
dihidrolisis secara
enzimatis dengan
enzim Rhizomucor
miehei
2 Fucoidan Fucoidan yang Timbangan Gram Numerik
digunakan diperoleh
dari PT. Kalbe, Tbk
3 Uji In Pengujian secara in
Vitro vitro pada penelitian
ini dilakukan dengan
menggunakan kultur
sel fibroblas NIH 3T3.
4 Sel Sel punca fibroblas

Fibroblas yang berasal dari cell
NIH 3T3 lines 3T3
62
Tabel 3.1 (Sambungan)
Penelitian Ukur ukur
5 Aktivitas Aktivitas proliferasi ELISA Persen sel Numerik
proliferasi sel menggambarkan microplate hidup
sel kemampuan sel reader
untuk tumbuh dan
berkembang, yani
aktivitas pembelahan
sel. Kemampuan
proliferasi sel
fibroblast NIH 3T3
diukur
menggunakan
metode pengujian
dengan Metode
MTT. Aktivitas
proliferasi sel diukur
dengan ELISA
reader pada 24, 48
dan 72 jam setelah
pemberian bahan uji
pada sel NIH 3T3.
6 stratch Pengujian migrasi Software Persen Numerik
wound sel untuk Image J penutupan
healing penyembuhan luka luka
assay (Uji dilakukan dengan
Migrasi metode stratch
sel) wound healing
assay. Metode ini
dilakukan dengan
membuat goresan
pada sel monolayer
NIH 3T3 dengan
ujung yellow tip
steril, lalu dilakukan
kuantifikasi lebar
goresan pada jam ke-
0 dan pada interval
waktu tertentu
hingga sel
bermigrasi untuk
menutupi goresan.
63
Tabel 3.1 (Sambungan)
Penelitian Ukur ukur
7 Aktivitas Aktivitas ekspresi Software Jumlah Numerik
ekspresi COX-2 merupaka Optilab 2.2 ekspresi
protein jumlah COX-2 Image
COX-2 dan yang di Rastar
VEGF ekspresikan
dengan pemberian
bahan uji.
Pengukurannya
dilakukan dengan
metode
imunositokimia
64
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hidrolisis Minyak Kelapa Murni
Perhitungan data bilangan asam dapat dilihat pada Lampiran 18
Halaman 110. Bilangan asam dari minyak kelapa murni dan hasil hidrolisis
minyak kelapa murni pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 4.1.
Tabel 4.1 Bilangan asam hasil hidrolisis minyak kelapa murni
Bilangan asam (mg KOH/g minyak)

Sampel
n=3
VCO 1,0757±0,0054
HVCO 133,8711±0.4598
Hidrolisis enzimatik minyak kelapa murni dilakukan dengan
menggunakan enzim lipase dari Rhizomucor miehei yang khusus untuk gugus asil
pada posisi sn-1 dan sn-3 dalam molekul trigliserida (Perbina, 2019; Margata, et
al., 2018; Silalahi & Surbakti, 2015).
Penentuan bilangan asam bertujuan untuk menentukan banyaknya asam
lemak bebas yang ada dalam minyak dengan dilakukannya hidrolisis.
Berdasarkan Tabel 4.1 diatas dapat dilihat bahwa terjadi peningkatan bilangan
asam setelah dilakukan hidrolisis terhadap minyak kelapa murni. Bilangan asam
dari minyak kelapa murni adalah 1,0757 mg KOH/g lemak, sedangkan bilangan
asam dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni adalah 133,87 mg KOH/g lemak,
dimana hasil ini lebih rendah dari bilangan penyabunan (~ 250) dimana semua
asam lemak dalam trigliserida (dalam minyak kelapa) disaponifikasi atau
65
dihidrolisis secara sempurna menjadi sabun. Hasil ini menunjukkan bahwa hanya
sekitar 65% (dua pertiga) dari total asam lemak yang ada dalam minyak karena
enzim yang digunakan dalam percobaan ini secara khusus hanya aktif pada posisi
sn 1,3 dalam molekul trigliserida. Hasil penelitian Margata, et al., 2018
menunjukkan bilangan asam dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni adalah
134,11 mg KOH/g lemak. Hasil ini tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian
yang telah dilakukan diatas.
Penelitian Margata, et al., 2018, menunjukkan bahwa kondisi optimum
untuk hidrolisis menggunakan enzim tersebut ialah pada suhu 50 oC, pH 8, selama
10 jam, dimana enzim ini menghidrolisis asam lemak pada posisi sn-1 dan sn-3
dalam molekul trigliserida yang menghasilkan dua asam lemak bebas (FFA) dan
2-monogliserida dalam hasil hidrolisis minyak kelapa murni (HVCO). Hasil
hidrolisis minyak kelapa murni terdiri dari asam lemak bebas terutama asam laurat
dan 2 monogliserida terutama 2-monolaurin. Kombinasi asam laurat dan
monolaurin berperan sebagai agen antibakteri dan antivirus. Mekanisme kerja
asam laurat dan monolaurin ini yakni dengan menghancurkan struktur lipid virus
dan membran sel bakteri (Silalahi, et al. 2016; Karouw, et al., 2018; Margata, et
al., 2018; Elysa, et al., 2014; Silalahi & Surbakti, 2015; Silalahi, et al., 2014).
Penelitian VCO dan HVCO telah dilakukan secara in vitro. Penelitian oleh
Ibrahim, et al (2017) pada VCO hasil fermentasi menunjukkan peningkatan
viabilitas, proliferasi dan migrasi sel pada pengujian secara in vitro. Hasil
penelitian oleh Perbina (2009) menunjukkan peningkatan aktivitas penyembuhan
luka secara in vitro pada HVCO dengan parameter peningkatan viabilitas sel,
66
peningkatan aktivitas migrasi dan peningkatan ekspresi COX-2 dan PDGF
(Ibrahim, et al., 2017; Perbina, 2009).
4.2 Aktivitas Proliferasi Sel NIH 3T3
Data hasil pengukuran dan penghitungan persentase proliferasi sel dari
masing-masing bahan uji dan hasil analisis dengan SPSS 22 dapat dilihat pada
Lampiran 19 Halaman 112 dan Lampiran 22 Halaman 117. Hasil pengujian
aktivitas proliferasi sel NIH 3T3 dengan pemberian bahan uji pada berbagai
variasi konsentrasi dapat dilihat dari Tabel 4.2 dan Gambar 4.1.
Berdasarkan Tabel 4.2 dan Gambar 4.1 diatas dapat dilihat efek bahan uji
terhadap persentase proliferasi sel pada berbagai konsentrasi. Kontrol sel
dianggap memiliki persentase jumlah sel hidup sebesar 100 %. Untuk bahan uji
hasil hidrolisis minyak kelapa murni, dapat dilihat bahwa terdapat 3 (tiga) variasi
konsentrasi yang lebih kecil dari kontrol sel yaitu pada konsentrasi 500 mcg/ ml,
250 mcg/ml dan 15,625 mcg/ml, persentase sel yang hidup berturut-turut hanya
10,8333 %, 26,7363 %, dan 89,0377%. Begitu juga dengan Fucoidan dan kontrol
positif , konsentrasi yang lebih kecil dari kontrol sel ditemukan pada konsentrasi
15,625 mcg/ml dengan persentase sel hidup sebesar 99,0377% untuk Fucoidan
dan 98,3540% untuk kontrol positif. Hasil ini berbeda secara signifikan dengan
pengujian pada konsentrasi yang lain (p<0,05).
Penentuan konsentrasi terbaik dilakukan dengan membandingkan kepada
persentase proliferasi kontrol sel. Persentase proliferasi tertinggi dianggap
sebagai konsentrasi terbaik.
67
Tabel 4.2 Aktivitas proliferasi Sel NIH 3T3 dengan pemberian bahan uji pada
berbagai variasi konsentrasi
Konsentrasi bahan Persentase proliferasi
Bahan Uji
uji sel (%)
HVCO 500 mcg/ml 10,8333±0,55120*
250 mcg/ml 26,7363±3,75075*
125 mcg/ml 129,5833±5,63027*
62,5 mcg/ml 133,7500±0,24076*
31,25 mcg/ml 139,4443±1,52311*
15,625 mcg/ml 89,0377±0,57783
Fucoidan 500 mcg/ml 106,5280±4,98008

250 mcg/ml 109,8610±1,99221
125 mcg/ml 113,1943±8,57484
62,5 mcg/ml 121,2503±4,92566
31,25 mcg/ml 121,1807±8,94639
15,625 mcg/ml 89,0377±0,49661
Aloclair® 500 mcg/ml 127,2917±1,57728*

250 mcg/ml 156,2503±4,63980*
125 mcg/ml 156,7360±5,30664*
62,5 mcg/ml 152,1527±3,95362*
31,25 mcg/ml 145,6250±7,55294*
15,625 mcg/ml 88,3540±0,54317*
Kontrol Sel 100,0000±5,92664

Kontrol Media 0,0000±4,82857*
Keterangan : Data merupakan hasil analisa statistik menggunakan Uji One way
Anova - Post-Hoc Tukey, (p<0,05); ± SEM; n=3 untuk setiap grup.
*p<0,05, artinya terdapat perbedaan yang signifikan dengan kontrol sel
Untuk hasil hidrolisis minyak kelapa murni (HVCO), persentase
proliferasi diatas persentase kontrol sel terdapat pada variasi konsentrasi 125
mcg/ml (129,5833%), konsentrasi 62,5 mcg/ml (133,7500%) dan konsentrasi
31,25 mcg/ml (139,4443%).
68
Gambar 4.1 Aktivitas proliferasi sel NIH 3T3 dengan pemberian bahan uji
Persentase tertinggi ditemukan pada konsentrasi 31,25 mcg/ml, sehingga
konsentrasi ini ditentukan sebagai konsentrasi terbaik untuk HVCO. Persentase
proliferasi pada 31,25 mcg/ml berbeda secara signifikan (p<0,05) pada analisa
data secara statistik.
Untuk bahan uji Fucoidan persentase proliferasi diatas persentase kontrol
sel terdapat pada variasi konsentrasi 500 mcg/ml (106,5280%), konsentrasi 250
mcg/ml (109,8610%), konsentrasi 125 mcg/ml (113,1943%), konsentrasi 62,5
mcg/ml (121,2503%) dan konsentrasi 31,25 mcg/ ml (121,1807%). Persentase
proliferasi tertinggi memang ditemukan pada konsentrasi 62,5 mcg/ml
(121,2503%), akan tetapi hasil ini tidak memiliki perbedaan secara signifikan
(p<0,05) dengan persentase proliferasi pada konsentrasi 31,25 mcg/ml
(121,1807%). Berdasarkan hasil analisa data ini lalu ditentukan bahwa
konsentrasi terbaik untuk Fucoidan adalah pada konsentrasi 31,25 mcg/ml.
Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah Aloclair® Plus
Gel. Kontrol positif ini dipilih berdasarkan hasil studi literatur dari penelitian-
69
penelitian tentang penyembuhan luka sebelumnya yang menggunakan Aloclair®
Plus Gel, dimana bahan uji ini tidak bersifat sitotoksik terhadap sel. Apabila
menggunakan obat luka seperti Povidon Iodida atau alkohol, sel akan mati. Oleh
karena itu Aloclair® Plus Gel digunakan sebagai kontrol positif pada penelitian
ini.
Untuk kontrol positif yakni Aloclair® Plus Gel, persentase proliferasi
diatas persentase kontrol sel terdapat pada variasi konsentrasi 500 mcg/ ml
(127,2917%), konsentrasi 250 mcg/ml (156,2503%), konsentrasi 125 mcg/ ml
(156,7360%), konsentrasi 62,5 mcg/ml (152,1527%) dan konsentrasi 31,25
mcg/ml (145,6250%). Berdasarkan data ini, terdapat 3(tiga) variasi konsentrasi
yang persentase proliferasinya lebih besar dibandingkan persentase pada
konsentrasi 31,25 mcg/ml, akan tetapi hasil ini tidak memiliki perbedaan secara
secara signifikan dengan persentase proliferasi pada konsentrasi 31,25 mcg/ml
(p<0,05). Berdasarkan hasil analisa data ini lalu ditentukan bahwa konsentrasi
terbaik untuk kontrol positif adalah pada konsentrasi 31,25 mcg/ml, karena
dengan konsentrasi yang lebih kecil memiliki aktivitas yang sama dengan
konsentrasi yang lebih tinggi.
Berdasarkan data diatas ditemukan bahwa konsentrasi yang terlalu tinggi
dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni akan mempengaruhi persentase sel yang
hidup menjadi sangat rendah, dimana banyak sel mengalami kematian, sehingga
dapat disimpulkan bahwa konsentrasi tinggi tersebut bersifat sitotoksik. Begitu
juga dengan konsentrasi bahan uji yang terlalu rendah, juga mempengaruhi
kehidupan sel yakni persen sel yang hidup juga menjadi rendah.
70
Pengujian aktivitas proliferasi sel NIH 3T3 dilakukan masa inkubasi 24
jam. Hal ini dilatarbelakangi oleh penelitian terdahulu oleh Rubin, et al. (2017),
yang memberi kesimpulan bahwa waktu pembelahan untuk sel NIH 3T3 adalah
18-22 jam dalam kondisi yang sesuai yakni dalam media pertumbuhan DMEM.
Sesuai juga dengan informasi pada situs resmi sel NIH 3T3, bahwa waktu
proliferasi untuk sel NH 3T3 adalah 24-26 jam dalam kondisi yang sesuai yakni
dalam media pertumbuhan yang sesuai dan diinkubasi di dalam inkubator CO2
pada suhu 37oC dengan kadar CO2 5% (Rubin, et al., 2017; www.nih3t3.com)
Penelitian oleh Ibrahim, et al (2017) pada VCO hasil fermentasi
menunjukkan peningkatan aktivitas proliferasi sel pada pengujian secara in vitro.
Hasil penelitian oleh Perbina (2009) menunjukkan peningkatan aktivitas
penyembuhan luka secara in vitro pada HVCO dengan parameter peningkatan
persen proliferasi sel. Asam laurat dan monolaurin adalah senyawa yang terdapat
dalam hasil hidrolisis minyak kelapa murni. Asam laurat dan mono laurin dapat
menurunan waktu untuk epitelisasi lengkap, karena asam laurat dan monolaurin
dapat meningkatkan proliferasi sel dan migrasi sel. Dengan peningkatan
proliferasi sel maka jumlah sel akan semakin banyak, sehingga proses
penyembuhan luka akan semakin cepat (Dryden, et al., 2013; Perbina, 2009;
Ibrahim, et al., 2017).
Pada penelitian yang dilakukan oleh O’Leary, et al. (2004)
menggunakan metode in vitro yakni dengan menggunakan kultur sel fibroblas
untuk melihat aktivitas proliferasi sel. Uji proliferasi sel dilakukan dengan metode
MTT. Hasil pengukuran proliferasi sel diperoleh persentase sel yang hidup pada
71
kelompok yang diberi fucoidan lebih tinggi dibandingkan dengan kelompok
tanpa fucoidan (O’Leary, et al., 2004).
Salah satu fase dalam proses penyembuhan luka adalah fase proliferasi.
Tahap proliferasi ini disebut juga fase fibroplasias karena yang menonjol adalah
proses proliferasi fibroblast. Peran fibroblas sangat besar pada proses perbaikan,
yaitu bertanggung jawab pada persiapan menghasilkan produk struktur protein
yang akan digunakan selama proses rekonstruksi jaringan. Oleh sebab itu, apabila
aktivitas proliferasi semakin baik (semakin tinggi) maka proses penyembuhan
luka akan semakin cepat (Dryden, et al., 2013; Velnar, et al., 2009; Pratsinis, et
al., 2018).
Berdasarkan data diatas, diperoleh hasil konsentrasi terbaik untuk semua
bahan uji adalah 31,25 µg/ml. Konsentrasi terbaik yang diperoleh untuk masing-
masing bahan uji akan dibawa untuk pengujian selanjutnya, yakni pengujian
migrasi sel NIH 3T3 dengan metode Scratch migration assay.
4.3 Aktivitas Migrasi Sel NIH 3T3
Proses penutupan goresan yang menggambarkan aktivitas migrasi sel
dapat dilihat pada Gambar 4.2. Data luas area luka dan penghitungan persentase
penyembuhan luka dari masing-masing bahan uji dapat dilihat pada Lampiran 20
Halaman 114. Data kemudian dianalisis dengan SPSS 22. Hasil pengujian secara
statistik dapat dilihat pada Lampiran 23 Halaman 120. Hasil pengujian aktivitas
penyembuhan luka dari bahan uji berdasarkan pengujian migrasi sel NIH 3T3,
dapat dilihat pada Tabel 4.3 dan Gambar 4.3.
72
0 Jam
Bahan Uji 24 Jam 48 Jam 72 Jam
HVCO
tunggal
Fucoidan
tunggal
Kombinasi
HVCO dan
Fucoidan
50:50
Kombinasi
HVCO dan
Fucoidan
25:75
Kombinasi
HVCO dan
Fucoidan
75:25
Aloclair®
Kontrol sel
Gambar 4.2 Proses penutupan luka pada pengujian aktivitas migrasi sel NIH
3T3 pada 0 jam, 24 jam, 48 jam dan 72 jam.
73
Tabel 4.3 Persentase penutupan luka dari bahan uji dengan pengujian migrasi sel
NIH 3T3 berdasarkan periode masa inkubasi.
Persentase penyembuhan luka (%)

No Bahan uji
24 jam 48 jam 72 jam
1 Kontrol sel 15,2433±0,41478 74,3600±0,45574 100,0000±0,0000
2 Aloclair® 28,5767±0,45157* 82,5467±0,91732* 92,7167±0,54272*
Fucoidan
3 tunggal 29,7100±0,58158* 85,6167±0,30322* 100,0000±0,0000*
HVCO
4 tunggal 62,3700±0,44736* 100,0000±0,0000* 100,0000±0,0000*
Kombinasi
HVCO
77,5067±0,28620* 100,0000±0,0000* 100,0000±0,0000*
Fucoidan
5 50:50
Kombinasi
HVCO -
2,5433±0,16496* -3,3267±0,20755*
Fucoidan 18,2367±0,02404*
6 25:75
Kombinasi
HVCO - -
-9,0700±0,35346*
Fucoidan 18,4765±0,02404* 29,2733±0,29157*
7 75:25
74
Gambar 4.3 Persentase penyembuhan luka dari bahan uji dalam pengujian
migrasi sel berdasarkan periode masa inkubasi.
Perbedaan persen penyembuhan luka secara signifikan pada setiap bahan
uji dari variasi waktu ini didukung dengan hasil pengujian menggunakan one way
anova- post hoc tukey (p<0,05) pada analisa data secara statistik menggunakan
SPSS 22. Berdasarkan data pada Tabel 4.3 dan Gambar 4.3 diatas dapat dilihat
bahwa setelah inkubasi 24 jam dari pemberian bahan uji, persentase
penyembuhan luka yang tertinggi adalah pada bahan uji dengan kombinasi hasil
hidrolisis minyak kelapa murni dan Fucoidan 50 : 50 yang mencapai 77,5067 %,
tertinggi berikutnya adalah hasil hidrolisis minyak kelapa murni (62,3700 %),
Fucoidan tunggal (29,7100 %), kontrol positif yakni Aloclair® Plus Gel (28,5767
%) dan kontrol sel (15,2433%). Sedangkan untuk bahan uji dengan kombinasi
25:75 hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan Fucoidan hanya 2,5433%.
Sementara itu untuk bahan uji kombinasi 75:25 dari hasil hidrolisis minyak kelapa
murni dan Fucoidan mengalami perluasan area luka (goresan), sehingga diperoleh
hasil persentase penutupan luka sebesar -9,0700%. Persentase migrasi tertinggi
pada masa inkubasi 24 jam terdapat pada kombinasi minyak kelapa murni dan
Fucoidan 50:50, dimana hasil ini berbeda secara signifikan (p<0,05) dengan bahan
uji lainnya.
Perhitungan persentase penyembuhan luka pada masing-masing bahan uji
hasil hidrolisis minyak kelapa murni, fucoidan maupun kombinasi keduanya pada
perbandingan 50:50 pada jam ke-24 ini menunjukkan adanya kombinasi yang
sinergis. Hal ini dapat ditunjukkan dengan persentase penyembuhan luka pada
kombinasi 50:50 sebesar 77%. Data ini menunjukkan adanya efek sinergis dari
kedua bahan uji apabila dikombinasi sebesar 50:50.
75
Setelah inkubasi 48 jam dari pemberian bahan uji, persentase
penyembuhan luka dari bahan uji kombinasi 50 : 50 dari hasil hidrolisis minyak
kelapa murni dan Fucoidan mencapai 100 %, begitu juga dengan hasil hidrolisis
minyak kelapa murni. Hal ini ditandai dengan tidak adanya area kosong pada
lapisan permukaan monolayer, semua sudah diisi oleh sel. Untuk Fucoidan
tunggal, persentase penutupan luka mencapai 85,6167 %, untuk kontrol positif
sebesar 82,5467 %, dan kontrol sel sendiri sudah mencapai 74,3600 %. Adapun
untuk kombinasi 25:75 dan 75:25 dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan
Fucoidan, area goresan semakin besar, sehingga penghitungan persentase
penutupan luka menunjukkan angka -3,3267 % dan -18,2367 %, hasil ini berbeda
secara signifikan dengan kombinasi 50:50 (p<0,05).
Perhitungan persentase penyembuhan luka pada masing-masing bahan uji
hasil hidrolisis minyak kelapa murni, fucoidan maupun kombinasi keduanya pada
perbandingan 50:50 pada jam ke-48 ini menunjukkan adanya kombinasi yang
sinergis. Hal ini dapat ditunjukkan dengan persentase penyembuhan luka pada
kombinasi 50:50 sudah mencapai 100%. Data ini menunjukkan adanya efek
sinergis dari kedua bahan uji apabila dikombinasi sebesar 50:50.
Pada akhir masa inkubasi 72 jam dari pemberian bahan uji persentase
penyembuhan luka dari bahan uji kontrol positif dan Fucoidan tunggal juga sudah
mencapai 100%. Kontrol sel sudah mencapai 92,7167%. Akan tetapi untuk
kombinasi 25:75 dan 75:25 dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan
Fucoidan, area goresan semakin besar, sehingga penghitungan persentase
penutupan luka menunjukkan angka -18,4765 % dan -29,2733 %. Hasil ini
berbeda secara signifikan dengan kombinasi 50:50 (p<0,05).
76
Hasil pengujian migrasi berupa persentase penutupan luka pada kombinasi
hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan Fucoidan 25:75 dan 75:25 tidak
menunjukkan aktivitas yang positif, akan tetapi menunjukkan aktivitas negatif,
hal ini ditandai dengan goresan yang semakin lebar. Efek negatif ini kemungkinan
dikarenakan oleh pada kombinasi 25:75 dan 75:25 maka konsentrasi dari masing-
masing bahan uji yang digunakan bukan lagi konsentrasi terbaik yakni 31,25
mcg/ml, akan tetapi pada konsentrasi yang lebih besar atau lebih kecil dari
konsentrasi terbaik tersebut.
Proses migrasi akan mempengaruhi proses epitelisasi, dimana dengan
terjadinya proses migrasi, sel-sel bisa lebih cepat bergerak untuk pembentukan sel
epitel. Penelitian oleh Ibrahim, et al (2017) pada VCO hasil fermentasi
menunjukkan peningkatan aktivitas migrasi sel pada pengujian secara in vitro.
Penelitian oleh Perbina (2019) menunjukkan hasil persentase penyembuhan luka
yang berbeda secara signifikan antara VCO dengan HVCO pada pengujian secara
in vitro (Ibrahim, et al., 2017; Justus, C.R., et al., 2014; Eberlein, et al., 2016;
Perbina, 2019).
Hasil pengujian aktivitas migrasi sel menunjukkan bahwa kombinasi yang
terbaik untuk hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan Fucoidan adalah 50:50,
dimana hasil pada kombinasi ini memiliki perbedaan secara signifikan dengan
kombinasi yang lain (p<0,05), sehingga kombinasi terbaik ini akan digunakan
untuk pengujian selanjutnya yaitu pengujian ekspresi protein COX-2 dan VEGF
dengan metode imunositokimia.
77
4.4 Ekspresi Protein COX-2 dan VEGF Sel NIH 3T3
Data jumlah sel yang mengekspresikan protein dan penghitungan
persentase ekspresi protein COX-2 dan VEGF dari masing-masing bahan uji dan
hasil analisis dengan SPSS 22 dapat dilihat pada Lampiran 21 Halaman 115,
Lampiran 24 Halaman 125 dan Lampiran 25 Halaman 127. Dokumentasi hasil
pengamatan ekspresi protein COX-2 dan VEGF dengan menggunakan mikroskop
yang dilengkapi dengan kamera optilab (perbesaran 40x) dapat dilihat pada
Gambar 4.4. Data persentase ekspresi protein COX-2 dan VEGF dengan
pemberian bahan uji dapat dilihat pada Tabel 4.4 dan Gambar 4.5. Data yang
diperoleh dalam pengujian ini adalah dalam bentuk persentase yaitu persentase
perbandingan dari sel yang mengekspresikan protein dari total jumlah sel. Analisis
data dilakukan untuk menghitung jumlah sel yang mengekspresikan protein COX-
2 dan VEGF dengan menggunakan software optilab viewer 2.2 image raster.
Hasil analisis adalah melalui kuantifikasi gambar dari rata-rata 5 (lima) bidang
pandang. Sel yang berwarna gelap artinya mengekspresikan protein tersebut,
sedangkan sel yang berwarna biru artinya tidak mengekspresikan protein.
Ekspresi protein COX-2 dipilih sebagai parameter penyembuhan luka secara in
vitro, karena COX-2 berperan dalam pembentukan prostaglandin yang berperan
untuk angiogenesis. Selain itu COX-2 juga berperan dalam vasodilatasi pembuluh
darah sehingga sel-sel inflamasi dapat segera sampai di tempat radang dan
mempercepat proses penyembuhan luka.
78
Bahan Uji Ekspresi COX-2 Ekspresi VEGF
HVCO tunggal
Fucoidan tunggal
Kombinasi HVCO
dan Fucoidan 50:50
Aloclair®
Kontrol sel
Gambar 4.4 Pengamatan ekspresi sel dengan menggunakan mikroskop yang

dilengkapi dengan kamera optilab (perbesaran 40x).
Keterangan : : ekspresi (+)
: ekspresi (-)
79
Tabel 4.4 Persentase ekspresi protein COX-2 dan VEGF
% Ekspresi % Ekspresi
No Bahan Uji
Protein COX 2 Protein VEGF
1 Kontrol 6,4816±0,29969 7,3599±0,23778
®
2 Aloclair 27,1261±0,28401* 33,2574±0,36119*
3 HVCO Tunggal 28,4203±0,25630* 25,4550±0,21897*
4 Fucoidan Tunggal 26,8923±0,10610* 27,4068±0,24609*
Kombinasi HVCO dan
5 34,7558±0,09872* 30,0957±0,29865*
Fucoidan 50:50
(A)
(B)
Gambar 4.7 Persentase ekspresi protein dengan pemberian bahan uji
(A) Ekspresi protein COX-2; (B) Ekspresi protein VEGF
80
Berdasarkan data pada Tabel 4.4 dan Gambar 4.5 dapat dilihat bahwa
untuk ekspresi protein COX-2 yang tertinggi terdapat pada bahan uji kombinasi
hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan Fucoidan 50:50, yakni sebesar
34,7558%. Hasil ini lebih tinggi 7,8635% dari Fucoidan tunggal (26,8923%),
lebih tinggi 6,3355% dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni tunggal
(28,4203%) dan lebih tinggi 7,6297% dari kontrol positif (27,1261%) Aloclair®
Plus Gel. Untuk kontrol sel sendiri, persen ekspresi protein COX-2 sebesar
6,4816. Pengujian homogenitas menggunakan Tukey Test menunjukkan bahwa
persen ekspresi COX-2 dari Fucoidan tidak memiliki perbedaan secara signifikan
dengan kontrol positif (p<0,05). Hasil pengujian menunjukkan bahwa ekspresi
tertinggi ada pada kombinasi minyak kelapa murni dan Fucoidan 50:50, dimana
hasil ini memiliki berbeda secara signifikan dengan bahan uji lainnya (p<0,05).
Vascular endothelial growth factor (VEGF), merupakan faktor
pertumbuhan angiogenik paling kuat, menstimulasi pembentukan pembuluh darah
baru. Itulah sebabnya faktor pertumbuhan ini dipilih untuk parameter aktivitas
ekspresi protein, dimana semakin tinggi persentase ekspresi protein, maka
aktivitas penyembuhan luka akan semakin baik. Data pada pengujian ekspresi
protein VEGF menunjukkan bahwa ekspresi yang tertinggi terdapat pada kontrol
positif Aloclair® Plus Gel sebesar 33,2574, dimana hasil ini berbeda secara
signifikan dengan bahan uji lainnya (p<0,05) . Untuk bahan uji kombinasi hasil
hidrolisis minyak kelapa murni dan Fucoidan 50:50, persen ekspresi protein
sebesar 30,0957%. Hasil ini lebih tinggi 2,6889% dari Fucoidan tunggal
(27,4068%) dan 4,6407% lebih tinggi dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni
tunggal (25,4550%). Untuk kontrol sel sendiri, persen ekspresi protein VEGF
81
sebesar 7,3599%. Persentase ekspresi protein VEGF dari masing-masing bahan
uji memiliki perbedaan secara signifikan, sehingga persentase ekspresi ekspresi
dari kombinasi memiliki perbedaan dengan tunggal baik tunggal HVCO maupun
Fucoidan (p<0,05).
Kontrol positif yakni Aloclair® Plus Gel memiliki kandungan utama
ekstrak lidah buaya (Aloe vera) ditambah dengan bahan bahan lain seperti
maltodextrin, propilen glikol, PEG-40, hydrogenated castor oil, xantan gum,
potassium sorbate, sodium benzoat, sodium hyaluronate, aroma, benzalkonium
chloride, disodium EDTA, yang berperan dalam penyembuhan luka. Aloclair
memiliki berbagai kandungan di dalamnya yang dapat mempercepat
penyembuhan luka, dan terutama diinkasikan pada luka akibat sariawan
(Nofikasari, I., et al., 2016).
Penelitian sebelumnya telah membuktikan potensi angiogenesis dan
penyembuhan luka dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni. Hasil penelitian
Perbina (2019) menunjukkan adanya peningkatan ekspresi COX-2 secara
signifikan pada HVCO dibandingkan dengan VCO pada pengujian secara in vitro.
Park, et al. (2017) melakukan penelitian tentang aktivitas penyembuhan luka dari
Fucoidan. Dari hasil penelitian dapat diambil kesimpulan bahwa Fucoidan dapat
mempercepat penyembuhan luka ditandai dengan penyempitan luas area luka dan
peningkatan ekspresi TGF- β1, VEGFR dan MMP 9 (Nofikasari, I., et al., 2016;
Ibrahim, et al., 2017; Park, et al., 2017).
Pengujian parameter-parameter penyembuhan luka yang telah dilakukan
secara in vitro ini bertujuan untuk melihat mekanisme penyembuhan luka
menurut fase-fase penyembuhan luka. Penelitian ini melihat mekanisme
82
penyembuhan luka terutama pada fase proliferasi. Dari hasil diatas dapat
disimpulkan bahwa kombinasi dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni (HVCO)
dan Fucoidan memiliki aktivitas yang lebih baik yakni pada kombinasi 50:50
menunjukkan aktivitas yang berbeda secara signifikan (p<0,05) dibanding
Fucoidan tunggal maupun dibandingkan dengan hasil hidrolisis minyak kelapa
murni (HVCO) tunggal.
83
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan yang diperoleh dari penelitian ini adalah :
c. Kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan memiliki
aktivitas penyembuhan luka secara in vitro.
d. Kombinasi hasil hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan memiliki
aktivitas penyembuhan luka secara in vitro yang lebih baik yaitu pada
kombinasi 50:50 dimana kombinasi ini memiliki aktivitas penyembuhan
luka yang berbeda secara signifikan (p<0,05) dibandingkan dengan
hidrolisis minyak kelapa murni tunggal maupun fucoidan tunggal.
5.2 Saran
Berdasarkan kesimpulan diatas, disarankan untuk peneliti selanjutnya:
a. Menguji aktivitas penyembuhan luka dari kombinasi hasil hidrolisis
minyak kelapa murni dan fucoidan terhadap growth factor lain yang
berperan dalam penyembuhan luka.
b. Menguji aktivitas penyembuhan luka diabetes dari kombinasi hasil
hidrolisis minyak kelapa murni dan fucoidan secara in vivo.
84
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. NIH 3T3 Cell Line Mouse Embryonic Fibroblast- NIH 3T3 General
Information. [diakses 14 Februari 2019]; [2 screens]. Diambil dari: URL:
http://www. nih3t3.com
Abbas, A.K., and Lichtman, A.H. (2003). Cellular and Molecular Immunology.
5th ed. Philadelphia. Saunders. (522): 34- 45.
Ariffin, N.H.M., and Hasham, R. (2016). Potential Dermatological Application on
Asian Plants. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 21: 337-354.
Ashrafi, M., Hague, A., Baguneid, M., Rasgado, T.A. and Bayat, A. (2018).
Wound Healing and Cutaneous Scarring Models of The Human Skin.
Skin Tissue Models. 9: 201-221.
Bando, T., Fujita, S., Nagano, N., Yoshikawa, S., Yamanishi, Y., et al. (2017).
Differential Usage of COX-1 and COX-2 in Prostaglandin Production by
Mast Cells and Basophils. Biochemistry and Biophysics Reports. 10: 82-
87.
Balzer, J., Heuer, K., Demir, E., Hofmanns, M.A., Baldus, S., Fuchs, P.C., et al.
(2015). Non-Thermal Dielectric Barrier Discharge (DBD) Effects on
Proliferation and Differentiation of Human Fibroblasts Are Primary
Mediated by Hydrogen Peroxide. Plos One. 10: 1-18.
Bao, M.D.P., Kodra, B.A.A., Canic, M.T., Golinko, M.D.M.S., Ehrlich, H.P., and
Brem, M.D.H. (2009). The Role of Vascular Endothelial Growth Factor in
Wound Healing. Journal of Surgical Research. 153: 347–358.
Borena, B.M., Martens, A., Broeckx, S.Y., Meyer, E., Chiers, K., and et al.
(2015). Regenerative Skin Wound Healing in Mammals: State-of-the-Art
on Growth Factor and Stem Cell Based Treatments. Cell Physiol Biochem.
36(1): 1-23.
CCRC (Cancer Chemoprevention Research Centre). (2009). Protokol Kultur
Sel. Yogyakarta: Cancer Chemoprevention Research Centre. Halaman 1
– 7.
Chua, L.S, Alitabarimansor, M., Lee, C.T., and Mat, R. (2012). Hydrolisis of
Coconut Oil Using Immobilized Lipase in a Batch Reactor. Enzyme
Research. 10: 1-5.
Cree, I.A. (2011). Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. Edisi Kedua.
New York: Springer Humana Press. Halaman 237 – 244.
Cutting, K.F., White, R.J. and Legerstee, R. (2017). Evidence and Practical
Wound Care- An All-Inclusive Approach. Wound Medicine. 16: 40-45.
Daydrit, Fabian M. (2015). The Properties of Lauric Acid and Their
Significance in Coconut Oil. J Am Oil Chem Soc. 92: 1-15.
DebMandal, M. and Mandal, S. (2011). Coconut (Cocos nucifera L.: Arecaceae):

In Health Promotion and Disease Prevention. Asian Pacific Journal of
Tropical Medicine. 241-247.
85
DEPKES RI. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi IV. Ditjen POM. Hal. 1167,
1144, 1182-1183, 1216 .
Dorai, A.A. (2012). Wound care with traditional, complementary and alternative
medicine. Review Article. Indian Journal of Plastic Surgery. 45(2):418-
424.
Dosumu, O.O., Akinola, O.B., and Akang, E.N.,. (2012). Alkohol- Induced
Testicular Oxidative Stress and Cholesterol Homeostatis in Rats- The
Therapeutic Potential Of Virgin Coconut Oil. Review Article. Middle East
Fertility Society Journal. 17: 122-128.
Dryden, S.V, Shoemaker, W.G. and Kim, J.H. (2013). Wound Management and
Nutrition for Optimal Wound Healing. Atlas Oral Maxillofacial Surg Clin
N Am. 21. 37-47.
Eberlein, T., Gerke, P., Lorenz, H. and Ammer, R. (2016). Advantages in Wound
Healing by A Topical Easy To Use Wound Healing Lipo-gel For Abrasive
Wounds- Evidence From A Randomized, Controlled Experimental
Clinical Study. Wound Medicine. 15: 11-19.
Ferrara, N. (2014). Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Science and

Clinical Progress. Endocrine Reviews. 25(4): 581-611.
Fitton, J.H., Stringer, D.N. and Karpiniec, S.S. (2015). Therapies From Fucoidan:
An Update. Marine Drugs. 13: 5920-5946.
Freshney, I.A. (2000). Culture Of Animal Cells. A Manual of Basic Technique.

Edisi IV. Toronto: Willey-Liss. Halaman 329 – 344.
Freiesleben, S.H., Soelberg,J., Nyberg, N.T., and Jäger, A.K. (2017).

Determination of the Wound Healing Potentials of Medicinal Plants
Historically Used in Ghana. Hindawi Publishing Corporation Evidence-
Based Complementary and Alternative Medicine. 1-6.
Ghafouri, H.B., Zavareh, M., Jalili, F. and Cheragi, S. (2016). Is 1% Povidone-

Iodine Solution Superior To Normal Saline For Simple Traumatic Wound
Irrigation?. Wound Medicine. 15 : 1-5.
Gilaberte, Y., Prieto-Torres, L., Pastushenko, I. and Juarranz, A. (2016). Anatomy

and Function of The Skin. Nanoscience In Dermatology : 1-13.
Guo,S. and Dipietro, L.A. (2010). Factors Affecting Wound Healing. J Dent Res.
89(3). 219-229.
Gutner, G.C. (2007). Wound Healing, Normal and Abnormal. In Grabb and
Smith’s Plastic Surgery. 6th ed. Philadelphia. Elseviers. Halaman 15 – 22.
Hamsi, M.A., Othman,F., Das,S., Kamisah,Y., Thent, Z.C., Qodriyah,H.M.S.,

dkk. (2015). Effect of Consumption of Fresh and Heated Virgin Coconut
Oil on the Blood Pressure and Imflammatory Biomarkers: An
86
Experimental Study in Sparague Dawley Rats. Alexandria Journal of
Medicine. 51: 53-63.
Harahap,U., Hasibuan, P.A.Z., Sitorus, P., Arfian, N., and Satria, D (2018).
Antimigration Activity of An Ethylacetate Fraction of Zanthoxylum
acanpodium DC. Fruits in 4T1 Breast Cancer Cells. Asian Pacific Journal
of Cancer Prevention. 19:565-569.
Harlystiarini. (2010). Kultur In Vitro Sel-Sel Fibroblas Fetus Tikus. Skripsi.
Program Studi Sarjana Kedokteran Hewan. Fakultas Kedokteran Hewan.
Institut Pertanian Bogor.
Ibrahim, A.H., Li, H., Al-Rawi,S.S., Majid, A.S.A., Al-Habib, O.A., Xia, X., dkk.
(2017). Angiogenic and Wound Healing Potency of Fermented Virgin
Coconut Oil : In Vitro and In Vivo Studies. Am J Transl Res. 9(11): 4936-
4944.
Justus, C.R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., and Yang, L. V. (2014). In Vitro
Cell Migration and Invasion Assay. Journal of Visualized Experiments.
88: 1-8.
Ikatan Apoteker Indonesia. (2017). Informasi Spesialite Obat Indonesia. Jakarta.

isfiPenerbitan. Halaman 331, 353.
Kaiin, E.M., dan Djuwita, I. (2016). Potensi Transdiferensiasi Sel Fibroblas
Menjadi Sel Saraf Secara In Vitro. Jurnal Kedokteran Hewan. 10(1): 49-
53.
Lay, B.W. (1994). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo

Persada. Halaman 57.
Li,B., Lu, F., Wei, X. and Zhao, R. (2008). Fucoidan: Structure and Bioactivity.
Molecules. 13: 1671-1695.
Lin,T., Zhong, L. and Santiago, J.L. (2018). Anti-Inflammatory and Skin Barrier
Repair Effects of Topical Aplication of Some Plants Oil. International
journal of Molecular Sciences. 19: 1-21.
Liu,M., Liu, Y., Jie, M., Liu, G.m Chen, Q, et al. (2017). Anti Bacterial Activity
and Mechanisms of Depolymerized Fucoidans Isolated from Laminaria
japonica. CarbohydratePolymers. 127: 294-305.
Loung, F.S., Silalahi, J., and Suryanto, D. (2014). Antibacterial Activity of

Enzymatic Hydrolyzed of Virgin Coconut Oil and Palm Kernel Oil
Against Staphylococcus aureus, Salmonella thypi, and Escherichia coli.
International Journal of Pharmtech Research. 6(2): 628-633.
Margata, L., Silalahi, J., Harahap, U., Satria, D. (2017). The Effect Of Dietary
Oils and Hidrolyzed Coconut Oil on Minerals Absorption in Rats. Asian
Journal of Pharmaceutical and Clinical Research. 11 (1): 185-190.
87
Margata, L., Silalahi, J., Harahap, U., Suryanto, D dan Satria, D. (2019). The
ntibacterial Effect of Enzymatic Hydrolyzed Virgin Coconut Oil on
Propionibacterium acne, Bacillus subtilis, Staphylococcus epidermidis and
METHICILLIN-RESISTANT Staphylococcus aureus. RASAYAN J Chem.
12 (2): 987-993.
Murakami, K., Aoki, H., Nakamura, S., Takikawa, M., Hanzawa, M., Kishimoto,
S., dkk. (2010). Hydrogel Blends of Chitin/ Chitosan, Fucoidan and
Alginate as Healing-Impaired Wound Dressing. Biomaterials. 31: 83-
90.
Nasir, N.A.M., Jalaludin, A.A., Abllah, Z., Shahdan, I.A. and Manan, W.N.H.W.A.
(2017). Virgin Coconut Oil and Its Antimicrobial Properties Against
Phatogenic Microorganisms: A Review. Advances In Health Science
Research. 8 : 192-197.
Nevin, K. G. and T. Rajamohan (2010) Effect of topical application of virgin

coconut oil on skin components and antioxidantstatus during dermal
wound healing in young rats. Skin Pharmacol Physiol. (23): 290-297.
Nguyen, T.A.V., Le, T.D., Phan, H.N., and Tran, L.B. M. (2018). Hydrolisis
Activity of Virgin Coconut Oil Using Lipase from Different Sources.
Scientifica. 1: 1-6.
Nguyen, T.A.V., Le, T.D., Phan, H.N., and Tran, L.B. M. (2017). Antibacterial
Activity of Free fatty Acids from Hydrolized Virgin Coconut Oil Using
Lipase from Candida rugosa. Journal of Lipids. 1: 1-7.
Nofikasari, I., Rufaida, A., Aqmarina, C.D., Failasofia, Fauzia, A.R., dkk. (2016).
Efek Aplikasi Topikal Gel Ekstrak Pandan Wangi Terhadap
Penyembuhan Luka Gingiva. Majalah Kedokteran Gigi Indonesia. 2 (2):
53-59.
Nurani, L.H., dkk. (2011). Uji Sitotoksisitas, Antiproliferatif, dan Pengaruhnya

Terhadap Ekspresi P53 dan BCl2 dari Ekstraksi Etanol Infusa Daun
Teh (Camelia sinensis (L.) O.K.) Terhadap Sel Hela. Majalah Obat
Tradisional. 16 (1): 14-21.
Obolensky, V.N., Ermolova, D.A., and Laberko, L.A. (2017). Clinical and
Economic Effectiveness Of The Use Of Platelet Rich Plasma In The
Treatment Of Chronic Wounds. Wound Medicine. 19 : 27-32.
O’Leary,R., Rerek, M., and Wood, J.W. (2004). Fucoidan Modulates the Effects
of Transforming Growth Factor (TGF)-β1 on Fibroblast Proliferation and
Wound Repopulation an In Vitro Models of Dermal Wound Healing. Biol.
Pharm. Bull. 27 (2) : 266-270.
Oostra, B.A. (1996). FMR 1 protein studies and animal model for Fragile X
syndrome. In : Hagerman RJ, Cronister A eds. Frafile X syndrome,
Diagnosis, Treatment, and Research. 2nd ed. Baltimore. The Johns
Hopkins University Press. Halaman 193 – 205.
88
Oshima,M., Yamaguchi, Y., Kappert, K., Micke, P. and Otsuka, K. (2009). bFGF
Rescues Imatinib/ STI571- Induced Apoptosis of sis-NIH3T3 Fibroblast.
Biochemical and Biophysical Research Communications. 381 : 165-170.
Park, J.H., Choi, S.H., Park, S.J. , Jin, C.Y., Lee, Y.J., Park, J.H., dkk. (2017).
Promoting Wound Healing Using Low Molecular Weight Fucoidan in a
Full-Thickness Dermal Excision Rat Model. Marine Drugs. 15: 112-127.
Perbina, Dian Ika. (2019). Efek Penyembuhan Luka dari Minyak Kelapa Murni
dan Hasil Hidrolisisnya Secara In Vitro. Tesis. Program Studi Magister
Farmasi. Universitas Sumatera Utara.
Pratsinis, H., Mavrogonatou,E. and Kletsas, D. (2018). Scarless Wound
Healing: From Development to Senescence. Advanced Drug Delivery
Reviews. 18: 1-11.
Premarathna, A.D., Ranahewa, T.H., Wijesekera, S.K., Wijesundara,R.R.M.K.K,

Jayasooriya, A.P., dkk. (2018). Wound Healing Properties of Aqueous
Extracts of Sargassum illicifolium: An In Vitro Assay. Wound Medicine.
22 (13): 1-7.
Primadina, N., Basori, A.,dan Perdanakusuma, D,S. (2019). Proses

Penyembuhan Luka Ditinjau dari Aspek Mekanisme Seluler dan
Molekuler . Qanun Medika. 3(1): 31-43.
Pulung, M.L., Yogaswara, R., dan Sianipar, F.R. (2016). Potensi Anti Oksidan
dan Anti Bakteri Virgin Coconut Oil dari Tanaman Kelapa Asal Papua.
Chem Prog. 9(2): 75-82.
Purnama, H., Sriwidodo dan Ratnawulan, S. (2018). Review Sistematik:

Proses Penyembuhan dan Perawatan Luka . Farmaka. 15(2): 251-258.
Roopan, S.M. and Elango, G. (2015). Exploitation of Cocos Nucifera a Non-

Food Toward the Biological and Nanobiotechnology Field. Industrial
Crops And Products. 67: 130-136.
Rouzer, C. A., dan L. J. Marnett. (2003). Mechanism of free radical oxygenation of

polyunsaturated fatty acids by cyclooxygenases. Chemistry Reviews. 103:
2239–2304.
Rubin, H. (2017). Dynamics of Cell Transformation in Culture and Its

Significance for Tumour Developments in Animals. Proceedings of The
National Academy of Sciences of The United States of America. 114(46):
12237-12242.
Schneider, C., Pratt, D.A., Porter, N.A., dan Brash, A.R. (2007). Control of
oxygenation in lipoxygenase and cyclooxygenase catalysis. Chemistry and
Biology. 14(5): 473–488.
89
Siebert,A., Goren,I., Pfeilschifter,J., and Frank, S. (2016). Anti-Inflammatory
Effects of Rosiglitazone in Obesity-Impaired Wound Healing Depend on
Adipocyte Differentiation. Plos One. 10: 1-25.
Singh, A., Young, A. and McNaught, C. (2017). The Physiologi of Wound

Healing. Surgery. 35(9). 473-477.
Shrivastav,A., Mishra, A.K., Ali, S.S., Ahmad, A., Abuzinadah, M.F. and Khan,
N.A. (2018). In Vivo Models For Assesment of Wound Healing
Potential: A Systematic Review. Wound Medicine. 20 : 43-53.
Silalahi J. and Surbakti C. (2015). Burn Wound Healing Activity of Hydrolyzed

Virgin Coconut Oil. International Journal of PharmaTech Research. 8 (1):
67-73.
Silalahi, J., Yademetripermata, and Putra, E.D.L. (2014). Antibacterial Activity of

Hydrolized Virgin Coconut Oil. Asian Journal of Pharmaceuticl and
Clinical Research. 7(2). 90-94.
Silalahi, J., Pertiwi, D., Dalimunthe, A., and Silalahi, Y.C. (2015). Effect of Acute
Consumption of Coconut and Palm Oil on Swimming Capacity Endurance
of Mice (Mus musculus). Asian Journal of Pharmaceuticl and Clinical
Research. 8(9). 55-59.
Silalahi, J., Situmorang, P., Patilaya, P., and Silalahi, Y.C. (2016). Antibacterial
Activity of Chitosan and Hydrolized Coconut Oil and Their Combination
Against Bacillus cereus and Escherecia coli. Asian Journal of
Pharmaceuticl and Clinical Research. 9(5). 69-73.
Soliman, A.M., Lin, T.S., Ghafar, N.A. and Das, S. (2018). Virgin Coconut Oil and
Diabetic Wound Healing: Histopathological and Biochemical Analysis.
Eur J Anat. 22 (2): 135-144.
Stites DP, Rodgers RP, Folds JD, Schmitz J. (1997). Clinical laboratory methods
for detection of antigen and antibodies. In : Stites DP, Terr AI, Parslow
TG eds. Medical Immunology. 9th ed. Ney Jersey. Prentice Hall. Halaman
53 – 211.
Susanto, T.D., Sujatno, M., Kuswinarti dan Yuwono, H.S. (2015). Efek Anti
Bakteri Virgin Coconut Oil terhadap Methicillin Resistant
Staphylococus aureus. Medicinus. 4(8): 274-281.
Talwar, G. P., Hasnain, S.E., Sarin, S.K. (2016). Textbook of Biochemistry,

Biotechnology, Allied and Molecular Medicine. 4th edition. Delhi: PHI
Learning Private Limited. 74.
Thangapandi, M. (2013). Antibacterial effect of fucoidan from Sargassum

wightii against the chosen human bacterial pathogens. International
Current Pharmaceutical Journal. 2(10): 156-158.
Topman, G., Huelin, F., Gefen, A. (2013). The Natural Medication for Wound
Healing Curcumin, Aloe-Verrand, Ginger, do not induce a significant
90
effect on the migration kinematics of cultured fibroblasts. Journal of
Biomechanics. 46: 170–174.
Tsiouris, C.G. and Tsiouri, M.G. (2017). Human Microflora, Probiotics and
Wound Healing. Wound Medicine. 19: 33-38.
Uchida, Koji (2017). HNE as an inducer of COX-2. Free Radical Biology &
Medicine. 111: 167-172.
Van, N.T.A., Hoa, P.N., Lam, T.B., and Ai, C.T.D. (2016). Enzymatic Hydrolisis
of Coconut Oil Using Free and Immobilized Porcine Pancreas Lipases.
Science and Technology Development. 19(3): 70-74.
Velnar, T., Bailey, T. and Smrkolj, V. (2009). The Wound Healing Process: An
Overview of The Cellular and Molecular Mecanisms. The Journal of
International Medical Research. 37 (5): 1528-1542.
Vo,T. and Kim, S. (2013). Fucoidan As A Natural Bioactive Ingredient For

Functional Foods. Journal Of Functional Foods. 5: 16-27.
Wang, P., Huang, B., Horng, H., Yeh, C. and Chen, Y. (2018). Wound Healing.
Journal Of The Chinese Medical Assosiation. 81. 94-101.
Wijesinghe, W.A.J.P. and Jeon, Y.J. (2012). Biological Activities and Potential
Industrial Application of Fucose Rich Sulfated Polysaccharides and
Fucoidans Isolated From Brown Seaweeds: A Review. Carbohydrate
Polymers. 88: 13-20.
Yunhai, H. (2016). In vitro Antibacterial Activity of Fucoidan Isolated from

Ascophyllum nodosum and Laminaria digitata. Nations University
Fisheries Training Programme. Final Project: 1-30.
Zhang, Y., Guan, X.Y., Dong, B., Zhao, M., Wu, J.H., Tian, X.Y., dkk. (2012).
Expression of MMP-9 and WAVE3 in colorectal cancer and its
relationship to clinicopathological features. J Cancer Res Clin Oncol.
(138): 2035–2044.
91
Lampiran 1 . Rekomendasi Persetujuan Etik Penelitian Kesehatan
92
Lampiran 2. Gambar alat-alat
A B
C D
E F G
Keterangan : (A) Inkubator CO2 (Heraeus) tampak luar; (B) Inkubator CO2
(Heraeus) tampak dalam; (C) Microplate reader (Bio-Rad
microplate reader Benchmark serial no.11565, Jepang); (D)
Mikropipet berbagai ukuran; (E) haemocytometer (Nebauer
improved 0,100 mm Tiefe Depth Profondeur 0,0025 mm2 ,
Germany); (F) Counter; (G) Mikroplate 96-sumuran (Iwaki)
93
Lampiran 3. Gambar bahan-bahan
B C
Keterangan : (A) Bahan uji di dalam microtube yakni VCO, Aloclair,

HVCO,fucoidan; (B) Fucoidan (diperoleh dari PT. Kalbe Tbk.); (C) VCO merek
Palem Mustika; (D) Media kultur MK-DMEM
94
Lampiran 4. Sertifikat Analisis Fucoidan
95
Lampiran 5. Gambar sel NIH 3T3
Keterangan : (A) Sel NIH 3T3 baru ditanam kedalam sumuran (B) Sel NIH 3T3
sudah konfluent dan siap untuk dipanen
96
Lampiran 6. Gambar goresan pada sel monolayer pada pengujian migrasi
97
Lampiran 7. Bagan Alur Penelitian
30 g minyak dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml
Ditambahkan 30 ml aquades
Ditambahkan 12,5 ml CaCl2 0,063 M
Ditambahkan 25 ml larutan buffer Tris-HCl 1 M

pH 8
Ditambahkan 3 ml enzim lipase Rhizomucor
miehei
Dikocok dengan shaker kecepatan 200 rpm selama

10 menit
Diinkubasi pada suhu 50oC selama 10 jam, dan

setiap jamnya dikocok selama 10 menit
Dipindahkan ke corong pisah untuk diekstraksi
Hasil hidrolisis VCO sebelum ekstraksi (berlanjut)
98
Lampiran 7 (Sambungan)
Hasil hidrolisis VCO sebelum ekstraksi (lanjutan)
Diekstraksi dengan 50 ml n-heksan
Didimkan beberapa saat
Residu : Filtrat I :
Fraksi air (lapisan bawah) Fraksi n-heksan (lapisan
atas)
Diekstraksi dengan 50 ml
n-heksan
Didimkan beberapa saat
Residu : Filtrat II :
Fraksi air (lapisan Fraksi n-heksan (lapisan
bawah) atas)
Digabungkan
Ditambahkan 250 mg Na2SO4

anhidrat, diamkan 15 menit
Diuapkan diatas penangas air

untuk menghilangkan n-heksan
Hasil hidrolisis VCO: asam lemak bebas,

monogliserida dan trigliserida (berlanjut)
99
Hasil hidrolisis VCO: asam lemak bebas,

monogliserida dan trigliserida (berlanjut)
Dihitung jumlah asam lemak bebas

dengan penentuan nilai bilangan
asam
Hasil hidrolisis VCO (HVCO) Fucoidan
Uji proliferasi sel NIH3T3 24 jam
Konsentrasi terbaik Konsentrasi terbaik

HVCO fucoidan
Dibuat konsentrasi kombinasi 50:50; 25:75;75:25
Uji migrasi sel NIH3T3 0,

24, 48, 72 jam
Konsentrasi kombinasi terbaik
Uji ekspresi COX-2 dan

VEGF
Aktivitas penyembuhan luka secara in-vitro
100
Lampiran 8. Prosedur Pembuatan Media Kultur
1 sachet DMEM, 2 gram Hepes NaHCO3 dimasukkan

ke dalam erlenmeyer
Ditambahkan 800 ml aquabides steril
Dihomogenkan dengan magnetic stirer
Diukur pH dengan pH meter (pH yang diinginkan

7,2 -7,4)
Ditambahkan aquabides steril sampai 1 L
Dilakukan sterilisasi dengan filter vakum didalam

LAF
Dipasang filter apparatus steril pada botol duran 1

L steril
Dilakukan proses penyaringan dengan filter
Ditampung aliquot ke dalam botol duran 500 mL,

diberi identitas pada botol media (nama media, tanggal
pembuatan, expired date, dan nama pembuat)
101
Lampiran 9. Prosedur Pembuatan Media Kultur Lengkap
Dicampur Fetal Bovin Serum (FBS), Penisillin-

Streptomisin, fungizone, DMEM (dilakukan dalam
LAF)
Diberi identitas pada botol MK (nama media, tanggal

pembuatan, expired date, dan nama pembuat)
102
Lampiran 10. Prosedur Penumbuhan Sel NIH 3T3
Diambil 10 ml media DMEM pada tabung konikel 15

ml
Dimasukkan tetes demi tetes suspensi sel NIH

3T3 dari ampul
Disentrifuge pada 600 rpm selama 5 menit
Dibuang supernatan dan ditambahkan 4 ml MK

DMEM, lalu di resuspensi
Ditransfer masing-masing 2 ml ke dalam flask

kultur baru
Ditambahkan 5 ml DMEM ke dalam masing-

masing flask kultur dan dihomogenkan
Diamati kondisi sel dengan menggunakan inverted

microscope
Dipastikan sel homogen pada seluruh permukaan

flask kultur
Diberi identitas pada flask kultur, lalu disimpan dalam

inkubator CO2
103
Lampiran 11. Prosedur Subkultur Sel
Diambil 500 µL panenan sel
Dimasukkan ke dalam flask kultur
Ditambahkan 6 ml DMEM
dihomogenkan
Diinkubasi sel dengan inkubator CO2
Diamati kondisi sel pada keesokan harinya
104
Lampiran 12. Prosedur Panen Sel
Dibuang DMEM dari flask dengan mikropipet
Dicuci sel 2 kali dengan 5 ml PBS
Ditambahkan 300-500 µL tripsin-EDTA 0,25%

secara merata
Diinkubasi dalam inkubator CO2 selama ± 5

menit
Ditambahkan 4 ml MK untuk menginaktifkan

tripsin
Diresuspensi sel dengan mikropipet agar sel

terlepas satu-satu (tidak menggerombol)
Diamati kondisi sel dengan menggunakan inverted

microscope
Diresuspensi sel kembali jika masih ada sel yang

menggerombol
Ditransfer sel ke dalam tabung kronikel
105
Lampiran 13. Prosedur Penghitungan Sel
Diambil 10 µL panenan sel dari konikel
Dipipetkan ke dalam hemositometer
Dihitung jumlah sel di bawah mikroskop dengan

menggunakan counter
Dihitung jumlah sel pada 4 kamar hemositometer,

sel yang gelap (mati) dan sel yang berada dibatas
luar di sebelah kiri dan atas tidak ikut dihitung
Dihitung jumlah volume sel yang diperlukan

sesuai kebutuhan
Diambil volume panenan sel, transfer ke tabung

konikel baru kemudian tambahkan MK sampai total
volume yang diperlukan
106
Lampiran 14. Prosedur Pembuatan Larutan Uji
Ditimbang sampel sebanyak 50 mg dalam politube
Dilarutkan dalam DMSO sebanyak 1000 µL
Divortex agar sampel terlarut sempurna
Dicukupkan dengan media kultur MK-DMEM
Dibuat pengenceran selanjutnya sampai diperoleh

larutan uji dengan konsentrasi 500 µg/ml; 250 µg/ml;
125 µg/ml; 62,5 µg/ml; 31,25 µg/ml dan 15,625
µg/ml (pengenceran dengan DMEM)
107
Lampiran 15. Prosedur Uji aktivitas proliferasi Sel
Disiapkan sel NIH 3T3 dalam 10 ml media DMEM pada

microplate 96- sumuran dengan konsentrasi 104 sel/ sumuran,
pipet sebanyak 100 µL kedalam masing-masing sumuran
Diinkubasi selama 24 jam
Media dibuang dari microplate 96-sumuran, kemudian

ditambahkan larutan uji yang telah diencerkan dengan
MK DMEM dengan berbagai konsentrasi @ 100 µl
Diinkubasi selama 24 jam
Ditambahkan 100 µL MTT (sigma) 5 mg/ml pada

masing-masing sumuran
Diinkubasi kembali sel NIH 3T3 selama 4-6 jam

dalam inkubator CO2 5%, 37oC
Dihentikan reaksi MTT dengan reagen stopper

(SDS 10% dalam HCl 0,01N)
Dibungkus plate dibiarkan selama satu malam
Serapan dibaca dengan microplate reader (Biorad)

pada panjang gelombang 595 nm
108
Lampiran 16. Prosedur Scratch Wound Healing
Ditanam sel NIH 3T3 dalam 10 ml media DMEM

pada microplate 24- sumuran dengan konsentrasi 5 x
104 sel/ ml
Diinkubasi selama 24 jam dalam media kultur

lengkap, lalu cuci sel dengan PBS dan ganti
media dengan FBS 0,5 %, inkubasi kembali
selama 24 jam
Dibuat goresan pada permukaan dasar sumuran

dengan menggunakan ujung yellow tip
Media lama dibuang dan di cuci dengan PBS

hingga pencucian sel benar-benar bersih
Dilakukan pengambilan gambar dari tiap kelompok

dengan menggunakan inverted microscope
Sel kemudian diberikan bahan uji yang sudah

diencerkan dalam media MK DMEM sesuai variasi
konsentrasi yang diinginkan, inkubasi dalam
inkubator CO2
Dilakukan pengambilan gambar dari tiap kelompok

dengan menggunakan inverted microscope pada
jam ke 0, 24, 48 dan 72 jam setelah pemberian
Dipindahkan citra mikroskopis dalam format JPEG
Diukur Pixel jarak goresan awal dengan pixel area

yang kosong dengan menggunakan software ImageJ
109
Lampiran 17. Prosedur Analisa Ekspresi protein COX-2 dan VEGF dengan
Metode Imunositokimia
Ditanam sel NIH 3T3 pada microplate 24 - sumuran

dengan jumlah 5 x 104 sel/ ml pada tiap sumuran,
sebelumnya sudah dimasukkan cover slip
Diinkubasi dalam media MK DMEM pada

inkubator CO2 5% selama 24 jam pada suhu 37oC
Media dibuang, lalu sel diberikan larutan uji

dalam media MK DMEM
Diinkubasi kembali dalam inkubator CO2 5%

selama 24 jam pada suhu 37oC
Dilakukan fiksasi dengan metanol, lalu dicuci

dengan aquades, kemudian inkubasi dengan larutan
hidrogen peroxide blocking
Diinkubasi dengan prediluted blocking serum, lalu

ditambahkan anti bodi monoklonal COX-2 ,
inkubasi kembali
Dicuci coverslip dengan PBS dan ditetesi antibodi

sekunder (biotinylated universal secondary
antibody), tetesi dengan streptavidin-enzim horse
radish peroxide dan tambahkan 3,3’-
diaminobenzidin, lalu inkubasikan
Lakukan dokumentasi ekspresi dengan optilab

penghitungan dengan menggunakan software
image raster
Data ekspresi protein COX-2 dan VEGF
110
Lampiran 18. Data bilangan asam VCO dan HVCO
 Standarisari NaOH 0,5 N
Rumus hitung pembakuan NaOH (Normalitas NaOH)
Miligrek kalium biftalat = miligrek NaOH
N NaOH = miligram kalium biftalat

BE x V
Keterangan:
N NaOH = Normalitas NaOH
Miligram asam kalium biftalat = berat kalium biftalat yang ditimbang
BE = Berat ekivalen kalium biftalat
V = volume titrasi
No. Berat kalium biftalat (mg) Volume titrasi (ml) Normalitas (N)
1 20,07 2,0 0,4913
2 20,03 2,1 0,4670
3 20,17 2,1 0,4762
Normalitas rata-rata 0,4762
 Penentuan bilangan asam VCO dan HVCO
Bilangan asam = ml x N x BM NaOH

g
Keterangan:
ml = volume titrasi
N NaOH = Normalitas NaOH (0,4762)
BM NaOH = 40
g = Berat minyak yang diuji
Bilangan asam yang diperoleh dalam mg NAOH/ g minyak kemudian dikonversi
menjadi mg KOH/ g minyak, dengan rumus :
Bilangan asam KOH = Bilangan Asam NaOH x BM KOH

BM NaOH
BM KOH = 56
111
a. Bilangan asam minyak kelapa murni (VCO)
No. Berat sampel Volume Bilangan Asam (mg Bilangan Asam

(g) titrasi (ml) NaOH/ g minyak) (mg KOH/ g
minyak)
1 5,1701 0,2 0,7737 1,0832
2 5,1902 0,2 0,7706 1,0789
3 5,2575 0,2 0,7608 1,0651
b. Bilangan asam hasil hidrolisis minyak kelapa murni (HVCO)
No. Berat sampel Volume Bilangan Asam (mg Bilangan Asam

(g) titrasi (ml) NaOH/ g minyak) (mg KOH/ g
minyak)
1 5,0053 25,1 95,7513 134,0519
2 5,0047 24,9 94,9997 132,9997
3 5,0062 25,2 96,1155 134,5617
112
Lampiran 19. Perhitungan persentase sel hidup pada pengujian aktivitas
proliferasi sel
Rumus hitung persentase sel hidup
Contoh % sel hidup untuk HVCO 500 mcg/ml sebagai berikut:
10,000 %
Konsentrasi Bahan Persentase sel

Bahan Uji Absorbansi
Uji hidup (%)
HVCO 500 mcg/ ml 0,127 10,000

0,130 10,625
0,136 11,875
250 mcg/ ml 0,231 31,667
0,219 29,167
0,172 19,375
125 mcg/ ml 0,650 118,958
0,711 131,667
0,742 138,125
62,5 mcg/ ml 0,721 133,750
0,719 133,333
0,723 134,167
31,25 mcg/ ml 0,734 136,458
0,753 140,417
0,758 141,458
15,625 mcg/ ml 0,598 89,778
0,596 89,436
0,587 87,899
Fucoidan 500 mcg/ ml 0,637 116,250
0,576 103,542
0,558 99,792
250 mcg/ ml 0,622 113,125
0,589 106,250
0,608 110,208
Lampiran 19 (Lanjutan)
113
Konsentrasi Bahan Persentase sel
Bahan Uji Absorbansi
Uji hidup (%)
Fucoidan 125 mcg/ ml 0,674 123,958

0,652 119,375
0,541 96,250
62,5 mcg/ ml 0,642 117,292
0,633 115,417
0,708 131,042
31,25 mcg/ ml 0,739 137,500
0,652 119,375
0,591 106,667
15,625 mcg/ ml 0,593 88,924
0,599 89,949
0,589 88,240
Aloclair® 500 mcg/ ml 0,678 124,792
0,704 130,208
0,688 126,875
250 mcg/ ml 0,813 152,917
0,873 165,417
0,801 150,417
125 mcg/ ml 0,867 164,167
0,845 159,583
0,782 146,458
62,5 mcg/ ml 0,818 153,958
0,837 157,917
0,773 144,583
31,25 mcg/ ml 0,844 159,375
0,771 144,167
0,719 133,333
15,625 mcg/ ml 0,584 87,386
0,590 88,411
0,595 89,265
Kontrol Sel 0,605 109,583
0,565 101,250
0,507 89,167
Kontrol Media 0,076 -0,625
0,089 2,083
0,072 -1,458
Lampiran 20. Perhitungan persentase penyembuhan luka pada pengujian migrasi
114
Rumus hitung persentase penutupan luka
Contoh % penutupan luka untuk kontrol sel pada inkubasi 24 jam adalah:
Lama inkubasi 24 Lama inkubasi 48

Luas Lama inkubasi 72 jam
jam jam
Area
No Sampel Luas % %
kosong Luas Area Luas Area % migrasi
Area migrasi migrasi
Awal kosong kosong sel
kosong sel sel
1 143346 120441 15,85 35679 75,07 0 100,00
Kontrol sel 143051 12034 15,43 36499 74,50 0 100,00
143819 122437 14,45 37916 73,51 0 100,00
2 143651 101290 29,23 27380 80,87 15669 92,71
Aloclair® 143747 103462 27,71 24707 82,74 15987 91,78
143782 101918 28,79 22860 84,03 14961 93,66

3 143066 99069 30,78 19821 86,15 0 100,00
Fucoidan
143927 100810 29,57 20615 85,60 0 100,00
tunggal
143041 101935 28,78 21329 85,10 0 100,00
4 143781 53996 62,27 0 100,00 0 100,00
HVCO
143405 54890 61,65 0 100,00 0 100,00
tunggal
143314 52688 63,19 0 100,00 0 100,00
5 Kombinasi 143133 33000 76,94 0 100,00 0 100,00
HVCO 143293 31890 77,72 0 100,00 0 100,00
Fucoidan
50:50 143050 31688 77,86 0 100,00 0 100,00
6 Kombinasi 143346 139514 2,52 147.475 -3,04 169158 -18,19
HVCO 143051 139881 2,27 147.721 -3,21 169277 -18,27
Fucoidan
25:75 143819 139057 2,84 148.458 -3,73 169242 -18,25
7 Kombinasi 143406 156015 -9,71 169.158 -18,19 185744 -29,78
HVCO 143562 155275 -9,01 169.277 -18,27 184303 -28,77
Fucoidan
75:25 143658 150116 -8,49 169.242 -18,25 185023 -29,27
Lampiran 21. Perhitungan ekspresi protein COX-2 dan VEGF

Rumus hitung ekspresi protein:
Contoh % ekspresi protein COX-2 untuk Kontrol pada inkubasi 24 jam adalah:
115
a. Ekspresi protein COX-2
Jumlah Jumlah Sel Total % Ekspresi

No Bahan Uji Sel tidak Jumlah Protein
terekspresi terekspresi Sel COX-2
1 Kontrol 14 184 198 7,070707071
12 185 197 6,091370558
12 179 191 6,282722513
2 Aloclair® 50 136 186 26,88172043
52 142 194 26,80412371
54 141 195 27,69230769
3 HVCO Tunggal 46 113 159 28,93081761
44 112 156 28,20512821
45 115 160 28,125
4 Fucoidan Tunggal 46 125 171 26,9005848
47 129 176 26,70454545
49 132 181 27,0718232
5 Kombinasi HVCO 63 119 182 34,61538462
Fucoidan 50:50 65 121 186 34,94623656
59 111 170 34,70588235
Lampiran 21. (Lanjutan)

b. Ekspresi protein VEGF
Jumlah Jumlah Sel Total % Ekspresi

No Bahan Uji Sel tidak Jumlah Protein
terekspresi terekspresi Sel VEGF
1 Kontrol 11 147 158 6,962025316
13 154 167 7,784431138
11 139 150 7,333333333
2 Aloclair® 59 116 175 33,71428571
62 123 185 33,51351351
55 114 169 32,5443787
3 HVCO Tunggal 58 166 224 25,89285714
55 163 218 25,2293578
116
52 154 206 25,24271845
4 Fucoidan Tunggal 61 159 220 27,72727273
59 155 214 27,57009346
56 152 208 26,92307692
5 Kombinasi HVCO 67 160 227 29,5154185
Fucoidan 50:50 72 164 236 30,50847458
69 159 228 30,26315789
117
Lampiran 22. Analisis statistik dari persen sel hidup pada pengujian aktivitas
proliferasi sel
a. Uji Normalitas sampel
Tests of Normality
a
Kolmogorov-Smirnov Shapiro-Wilk
Bahan Uji Statistic df Sig. Statistic Df Sig.
PERS HVCO 500 ,253 3 . ,964 3 ,637

ENTA HVCO 250 ,313 3 . ,895 3 ,370
SE HVCO 125 ,251 3 . ,966 3 ,645
PROLI
HVCO 62,5 ,175 3 . 1,000 3 1,000
FERA
HVCO 31,25 ,310 3 . ,898 3 ,379
SI
HVCO 15,625 ,321 3 . ,881 3 ,328
Fucoidan 500 ,302 3 . ,910 3 ,418
Fucoidan 250 ,207 3 . ,992 3 ,833
Fucoidan 125 ,328 3 . ,870 3 ,296
Fucoidan 62,5 ,345 3 . ,839 3 ,210
Fucoidan 31,25 ,213 3 . ,990 3 ,807
Fucoidan 15,625 ,219 3 . ,987 3 ,781
Aloclair 500 ,227 3 . ,983 3 ,747
Aloclair 250 ,328 3 . ,871 3 ,298
Aloclair 125 ,288 3 . ,928 3 ,481
Aloclair 62,5 ,271 3 . ,948 3 ,560

Aloclair 31,25 ,211 3 . ,991 3 ,815
Aloclair 15,625 ,191 3 . ,997 3 ,900
Kontrol sel ,215 3 . ,989 3 ,798
Kontrol media ,299 3 . ,915 3 ,433
a. Lilliefors Significance Correction
118
b. Uji Anova
Descriptives
PERSENTASE PROLIFERASI
95% Confidence
Interval for Mean
Std. Lower Upper Minimu
N Mean Deviation Std. Error Bound Bound m Maximum
HVCO 500 3 10,8333 ,95470 ,55120 8,4617 13,2049 10,00 11,88
HVCO 250 3 26,7363 6,49649 3,75075 10,5982 42,8745 19,38 31,67
HVCO 125 3 129,5833 9,75191 5,63027 105,3582 153,8084 118,96 138,13
HVCO 62,5 3 133,7500 ,41700 ,24076 132,7141 134,7859 133,33 134,17
HVCO 31,25 3 139,4443 2,63810 1,52311 132,8909 145,9977 136,46 141,46
HVCO 15,625 3 89,0377 1,00083 ,57783 86,5515 101,5239 87,90 89,78
Fucoidan 500 3 106,5280 8,62575 4,98008 85,1004 127,9556 99,79 116,25
Fucoidan 250 3 109,8610 3,45061 1,99221 101,2892 118,4328 106,25 113,13
Fucoidan 125 3 113,1943 14,85206 8,57484 76,2998 150,0889 96,25 123,96
Fucoidan 62,5 3 121,2503 8,53150 4,92566 100,0569 142,4437 115,42 131,04
Fucoidan 31,25 3 121,1807 15,49561 8,94639 82,6874 159,6739 106,67 137,50
Fucoidan 15,625 3 89,0377 ,86015 ,49661 86,9009 101,1744 88,24 89,95
Aloclair 500 3 127,2917 2,73194 1,57728 120,5052 134,0782 124,79 130,21
Aloclair 250 3 156,2503 8,03638 4,63980 136,2869 176,2138 150,42 165,42
Aloclair 125 3 156,7360 9,19137 5,30664 133,9034 179,5686 146,46 164,17
Aloclair 62,5 3 152,1527 6,84787 3,95362 135,1416 169,1637 144,58 157,92
Aloclair 31,25 3 145,6250 13,08208 7,55294 113,1273 178,1227 133,33 159,38
Aloclair 15,625 3 88,3540 ,94080 ,54317 86,0169 100,6911 87,39 89,27
Kontrol sel 3 100,0000 10,26524 5,92664 74,4997 125,5003 89,17 109,58
Kontrol media 3 ,0000 1,85139 1,06890 -4,5991 4,5991 -1,46 2,08
Total 60 107,3423 44,98158 5,80710 95,7224 118,9623 -1,46 165,42
ANOVA
PERSENTASE PROLIFERASI
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 116874,921 19 6151,312 98,332 ,000

Within Groups 2502,270 40 62,557
Total 119377,191 59
119
PERSENTASE PROLIFERASI SEL
a
Tukey HSD
Subset for alpha = 0.05
Bahan Uji N 1 2 3 4 5 6 7 8
Kontrol media 3 ,0000
HVCO 500 3 10,8333 10,8333
HVCO 250 3 26,7363
Aloclair 15,625 3 88,3540
HVCO 15,625 3 89,0377
Fucoidan 15,625 3 89,0377
Kontrol sel 3 100,0000
Fucoidan 500 3 106,5280 106,5280
Fucoidan 250 3 109,8610 109,8610 109,8610
Fucoidan 125 3 113,1943 113,1943 113,1943
Fucoidan 31,25 3 121,1807 121,1807 121,1807 121,1807
Fucoidan 62,5 3 121,2503 121,2503 121,2503 121,2503
Aloclair 500 3 127,2917 127,2917 127,2917
HVCO 125 3 129,5833 129,5833 129,5833 129,5833
HVCO 62,5 3 133,7500 133,7500 133,7500 133,7500
HVCO 31,25 3 139,4443 139,4443 139,4443
Aloclair 31,25 3 145,6250 145,6250 145,6250
Aloclair 62,5 3 152,1527 152,1527
Aloclair 250 3 156,2503
Aloclair 125 3 156,7360
Sig. ,973 ,616 ,090 ,085 ,062 ,050 ,101 ,087
Means for groups in homogeneous subsets are displayed.
a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3,000.
120
Lampiran 23. Analisis statistik dari persentase penyembuhan luka pada uji
aktivitas migrasi sel
Tests of Normalityb,c,d,e,f,g
Kolmogorov-
Smirnova Shapiro-Wilk
Bahan Uji Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Pesen KONTROL SEL 24 JAM ,269 3 . ,949 3 ,567
Penutupan KONTROL POSITIF 24 JAM ,274 3 . ,944 3 ,545
Luka FUCOIDAN TUNGGAL 24 JAM ,222 3 . ,986 3 ,770
HVCO TUNGGAL 24 JAM ,218 3 . ,988 3 ,786
KOMBINASI HVCO FUCOIDAN
,333 3 . ,861 3 ,271
50:50 24 JAM
,199 3 . ,995 3 ,865
25:75 24 JAM
,206 3 . ,993 3 ,838
75:25 24 JAM
KONTROL SEL 48 JAM ,237 3 . ,976 3 ,705
KONTROL POSITIF 48 JAM ,215 3 . ,989 3 ,798
FUCOIDAN TUNGGAL 48 JAM ,179 3 . ,999 3 ,948
,294 3 . ,921 3 ,456
25:75 48 JAM
,292 3 . ,923 3 ,463
75:25 48 JAM
KONTROL POSITIF 72 JAM ,176 3 . 1,000 3 ,988
,292 3 . ,923 3 ,463
25:75 72 JAM
,175 3 . 1,000 3 ,989
75:25 72 JAM
b. Pesen Penutupan Luka is constant when Bahan Uji = HVCO TUNGGAL 48 JAM. It has been omitted.
c. Pesen Penutupan Luka is constant when Bahan Uji = KOMBINASI HVCO FUCOIDAN 50:50 48 JAM. It
has been omitted.
d. Pesen Penutupan Luka is constant when Bahan Uji = KONTROL SEL 72 JAM. It has been omitted.
e. Pesen Penutupan Luka is constant when Bahan Uji = FUCOIDAN TUNGGAL 72 JAM. It has been omitted.
f. Pesen Penutupan Luka is constant when Bahan Uji = HVCO TUNGGAL 72 JAM. It has been omitted.
g. Pesen Penutupan Luka is constant when Bahan Uji = KOMBINASI HVCO FUCOIDAN 50:50 72 JAM. It
has been omitted.
121
b. Uji Anova
Descriptives
Persen Penutupan Luka
95% Confidence Interval
for Mean
Std. Std. Lower Upper Minim Maxim
N Mean Deviation Error Bound Bound um um
KONTROL SEL 24 JAM 3 15,2433 ,71842 ,41478 13,4587 17,0280 14,45 15,85
ALOCLAIR 24 JAM 3 28,5767 ,78213 ,45157 26,6337 30,5196 27,71 29,23
FUCOIDAN TUNGGAL 24 JAM 3 29,7100 1,00732 ,58158 27,2077 32,2123 28,78 30,78
HVCO TUNGGAL 24 JAM 3 62,3700 ,77485 ,44736 60,4452 64,2948 61,65 63,19
KOMBINASI HVCO
3 77,5067 ,49571 ,28620 76,2752 78,7381 76,94 77,86
FUCOIDAN 50:50 24 JAM
KOMBINASI HVCO
3 2,5433 ,28572 ,16496 1,8336 3,2531 2,27 2,84
KOMBINASI HVCO
3 -9,0700 ,61221 ,35346 -10,5908 -7,5492 -9,71 -8,49
KONTROL SEL 48 JAM 3 74,3600 ,78937 ,45574 72,3991 76,3209 73,51 75,07
ALOCLAIR 48 JAM 3 82,5467 1,58885 ,91732 78,5998 86,4936 80,87 84,03
FUCOIDAN TUNGGAL 48 JAM 3 85,6167 ,52520 ,30322 84,3120 86,9213 85,10 86,15
HVCO TUNGGAL 48 JAM 3 100,0000 ,00000 ,00000 100,0000 100,0000 100,00 100,00
KOMBINASI HVCO
3 100,0000 ,00000 ,00000 100,0000 100,0000 100,00 100,00
KOMBINASI HVCO
3 -3,3267 ,35949 ,20755 -4,2197 -2,4336 -3,73 -3,04
KOMBINASI HVCO
3 -18,2367 ,04163 ,02404 -18,3401 -18,1332 -18,27 -18,19
KONTROL SEL 72 JAM 3 92,7167 ,94002 ,54272 90,3815 95,0518 91,78 93,66
ALOCLAIR 72 JAM 3 100,0000 ,00000 ,00000 100,0000 100,0000 100,00 100,00
FUCOIDAN TUNGGAL 72 JAM 3 100,0000 ,00000 ,00000 100,0000 100,0000 100,00 100,00
HVCO TUNGGAL 72 JAM 3 100,0000 ,00000 ,00000 100,0000 100,0000 100,00 100,00
KOMBINASI HVCO
3 100,0000 ,00000 ,00000 100,0000 100,0000 100,00 100,00
KOMBINASI HVCO
3 -18,2367 ,04163 ,02404 -18,3401 -18,1332 -18,27 -18,19
KOMBINASI HVCO
3 -29,2733 ,50501 ,29157 -30,5278 -28,0188 -29,78 -28,77
Total 6,0015
63 51,0975 47,63585 39,1005 63,0944 -29,78 100,00
5
122
ANOVA
Between Groups 140672,538 20 7033,627 18146,018 ,000

Within Groups 16,280 42 ,388
Total 140688,817 62
123
a
Tukey HSD
Bahan Uji N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
KOMBINASI HVCO FUCOIDAN 75:25 72

3 -29,2733
JAM

3 -18,2367
JAM

3 -18,2367
JAM

3 -9,0700
JAM

3 -3,3267
JAM

3 2,5433
JAM
KONTROL SEL 24 JAM 3 15,2433
ALOCLAIR 24 JAM 3 28,5767
FUCOIDAN TUNGGAL 24 JAM 3 29,7100
HVCO TUNGGAL 24 JAM 3 62,3700

3 77,5067
JAM
124

3 100,0000
JAM

3 100,0000
JAM
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 ,786 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000
125
Lampiran 24. Analisis statistik dari persentase ekspresi protein COX-2 pada uji
aktivitas ekspresi protein dengan metode imunositokia
Tests of Normality
Kolmogorov-
a
Smirnov Shapiro-Wilk
Statisti
Bahan Uji c df Sig. Statistic df Sig.
Persen KONTROL SEL ,316 3 . ,890 3 ,354

Ekspresi ALOCLAIR ,357 3 . ,815 3 ,151
COX-2 HVCO TUNGGAL ,353 3 . ,824 3 ,173
FUCOIDAN TUNGGAL ,185 3 . ,998 3 ,926
KOMBINASI HVCO
,282 3 . ,936 3 ,512
FUCOIDAN 50:50
b. Uji Anova
Descriptives
Persen Ekspresi COX-2
95% Confidence
Interval for Mean
Std. Std. Lower Upper Minimu Maxim

N Mean Deviation Error Bound Bound m um
KONTROL SEL 3 6,4816 ,51908 ,29969 5,1921 7,7711 6,09 7,07

ALOCLAIR 3 27,1261 ,49193 ,28401 25,9040 28,3481 26,80 27,69
HVCO TUNGGAL 3 28,4203 ,44392 ,25630 27,3176 29,5231 28,13 28,93
FUCOIDAN
3 26,8923 ,18378 ,10610 26,4358 27,3488 26,70 27,07
TUNGGAL
KOMBINASI HVCO
3 34,7558 ,17099 ,09872 34,3311 35,1806 34,62 34,95
FUCOIDAN 50:50
Total 15 24,7352 9,90747 2,55810 19,2486 30,2218 6,09 34,95
ANOVA
Between Groups 1372,669 4 343,167 2224,009 ,000
Total 1374,212 14
126
a
Tukey HSD
Bahan Uji N 1 2 3 4
KONTROL SEL 3 6,4816
FUCOIDAN TUNGGAL 3 26,8923
ALOCLAIR 3 27,1261
HVCO TUNGGAL 3 28,4203

3 34,7558
50:50
Sig. 1,000 ,945 1,000 1,000
127
Lampiran 25. Analisis statistik dari persentase ekspresi protein VEGF pada uji
aktivitas ekspresi protein dengan metode imunositokia
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Bahan Uji Statistic df Sig. Statistic df Sig.
PERSEN KONTROL SEL ,192 3 . ,997 3 ,893
EKSPRESI ALOCLAIR ,326 3 . ,874 3 ,308

VEGF HVCO TUNGGAL ,379 3 . ,765 3 ,034
FUCOIDAN TUNGGAL ,316 3 . ,890 3 ,354
KOMBINASI HVCO
,294 3 . ,921 3 ,457
FUCOIDAN 50:50
b. Uji Anova
Descriptives
PERSEN EKSPRESI VEGF
95% Confidence Interval
for Mean
Std. Lower Upper Maxim
N Mean Deviation Std. Error Bound Bound Minimum um
KONTROL SEL 3 7,3599 ,41185 ,23778 6,3368 8,3830 6,96 7,78
ALOCLAIR 3 33,2574 ,62559 ,36119 31,7033 34,8115 32,54 33,71
HVCO TUNGGAL 3 25,4550 ,37927 ,21897 24,5128 26,3971 25,23 25,89
FUCOIDAN
3 27,4068 ,42624 ,24609 26,3480 28,4656 26,92 27,73
TUNGGAL
KOMBINASI HVCO
3 30,0957 ,51728 ,29865 28,8107 31,3807 29,52 30,51
FUCOIDAN 50:50
Total 15 24,7150 9,39246 2,42512 19,5136 29,9163 6,96 33,71
ANOVA
Between Groups 1232,748 4 308,187 1335,196 ,000
Total 1235,057 14
128
a
Tukey HSD
Bahan Uji N 1 2 3 4 5
KONTROL SEL 3 7,3599
HVCO TUNGGAL 3 25,4550
FUCOIDAN TUNGGAL 3 27,4068
KOMBINASI HVCO
3 30,0957
FUCOIDAN 50:50
ALOCLAIR 3 33,2574
Sig. 1,000 1,000 1,000 1,000 1,000
129

Theses Penyembuhan Luka

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Judul Asli

Hak Cipta

Format Tersedia

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Format Tersedia

Theses Penyembuhan Luka

Diunggah oleh

Hak Cipta:

Format Tersedia

TESIS

AKTIVITAS PENYEMBUHAN LUKA DARI KOMBINASI

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

AKTIVITAS PENYEMBUHAN LUKA DARI KOMBINASI

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister

PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI

Nama Mahasiswa : Evayanti Meiliana Sagala

Ketua : Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.

Sekretaris : Yuandani, S.Farm, M.Si., Ph.D., Apt.

Anggota : Prof. Dr. Ginda Haro, M.Sc., Apt.

Dr. Edi Suwarso, SU, Apt.

Medan, 26 Juli 2019

Evayanti Meiliana Sagala

Kata kunci : MTT, viabilitas, proliferasi, migrasi, imunositokimia

Keywords: MTT, viability, proliferation, migration, immunocytochemistry

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 8

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................... 64

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .......................................................... 83

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................. 84

2.1 Sediaan farmasi untuk pengobatan lokal pada luka................................... 29

1.1 Diagram kerangka pikir penelitian...…………………………………… 7

1. Rekomendasi persetujuan etik penelitian kesehatan ............................... 91

bFGF : basic Fibroblast Growth Factor

1.1 Latar Belakang

atau cedera fisik dapat menyebabkan hancurnya jaringan kulit, yang

fungsinya. Penyembuhan luka merupakan suatu proses yang kompleks dengan

inflamasi, proliferasi, dan remodeling (Wang, et al.,2017; Dryden, et al., 2013;

Tujuan utama dari penyembuhan luka untuk mengembalikan sifat

Kontaminasi dan atau kolonisasi luka dengan bakteri seperti Staphylococcus

aureus (S. aureus), Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), dan streptokokus β-

antibiotik dan penurunan penemuan antibiotik baru. Efek samping penggunaan

melakukan penelitian terhadap bahan alam sebagai penyembuhan luka. Banyak

penyembuhan luka. Penelitian menunjukkan bahwa pengobatan dengan VCO

Penelitian sebelumnya telah membuktikan potensi angiogenesis dan

kolagen, proliferasi fibroblas, dan neovaskularisasi. Dengan peningkatan kolagen

et al., 2017; Nevin and Rajamohan, 2010; Perbina, 2019).

menghasilkan dua asam lemak bebas dan 2-monogliserida terutama 2-monolaurin

2010; Silalahi, et al., 2015; Perbina, 2019; Silalahi, et al., 2014).

Fucoidan adalah jenis kompleks polisakarida sulfat, umumnya

dasawarsa terakhir, fucoidan telah banyak sekali diteliti sehubungan dengan

aktivitas biologisnya, diantaranya sebagai imunomodulator, anti oksidan, anti

pertumbuhan seperti faktor pertumbuhan fibroblas (basic fibroblast growth factor

= bFGF) dan faktor pertumbuhan transformasi (transforming growth factor).

Fucoidan diketahui memiliki aktivitas penyembuhan luka karena dapat

meningkatkan proliferasi sel dengan memodulasi faktor pertumbuhan

transformasi (Transforming Growth Factor (TGF)-β1. Pada penelitian yang

menginduksi angiogenesis dan perbaikan luka. Park, et al. (2017) melakukan

hasil penelitian dapat diambil kesimpulan bahwa fucoidan dapat mempercepat

2010; Park, et al., 2017; O’Leary, et al., 2004).

Tampilan visual terakhir dari proses penyembuhan luka sangat penting

luka abnormal (Ashrafi, et al., 2018).

merupakan fenomena yang kompleks yang berhubungan dengan banyak proses

scratch wound healing assay. Pengukuran ini secara langsung memungkinkan

kemampuan interaksi sel-sel selama melakukan migrasi sel (CCRC, 2009).

mengatur angiogenesis dilakukan untuk melihat seberapa besar peningkatan

ekspresi protein tersebut. Peningkatan ekspresi COX-2 dan VEGF akan

mempercepat proses angiogenesis sehingga proses penyembuhan luka juga akan

sudah dilakukan, sedangkan uji aktivitas penyembuhan luka untuk kombinasi

aktivitas penyembuhan luka dari hasil hidrolisis minyak kelapa murni

metode MTT, sedangkan pengujian aktivitas migrasi sel dilakukan dengan

metode scratch migration assay. Pengujian aktivitas ekspresi protein yang

mengatur proses angiogenesis (COX-2 dan VEGF) dengan menggunakan metode