Terapi Gen

Sri Wahyuni
Bagian Biokimia
Fakultas Kedokteran UNIMAL
1. Pengantar
2. Aspek histori
3. Konsep dasar
4. Teknologi terapi gen
5. Terapi gen dalam klinikal trial
6. Penutup
Pengantar
Terapi gen
Aplikasi dari transfer gen pada pengobatan
suatu penyakit dengan memasukkan material
genetik (DNA atau mRNA) yang mengkode
protein yang mempunyai manfaat terapi dalam
tubuh penderita untuk menormalkan kembali
gen yang rusak sehingga fungsi biologi tubuh
kembali normal.
 Terapi Gen
• Urutan DNA diinsersikan dalam suatu sel
somatik untuk mengkoreksi mutasi
• Sel dapat diambil dari pasien untuk
dimanipulasi → reinsersi (ex vivo) atau
Somatic cell dimanipulasi tanpa diambil dari pasien (in
gene vivo)
• Sel target: Sel dengan waktu hidup panjang
therapy (sel sumsum tulang) atau limfosit

• DNA diinjeksikan dalam sebuah pronukleus

• DNA ditambahkan pada semua sel termasuk sel gamet
• Pernah dilakukan pada tikus, namun sebagian besar embrio mati,
membentuk tumor dan berbagai malformasi
Germline • Masalah etik tentang modifikasi permanen terhadap warisan
gene genetik sehingga tidak dilakukan pada manusia
therapy • Pada hewan coba untuk model penyakit manusia → hewan coba
transgenik
Keunggulan Terapi Gen

1. Dapat menggantikan disfungsi atau defisiensi

gen yang disebabkan oleh penyakitnya
2. Dapat menghasilkan protein secara terus
menerus yang secara normal waktu paruhnya
pendek
3. Dapat ditujukan pada tempat atau sel
tertentu sehingga efek toksik sistemik bisa
dihindari
4. Meningkatkan ketaatan dan menurunkan biaya
pengobatan
 Tantangan
• Terbatasnya ukuran dari vektor yang
diinsersikan. Beberapa kasus sekuens
DNA yang dibutuhkan terlalu besar untuk
dimasukkan dalam vektor virus
• Level ekspresi gen rendah (sekuens DNA
diinsersikan secara acak ke DNA host,
sekuens gen regulator tidak ada → under-
expression or transient expression
• Sulitnya mencapai jaringan yang sakit
(contoh otak)
Sejarah
• 1918 – Griffit membuktikan material
bakteri bisa saling tertukar.
• 1944-Macleod & MacCarty membuktikan
DNA yg bertanggung jawab thd
transformasi bakteri patogen.
• Sejak pertengahan abad 20 diyakini
DNA mempengaruhi fenotif suatu
organisme.
• 1972 teknologi kloning ditemukan
Recombinant DNA technology in drug discovery

+ +
Vektor fragmen DNA DNA rekombinan bakteri

DNA rekombinan
Replikasi DNA masuk dalam host
rekombinan

Pembelahan host

Koloni bakteri pada kultur

 Recombinant DNA technology products in clinical development

Product Disease indication Status

Hormones & Growth Factors
Human insulin Diabetes Approved 1982
Human growth hormone (hGH) Growth hormone deficiency Approved 1985
Epidermal growth factor (EGF) Corneal transplants, cancer, Phase I/II
burns, ulcers, wound healing
Tissue necrosis factor (TNF) Cancer, wound healing Preregistration
Erythropoetin (EPO) Anemia of kidney dialisis Approved 1989
Enzymes and Inhibitors
Tissue-type plasminogen Myocardial infarction Approved 1987
activator (t-PA) Pulmonary embolism Approved 1990
Factor VII:C Hemophilia Phase II
Factor VIII Hemophilia Approved 1993
Urokinase Myocardial infraction Phase II
Cytokines
Interleukin-2 (IL-2) Renal cell carcinoma Approved 1992
IL-4 Cancer immunomodulator Phase I/II
Interferon- (INF- ) Hairy-cell leukemia Approved 1986
INF-  AIDS Approved 1993
Clinical trial terapi gen

• 1990- Retroviral vector for ADA-SCID

• 1992- Plasmid for Alpha-1-Trypsin Deficiency
• 1993-Adenovirus vector for Cystic Fibrosis
• 1995- Adeno-Associated vector- CF
• 1996- Fowl pox vector- Melanoma
• 1997- Herpes Simplex- Glioblastoma
• 2002- Lentivirus vector for HIV-1
• 2003- Measles virus for Ovarian Cancer
Konsep dasar terapi gen
Mekanisme molekuler terapi gen
Protein Produk Terapi Gen

1. Berfungsi secara intraselular misalnya

adenosin deaminase untuk mengoreksi
mutasi dalam limfosit.
2. Menggantikan protein membran sel
misalnya mutan CFTR saluran ion Cl
pada CF (Cystic Fibrosis).
3. Memacu sekresi protein sitokin tertentu
seperti interleukin-2 dan TNF.
Material genetik pada terapi gen
1. Transfer gen luar ke dalam sel dengan tujuan :
‣ menggantikan fungsi gen mutan dalam sel (gen
supresor tumor wild-type, gen eksogen CF).
‣ meningkatkan sistem imunitas tubuh thd
penyakit.
‣ menghasilkan enzim pemetabolisme prodrug.
3. Terapi antisen untuk mempengaruhi ekspresi gen
yg berperan dlm timbulnya penyakit.
4. Penggunaan ribozim untuk menghentikan fungsi
mRNA (ribozim memutuskan urutan mRNA mutan
dan mencegah translasinya menjadi polipeptida)
 Teknologi Antisen pada Terapi Gen

Oligonukleotida dengan urutan DNA

komplementer dengan mRNA dari urutan DNA
yang mutasi → hibridisasi dengan mRNA →
menghambat translasi produk protein abnormal
Komponen material genetik yg ditransfer

• Seluruh sekuen yg mengkode protein

(intron, nuclear localization, sinyal sekresi
protein)
• Komponen yang diperlukan untuk
memproduksi RNA lewat transkripsi dan
protein lewat translasi
• Sekuen pengatur transkripsi (elemen
promotor gen & tempat awal transkripsi)
• Sekuen RNA poliadenilasi yg mempengaruhi
stabilitas RNA
• DNA mudah diinsersikan ke plasmid
 Single gen Rec. enzim
Tranfer Gen

Gen & regulator Rec. reg & enzim

Sel target dalam terapi gen
1. Germ sel
2. Sel somatik
- sel darah
- sel sungsumg tulang
- sel hepar
- sel otak Membelah
atau tidak
- sel otot
- sel paru
- sel tumor
Teknologi terapi gen
Prasyarat Terapi Gen
1. Calon penyakit untuk terapi gen harus
diidentifikasi.
2. Dasar genetika penyakit harus ditetapkan:
‣ Identifikasi protein penyebab penyakit
‣ Kloning gen yang mengkode
‣ Menemukan marker kromosom
3. Patofisiologi penyakit diketahui
4. Metode deteksi ekspresi gen eksogen, RNA,
protein dan fungsinya dalam sel target diketahui
5. Evaluasi efektivitas transfer gen in vitro dan in
vivo dikembangkan.
 Vektor pembawa untuk Terapi Gen

Non virus –Based Vectors Virus-Based Vectors

• Naked DNA • Retrovirus
• Liposom-DNA • Adenovirus
• Adeno-associated virus
• Lentinovirus
• Herpes simplex virus
 Karakteristik Vektor untuk Terapi Gen
Vehicle Advantages Disadvantages
NONVIRAL
• Naked DNA  Ease of production • Low efficiency
 No DNA size limitation
• Liposome-DNA  Ease of production  Low efficiency
 No DNA size limitation
 Low immune reaction
VIRAL
• Retrovirus  Ease of production • Transfer to dividing cells only
 Efficient DNA transfer • Random DNA integration
 Stable expression • DNA transfer size limited
 Low immune reaction
• Adenovirus  Ease of production • Host immune reaction
 Efficient DNA transfer • Transient expression
 Transfer to non dividing cells • DNA transfer size limited
Sediaan Umum untuk Transfer Gen
 Liposome based vector

Liposom tidak memiliki peptida →

tidak menstimulasi respon imun
Teknik penghantaran dan cara pemberian

1. Penghantaran ex vivo
‣ mengambil sel target, melakukan rekayasa
genetik, dan mentranplantasikan kembali.
‣ untuk sel yg dapat diambil dan dikultur
scr in vitro (limfosit, hepatosit, sel tumor, dll).
2. Penghantaran in vivo
‣ menginjeksikan langsung vektor pembawa gen
pada sel target (otak, paru-paru, hepar, otot, dll)
Penghantaran ex vivo
 Evaluasi keberhasilan terapi gen
1. Farmakokinetika terapi gen ditetapkan melalui
besar dan durasi ekspresi gen dg mengukur :
- jumlah DNA yg mencapai sel target
- jumlah RNA & protein yg diproduksi & fungsinya
2. Besar ekspresi tergantung penyakit & ditentukan :
- waktu paro protein
- tujuan pengobatan
- efesiensi transfer & potensi promotor gen
3. Durasi ekspresi gen tergantung vektor
- umumnya vektor untuk menghasilkan ekspresi
sementara pd penyakit non genetik & infeksi
- ekspresi tetap/jangka panjang dg menyatukan gen
transfer dg genom sel inang dg teknik ex vivo
4. Evaluasi keamanan terapi gen
Pertimbangan rasio keamanan dan
efektivitas sama dengan pertimbangan
pada obat standar
 Drug discovery and development process

Lead compound

Screening of Acute toxicity

pharmacology study

Stability study Sub acute

Advance toxicity studies
pharmacology
Pharmacokinetic Carcinogenicity &
study on animal Mutagenicity studies
Phase I clinical study

Product Chronic
Phase II clinical study toxicity studies
development

Phase III clinical study

Pharmacokinetic
study on human
Registration &
Marketing

Phase IV clinical study

Masalah dalam Terapi Gen

Insertion error Activated oncogene

by regulating gene
 Gene inserted into One gene is mutated
normal gene but the other works

One gene is mutated Gene that are mutated

and the other is inserted don’t work but the
and mutated inserted gene works
Terapi gen dalam trial
 Protokol untuk Terapi Gen
Penyakit Gen Vektor Strategi Sel Target
Genetik
• SCID ADA RV Ex vivo Limfosit, CD34+
• CF CFTR Ad, L+P In vivo Epithelial paru
• Hiperkolesterolemia LDL reseptor RV Ex vivo Hepatosit
• Hemofili Faktor VIII & IX RV Ex vivo Fibroblas
• Goucher Glukoserebosidase RV Ex vivo Monosit, CD34+
• Def. –1antitripsin –1antitripsin L+P In vivo Epitelial paru
Kanker
• Melanoma TNF, IL-2, GM-CSF RV Ex vivo TIL, melanoma
• Sel ginjal IL-4 RV Ex vivo Fibroblas, tumor
• Glioblastoma HS-TK RV In vivo Glioblastoma
• Paru-paru p53 RV In vivo Sel tumor paru
• Payudara C-myc/c-fos antisen RV In vivo Kanker payudara
• Payudara, ovarium MDR RV Ex vivo Sungsumg tulang, CD34+
Infeksi
• HIV HIV TAT antisen RV Ex vivo Sel T CD4
HIV RNA ribozim RV Ex vivo Sel T CD4
Lain
• Artritis reumatoid IRAP RV In vivo Sinovial
• Vaskuler perifer VEGF P In vivo Endotelial
Terapi Gen pada Cystic Fibrosis
dg memasukkan DNA eksogen
Terapi gen pada kanker

1. Transfer gen untuk meningkatkan imunitas lewat

ekspresi gen imunomodulator/gen sitokin.
2. Transfer gen yang mampu mengkode produksi
enzim yang dapat memetabolisme prodrug.
3. Menambahkan gen supresor tumor untuk
melengkapi gen supresor tumor mutan.
4. Strategi kemoproteksi yang menghasilkan sel
resisten terhadap antitumor.
5. Strategi antisen untuk menekan ekspresi
onkogen
Transfer Gen Pemetabolisme Prodrug

mekanisme aksi timidin kinase

Gen supresor tumor yang dihubungkan dengan hipermetilasi pada tumor

Gen Lokus Tumor dengan metilasi

Rb 13q14.2 Retinoblastoma
VHL 3p25 Kanker ginjal
p16INK4A 9p21 Limfoma
p15INK4B 9p21 Leukemia akut primer, limfoma Burkitt
E-cadherin 16q22.1 Kanker kandung kemih, payudara, kolon,
liver
H-cadherin 16q Ovarium
hMLH1 3p21 Kolon
PTEN/MMAC1 10q23 Prostat
H19 11p15 Tumor Wilm
p73 1p36.2 Lekemia
BRCA1 17q11 Payudara
 Kedokteran di era genomic

Phenotypes Bioinformatik
• Kondisi fisiologis
• Kondisi patologis
Individualisasi
terapi
Genotypes Prescribing
• Kartu genetic
• Kelainan genetic
Farmakogenomik