TUGAS MATA KULIAH KAPITA SELEKTA

Rabbit Test Untuk Identifikasi Pirogen

 Kelompok 2

Rizky Oktavia Jabeth Putri Rusiana Ruth Debora Samuel M Khosyie Abror
2019000075 2019000076 2019000077 2019000078 2019000117

APOTEKER ANGKATAN 64
 Latar Belakang
Pirogen Uji Pirogen pada Kelinci (Rabbit Test)
produk metabolisme mikroorganisme umumnya merupakan metode kualitatif untuk mendeteksi adanya
berasal dari bakteri, kapang dan virus kontaminan penyebab demam secara parenteral

Salah satunya
Dengan cara

Pirogen eksogen
berasal dari luar tubuh apabila
mengukur perubahan suhu pada kelinci
diinjeksikan kedalam tubuh manusia
setelah pemberian sampel uji
atau hewan dapat menyebabkan Uji pirogen
Pirogen
kenaikan suhu tubuh

Produk parenteral
sediaan dengan pemberian injeksi melalui kulit
atau membran mukosa langsung menuju sistem
biologis melewati mekanisme pertahanan tubuh,
sehingga sediaan parenteral memiliki kriteria yang
lebih ketat jika dibandingkan dengan rute
pemberian lain
Produk
parenteral Penggunaan pertama pada tahun 1912 oleh Hort
dan Penfold yang menyelidiki asal-usul pirogen
yang menyebabkan demam pada pasien yang
dirawat melalui parenteral
 Tujuan

Mengetahui prosedur uji

pirogen dengan Rabbit tes

Mengetahui keterbatasan tes pirogen

pada kelinci untuk menilai vaksin
berbasis OMV Meningokokus.
 Produk parenteral terutama pada
vaksin haruslah memenuhi keamanan
sesuai persyaratan yang berlaku

Jika suatu vaksin dipasaran dapat menimbulkan efek

berbahaya bagi pengguna, maka perlu adanya uji
lebih lanjut terkait kandungan vaksin tersebut

Makalah ini akan membahas suatu metode

identifikasi pirogen dari vaksin berbasis OMV
Meningokokus

disusun berdasarkan rumusan masalah :

 Bagaimana permasalahan penggunaan
RPT dalam identifikasi vaksin?
 Bagaimana penggunaan RPT dalam
produk berbasis Meningokokus OMV?
 Mengapa uji keamanan dialihkan ke
Rumusan Masalah RPT sebagai Uji Konsistensi?
 Pirogen
Senyawa dengan dinyatakan diproduksi oleh
berat molekul sebagai senyawa kira-kira 5-10%
tinggi lipopolisakarida massa total bakteri.

senyawa yang jika masuk biasanya

ke aliran darah akan menghasilkan
Pirogen mempengaruhi suhu tubuh demam (suhu ≥38℃)

Pengobatan demam pada beberapa kasus

yang disebabkan oleh dapat menyebabkan
pirogen sangat sulit kematian.

(Sudjadi. 2008. Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: penerbit kanisius (anggota IKAPI)

 Sifat-sifat Pirogen

Termostabil
sehingga hanya dapat dihilangkan dengan Berat Molekul (BM) antara 15.000-
pemanasan pada suhu 650˚C selama 1 menit 4.000000

Tidak dipengaruhi oleh Ukuran umumnya 1-50

bakterisida biasa millimikron

Larut dalam air Tidak menguap

 Kelompok pirogen
Pirogen Endogen

Pirogen

Pirogen Eksogen

Sumber- sumber pirogen

(gennaro et all 1990, scoville 196, RPS 18, steril dosage form 46)

Air kontaminan Bahan perlengkapan Bahan terlarut yang pirogenik: Mikroorganisme

dekstrosa dan NaCl dari udara dan debu
Pencegahan Terhadap Pirogen
Perancangan dan pengoprasian penyulingan
Perlakuan untuk menghilangkan tetesan-tetesan air yang terakumulasi yang dapat mengandung
pirogen atau untuk menghilangkan bahan pirogenik yang dapat mengering dan melekat pada
bagian dalam permukaan wadah

Pengumpulan hasil destilat yang terlindungi

Air destilasi harus terlindung selama pengumpulan dan harus digunakan sesegera mungkin setelah
didestilasi untuk mencegah perkembangbiakan bakteri yang mungkin ada. Larutan seharusnya disaring,
dikemas, disegel, dan disterilkan dengan secepat mungkin.

Menambahkan adsorben
menghilangkan pirogen dari larutan dengan absorbsi. Larutan dikocok
dengan 0,1 % arang aktif serbuk halus selama 5-10 menit

Penyaringan asbes aktif

terdiri dari sediaan larutan yang dilewatkan melalui penyaring asbes
kompresi dari serum seitz no 3 pirogen diabsorbsi pada permukaan
dari asbes dan oleh karena itu pirogen dihilangkan dari larutan

Melibatkan beberapa reaksi kimia
contohnya oksidasi, alkilasi, atau
hidrolisis endotoksin
(destruksi)
• Tidak banyak digunakan untuk
depirogenasi bahan awal dan air.
• harus memperhatikan bahan kimia
yang digunakan untuk memastikan
tidak adanya efek samping
Depirogenisasi
Secara fisik
lebih menguntungkan dari pada
penambahan bahan kimia
Depirogenisasi bahan,
alat dan wadah pada
produksi sediaan farmasi
Inaktivasi dengan panas kering
dapat dilakukan dengan
metode yang efektif untuk
dua cara
inaktivasi pirogen pada alat-alat
inaktivasi gelas dan minyak yang tahan
Removal panas, juga bubuk tahan panas
Temperatur yang disarankan
• 170-350°C.
• Paling umum 250°C selama 30
menit (Remington: 45 menit)
• Suhu lain bisa digunakan 650°C
selama 1 menit /180°C selama 4
jam
 Uji Pirogen
Rabbit Test
Dirancang untuk membatasi resiko terjadinya reaksi
demam pada pemberian obat obatan Parenteral

Kelinci Uji
Suhu tubuh Mengandung Pirogen

Add Text Here

You can simply impress your
audience and add a unique zing
and appeal to your Presentations.
Bahan Uji Get a modern PowerPoint
Presentation that is beautifully
designed.

Pengukuran
suhu tubuh
kelinci
 Persyaratan kelinci yang digunakan
• Digunakan kelinci dewasa yang sehat,
dengan varietas yang sama,
• Ditempatkan sendiri- sendiri dengan
temperature yang seragam (suhu ruangan
±2 °C), kelembaban yang sama dan bebas
dari segala gangguan.
• Jangan gunakan hewan untuk uji lebih dari
satu kali setiap 48 jam.
• Untuk hewan yang telah digunakan untuk
uji pirogen didiamkan terlebih dahulu
setidaknya 2 minggu sebelum hewan
digunakan kembali.
• Gunakan kelinci dewasa yang sehat.
• Tepatkan kelinci satu ekor dalam satu kandang
dalam ruangan suhu (20°C-23°C ), bebaskan dari
gangguan
• Beda suhu tidak boleh berbeda ±3°C dari suhu
yang telah ditetapkan
• Untuk kelinci yang belum pernah digunakan untuk
uji, adaptasikan tidak lebih dari 7 hari
• Kelinci tidak boleh digunakan untuk uji pirogen
lebih dari sekali dalam jangka waktu 48 jam atau
sebelum 2 minggu setelah digunakan untuk uji
pirogen bila menunjukan kenaikan suhu maksimum
0,60̊ atau lebih, atau bila setelah digunakan untuk
melakukan uji sediaan uji yang mengandung
pirogen.
Pengukuran Suhu
Alat pengukur suhu tubuh kelinci
Cepat dan Teliti
telah dikalibrasi untuk menjamin ketelitian skala
kurang lebih 0,1̊ dan telah diuji bahwa pembacaan
suhu maksimum tercapai kurang dari 5 menit

Akurat dan Sensitif

dapat membaca minimal 1 angka dibelakang koma
(,) atau alat pengukur suhu lainnya dengan tingkat
sensitifitas yang sama atau lebih baik

Contoh alat yang dapat digunakan

thermometer klinik atau thermistor atau alat sejinis
yang telah dikalibrasi

pengukuran suhu tubuh kelinci

memasukan bagian sensor termometer ke bagian
dubur kelinci
International Pharmocopoeia : 6cm kedalam dubur
Farmakope Indonesia : tidak kurang dari 7,5cm
 Prosedur pelaksaan Rabbit test
tidak diberikan makanan 1 berat badan atau jumlah yang ditentukan dalam
Selama 2 jam sebelum tes dan
selama tes, hewan tidak diberikan
makanan, tetapi air minum masih
diperbolehkan
Ditempatkan di bawah
kondisi pengujian 2
Hewan-hewan harus ditempatkan
di bawah kondisi pengujian
setidaknya 1 jam sebelum injeksi
Penyuntikan
5
• Hangatkan larutan uji hingga sekitar 38 ° C.
• Suntikkan ke dalam vena marginal dari telinga
masing-masing (3 kelinci) 10 mL larutan per kg
3 monografi.
• Suntikan harus berlangsung tidak lebih dari 4
Ukur suhu kontrol menit, kecuali ditentukan lain dalam monografi
sebelum injeksi bahan uji, ukur suhu
hewan dengan mengambil 2 pengukuran
setiap 30 menit. Rata-rata dari 2 suhu
digunakan sebagai suhu kontrol
hewan yang digunakan adalah hewan
dengan suhu kontrolnya tidak
menyimpang lebih dari 1,0 ° C dari satu bebas pirogen-kan alat dan bahan
4
sama lain yang akan digunakan
hewan dengan suhu kontrol di bawah Jarum suntik, jarum, bahan pengencer, larutan
38,0 ° C atau di atas 39,8 ° C tidak untuk pencuci dan pembilas, dan alat lainnya
digunakan harus bebas dari pirogen juga dengan cara
memanaskan pada 250 ° C selama tidak
kurang dari 30 menit atau dengan metode lain
yang sesuai
 Infographic Style
6 Catat peningkatan suhu tubuh kelinci
selama 3 jam, lakukan pengukuran secara terus
menerus setiap 30 menit. Suhu maksimum yang
dididapat untuk setiap kelinci dianggap sebagai
responsnya Jika pembacaan suhu yang diambil
setelah injeksi semua di bawah suhu kontrol,
respon kenaikan suhu dianggap nol

7
Memenuhi persyaratan tidak adanya pirogen
kenaikan < 0,6 ° C
Jumlah dari ketiga suhu naik tidak melebihi 1,4 ° C
8 Tidak memenuhi persyaratan
1 atau 2 kelinci menunjukan kenaikan > 0,6 ° C
Jumlah dari ketiga suhu naik melebihi 1,4 ° C

Uji Lanjutan 7
menggunakan 5 kelinci yang lain
Jika dalam 8 kelinci tersebut tidak lebih dari 3
kelinci menunjukkan kenaikan suhu 0,6 ° C atau
lebih, dan jika jumlah dari 8 peningkatan tidak
melebihi 3,7 ° C
 Vaksin Berbasis OMV
Komponen OMV (vaksin diproduksi dengan menghilangkan
berbasis meningokokus) ekstraksi deterjen lipoprotein dan
dalam vaksin untuk (detergent extraction) lipopolisakarida (LPS)
penggunaan manusia
konsekuensi dari ektraksi ini adalah adalah
terdapat sisa komponen periplasma dan
sitoplasma yang ikut terbawa

Hasil dari OMV mengandung endotoksin (LPS/Lipopolisakarida) dan pirogen non-endotoksin (seperti, porin,
muramilpeptida, DNA bakteri, dan peptidoglikan) baik sebagai komponen intrinsik dalam membran luar
bakteri gram negatif ataupun sebagai produk yang berkaitan erat dengan sifat pirogenik. Tetapi dalam kasus
vaksin berbasis meningokokus OMV, yang secara intrinsik mengandung konsentrasi materi pirogenik yang
relatif tinggi, dan vaksin yang mengandung bahan pembantu yang diketahui mengiritasi, menggunakan RPT
lebih bermasalah.
Permasalahan Penggunaan RPT Dalam Identifikasi Vaksin

Tujuan dari penggunaan hewan coba adalah untuk menirukan respon manusia terhadap suatu penyakit dan pengobatannya.
Kelinci dipilih untuk digunakan dalam uji pirogen, karena sensitivitasnya terhadap endotoksin yang mirip dengan manusia

Intravena (IV) Rabbit Pyrogen Test (RPT) Pada manusia • Intravena (IV)
• Intramuscular (IM)
• Subkutan (SC)
• Intradermal (ID)
• Oral
• nasal

RPT dikembangkan untuk mengkonfirmasi adanya pirogen dalam sediaan parenteral dalam jumlah besar. Berdasarkan
Farmakope, tes ini termasuk infus intravena (IV) obat untuk diujikan ke dalam kelinci. Produk dikatakan bebas pirogen jika
kenaikan suhu kelinci berada dalam spesifikasi yang ditentukan. Selain itu, RPT sangat sensitif, tetapi tidak kuantitatif
Penggunaan RPT Dalam Produk Berbasis Meningokokus OMV

Meningokokus OMV terdiri dari protein Oleh karena itu,

membran luar, lipid, endotoksin secara intrinsik
dan lipopolisakarida merupakan bagian dari
(LPS) atau endotoksin. vaksin OMV

Kandungan pirogen non-endotoksin (seperti, porin, muramilpeptida, DNA bakteri, dan peptidoglikan)
dalam vaksin berbasis meningokokus OMV tidak dapat terdeteksi dengan BET (Bacterial Endotoxins
Test). Sehingga dipilih RPT yang dimodifikasi, digunakan selama pengujian pra-klinis, dalam pengujian
kontrol kualitas yang dilakukan pada batch uji klinis, dan akhirnya dalam pengujian kontrol rutin
setelah lisensi
 Peralihan RPT sebagai Uji Konsistensi daripada Uji Keamanan

mengindentifikasi masalah terkait sterilitas sediaan biologis

secara intravena

Rabbit Pyrogen Test meningkatkan kualitas produk, dengan mengurangi reaksi efek
(RPT) samping pada saat penggunaanya

metode ini menjadi salah satu metode standar industri untuk uji
pyrogen, sampai akhirnya muncul Bacterial Endotoxin Test (BET) 20
tahun kemudian.
vaksin berbasis OMV
memiliki endotoksin dalam jumlah tinggi
uji terhadap vaksin berbasis OMV ini dinyatakan gagal
vaksin perlu diencerkan hingga
700 kali sebelum diberikan
kepada kelinci
Peralihan RPT sebagai Uji Konsistensi daripada Uji Keamanan

diencerkan hingga
700 kali sebelum
diberikan kepada
Rabbit test
kelinci
vaksin berbasis OMV

Bukan sebagai uji keamanan (safety test). Oleh karena itu, RPT
dipertimbangkan sebagai uji konsistensi daripada keamanan

Uji konsistensi ini termasuk uji fisika-kimia, immunochemical,

dan in vitro bioassays. Sehingga, sebagai uji konsistensi, RPT
menyediakan data kualitatif daripada kuantitatif
 Kesimpulan
A. Kesimpulan
Penggunaan RPT untuk mengevaluasi vaksin yang diketahui mengandung pirogen menjadi dipertanyakan. Produsen
maupun laboratorium kontrol nasional perlu mempertimbangkan dengan hati – hati informasi yang bisa didapatkan
saat melakukan uji. Oleh karena semakin berkembangnya kompleksitas vaksin, MAT (Monocyte Activation Test)
dapat menjadi alternatif metode dalam menyediakan data kuantitatif untuk mjkengukur respon inflamasi manusia.
Metode ini tidak menggunakan hewan coba dan menggunakan sel manusia. Sehingga sesuai dengan karakteristik
vaksin yang berkaitan erat denga pirogen.

A. Saran
Disarankan untuk ada penelahaan lebih lanjut mengenai pengembangan dan validasi alternatif metode MAT untuk uji
pengawan atau keamanan vaksin berbasis OMV.
 Daftar Pustaka
1. World Health Organization., 2019. The International Pharmacopoeia 9th edition. 3.5 Test for pyrogens. WHO
2. Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Farmakope Indonesia. Edisi IV. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan; 1995.
3. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia, Farmakope Indonesia. Edisi V. Jakarta: Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan; 2014.
4. Vipond, C., Findlay, L., Feavers, I. & Care, R. Limitations of the rabbit pyrogen test for assessing meningococcal OMV based vaccines. ALTEX 33, 47–53 (2016).
5. World Health Organization. Requirements for Meningococcal Polysaccharide Vaccine (Requirements for Biological Substances no. 23). (1976).
6. Vipond, C. et al. Development and validation of a monocyte activation test for the control/safety testing of an OMV-based meningococcal B vaccine. Vaccine 37, 3747–3753 (2019).
7. Kulpa-Eddy, J. and Dusek, D. Application of The Consistency Approach to Reduce Animal Use in Vaccine Potency Testing. Procedia Vaccinol. 5, 232–235 (2011).
8. Hasiwa, N., Daneshian, M., Bruegger, P. et al. Evidence for The Detection of Non-Endotoxin Pyrogens by The Whole Blood Monocyte Activation Test. ALTEX 30, 169–208 (2013).
9. De Mattia, F., Chapsal, J. M., Descamps, J. et al. The Consistency Approach for Quality Control of Vaccines – a Strategy to Improve Quality Control and Implement 3Rs. Biologicals 39,
59–65 (2011).
10. Code Federal Regulation. 1976. Chapter 21. Food and Drug Administration. Department of Health and Human Services. 1976.
11. Guidance for Industry Pyrogen and Endotoxins Testing. 2012. Questions and Answers ; U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration,Center for Drug
Evaluation and Research (CDER), Center for Biologics Evaluation and Research (CBER); Center for Veterinary Medicine (CVM), Center for Devices and Radiological Health (CDRH);
Office of Regulatory Affairs (ORA).
12. Sudjadi. 2008. Bioteknologi kesehatan. Yogyakarta: penerbit kanisius (anggota IKAPI).
13. Miyamoto, T., Okano, S., & Kasai, N. (2009). Inactivation of Escherichia coli Endotoxin by Soft Hydrothermal Processing. Applied and Environmental Microbiology, 75(15), 5058–
5063. doi:10.1128/aem.00122-09.
 Daftar Pustaka
14. Gennaro,A.R,et al. 1990. Remingtons Pharmaceutical Science 18th Edition. Pensylvania:Marck publishing company.
15. Suwandi, Usman. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt Lysate. Cermin Dunia Kedokteran no.52.
16. Walter F., PhD. Boron. 2003. Medical Physiology: A Cellular And Molecular Approaoch. Elsevier/Saunders. p. 1300. ISBN 1-4160-2328-3.
17. Jenkins, Glen, dkk, (1957), “Scoville’s The Art of Compounding”, MC Growhill, Book Company, New York. 194, 195, 196-198.
18. Turco, Salvatore dan Robert E. 1974. Sterile Dosage Forms. London : Published in Great Britain by Henry Kimpton Publishers.
19. https://www.acciusa.com/pdfs/newsletter/LAL_Vol.11No.5.pdf diakses 9 November 2019 pukul 20.10 WIB
20. Ansel, Howard C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Jakarta : Penerbit UI Press.
21. U.S. Pharmacopeia. 2007. The United States Pharmacopeia, USP 31 Chapter 151; The National Formulary: NF 26. Rockville MD: U.S. Pharmacopeial
Convention, Inc.
22. J. van Noordwijk and Y.DeJong, Comparison of the LAL test with the rabbit test: False positives and false negatives, Dev. Boil. Stand. 34, 39 - 43(1977).
23. J.Van Noordwijk and Y.DeJong, Comparison of the Limulus test for endotoxin with the rabbit test for pyrogens of the European pharmacopoeia,
J.Biol.Stand., 4, 131-139 (1976).
PowerPoint Presentation

Thank You
Insert the Sub Title of Your Presentation