FITOKIMIA II

Dra. Ike Yulia W, M.Farm., Apt.

Yulianita, M.Farm.
Novi Fajar Utami, M.Farm., Apt
Siti Mahyuni, M.Sc.
Maribeth T.R.H., M.Farm.
 MATERI II:
METODE ISOLASI POLIFENOL ( FLAVONOID)
Senyawa Fenol
 Istilah senyawa fenol digunakan untuk senyawa
yang memiliki ciri adanya cincin aromatik dan 1
atau 2 gugus hidroksil  gol. Senyawa aromatik
 Senyawa fenol yang memiliki gugus hidroksil lebih
dari 1  polifenol ( flavonoid, tanin, antrakuinon)
 Fungsi  pembangun dinding sel, pigmen bunga
dan enzim
 Sifat  toksik terhadap serangga/hama.
 Seny. Fenol yang memiliki gugus karboksilat 
asam fenolat.
 Kerangka Dasar Flavonoid
 Flavonoid merupakan senyawa metabolit sekunder yg
mempunyai kerangka dasar karbon yang terdiri dari 15 atom
karbon, dimana dua cincin benzene (C6) terikat pada suatu
rantaipropana (C3) sehingga membentuk suatu susunan C6-C3-
C6.
 Senyawa flavonoid dimasukkan dalam senyawa polifenol
 Fungsi Flavonoid pada Tumbuhan
1. Fungsi penyerbukan
pigmen bunga&buah seperti flavin (kuning, jingga),
antosianin (merah,biru,ungu)
2. Fungsi pengatur tumbuh (pertumbuhan)
kuersetin meningkatkan pertumbuhan, selain itu feeding
deterrent (tanin pd buah muda) dan feeding stimulant
(morin dan isoquersetrin pd daun murbei).
3. Sebagai pertahanan diri dari serangan hama dan penyakit
4. Zat alelopati (katekin) sbg herbisida alami
5. Tabir surya sebagai toleransi tinggi thd sinar UVB
 Klasifikasi Senyawa Flavonoid

Susunan tsb dapat menghasilkan tiga jenis struktur

senyawa flavonoid, yaitu:
1. Flavonoid atau 1,3-diarilpropana
2. Isoflavonoid atau 1,2-diarilpropana
3. Neoflavonoid atau 1,1-diarilpropana
 Contoh Senyawa Flavonoid
 Flavan
 Flavanone
 Flavone
 Flavonol
 Dihidroflavonol
 Flavan-3-ol
Dihidroflavonol
 Flavonoid atau 1,3-diarilpropana
Beberapa senyawa flavonoida yang ditemukan di alam:
1. Antosianin
Antosianin merupakan pewarna yang paling penting
dan paling tersebar luas dalam tumbuhan.
 Secara kimia antosianin merupakan turunan suatu
struktur aromatik tunggal, yaitu sianidin
 Antosianidin secara struktur termasuk kelompok
flavon.
 Antosianidin ialah aglikon antosianin yang terbentuk
bila antosianin dihidrolisis dengan asam.
 Senyawa ini tergolong pigmen dan pembentuk warna
pada tanaman yg ditentukan oleh pH dari
lingkungannya.
2. Flavonol
flavonol lazim sebagai konstituen tanaman yang
tinggi, dan terdapat dalam berbagai bentuk
terhidroksilasi. Flavonol alami yang paling sederhana
adalah galangin, 3,5,7 –tri-hidroksiflavon;
sedangkan yang paling rumit, hibissetin adalah
3,5,7,8,3’,4’,5’ heptahidroksiflavon.
 Hidroksiflavonol,seperti halnya hidroksi flavon,
biasanya terdapat dalam tanaman sebagai glikosida.
Flavonol kebanyakan terdapat sebagai 3-glikosida.
3. Khalkon
 Beberapa khalkon misalnya merein, koreopsin,
stillopsin, lanseolin yang terdapat dalam tanaman,
terutama sebagai pigmen daun bunga berwarna
kuning, kebanyakan terdapat dalam tanaman
Heliantheaetribe, Coreopsidinae subtribe, dan family
Compositae.
4. Dihidrokhalkon
 Meskipun dihidrokhalkon jarang terdapat di alam,
namun satu senyawa yang penting yaitu phlorizin
merupakan konstituen umum family Rosaceae juga
terdapat dalam jenis buah-buahan seperti apel dan
pear.
 Phlorizin telah lama dikenal dalam bidang farmasi,
sebagai glucose inhibitor dengan cara menghambat
reabsorpsi glukosa di tubular ginjal.
 Contoh Senyawa Isoflavonoid

 Isoflavan
 Isoflavone
 Isoflavanone
 Isoflav-3-ene
 Isoflavanol
 Rotenoid
 Isoflavonoid atau 1,2-diarilpropana
 Isoflavon termasuk dalam kelompok flavonoid (1,2-
diarilpropan) dan merupakan kelompok yang terbesar dalam
kelompok tersebut. Meskipun isoflavon merupakan salah satu
metabolit sekunder, tetapi ternyata pada mikroba seperti
bakteri, algae, jamur dan lumut tidak mengandung
isoflavon, karena mikroba tersebut tidak mempunyai
kemampuan untuk mensintesanya.
 Jenis senyawa isoflavon di alam sangat bevariasi. Diantaranya
telah berhasil diidentifikasi struktur kimia dan diketahui fungsi
fisiologisnya, seperti isoflavon, rotenoid dan kumestan, serta
telah dimanfaatkan sebagai obat-obatan.
 Potensi senyawa isoflavon untuk pengobatan
1. Anti-inflamasi
 Mekanisme anti-inflamasi terjadi melalui efek penghambatan
jalur metabolisme asam arachidonat, pembentukan
prostaglandin, pelepasan histamin, atau aktivitas
penghambatan radikal bebas suatu molekul.
 Melalui mekanisme tersebut, sel lebih terlindung dari
pengaruh negatif, sehingga dapat meningkatkan viabilitas
sel.
 Senyawa flavonoid yang dapat berfungsi sebagai anti-
inflamasi adalah toksifolin, biazilin, haematoksilin, gosipin,
prosianidin, nepritin, dll.
2. Anti-tumor/Anti-kanker
 Senyawa isoflavon yang berpotensi sebagai
antitumor/antikanker adalah genistein yang
merupakan isoflavon aglikon (bebas).
 Genistein merupakan salah satu komponen yang
banyak terdapat pada kedelai dan tempe.
 Penghambatan sel kanker oleh genistein, melalui
mekanisme :
 (1) penghambatan pembelahan/proliferasi sel (baik sel
normal, sel yang terinduksi oleh faktor pertumbuhan
sitokinin, maupun sel kanker payudara yang terinduksi
dengan nonil-fenol atau bi-fenol A) yang diakibatkan oleh
penghambatan pembentukan membran sel, khususnya
penghambatan pembentukan protein yang mengandung
tirosin;
(2) penghambatan aktivitas enzim DNA isomerase II;
(3) penghambatan regulasi siklus sel;
(4) sifat antioksidan dan anti-angiogenik yang disebabkan
oleh sifat reaktif terhadap senyawa radikal bebas;
(5) sifat mutagenik pada gen endoglin (gen transforman
faktor pertumbuhan betha atau TGFβ).
Mekanisme tersebut dapat berlangsung apabila konsentrasi
genestein lebih besar dari 5μM.
3. Anti-virus
 Mekanisme penghambatan senyawa flavonoid pada virus
diduga terjadi melalui penghambatan sintesa asam nukleat
(DNA atau RNA) dan pada translasi virion atau pembelahan
dari poliprotein.
 Percobaan secara klinis menunjukkan bahwa senyawa
flavonoid tersebut berpotensi untuk penyembuhan pada
penyakit demam yang disebabkan oleh rhinovirus, yaitu
dengan cara pemberian intravena dan juga terhadap penyakit
hepatitis B.
 Berbagai percobaan lain untuk pengobatan penyakit liver
masih terus berlangsung.
4. Anti-allergi
 Aktivitas anti-allergi bekerja melalui mekanisme sebagai berikut
:
(1) penghambatan pembebasan histamin dari sel-sel “mast‟,
yaitu sel yang mengandung granula, histamin, serotonin, dan
heparin;
(2) penghambatan pada enzim oxidative nukleosid-3‟,5‟ siklik
monofast fosfodiesterase, fosfatase, alkalin, dan penyerapan Ca;
(3) berinteraksi dengan pembentukan fosfoprotein.

 Senyawa-senyawa flavonoid lainnya yang digunakan sebagai

anti-allergi antara lain terbukronil, proksikromil, dan senyawa
kromon.
5. Penyakit kardiovaskuler
 Isoflavon memberikan efek positif terhadap sistem
peredaran darah dan penyakit jantung
 Khususnya isoflavon pada tempe yang aktif sebagai
antioksidan, yaitu 6,7,4- trihidroksi isoflavon (Faktor-II),
terbukti berpotensi sebagai anti kontriksi pembuluh darah
(konsentrasi 5μg/ml) dan juga berpotensi menghambat,
pembentukan LDL (low density lipoprotein).
5. Penyakit kardiovaskuler
 Sehingga isoflavon dapat mengurangi terjadinya
arterosklerosis pada pembuluh darah.
 Pengaruh isoflavon terhadap penurunan tekanan darah dan
resiko CVD (penyakit kardiovaskular) dihubungkan dengan
sifat hipolipidemik dan hipokholesteremik senyawa
isoflavon.
6. Estrogen dan Osteoporosis
 Pada wanita menjelang menopause, produksi estrogen
menurun sehingga menimbulkan berbagai gangguan.
 Senyawa isoflavon terbukti mempunyai efek hormonal,
khususnya efek estrogenik.
 Efek estrogenik ini terkait dengan struktur isoflavon yang
dapat ditransformasikan menjadi equol. Dimana equol
mempunyai struktur fenolik yang mirip dengan hormon
estrogen.
6. Estrogen dan Osteoporosis
 Mengingat hormon estrogen berpengaruh pula terhadap
metabolisme tulang, terutama proses kalsifikasi, maka
adanya isoflavon yang bersifat estrogenik dapat
berpengaruh terhadap berlangsungnya proses kalsifikasi.
Dengan kata lain, isoflavon dapat melindungi proses
osteoporosis pada tulang sehingga tulang tetap padat dan
masif.
7. Anti kolesterol
 Efek isoflavon terhadap penurunan kolesterol terbukti melalui
beberapa penelitian.
 Pada penelitian dengan menggunakan tepung kedelai sebagai
perlakuan, menunjukkan bahwa tidak saja kolesterol yang
menurun, tetapi juga trigliserida VLDL (very low density
lipoprotein) dan LDL (low density lipoprotein).
 Di sisi lain, tepung kedelai dapat meningkatkan HDL (high
density lipoprotein) (Amirthaveni dan Vijayalakshmi, 2000).
 Mekanisme lain penurunan kolesterol oleh isoflavon
dijelaskan melalui pengaruh peningkatan katabolisme sel
lemak untuk pembentukan energi yang berakibat pada
penurunan kandungan kolesterol.
Contoh Senyawa Neoflavonoid
 Identifikasi Senyawa Flavonoid
 Sebagian besar ditemukan dalam bentuk glikosida
dimana unit flavonoid terikat pada suatu gula
 Glikosida adalah kombinasi antara gula dan suatu
alkohol yang saling berikatan melalui ikatan
glikosida.
 Residu gula dari glikosida flavonoid alam adalah
glukosa, ramnosa, galaktosa, dan gentiobiosa
 Identifikasi Senyawa Flavonoid
 Flavonoid dapat ditemukan sebagai mono-, di- atau
triglikosida dimana satu, dua atau tiga gugus
hidroksil dalam molekul flavonoid terikat oleh gula.
 Poliglikosida larut dalam air dan sedikit larut dalam
pelarut organik seperti eter, benzene, kloroform dan
aseton.
 Identifikasi Senyawa Flavonoid
 Sianidin Test
 Kira-kira 0.5 mg sampel yang telah dirajang halus,
diekstrak dengan 5 ml metanol dan dipanaskan
selama 5 menit dalam tabung reaksi.
 Tambahkan beberapa tetes HCl pekat dan sedikit
serbuk magnesium.
 Perubahan warna merah/pink atau kuning
menunjukan sampel mengandung flavonoid.
 Identifikasi Senyawa Flavonoid
 0,5 g serbuk simplisia + 10 ml etanol 96% dipanaskan
 saring filtrat  + 10 ml air didinginkan.
 + 5 ml petroleum eter  kocok & diamkan
 Terbentuk 3 lapisan:
 Diambil lapisan metanol  diuapkan + 5 ml etil
asetat, bagi mjd 2 bagian: A dan B
A : + etanol 96%, serbuk Zn, HCl pekat 5 ml 
positif merah jingga/ungu
B : + etanol 96%, serbuk Mg, HCl pekat 5 ml 
positif merah jingga/ungu
 Sifat Fisika dan Kimia Senyawa Flavonoid

 Flavonoid merupakan senyawa polifenol sehingga

bersifat agak asam dan dapat larut dalam basa, dan karena
merupakan senyawa polihidroksi (gugus hidroksil) maka
juga bersifat polar sehingga dapat larut dalam pelarut
polar seperti metanol, etanol, aseton, air, butanol,
dimetil sulfoksida, dimetil formamida.
 Disamping itu dengan adanya gugus glikosida yang
terikat pada gugus flavonoid menyebabkan flavonoid
mudah larut dalam air.
METODE ISOLASI
FLAVONOID
 Sifat Kelarutan Flavonoid
 Flavonoid → senyawa fenol → mempunyai sifat kimia
senyawa fenol → bersifat agak asam sehingga dapat
larut dalam basa
 Karena mempunyai gugus hidoksil atau suatu gula,
flavonoid merupakan senyawa polar → larut dalam
pelarut polar seperti etanol, metanol, butanol, aseton,
dimetilsulfoksida, dimetilformamida, air, dll.
 Aglikon yg kurang polar (isoflavon, flavanon, flavon,
dan flavonol ) yg termetoksilasi lebih mudah larut dlm
pelarut seperti eter dan kloroform.
 Isolasi Flavonoid secara umum
 Penyiapan bahan segar → Tumbuhan segar lebih ideal
untuk menganalisis flavonoid krn dlm tumbuhan yg
disimpan lama glikosida → menjadi aglikon akibat
pengaruh fungi dan aglikon mudah teroksidasi.
 Pengeringan → mencegah kerja enzim (suhu 1000C)
 Penyimpanan atau Penggilingan → serbuk halus
 Penimbangan bahan
Lanjutan…
 Proses Ekstraksi → maserasi MeOH:H2O (9:1) lalu
(1:1) masing-masing selama 6-12 jam
 Penyaringan dg corong bersumbat kapas atau kertas
Whatman
 Penguapan → menghilangkan metanolnya
 Ekstrak air yg diperoleh diekstraksi dalam corong pisah
dg heksan/kloroform → utk membebaskan senyawa yg
kurang polar seperti lemak, terpen, klorofil, xantofil, dll.
 Lapisan air (mengandung flavonoid ) yg telah diekstraksi
dg pelarut, diuapkan dg rotary evaporator
 Isolasi Flavonoid Secara Khusus
1. Untuk antosianin → Daun atau bunga segar digerus
dengan metanol yg mengandung 1% HCl pekat →
Segera lakukan kromatografi atau analisis
spektroskopi untuk mencegah hidrolisis glikosida
2. Untuk flavonoid yg kepolarannya rendah → maserasi
bahan tumbuhan segar dalam heksana atau eter selama
beberapa menit → Selanjutnya dipisahkan dengan
kromatografi
Pemisahan Flavonoid
 Kromatografi Kertas
 Kromatografi Kolom
 KLT, KCKT
 Kromatografi
 Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul
berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak
dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa
molekul) yang berada pada larutan.
 Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati
fase diam.
 Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan fase
diam akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding
molekul yang berikatan lemah.
 1. Kromatografi Kertas (KKt)
 Paling umum untuk menguji adanya flavonoid
 Sebagai penyerap digunakan kertas dg susunan serabut
dan tebal yg sesuai.
 Susunan serat kertas membentuk medium berpori sbg
tempat mengalirkan fase gerak.
 Contohnya kertas whatman, asam asetil, kieselguhr,
silikon, dan penukar ion.
 Untuk pemisahan flavonoid dilakukan dengan KKt 2A
menurun, dg fase diam kertas Whatman 3MM (46x7cm)
 KKt 2 Arah Menurun
 Fase gerak arah I yg umum BAA (4:1:5) 50-60 ml selama
12-30 jam → kertas diangkat dari bejana dan dikeringkan
dlm lemari asam.
 Fase gerak arah II yg umum asam asetat 15% 4-6 jam
(atau HCl 1% untuk antosianin)
 Noda dilihat pada sinar UV 366 nm atau dengan uap NH
3
pada antosianin (jingga → biru)
 Dapat dihitung nilai Rf (jarak tempuh senyawa dibagi
jarak tempuh pelarut (Rf<1)
 Cara kerja KKt menurun
 Pd KKt menurun, fase gerak dibiarkan merambat turun pada
kertas. Kertas tsb digantung dalam bejana menggunakan
bahan antisifon yg menahan ujung atas kertas dalam bak
pelarut. Dasar bejana digenangi dg sistem pelarut yg telah
ditetapkan.
 Pelarut bergerak ke bawah karena adanya kapilaritas yg
dibantu gravitasi
 Zat terlarut bergerak di sepanjang kertas dg kecepatan yg
berbeda2 membentuk sederetan noda yg terpisah.
 Jika noda tsb berwarna dpt dilihat scr visual, jika tdk, dapat
dilihat dibawah lampu UV atau cara lain spt dg pereaksi
semprot → Nilai Rf
1. Pengembang arah I

Diputar 90 0C

2. Pengembang arah II
 Pereaksi semprot
1. AlCl3 5% disemprotkan pd KKt setelah dikeringkan →
dibawah sinar UV (366 nm) → bercak berfluoresensi
kuning (5-hidroksi flavonoid)
2. Kompleks difenil-asam borat-etanolamin 1% dlm
MeOH disemprotkan pd KKt setelah dikeringkan →
dibawah sinar UV (366 nm) → bercak hijau kuning
(3',4'-dihidroksi-flavon/flavonol)
 Pereaksi semprot
3. Asam sulfanilat terdiazotasi.
Lar asam sulfanilat 0.3% dlm HCl 8% (25ml) +
larutan natrium nitrit 5% (1.5ml) tepat sebelum
digunakan (rp), disemprotkan pd KKt, lalu larutan Na
karbonat 20% sebelum dikeringkan → bercak kuning,
jingga, atau merah (senyawa dgn gugus hidroksi
fenol)
 Pereaksi semprot
4. Vanilin-HCl.
Vanilin 5% dlm EtOH dicampur HCl pekat (4:1) (rp)
disemprotkan pd KKt lalu dikeringkan dg hair dryer →
bercak merah/ merah lembayung dg segera (katekin)
dan jika lambat → proantosianidin flavanon dan
dihidroflavanol
 Kromatografi Kertas Preparatif
1. Hasil KKt 2A → bercak yang sesuai digunting dan
digabungkan, dimaserasi dg meOH-H2O (1:1) selama
bbrp jam sambil dikocok → cairan dienaptuangkan.

2. Hasil KKt 1A dg totolan senyawa awal berupa pita lebar

1-3cm → pita yg terjadi dipotong dan diekstraksi spt cara
diatas atau dielusi dlm bejana kromatografi dan eluat
ditampung dg gelas piala → lar flavonoid pekat bebas
serat.
 2. Kromatografi Kolom
 Untuk isolasi flavonoid skala besar
 Prinsipnya: penempatan campuran flavonoid (lar) di
atas kolom yg berisi serbuk penyerap (selulose, silika,
poliamida), lalu dielusi bertahap dg pelarut yg sesuai.
 Ukuran garis tengah:panjang kolom → 1:10 hingga1:30
 Sampel:fase diam → 1:50 hingga 1:500
 Ukuran fase diam 100-300 mesh
Kolom kromatografi
 Cara mengemas kolom
 Leher kolom disumbat dg serat kaca atau kapas, rendam
dg eluen10 cm
 Fase diam dijadikan bubur dalam gelas piala memakai
eluen yg sama (utk poliamida direndam 1 jam)
 Dituang hati2 kedalam kolom
 Sejumlah sampel dilarutkan dg sedikit eluen, lalu
ditempatkan pada bgn atas fase diam dg pipet
 Masukkan eluen dg pipet secara hati2
 Memilih Fase Diam
 Sellulose → serupa dg kertas, ideal utk memisahkan
glikosida dg glikosida, glikosida dg aglikonnya, aglikon
yg kurang polar. Kapasitas: rendah. Misal: selulose
mikrokristal (Merck, Macherey & Nagel), Whatman CF-
11

 Silika → utk memisahkan aglikon yg kurang polar seperti

isoflavon, flavanon, metol flavon, flavonol (dicuci dl dg
HCl pekat utk menghilangkan sesepora besi). Kapasitas:
menengah. Misal: Kiselgel 60, 70-230 mesh (Merck).
 Memilih Fase Diam
 Poliamida→ cocok utk semua flavonoid, jg ideal utk
glukosida (dicuci dl dg MeOH dan H2O, dan perlu
diayak) kapasitas tinggi. Misal: Polyclar AT (General
Aniline and Film Corporation), Polypenco 66D (Polymer
Corporation), Polyamida (Woelm).

 GelSephadex (deret G) → utk memisahkan campuran

berdasarkan bobot molekul (bila digunakan pelarut air)
molekul besar terelusi lebih dulu → Utk poliglikosida
yg berbeda bobot molekulnya.
 Memilih Fase Diam
 Gel Sephadex (deret G) → bila digunakan pelarut organik
maka bekerja seperti selulose tetapi kapasitas lebih besar
(gel hrs direndam selama 12 jam dlm eluen).
Contoh: G-10 (utk BM 0-700), G-25 (utk BM 100-1500).
 Memilih Fase Diam
 GelSephadex LH-20 → Sephadex LH-20 Pharmacia
dirancang khusus utk menggunakan pelarut organik →
Cocok utk pemurnian akhir aglikon flavonoid dan
glikosida yg telah diisolasi dr kertas, selulose, silika, atau
poliamida. Pelarut yg cocok adalah MeOH, meski
diperlukan sedikit air utk melarutkan flavonoid.
(sebelumnya gel direndam dl dg MeOH)
 Memilih Pelarut/Eluen
 Cara sederhana adalah dg KLT sebelum dilakukan
kromatografi kolom.
 Umumnya kolom dielusi dg pelarut atau campuran
pelarut yg berurutan → dimulai dg pelarut yg kurang
polar, sedikit2 meningkat hingga ke yg paling polar.
 Memilih Pelarut/Eluen
 Selulose, silika → dg kepolaran menurun → H2O, asam
format, MeOH, HOAc, isopropil alkohol (i-PrOH),
aseton, n-PrOH, tetrahidrofuran, t-BuOH, 20-BuOH, metil
etil keton, n-amil alkohol, etil asetat, eter, CHCl3,
benzena.
 Poliamida → dg keefektifan menurun → larutan urea dlm
air, dimetilformamida, formamida, larutan NaOH, aseton,
MeOH, H2O, dikloroetana, atau CHCl3.
 Cara menampung eluat
 Kolom dielusi perlahan2 dg pelarut yg sdh disiapkan
 Pita yg memisah dlm kolom tampak kuning atau dpt
dideteksi dg sinar UV 366 nm → kumpulkan setiap pita
dlm wadah yg terpisah.
 Jika tdk kelihatan tampung semua fraksi dlm jumlah yg
sama → analisis secara KKt atau KLT → fraksi yg sama
digabung
 Cara kromatografi lain yang berguna
1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
→ utk mikroanalisis cepat
KLT berguna utk tujuan berikut :
 Mencari pelarut utk kromatografi kolom
 Analisis fraksi yg diperoleh dari kromatografi kolom
 Melihat arah /perkembangan reaksi spt hidrolisis atau
metilasi
 Isolasi flavonoid murni skala kecil.
 Fasegerak yang umum digunakan dalam
isolasi flavonoid:
 Etil asetat:asam format:as.asetat glasial:air =
100:11:11:27
 Kloroform:aseton:asam format = 75:16,5:8,5
 Kloroform:EA = 60:40

 Pengamatan hasil KLT  pjg gelombang 254

nm  peredaman warna biru tua
 365 nm  fluoresensi warna kuning, biru, hijau
 Penyerap dan pengembang umumnya sama dg KKt dan
Kromatografi Kolom
 Pelat KLT dr plastik dianjurkan krn tembus sinar UV (utk
mendeteksi bercak)
 Contoh: selulose F1440, kiselgel F1500, poliamida 11F,
poligram selulose 300 UV.
 Lembaran 20x20cm dpt dipotong mjd 8x4cm diletakkan
dlm gelas piala bertutup atau bejana kaca baku 9x9x4cm
→ umumnya dikembangkan selama 10-100 menit.
 Kadar flavonoid sebaiknya sekitar 0,5-1.5%
 Cara kromatografi lain
2. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
 Pd dasarnya perkembangan kromatografi kolom yg
menggunakan kolom dg bahan pengembang partikel
berukuran kecil dan teratur → luas permukaan lebih besar
→ meningkatkan interaksi antara fase diam dan molekul2
yang melintasinya → pemisahan komponen2 dalam
campuran yg lebih baik.
 Pelarut menetes melalui kolom sesuai gravitasi
 Utk mendapatkan laju aliran yg memadai digunakan
tekanan hingga 400 atm
 Dpt menganalisis komponen flavonoid dlm campuran
secara kuantitatif dg kepekaan tinggi (hingga <50 ng).
 Eluat yg keluar dr kolom secara otomatis dibaca dg
spektro UV dan kromatogram → berupa deretan puncak
 KCKT yg paling cocok adalah kolom fase balik
(hidrokarbon terikat pada kemasan silika) jenis μ-
Bondapak C-18.
 Silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan
rantai2 hidrokarbon panjang pd permukaannya.
 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

 Pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol

seperti metanol.
 Contoh: H2O/MeOH, H2O/MeOH/HOAc, dan
H2O/asetonitril → digunakan utk flavon, flavonol,
katekin, dihidroflavonoid, antosianin, dan flavonoid
glikosida.
Kekurangan cara KCKT:
 Biaya tinggi utk pompa, detektor, perekam, kolom
 Persyaratan dlm penyuntikan larutan hrs bebas partikel
utk mencegah penyumbatan dan kerusakan kolom
3. Cara penghabluran ulang
 Jika flavonoid tersedia cukup (4 mg atau lebih) → maka
cara pemurnian paling efektif adl penghabluran ulang utk
menghilangkan flavonoid lain dan bahan kromatografi yg
larut.
 Titik leleh flavonoid yg diperoleh dpt dibandingkan dg
titik leleh flavonoid yg pernah diisolasi sebelumnya.
 Salah satunya dg cara:
 Larutkan flavonoid pada 1000C dg pelarut sesedikit
mungkin.
 Larutan disaring dg corong Buchner atau bila volume
kecil dg pipet Pasteur melalui gumpalan kapas kecil.
 Larutan dibiarkan dingin dan menguap dlm labu
erlenmeyer hingga hablur terbentuk perlahan (dpt
dibantu dg pendinginan).
 Pelarut yg dipakai MeOH/H2O → utk glikosida
flavonoid, flavon, flavonol.
 Dietil eter/eter minyak bumi (t.d 60-800C) → utk
aglikon yg kurang polar.
CONTOH JURNAL
 METODOLOGI PENELITIAN
 Alat dan Bahan
 Peralatan yang digunakan untuk pengerjaan isolasi adalah
seperangkat alat distilasi, seperangkat alat rotary evaporator
(Betracher Lamag), lemari pengering atau oven (Fisher Scientific
Isotemp oven, model 630 F), lampu UV(λ = 254 nm dan 366 nm),
melting point apparatus (Fisher Jhon), spektrofotometer UV-Vis
(Type UV-160 A; Shimadzu), kolom kromatografi (50 cm x 2,5 cm
i.d), plat KLT (silika gel 60 F ), gelas ukur berbagai ukuran, botol
254

berbagai ukuran, chamber, plat tetes, corong pisah, kapiler,

alumunium foil dan kertas saring.
 Bahan-bahan yang digunakan untuk uji fitokimia adalah etanol,
kloroform, akuades, FeCl , asam asetat anhidrida, amonia, HCl
3

pekat, logam Mg, n-butanol, asam asetat, akuades. Bahan-

bahan untuk pengerjaan isolasi adalah daun salam (Polyanthi
folium), metanol, etil asetat, n-heksana dan silika gel 60 F.
 Uji Pendahuluan Flavonoid
 Sampel segar daun sebanyak 2 gram dipotong halus,
dimasukkan ke dalam sebuah tabung reaksi, kemudian
dimaserasi dengan metanol dan dipanaskan di atas
penangas air selama 15 menit. Hasil maserasi dalam
kondisi panas disaring dan dimasukan ke dalam
tabung reaksi lainnya. Tambahkan beberapa tetes
larutan HCl pekat dan beberapa butir bubuk Mg ke
dalam ekstrak metanol. Terbentuknya warna merah
menandakan adanya senyawa flavonoid (T.J. Mabry, et
al., 1970 dan Harbone, J.B, 1987).
 Isolasi Senyawa Flavonoid
 Sampel dimaserasi pada temperatur kamar
menggunakan pelarut metanol beberapa kali sampai
ekstraksi sempurna. Hasil maserasi dipekatkan
dengan rotary evaporator pada suhu 40 C. Ekstrak
0

pekat tersebut difraksinasi dengan n-heksana,

kemudian dilanjutkan fraksi dengan etil asetat dan
kemudian dengan n-butanol. Setiap fraksi yang
didapatkan dilakukan uji terhadap senyawa
flavonoid. Fraksi yang positif flavonoid (fraksi
etil asetat) dipekatkan dengan rotary evaporator.
 Ekstrak pekat dari fraksi etil asetat sebanyak 5 gram
dilakukan kolom kromatografi menggunakan eluen n-
heksana, etil asetat dan metanol dengan sistim kepolaran
bertingkat.
 Hasil kromatografi kolom tersebut selanjutnya diuji dengan
KLT dengan menggunakan pengungkap noda uap yodium.
 Untuk fraksi yang mempunyai pola noda dan harga Rf yang
sama digabung menjadi satu fraksi dan selanjutnya
dipekatkan dengan rotari evaporator. Fraksi yang diperoleh
dilakukan uji flavonoid dan dilakukan kromatografi kertas
untuk menentukan adanya senyawa flavonoid.
 Fraksi yang positif terhadap uji flavonoid dimurnikan dengan
kromatografi kertas preparatif menggunakan eluen n-
butanol:asam asetat:air (4:1:5). Hasil isolasi senyawa yang
didapatkan dilakukan karakterisasi untuk mengetahui
strukturnya (T.J. Mabry, et al., 1970).
 Karakterisasi senyawa hasil isolasi
 Untuk menentukan golongan flavonoid, hasil isolasi
diperiksa dengan metoda kromatografi kertas 2 arah,
dengan eluen campuran n-butanol, asam asetat, dan
air (4 : 1 : 5) serta asam asetat 15 %. Kemudian
dibandingkan dengan kromatogram standar.
 Untuk menentukan strukturnya digunakan analisis
spektroskopi spektrofotometer ultraviolet dan infra
merah.
 Khusus untuk spektofotometer ultraviolet dilakukan
penambahan pereaksi geser natrium metoksida
(NaOCH ), alumunium klorida/asam klorida (AlCl /HCl)
3 3

dan natrium asetat/asam borat (NaOOCCH /H BO ).

3 3 3

(T.J. Mabry, et al., 1970).

 HASIL DAN DISKUSI
 Salah satu metabolit sekunder yang terdapat dalam sampel
adalah senyawa flavonoid. Hal ini dibuktikan dengan Sianidin
test menggunakan HCl pekat dan bubuk Mg menghasilkan
warna merah muda. Fraksi etil asetat memberikan warna
merah dengan pereaksi Mg/HCl berarti mengandung senyawa
flavonoid.
 Fraksi etil asetat dilakukan kolom kromatografi, hasil
kromatografi kolom ditampung dalam vial 10 mL dan di KLT.
 Berdasarkan hasil KLT, fraksi-fraksi yang memiliki pola noda
dan Rf yang sama digabung diperoleh 7 fraksi. Fraksi yang
mengandung flavonoid adalah fraksi 5, 6, dan 7, sedangkan
fraksi 1 sampai 4 tidak mengandung flavonoid.
 Selanjutnya dilakukan pemurnian terhadap fraksi 5 dengan
kromatografi kertas preparatif menggunakan eluen n-
butanol:asam asetat:air (4:1:5).
 Hasil kromatografi diperoleh senyawa murni hasil isolasi
kristal/bubuk bewarna kuning dengan titik leleh 200-203 C.
0

 Senyawa hasil isolasi memberikan noda tunggal dengan eluen

yaitu eluen n-heksana : etil asetat (5 : 5) Rf 0,45 dengan eluen
n-heksana : etil asetat (2 : 8) Rf 0,55 dan etil asetat : aseton (5
: 5) Rf 0,75 serta etil asetat : metanol (1 : 1) Rf 0,88.
 Senyawa hasil isolasi dengan kromatografi kertas 2 arah dengan
eluen n-butanol:asam asetat:air (4:1:5) Rf 0,87 dan asam asetat
15% Rf 0,26.
 Pola noda yang dihasilkan dibandingkan indentik dengan
flavon aglikon. Informasi lain dari warna bercak yang terlihat
dengan sinar UV, yaitu berwarna kuning-kebiruan dan setelah
diuapi dengan NH warna berubah menjadi lebih terang.
3

 Hal ini mengindikasikan bahwa kemungkinan senyawa hasil

isolasi merupakan jenis flavon atau flavanon yang tidak
menggandung 5-OH.
 Sedangkan senyawa hasil isolasi memberikan
puncak pada panjang gelombang 310 nm sebagai
puncak I dan 255 nm sebagai puncak II. Bila
menggunakan pereaksi geser puncak yang
dihasilkan dapat dilihat pada Tabel 1.
 Pada pita I terjadi pergeseran batokromik sebesar 49
nm, setelah penambahan pereaksi geser NaOCH Hal 3

ini menindikasikan bahwa penambahan AlCl akan

3

membentuk komplek yang tahan asam antara gugus

hidroksi dan keton, dan komplek yang tidak tahan
asam antara gugus hidroksi yang bertetangga (gugus
orto-hidroksi).
 Jadi spektrum AlCl berguna untuk menditeksi 5-
3

OH dan orto-dihidroksida.
 Sedangkan penambahan HCl akan memutus
kompleks yang tidak tahan asam, jadi spektrum
AlCl /HCl hanya merupakan pengaruh gugus
3

hidroksi-keto dan mendeteksi ada atau tidaknya 5-

OH saja.
 Spektrum UV senyawa hasil isolasi dengan penambahan AlCl 3,

tidak ada pergeseran kearah panjang gelombang yang lebih

besar terhadap pita I, menunjukan tidak adanya gugus hidroksi
yang berdekatan dengan gugus keton, dan gugus orto-
dihidroksi pada cincin B.
 Hal ini diperkuat dengan tidak adanya pergeseran setelah
penambahan AlCl /HCl.
3

 Penambahan pereaksi geser yaitu NaOAc merupakan basa

yang lebih lemah dari pada NaOMe, karena itu spektrum
NaOAc hanya dapat menditeksi ada atau tidaknya gugus
hidroksi yang paling asam, terutama untuk gugus 7-OH atau
yang setara.
 Spektrum NaOAc/H BO berguna untuk menditeksi ada atau
3 3

tidaknya gugus orto-dihidroksi antara 2 gugus hidroksi paling

asam berdekatan (6,7-OH atau 7,8-OH pada cincin A dan 3’,4’-
OH pada cincin B), karena NaOAc/H BO menjembatani kedua
3 3

gugus tersebut.
 Dari spektrum UV senyawa hasil isolasi dengan
penambahan NaOAc didapatkan pergeseran
batokromik sebesar 42 nm, hal ini diperkirakan
karena adanya 7-OH.
 Setelah penambahan NaOAc/H BO tidak
3 3

memperlihatkan pergeseran ke arah panjang

gelombang yang lebih besar pada pita I, diperkirakan
karena tidak adanya orto-dihidroksi pada cincin B
 Mengacu pada hasil analisa preaksi geser
terhadap spektrum UV senyawa hasil isolasi,
maka diperkirakan bahwa senyawa ini termasuk
jenis senyawa flavon yang memiliki gugus –OH
pada posisi 7.
 Spektrum IR senyawa hasil isolasi serapan melebar
pada angka gelombang 3434 cm yang merupakan
-1

gugus OH dan diperkuat dengan adanya serapan

yang kuat pada daerah sidik jari 1054 cm , yang
-1

Khas untuk gugus C-O alkohol.

 Munculnya serapan pada angka gelombang 1710
cm menindikasikan adanya gugus C=O, yang khas
-1

untuk keton siklik. Pada angka panjang gelombang

1610 cm memperlihatkan adanya gugus C=C
-1

aromatik, adanya cincin benzen pada 1464 cm , 794

-1

cm , adanya C-H alifatis pada angka gelombang

-1

2932 cm , dan pada angka gelombang 1026 cm

-1 -1

memperlihatkan adanya serapan stretching C-O-C.

 Berdasarkan hasil penerjemahan spektrum
yang dihasilkan, senyawa hasil isolasi pada
sistem deteksi UV, IR, dan KKt 2 arah
menunjukan bahwa senyawa hasil isolasi
merupakan senyawa flavon yang memiliki
gugus OH pada posisi 7.
 KESIMPULAN DAN SARAN
1. Hasil isolasi dari fraksi etil asetat diperoleh
a) senyawa flavonoid berupa bubuk berwarna kuning
b) TL 200- 203 C
0

c) Rf 0,45 dengan eluen n-heksana : etil asetat (5 : 5),

Rf 0,55 dengan eluen n-heksana : etil asetat (2 : 8)
dan Rf 0,75 eluen etil asetat : aseton (5 : 5) serta Rf
0,88 dengan eluen etil asetat : metanol (1 : 1).
2. Senyawa hasil isolasi dengan kromatografi kertas
2 arah dengan eluen n-butanol:asam asetat:air
(4:1:5) Rf 0,87 dan asam asetat 15% Rf 0,26.
 3. Analisa data pemeriksaan kimia, kromatografi kertas 2
arah, spektrometri UV dan IR disimpulkan bahwa senyawa
hasil isolasi adalah senyawa flavonoid golongan flavon.
 4. Analisa spektrum UV dengan pereaksi geser
menunjukkan bahwa senyawa flavon memiliki gugus OH
pada posisi C .
7

SARAN  Untuk lebih sempurnanya penelitian ini, maka

dapat disarankan penelitian ini lebih lanjut melakukan
pengukuran spektroskopi massa dan spektroskopi NMR serta
uji efek fisiologis dan farmakologis terhadap senyawa hasil
isolasi.
 Pustaka
 Anonim. 1995. Farmakope Indonesia, ed. IV. Depkes
RI. Jakarta
 Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid;
terjemahan Kosasih Padmawinata, Bandung: Penerbit
ITB.
 Underwood. 1999. Analisis Kimia Kualitatif. Jakarta