PEWARNAAN BAKTERI

TIARA DINI HARLITA, S.S.T, M.Si.

PEMBUATAN PREPARAT

●
● Jika dari kultur : dibuat suspensi kuman dengan cara 1 tetes
NaCl 0,85% + biakan kuman sedikit, kemudian sebarkan setipis
1 mungkin dengan diameter ± 1 cm, panjang ± 2 cm. Kemudian
biarkan kering di udara. Setelah itu difiksasi dengan api spirtus.

●
● Jika dari sediaan langsung seperti sputum, kita
buat hapusan pada object glass yang bersih dan
2 bebas lemak dengan ukuran 2x3 cm, biarkan
kering lalu difiksasi.

●
● Untuk pemeriksaan bahan yang cair (urine, pus,
dsb), kita ambil satu ose, kemudian letakkan pada
3
object glass, lalu diratakan dan dibiarkan kering di
udara bebas,
 FIKSASI

Pengertian :

●
● Fiksasi adalah suatu cara yang dilakukan untuk merekatkan sampel pada
object glass, sehingga tidak mudah lepas pada saat pencucian ketika
diwarnai.

Tujuan :

●
● Agar kuman segera mati sehingga mudah untuk diwarnai dan tidak merusak struktur kuman.
●
● Agar substansi kuman dapat terlihat pada slide.
●
● Agar bahan warna dapat masuk dalam tubuh kuman dengan sempurna.
●
● Mengawetkan sediaan.
 Metode :

●
● Dengan api spirtus
●
● Sediaan yang sudah kering dilewatkan perlahan-lahan pada nyala api kira-kira 3x
berturut-turut.
●
● Dengan basa lemah : metanol, etil alkohol, alkohol absolut, eter, formalin, aceton.
●
● Sediaan yang sudah kering digenangi dengan salah satu bahan tersebut selama 3 menit.
●
● Dengan asam : asam chrimat 1%, asam pikrat, asam cuka.
●
● Sediaan yang sudah kering digenangi dengan salah satu bahan tersebut selama 3 menit.
 PEWARNAAN

Tujuan

●
● Melihat morfologi dan bentuk kuman
●
● Melihat susunan kuman
●
● Melihat sifat-sifat kuman terhadap pewarnaan (Misalnya cat Gram, (+) = violet; (-) = merah)
●
● Mengarahkan pemeriksaan lebih lanjut dari kuman yang kita temukan
●
● Membantu klasifikasi kuman
●
● Mendapatkan bentuk kuman yang khas
 Teori proses pewarnaan :

●
● Fisik : bahan pewarna diabsorbsi oleh kuman sehingga terjadi ikatan
antara zat warna dengan kuman
●
● Kimia : bahan warna yang diabsorbsi oleh kuman dan bergabung
dengan protoplasma kuman, dimana protoplasma kuman banyak
mengandung asam nukleat yang bermuatan (-) dimana akan
berikatan dengan bagian zat warna yang bermuatan (+).
 JENIS PEWARNAAN

Pewarnaan sederhana

●
Menggunakan 1 macam zat warna
●
Perbedaan warna sel-sel atau bagian sel tergantung dari besar kecilnya kemampuan sel atau
bagian sel menyerap warna yang diberikan.
●
Cat yang digunakan : Solutio fuchsin, carbol fuchsin, methilen blue, carbol gentian violet, dsb.

Pewarnaan diferensial

●
Teknik pewarnaan ini menyebabkan bagian sel terwarnai berbeda.
●
Pewarnaan Gram : dikembangkan pertama kali oleh Hans Christian Gram (1884). Dibagi menjadi 2,
yaitu Gram positif dan Gram negatif.
●
Pewarnaan tahan asam : pewarnaan ini sering digunakan untuk genus Mycobacterium dan Nocardia.
 Pewarnaan Khusus

●
Pewarnaan ini digunakan untuk melihat bagian-bagian khusus dari sel bakteri.
●
Pewarnaan negatif untuk kapsul. Banyak bakteri yang mempunyai kapsul di bagian luar sel.
●
Pewarnaan endospora : endospora tidak dapat diwarnai dengan cara pewarnaan biasa, sebab zat warna
tidak bisa menembus spora.

Pewarnaan majemuk

●
Pengecatan yang dilakukan dengan satu campuran cat yang terdiri dari 2
atau 3 cat yang terlarut.
●
Contoh : Wright, Giemsa, dll.
 PEWARNAAN SEDERHANA

 Cat yang digunakan : Methylen blue/Safranin/Fuchsin

 Prosedur :
 Dibuat sediaan tipis dan rata pada object glass
 Keringkan sediaan di udara lalu difiksasi di atas lampu spirtus
sebanyak 3 kali.
 Teteskan zat warna/cat yang akan digunakan di atas sediaan
selama 1-2 menit
 Setelah itu, cat dibuang dan sediaan dicuci dengan air mengalir
secara perlahan sampai bersih.
 Kemudian dikeringkan sediaan di udara atau dengan tisu.
 Baca sediaan di bawah mikroskop menggunakan perbesaran
objektif 100x menggunakan minyak imersi.
 PEWARNAAN GRAM

 Bahan :

 Gram A
▪ 2 gr kristal violet + 20 ml alkohol 95% + 0,8 gr ammonium oksalat + 80 ml
aquadest
 Gram B
▪ 1 gr Iodium + 2 gr Kalium Iodida + 300 ml aquadest
 Gram C
▪ 50 ml aseton + 50 ml alkohol 95%
 Gram D
▪ 0,25 gr safranin O / fuchsin + 10 ml alkohol 95% + 90 ml aquadest
 Prosedur :
 Dibuat sediaan tipis dan rata pada object glass
 Keringkan sediaan di udara, lalu difiksasi di atas lampu spirtus
sebanyak 3 kali.
 Teteskan Gram A di atas sediaan selama 1-2 menit.
 Cuci sediaan dengan air mengalir secara perlahan melalui ibu jari.
 Teteskan Gram B, diamkan selama 30 detik.
 Cuci kembali dengan air mengalir secara perlahan melalui ibu jari.
 Teteskan Gram C hingga warna ungu larut/pucat.
 Teteskan Gram D dan diamkan selama 1 menit.
 Cuci dengan air mengalir secara perlahan melalui ibu jari.
 Keringkan sediaan di udara atau dengan tisu.
 Baca sediaan di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x
menggunakan minyak imersi.
 PEWARNAAN TAHAN ASAM

Carbon Fuchsin 0,3 gram (ZN A)

●
● Larutan
Larutan Fuchsin
Fuchsin 3%
3% (100
(100 mL)
mL) ::
●
● Fuchsin
Fuchsin 33 gram
gram
●
● Etanol 96% 100
Etanol 96% 100 mL mL
●
● Larutan
Larutan Phenol
Phenol 5%
5% ::
●
● Phenol
Phenol kristal
kristal 45
45 gram
gram
●
● Aquadest add
Aquadest add 900
900 mL
mL

Asam Alkohol 3% (ZN B)

●
● HCl 37% 30 mL
●
● Etanol 96% 970 mL

Methylene Blue 0,3% (ZN C)

●
● Methylene blue 3 gram
●
● Aquadest add 1000 mL
 TAHAPAN PEWARNAAN ZIEHL -NEELSEN
(Standar Prosedur Operasional Pemeriksaan Mikroskopis TB, Kemenkes RI, 2012)
(The Handbook – Laboratory Diagnosis of Tuberculosis by Sputum Microscopu, SA Pathology, 2013)

1 2
Letakkan sediaan dengan
bagian apusan menghadap ke Genangi seluruh permukaan
atas pada rak yang sediaan dengan Carbol Fuchsin.
ditempatkan di atas bak cuci Saring zat warna setiap kali akan
atau baskom, antara satu melakukan pewarnaan sediaan.
sediaan dengan sediaan
lainnya masing-masing
berjarak kurang lebih 1 jari.
Lanjutan ...

3 4
Panasi dari bawah dengan
menggunakan sulut api Dinginkan selama minimal 5
setiap sediaan sampai keluar menit.
uap, jangan sampai
mendidih.
Lanjutan ...

5 X

Bilas sediaan dengan air

mengalir secara hati-hati dari Jangan ada percikan ke
ujung kaca sediaan sediaan lain.
Lanjutan ...

6 7
Genangi dengan asam
alkohol sampai tidak tampak
Miringkan sediaan
warna merah Carbol fuchsin.
menggunakan penjepit kayu
Jangan sampai ada percikan
atau pinset untuk membuang
ke sediaan lain.
air.
Lanjutan ...

8 9

Bilas sediaan dengan air

Genangi permukaan sediaan
mengalir secara hati-hati dari
dengan Methylene blue selama
ujung kaca sediaan. Jangan
20-30 detik
ada percikan ke sediaan lain.
 Lanjutan ...

10 11

Miringkan sediaan untuk

Bilas sediaan dengan air
mengalirkan sisa Methylene
mengalir. Jangan ada
blue.
percikan ke sediaan lain.
 Lanjutan ...

12 13

Keringkan sediaan pada rak

pengering. Jangan keringkan Contoh hasil pewarnaan
dengan kertas tissue. yang baik
 INTERPRETASI HASIL

• BTA (+) : tampak kuman berwarna merah, berbentuk batang

halus kadang- kadang bergranul disertai kuman-kuman lain
non BTA dan sel leukosit yang berwarna biru.

• BTA (-) : tidak ditemukan kuman batang berwarna merah,

hanya terlihat kuman-kuman non BTA dan sel leukosit yang
berwarna biru
 PELAPORAN

Skala Internatiaonal Union Against To Lung Disease (IUATLD)