Inokulasi/ mengisolasi

VIRUS
Prof. Dr.dr. I Wayan Putu Sutirta Yasa, M.Si
PEMBIAKAN VIRUS/ mengisolasi virus
Virus adalah mikroorganisme yang hidup secara
obligat intra seluler, oleh karena itu cara
pembiakannya lebih sulit daripada pembiakan bakteri.
Cara Pembuatan Inokulum
a. Sampel berupa organ atau jaringan diambil sebanyak kira-kira 1
gram, ditempatkan pada mortar steril, lalu dipotong kecil-kecil dan
digerus sampai halus sambil ditambahkan PBS pH 7,2 atau boleh
juga NaCl fisiologis sampai konsentrasinya 10-20 %.
b. Selanjunya suspensi jaringan dipindahkan ke dalam tabung steril
untuk disentrifuse dengan kecepatan 2500 rpm selama 10-15 menit,
kemudian dipisahkan supernatant dari endapan.
c. Diambil bagian supernatan sebanyak 9 ml, ditambahkan dengan
antibiotika 1 ml yang sudah diencerkan (dengan dosis 1000-5000 IU
penicillin dan 1000- 5000 µg/ml streptomisin). Campuran tersebut
selanjunya dieramkan pada inkubator bersuhu 37ºC selama 30
menit.
d. Campuran supernatan yang berisi antibiotika tersebut
selanjuntnya digunakan sebagai bahan untuk isolasi virus pada
tahap berikutnya.
Ada tiga cara yang umum digunakanuntuk
membiakkan virus yang dengan :
inokulasi pada hewan percobaan,
inokulasi pada telur berembrio,
Inokulasi pada biakan jaringan
1. Inokulasi Pada Hewan Percobaan
Metode yang digunakan untuk mengadakan inokulasi
virus tergantung pada jenis virus yang akan dicoba dan
lokasi anatomi dari sel yang dituju dalam percobaan.
Cara yang sering digunakan untuk melakukan inokulasi
adalah melalui intravena, intraserebral, intraperintonial,
intranasal, intratrakeal, intradermal dan melalui
subkutan. Dengan demikian jenis hewan percobaan,
umurnya, jenis kelamin serta cara penyuntikan untuk
inokulasi pada hewan percobaan sangat tergantung dari
jenis virus yang akan ditanam atau diisolasi.
Contoh :
- Virus Herpes simplex :
Pada Kelinci, dengan bahan digoreskan/skarifikasi pada kornea, setelah beberapa
hari kornea keruh karena ada vesikel-vesikel berisi virusnya.
- Virus Rabies :
Pada Tikus putih (albino) bayi atau dewasa, disuntikan intraserebral, setelah 1 minggu
Akan terlihat gejala ensefalitis (rabies) dan tikus akan mati.

- Dengue :
Pada Tikus putih berumur 1-3 hari, dsuntikan intraserebral dan subkutan, 3-7
hari kemudian terlihat tremor kemudian paralisis dan mati.
- Penyebab Q-fever :
Pada Cavia jantan, disuntikan intraperitonial, setelah 7-10 hari tampak orkhitis,
dalam cairan skrotum dapat ditemukan penyebab Q-fever.
- Polio
Dari tinja, liqour, apus tenggorokan penderita disuntikkan pada kera secara
intrakutan/intramuskular/intraneural/intraspinal, kemudian akan tampak
paralisis.
2. Inokulasi Pada Telur Berembrio
Beberapa jenis virus dapat dibiakkan pada sel-sel yang
membungkus rongga telur berembrio atau pada embrio
yang sedang tumbuh itu sendiri.
Berbagai jenis telur dapat digunakan untuk membiakkan
virus, antara lain telur bebek dan telur ayam kalkun
misalnya virus rabies, tetapi yang paling sering digunakan
adalah telur ayam.
Untuk mencegah masuknya bakteri, lapisan lilin diluar
dinding telur hanya boleh disikat, tidak boleh dicuci
dengan sabun.
Umur telur berembrio, suhu dan lamanya pengeraman serta
cara penyuntikan yang bermacam-macam tergantung
kepada jenis virus yang akan dibiakkan atau diisolasi.
Contoh :
a. Inokulasi pada selaput Chorio Allantois
(Dropping CAM)
- Intra amnion/Intra alantois :
Untuk Herpes simplex, Influenza dan Parotitis
epidemika dipakai telur berumur 9-12 hari dengan
lama pengeraman 2 x 24 jam pada suhu 37 C.
- Intra yolk sac :
Untuk Q-fever, telur berembrio berumur 6-8 hari, 10 x
24 jam pada suhu 37o C
.Untuk Trakhoma, telur berembrio berumur 7-10 hari,
lama pengeraman 1-2 minggu pada suhu 37 C.
 Intra embrional :
 Untuk Japanese B Encephalitis, dipakai telur
berembrio umur 8-10 haridan dieramkan pada suhu 37
C
b. Inokulasi pada CAM (Chorio Allantois
Membrane)
- Untuk Fow l pox, Variola, Vaccinia dan Cowpox
terbentuk pocs khas untuk masing-masing virus.
- Untuk Herpes simplex membentuk plaque.
- Pocks adalah bintik-bintik putih berbentuk bundar
dan menonjol pada permukaan CAM.
- Plaques adalah bintik-bintik putih berbentuk bundar
yang sangat datar dan transparan.
Sifat pocks dan plaques dari beberapa virus pada
(Chorio Allantois Membrane) :
1. Sifat pocks virus variola :
Bentuk bundar, diameter kira-kira 1 mm, berwarna putih keruh, menonjol
pada permukaan CAM.
2. Sifat pocks Virus Vaccinia :
Berwarna putih jernih, berukuran besar, tidak begitu menonjol pada
permukaan CAM.
3. Sifat pocks Virus Cowpox :
Ukurannya sama dengan pocks Virus Vaccinia, warnanya putih yang
ditengahnya terdapat warna merah karena adanya perdarahan.
4. Sifat pocks Virus Fowlpox :
Ukurannya jauh lebih besar dari pocks Virus Vaccinia tetapi lebih menonjol
pada permukaan CAM.
5. Sifat plaques Virus Herpes simplex :
Warnanya sama dengan pocks Vaccinia tetapi sama sekali tidak menonjol
padapermukaan CAM dan transparan, ukurannya lebih kecil dari pocks
Variola.
Hasil penyuntikan pada :
1. Intra amnion/intra alantois
Membentuk antigen hemaglutinin dan ikatan komplemen.
2. Intra Yolk sac
Membentuk antigen ikatan komplemen.
3. Intra embrional
Penyuntikan virus akan menyebabkan kematian embrio.
Tetapi tidak boleh menunggu sampai embrio mati
karena virusnya akan mati juga. Untuk itu telur
berembrio harus diperiksa setiap hari di kamar gelap,
apabila geraknya mulai lambat, embrio dikeluarkan dan
virusnya diambil.
Inokulasi
TAB (Telur Ayam Bertunas )
Media Isolasi Virus: Telur Ayam Bertunas Media yang digunakan untuk
isolasi virus antara lain: telur ayam bertunas (TAB), biakan sel, hewan
percobaan maupun hospes alami.
Pada modul ini akan dibahas tentang isolasi virus (sampel uji virus AI
dan ND (Avian Influenza/Flu burung, Newcastle Disease (ND)
Media yang umum digunakan untuk isolasi virus ND dan AI adalah telur
ayam bertunas (TAB).
Alasan pemilihan telur ayam bertunas sebagai media isolasi Virus ND
dan AI , antara lain:
a. Mudah diperoleh
b. b. Relative bebas dari mikroorganisme pathogen
c. c. Peka terhadap infeksi virus ND dan AI
d. d. Dapat diberikan tanda (ditulis dengan pensil: kode isolat, asal
isolat, tanggal inokulasi, jenis penyakit). Sebelum digunakan telur
diperiksa (candling) terlebih dahulu dengan menggunakan candler
(teropong telur).
Candling Telur Ayam Bertunas Pemeriksaan telur
ayam bertunas disebut candling yang dilakukan pada
ruangan gelap untuk mengamati pergerakan
embrionya.
Teropong telur (candler) dihidupkan lalu telur
diperiksa di depan Canler.
Diamati pergerakan ambrio dan pembuluh darahnya.
Telur yang fertile ditandai dengan pergerakan aktif
dan darahnya merah.
Sebaliknya telur yang infertile tidak ada pergerakan
embrio dan pembuluh darahnya tampak hitam.
Isolasi Virus pada Telur Ayam Bertunas Jalur
inokulasi yang umum dilakukan pada telur ayam
bertunas diantaranya adalah:
a. inokulasi melalui ruang alantois
b. inokulaasi melalui membrane korioalantois
(Chorioalantoic membrane= CAM)
c. inokulasi kantong kuning telur (Yolk Sac)
d. inokulasi melaui ruang amnion (amnionic cavity)
e. inokulasi melalui otak (intracerebtum)
f. inokulasi melalui pembuluh darah (intra vena)
Cara inokulasi virus melalui Ruang Alantois Jalur inokulasi ini
dipilih untuk virus: Newcastle Disease, Avian Influenza, Infectious Bronchitis,
Egg Drop Syndrome.
Telur yang digunakan biasanya berumur 9-10 hari. Jalur inokulasi adalah
sebagai berikut:
a. Telur di candling untuk menentukan fertile atau tidak
b. Ditandai ruang udaranya dengan menggunakan pensil 15
c. Kulit telur didesinfeksi dengan alkohol 70%.
d. Dibuat lubang pada cangkang telur dengan menggunakan jarum penusuk
e. Dilakukan inokulasi 0.2 ml inokulum/ butir telur dengan menggunakan
spuit dengan jarum berukuran 1 ml.
f. Lubang tempat suntikan tadi ditutup dengan menggunakan kuteks
g. Diberikan label pada telur tentang isolat yang diisolasikan.
h. Telur diinkubasikan di inkubator bersuhu 37ºC dan diamati setiap hari
dengan cara di canding
i. Kematian telur kurang dari 24 jam diabaikan dan dianggap telur
terkontaminasi.
j. Telur yang mati lebih dari 24 jam atau telur dengan embrio yang sudah
lemah selanjutnya dimasukkan ke almari pendingin selama satu malam.
k. Dilakukan pemanenen cairan alantois.
Cara Inokulasi Virus Melalui Membrana Korioalantois (CAM) Inokulasi
melalui membrane korioalantois dilakukan untuk mengisolasi virus –virus yang
bersifat epiteliotrofik, misalnya: virus Marek, Gumboro, Distemper, Pox, Variola,
Vaccinia.
Biasanya pertumbuhan virus bersifat lambat yang ditandai dengan pembentukan pox
pada CAM.
Cara inokulasi CAM:
a. Telur dipilih yang fertile dan berumur 11-13 hari
b. b. Dilakukan candling dan ditandai ruang udaranya dengan pensil.
c. c. Dibuat satu tanda (x) dibagian horizontal yang dekat dengan pembuluh darah.
d. d. Kulit telur didesinfeksi dengan alkohol 70 % kemudian dibuat lubang pada
posisi ruang udara alami dengan menggunakan jarum penusuk steril.
e. e. Dibuat lubang satu lagi di bagian horizontal yang telah diberikan tanda (point
c). 16
f. f. Udara dihisap keluar dari lubang ruang udara alami (point d) untuk membuat
ruang udara buatan pada lubang (point e)
g. g. Diinokulasikan 0,1 ml inokulum melalui ruang udara buatan, lalu lubang tadi
didesinfeksi dan ditutup dengan kutek
h. h. Telur diinkubasikan pada inkubator bersuhu 37ºC dengan posisi horizontal, dan
diamati setiap hari selama maximal 5 hari.
i. i. Telur dipanen dan dimasukkan ke almari pendingin.
Panen Virus Telur yang sudah
diinokulasi virus selanjutnya
dikeluarkan dari almari pendingin
untuk dipanen. Sebelum dipanen
disediakan alat-alat bedah yang terdiri
dari: gunting, pinset. Disiapkan pula
cawan petri, tabung steril, spatula,
pipet Pasteur, sarung tangan dan
masker, satu kantong plastik tempat
menampung sampah bekas panen.
Cara Panen Cairan Alantois
a. Telur dikeluarkan dari almari pendingin, lalu dipotong
cangkang telur pada bagian ruang udaranya secara
melingkar dengan menggunakan gunting.
b. b. Dikuakkan selaput korioalantoisnya dengan
menggunakan pinset sehingga tampak embrio yang
dikelilingi cairan alantois berwarna jernih. Apabila
cairan alantoisnya tampak keruh itu menandakan
terjadi kontaminasi bakteri dan tidak layak untuk diuji.
c. c. Cairan alantois dipanen dengan cara diisap dengan
pipet steril dan ditampung pada tabung steril. Embrio
ditekan dengan spatula untuk mendapatkan cairan yang
bebih banyak, lalu cairan alantois ditampung pada
tabung steril kemudian diberi label untuk di uji HA/HI.
Cara Panen CAM
a. Telur dikeluarkan dari almari pendingin, lalukulit
telur digunting melingkar secara horizontal. 17
b. Embrio dikeluarkan dari cangkang telur dan
ditampung pada cawan petri steril
c. Ambil selaput CAM yang menempel pada cangkang
telur danditempatkan pada cawan petri lain yang telah
diisi PBS.
d. CAM dicuci dengan PBS, digoyang-goyangkan sampai
bersih dan diamati adanya bentuk pox pada CAM.
e. Bagian CAM yang terinfeksi (bentuk pox) kemudian
dipotong dan disimpan untuk bahan uji pada PCR atau
uji AGPT
3. Inokulasi Pada Biakan Jaringan
Dengan kultur jaringan ini selain pembiakan virus dapat juga dilakukan
berbagai macam tindakan, misalnya penemuan berbagai macam virus baru,
penelitian sifat virus dalam jangka panjang dan juga usaha untuk menemukan
vaksin terhadap virus. Terdapat tiga dasar jenis kultur sel hewani yaitu kultur primer
dan kultur sekunder, diploid cell strains dan continuous cell lines.
Kultur primer berasal langsung dari jaringan hewan dan merupakan sel-sel
satu lapis (sel monolayer). Sedangkan kultur sekunder merupakan subkultur dari
kultur primer jaringan normal.
Sesudah melalui 30 sampai 50 subkultur atau bila dilakukan subkultur
ulangan, sel-sel mengalami generasi atau mati. Kadang-kadang sel mengalami
perubahan sehingga mampu hidup sesudah melewati subkular lebih dari 50 kali.
Sel-sel ini umumnya telah mengalami perubahan morfologi. Meskipun jumlah
kromosomnya tidak berubah dan disebut sebagai diploid cell strains.
Selama mengadakan kultur dari cell strains dapat
terjadi continuous cell lines yang berubah sifat-sifat
khasnya, tumbuh dengan cepat, membentuk beberapa
lapis sel dan juga berubah jumlah kromosomnya.
Continuous cell lines ini dapat juga
terbentuk dari kultur primer dari jaringan maligna
secara langsung atau tumbuh dari kultur primer yang
diinfeksi dengan virus onkogenik.
Di dalam penggunaannya biakan jaringan yang
berasal dari manusia maupun hewan dibagi menjadi
dua yaitu biakan jaringan primer (Primary tissue
culture = primary cell line), stable cell line
Biakan jaringan primer
Pada umumnya biakan jaringan berasal dari hewan (anjing, kera,
kelinci, ayam, babi, tikus, serangga dan lain-lain) dan bisa juga dari
manusia. Biakan jaringan baik yang berasal dari hewan ataupun
dari manusia bisa dibuat dari jaringan normal, embrional atau
abnormal.
Contoh :
a. Dari jaringan dewasa normal dibuat dari :
Ginjal kera atau ginjal kelinci dan hati manusia.
b. Jaringan embrional :
Paru-paru dan usus embrio manusia, embrio tikus, embrio anjing.
c. Jaringan abnormal :
Terutama dari tumor jinak atau ganas seperti, Roos Sarcoma dari
tikus,
karsinoma epidermoid dari cervix dan karsinoma epidermoid dari
nasopharynx manusia.
Stable cell line
Stable cell line diperoleh dengan pasase sel primer
sehingga sifat sel tidak berubah.
Contohnya :
a. Hela cell (Helena lane), berasal dari epidermoid
karsinoma cervix.
b. KB cell, berasal dari epidermoid karsinoma
nasopharynx.
c. LLCMK 2, berasal dari ginjal kera Rhesus.
d. BSCL cell, dari ginjal kera Grivet.
e. BHK 21 , dari ginjal Hamster bayi, pasase ke 21.
Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi
Pertumbuhan Virus Dalam Biakan Jaringan
1. Suhu
Biakan Jaringan bisa hidup terus pada suhu 40-41 oC, tetapi bila biakan
jaringan sudah ditanami virus maka virus hanya bisa hidup pada suhu
36-37oC. Apabila suhu kurang dari 36oC maka pertumbuhannya akan
sangat lambat atau tidak tumbuh sama sekali.

2. PH
Virus paling baik tumbuh pada pH 7-7,5, bila kurang dari 7 biasanya
virus akan mati. Untuk menghindarkan timbulnya keasaman pada
waktu pertumbuhan virus, maka mediumnya jangan diberi glukosa
danditambahkan Na2 CO 3 (Natrium bikarbonat).
3. Keadaan biakan jaringan
Cara menyimpan biakan jaringan berpengaruh terhadap
pertumbuhan virus. Biakan jaringan dapat diletakkan
miring 3o bisa stasioner (diam) atau diputar. Ada
beberapa virus yang pertumbuhannya subur dalam
keadaan memutar dengan alat tertentu (dalam
keadaan rotasi dengan alat roller drum).
Contohnya adalah virus Polio tumbuh lebih baik pada
keadaan rotasi daripada keadaan stasioner.
4. Jenis Virus, jenis biakan jaringan, jenis dan
konsentrasi sumber protein serta komposisi medium.
Contoh :

- Virus Polio akan tumbuh subur dengan cpe yang cepat

bila ditanam pada biakan jaringan ginjal kera Macaca
yang ditambah Earle’smedium dengan sumber protein
serum kuda 10%, cpe tampak setelah pengeraman 37C
3-4 hari.
- Virus Dengue, dipakai biakan jaringan LLCMK 2o
ditambah Earle’s medium dan serum anak sapi 5-10%,
akan memperlihatkan cpe yang sangat jelas.
(Kuswiyanto, 214 )
Ciri Virus hidup pada kultur sel terjadi CPE:
kelainan sel yang dapat diamati yang berbeda
karena infeksi virus, Jenis atau tingkat keparahan
CPE tergantung pada jenis virus yang terlibat :
1. Hilangnya kepatuhan pada permukaan
wadah.
2. perubahan bentuk sel dari datar menjadi
bulat.
3. penyusutan inti.
4. vakuola dalam sitoplasma, fusi membran
sitoplasma dan pembentukan syncytia berinti
banyak, badan inklusi di inti atau sitoplasma,
dan lisis sel lengkap.
Contoh CPE
Perhitungan Jumlah Virus
• Titer virus: Jumlah virus infeksius pe satuan volume
• Unit infeksius: jumlah terkecil virus yang
menyebabkan terdeteksinya efek pada hospes.
1. Quantal Assay
Tidak menghitung jumlah partikel virus infeksius dalam
inokulum
(suspensi virus), tetapi menentukan titer virus.
2. Quantitative Assay
Menghitung jumlah partikel virus infeksius pada
inoculum
Quantal Assay
Dapat dilakukan di kultur sel, TAB, hewan model.
Endpoint: efek virus pada host Rumus Reed and Muench.
LD50: titer virus yang mampu menyebabkan kematian 50%
hospes
yang diinokulasi
ID50: titer virus yang mampu menginfeksi 50% hospes yang
diinokulasi
• TCID50: titer virus yang mampu menimbulkan
terbentuknya CPE
50% pada kultur sel
• EID50: titer virus yang mampu menginfeksi 50% embrio
TAB yang diinfeksi
Quantitative Assay
• Pada bakteri adalah bacterial colony count:
Bakteri ditumbuhkan pada medium,koloni
diestimasikan
sebagai jumlah sel bakteri yang hidup.
• Virus: menghitung jumlah plak yang terbentuk pada
kultur sel monolayer yang diinfeksi virus, Plaque Assay
• Contoh lain quantitative assay: pock assay, infectious
center assay, transformation assay, electron mikroskop.
Plaque Assay
• CPE viruses.
• Plaque assay menggunakan kultur sel monolayer yang
konfluen,
dan diinfeksi dengan berbagai pengenceran virus,
kemudian ditutup dengan media semisolid atau padat.
• Media pada dipergunakan untuk melokalisir virus
hanya di sekelilingsel.
• Visualisasi terbentuknya plak: neutral red, tetrazolium
• Plak terbentuk apabila sel yang diinfeksi mengalami
lisis  zona bersih (tidak lisis terwarnai).
Rangkuman
Isolasi virus berguna untuk mendapatkan agen
penyebab penyakit atau digunakan pula untuk
memperbanyak virus misalnya untuk membuatan
vaksin. Tahapan isolasi meliputi: pemilihan sampel,
pembuatan inokulum, isolasi inokulum pada TAB, dan
panen virus. Isolasi virus pada TAB melalui ruang
alantois maka hasil panenya berupa cairan alantois,
sedangkan isolasi virus melalui CAM yang dipanen
adalah CAM yang terinfeksi virus yang ditandai
dengan bentuk pox.
See you late
r 。。。。。。