IDENTIFIKASI HASIL

SKRINNING FITOKIMIA
APT. ACHMAD WAHYUDI, M.PHARM

1
 METODE KROMATOGRAFI
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan
komponen dari suatu campuran menggunakan prinsip
perbedaan distribusi komponen tersebut dalam 2
fase, fase gerak dan fase diam.

Pemisahan

Campuran Komponen

2
Ilustrasi
Kromatografi

3
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
(KLT)
Fasa diam yg digunakan:
TLC plate
silica gel - silicon dioxide (SiO2)x
(a common, inexpensive stationary phase)
O O O
| | |
OSiOSiOSiOH
| | | Gugus OH memberikan
O O O relatifitas polar pada
| | | permukaan silika gel.
OSiOSiOSiOH
| | |
O O O

bulk (SiO2)x surface

4
 FASE GERAK

• FASE GERAK PADA KLT DAPAT DIPILIH DARI PUSTAKA,

TETAPI LEBIH SERING DENGAN MENCOBA-COBA KARENA
WAKTU YANG DIPERLUKAN HANYA SEBENTAR.
• SISTEM YANG PALING SEDERHANA IALAH CAMPURAN 2
PELARUT ORGANIK KARENA DAYA ELUSI CAMPURAN
KEDUA PELARUT INI DAPAT MUDAH DIATUR SEDEMIKIAN
RUPA SEHINGGA PEMISAHAN DAPAT TERJADI SECARA
OPTIMAL.

5
 PROSEDUR KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel hasil ekstraksi
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL

6
1. PERSIAPAN
• CHAMBER

Tuangkan pelarut/eluen ke dalam chamber

setinggi < 1 cm

7
1. PERSIAPAN
• CHAMBER

Agar chamber jenuh dengan eluen, masukkan

potongan kertas saring di sisi dalam chamber. Tutup,
diamkan hingga eluen naik hingga kertas saring
terbasahi semua. 8
1. PERSIAPAN
• PLAT KLT

Potong plat KLT dengan ukuran tertentu 9

(biasanya 2 x 10 cm)
1. PERSIAPAN
• PLAT KLT

Ukur 1 cm, tandai dengan pensil (jaga jangan sampai

merusak/menggores plat), buat garis melintang
setinggi 1 cm dari bawah. Ini adalah tempat sampel
ditotolkan. 10
 PROSEDUR KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL

11
2. PENOTOLAN SAMPEL

TLC plate

“finishing line”
 1 cm.

“starting line”
 1 cm.
ACE ASP CAF ACE ASP CAF
#5 #5 #5 Ref. Ref. Ref. 12
2. PENOTOLAN SAMPEL

Totolkan sampel dengan mikropipet (atau batang

kapiler yang diruncingkan) sebanyak 1 atau 2 µL.
13
MIKROPIPET

Mikropipet, sering
disebut juga spotter,
dapat dibuat dari
batang gelas kapiler.

Panaskan/bakar
dengan api, tarik
perlahan hingga
terpisah menjadi 2
bagian.

14
 PROSEDUR KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL

15
3. PENGEMBANGAN KLT

eluen
merambat
pada plat

16
3. PENGEMBANGAN KLT

17
3. PENGEMBANGAN KLT

A. Tempatkan plat ke dalam chamber TLC plate

B. Elusi plat dengan eluen,

hingga eluen mencapai garis atas

C. Ambil plat jika eluen sudah

mencapai garis batas atas.

eluen
}
18
TLC Developing Chamber
(just a glass jar with solvent in it!)
3. PENGEMBANGAN KLT

Pada saat diambil dari chamber, berilah tanda

garis dengan pensil akhir eluen. 19
 PROSEDUR KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL

20
4. VISUALISASI BERCAK
• LANGSUNG / MATA TELANJANG

• LAMPU UV

• UAP IODIN

• REAGEN PENYEMPROT

21
 4. VISUALISASI BERCAK

A. Biarkan eluen yg tersisa

di pemukaan plat KLT
mengering.

B. Lihat dibawah lampu UV UV light.

look for grayish spots on the UV
fluorescent green background

C. Tandai bercak dengan pensil.

22
 PROSEDUR KLT
1. PERSIAPAN : - chamber/wadah
- plat KLT
- sampel
2. PENOTOLAN SAMPEL
3. PENGEMBANGAN KLT / ELUSI
4. VISUALISASI BERCAK
5. INTERPRETASI HASIL

23
5. INTERPRETASI HASIL

Tentukan Retention factors(Rf) masing2

bercak.

distance spot has

____________ moved
___________ X
Rf = distance solvent has moved =
Y
T

distance spot has moved

_______________________ Z
Rf = distance solvent has moved =
Y
Y
Z Z

distance spot has moved

_______________________ T
Rf = distance solvent has moved
=
Y
X

24
 PERHITUNGAN NILAI RF

• PERHITUNGAN NILAI RF (RETENTION FACTOR/RATE OF

FLOW) DIDASARKAN ATAS RUMUS :

• NILAI RF DINYATAKAN HINGGA ANGKA 1,0 BEBERAPA

PUSTAKA MENYATAKAN NILAI RF YANG BAIK YANG
MENUNJUKKAN PEMISAHAN YANG CUKUP BAIK ADALAH
BERKISAR ANTARA 0,2-0,8.
25
 TROUBLESHOOTING KLT
 Bercak tidak membulat (mbleber)
 Sampel terlalu pekat. Kembangkan lagi KLT setelah
sampel diencerkan.
 Sampel terlalu banyak mengandung komponen. Perlu
dilakukan partisi terhadap sampel.
 Tidak nampak bercak
 Sampel terlalu encer. Pekatkan sampel, atau tambahkan
volume sampel yang ditotolkan.
 Beberapa senyawa memang tidak menunjukkan
pemadaman di bawah lampu UV. Pakailah reagen
semprot untuk menampakan bercak (biasanya uap iodin
atau serium sulfat)
26
 TROUBLESHOOTING KLT
 Garis batas atas (akhir eluen) tidak rata
 Chamber tidak/kurang jenuh eluen (penjenuhan kurang
optimum).
 Pemasangan plat dalam chamber tidak pas (miring).

 Bercak berekor
 Senyawa mengandung gugus yang bersifat asam atau
basa kuat (amina atau asam karboksilat). Tambahkan
beberapa tetes NH4OH (amina) atau asam asetat (asam
karboksilat) pada eluen.

27
 KLT DENSITOMETER
• METODA ANALISIS INSTRUMENTAL YANG BERDASARKAN
INTERAKSI RADIASI ELEKTRO MAGNETIK DENGAN ANALIT
YANG MERUPAKAN NODA PADA KLT
• ALAT DILENGKAPI DENGAN SPEKTROFOTOMETER YANG
MEMPUNYAI PANCARAN SINAR YANG PANJANG
GELOMBANG DIATUR DARI 200 - 700 NM.
• UJI KUALITATIF DAN KUANTITATIF DENGAN SISTEM
ABSORBSI SINAR ATAU EMISI SINAR (FLOURESENSI)

28
TEKNIK PENGGUNAANNYA :
- PENGUKURAN SINAR YANG DISERAP DAN DITERUSKAN
(HANYA UNTUK TLC DENGAN PENDUKUNG GELAS),
- SINAR YANG DISERAP DAN DIPANTULKAN
- ATAU SINAR YANG DIPENDARKAN.
SUSUNAN OPTIK DENSITOMETER INI TIDAK BANYAK BERBEDA
DENGAN SPEKTROFOTOMETER TETAPI PADA DENSITOMETER
DIGUNAKAN ALAT KHUSUS REFLECTION PHOTOMULTIPLIER,
SEBAGAI PENGGANTI  PHOTOMULTIPLIER PADA
SPEKTROFOTOMETER.

29

29
LNTERAKSI RADIASI ELEKTRORNAGNETIK DENGAN
NODA PADA KLT SECARA :

• ABSORPSI
• TRANSMISI
• PANTULAN (REFLEKSI) PENDAR FLUOR
• PEMADAMAN PENDAR FLUOR
 

30

30
 SUMBER RADIASI

• PADA UMUMNYA SPEKTROFOTODENSITOMETER MEMBERIKAN

RENTANG GELOMBANG PENENTUAN 200-630 NM.

• LAMPU D2 (DEUTERIUM) DIPAKAI UNTUK PENGUKURAN PADA

DAERAH ULTRA VIOLET DAN LAMPU TUNGSTEIN PENGUKURAN PADA
DAERAH SINAR TAMPAK.

• UNTUK PENENTUAN PENDAR FLUOR DAN PEMADAMAN PENDAR

FLUOR DIPAKAI LAMPU BUSUR HG BERTEKANAN TINGGI.

• PADA DENSITOMETRI JUGA DILAKUKAN PENENTUAN TRANSMISI ATAU

ABSORPSI DAN RETLEKSI PADA PANJANG GELOMBANG MAKSIMAL.
• 31
 
• PADA PENENTUAN PENDAR FLUOR DAN PEMADAMAN PENDAR
FLUOR DIUKUR PADA PANJANG GELOMBANG DIMANA TERJADI
EMISI ATAU INTENSITAS RELATIF PENDAR FLUOR YANG OPTIMAL.
• MONOKROMATOR DIPAKAI MONOKROMATOR KISI DIFRAKSI
• DETEKTOR PMI' (PHOTO MULTIPLIER TUBE = TABUNG
PENGGANDAAN FOTON) MERUPAKAN DETEKTOR UMUM YANG
DIPAKAI PADA DENSITOMETER.

DENSITOMETRI DIUTAMAKAN UNTUK ANALISIS KUANTITATIF

ANALIT-ANALIT DENGAN KADAR YANG SANGAT KECIL YANG
YANG MERUPAKAN HASIL PEMISAHAN DENGAN KL T.
32
BAGAN ALAT DENSITOMETER
• GAMBAR

33

33
 KROMATOGRAFI CAIR KINE
RJA TINGGI (KCKT)

Kromatografi Kolom Terbuka

Color

Sistem pemasukan sampel: manual, tidak volumetrik 

Injector
Waktu analisis lama, mengandalkan gaya grafitasi dan
kapiler  pompa
Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan kolom
Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk analit tidak
berwarna  Detektor
Kesulitan penghitungan kadar  integrator 34
KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka untuk menjawab
kekurang-kekurangan tersebut

Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan robotik injektor, sangat
volumetrik
Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik
Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil, tekanan dapat dibuat
besar  Hasil pemisahan baik
Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)
Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC  mudah
penghitungan kadar 

35

Sehingga disebut: Kinerja Tinggi

 BAGAN SISTEM KCKT

detektor

kolom
injektor
oven
pompa

Wadah
solven
integrator

36
WADAH FASE GERAK

Merupakan tandon berisi fase gerak

Mempunyai sistem penyaring

37
POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
 Tekanan yang dihasilkan tinggi

 Fluktuasi tekanan rendah

 Kecepatan aliran fase gerak tepat 38
 INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke dalam sistem
KCKT

Pump Pump

Column

Column

[INJECT] [LOAD] 39
 Sistem sample loop injektor

posisi load Posisi inject

pompa kolom pompa kolom

40
sample loop
OVEN KOLOM – instrumen pemanas
Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik

41
Kolom pada KCKT

> Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi

Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih
kompak, hasil pemisahan lebih baik
Dapat dipakai berulang

42
DETEKTOR HPLC

Yang umum dipakai

 Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array (PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
43

 Detektor spektrometer massa

TERIMAKA
SIH

44