Menganalisis Teknik Pembuatan Media

Kuljar tanaman perkebunan

I. Komponen Media dan Larutan Stok
A. Deskripsi Singkat Bahan Ajar
Dalam bahan ajar ini siswa dapat mempelajari
kompetensi yang diperlukan
dalam hal pembuatan media tanam. Kompetensi ini
berkaitan dengan
kompetensi pembuatan larutan stok. Untuk menguasai
kompetensi ini
diperlukan ketepatan dan ketelitian dalam melakukan
pehitunganperhitungan, dan pengukuran-pengukuran.
Hal ini bertujuan agar media
dapat dibuat dengan komposisi yang tepat.
B. Tujuan Akhir Pembelajaran
Setelah mempelajari bahan ajar ini diharapkan Anda mampu:
o
Menghitung kebutuhan media
o
Mencampur larutan stok
o
Melengkapi komponen media
o
Mengatur pH larutan
o
Memasak media kultur
o
Membagi media kultur kedalam botol
o
Melakukan sterilisasi media
o
Menyimpan media yang telah steril
A. Komponen Media dan Kegunaannya
komposisi media tanam kultur jaringan terdiri dari sejumlah unsur yang
diperlukan untuk pertumbuhan eksplan dalam lingkungan buatan, unsurunsur ini umumnya terdapat di
tanah. Komponen media kultur jaringan
dapat dikelompokkan kedalam :
1. Unsur makro, terdiri dari unsur-unsur: nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K),
kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S)
2. Unsur mikro, terdiri dari: boron (B), cobalt (Co), tembaga (Cu), Iodium (I),
besi(Fe), mangan (Mn), molybdenum (Mo), dan seng (Zn)
3. Vitamin (vitamin B1) dan Myo-inositol, pada beberapa formula media
ditambahkan niasin dan piridoksin (B6)
4. Gula (sukrosa), sebagai sumber energi
5. Zat pengatur tumbuh, untuk merangsang dan mengontrol pertumbuhan
6. Agar, sebagai pemadat media
7. Arang aktif, sebagai penyerap senyawa racun (jika diperlukan)
8. Air (aquades), sebagai pelarut
B. Formula Media
Terdapat banyak formula/resep media tanam kultur jaringan yang pada
umumnya diberi nama sesuai dengan nama penemunya, antara lain:
1. Murashige dan Skoog (MS), memiliki kisaran pemakaian yang paling
luas
2. Gamborg atau B-5, cocok untuk kultur suspensi sel kedele dan legum
3. Vacin Went (VW), digunakan untuk media anggrek
4. Nitsch dan Nitsch, digunakan untuk kultur tepung sari dan kultur sel
5. Schenk dan Hildebrandt (SH) digunakan untuk media tanam dikotil
6. Woody Plant Medium (WPM) digunakan untuk media tanaman berkayu
C. Pengertian, Tujuan, dan Prinsip Pembuatan Larutan Stok
Larutan stok adalah larutan yang konsentrasinya dipekatkan atau
ditinggikan
dari konsentrasi dalam media. Biasanya dinyatakan dalam kelipatan
konsentrasi media, misalnya 10x, 20x, 100x, bahkan 1000x konsentrasi
media. Tujuan pembuatan larutan stok adalah untuk menghindari
penimbangan yang berulang-ulang setiap kali membuat media. Disamping
itu, kadang-kadang timbangan untuk menimbang bahan-bahan dalam
jumlah
yang sangat kecil tidak tersedia di laboratorium. Larutan stok sebaiknya
disimpan di tempat yang bersuhu rendah dan gelap. Pembuatan larutan
stok
selengkapnya dapat dibaca pada bahan ajar Pembuatan Larutan Stok.
Pada prinsipnya pembuatan larutan stok harus mempertimbangkan hal-
hal
1.
Masa kadaluarsa
Larutan stok baik makro maupun mikro tidak dianjurkan untuk dipakai
lebih dari 2 bulan, sedangkan stok vitamin masa pemakaiannnya
sebaiknya tidak melebihi 2 minggu. Oleh karena itu stok yang dibuat
harus habis sebelum melewati batas kadaluarsanya
2.
Konsentrasi/kepadatan larutan
Larutan stok yang dibuat terlalu pekat dikhawatirkan akan mudah
membentuk endapan-endapan yang menyebabkan berkurangnya
konsentrasi senyawa-senyawa pada larutan stok tersebut
3.
volume wadah
Untuk menghemat tempat penyimpanan larutan stok di dalam kulkas,
kita dapat membuat larutan stok pada wadah yang lebih kecil dengan
tetap memperhatikan kejenuhan/kepekatan larutan.
 II. Perhitungan Kebutuhan Media dan Larutan Stok

A. Dasar Perhitungan Kebutuhan Media dan Larutan Stok

Kebutuhan media dan larutan stok diartikan sebagai kebutuhan
akan jumlah
bahan media dan larutan stok yang harus dipenuhi pada waktu
yang
diperlukan pada beberapa macam/tahap kegiatan kultur jaringan.
Kebutuhan media ini dapat dibedakan atas kebutuhan per
kegiatan kultur
jaringan per satuan waktu tertentu dan kebutuhan untuk total
kegiatan kultur
jaringan per satuan waktu tertentu. Kebutuhan media dan larutan
stok ini
ditentukan oleh sejumlah faktor:
1. Jumlah dan jenis bibit yang akan diproduksi
Makin banyak bibit yang akan diproduksi, makin banyak kebutuhan
media yang harus disediakan per satuan waktu tertentu. Antar jenis bibit
yang satu dengan yang lainnya akan berbeda dalam hal kebutuhan
media.
2. Jenis media yang dipilih
Pemilihan formula/resep akan menentukan jumlah dan jenis kebutuhan
media, mengingat komposisi formula pada setiap formula tidak sama.
Kebutuhan bahan untuk pembuatan media MS relatif lebih besar per
komponen media dibandingkan formula yang lain. Formula media MS
juga kadang-kadang disesuaikan dengan kebutuhan kultur, misalnya ada
yang memodifiasi menjadi ½ MS, dan lain-lain.
3. Metoda kultur jaringan yang dipilih
Metode kultur jaringan dapat dibedakan atas: metoda perbanyakan
tunas
samping (aksilar), metoda perbanyakan tunas adventif (langsung dan
tidak langsung), dan metoda embriogenesis (langsung dan tidak
langsung). Tiap-tiap metode yang dipilih tentu akan berbeda dalam
hal
penggunaan media.
4. Frekuensi penggandaan propagul
Makin banyak propagul yang diperbanyak makin banyak kebutuhan
media.
5. Cara pengakaran kultur
Ada dua cara pengakaran kultur: cara in-vitro dan ex-vitro.
Pengakaran
secara in vitro akan membutuhkan media untuk media pengakaran.
Pada pengakaran ex vitro, media yang digunakan dapat menggunakan
Kebutuhan media ini secara rinci dihitung berdasarkan tahapan-tahapan
pekerjaan yang berkaitan dengan pemakaian media, yaitu: tahap inisiasi
kultur (penumbuhan awal eksplan), tahap penggandaan propagul
(tergantung frekuensi penggandaan), tahap pembesaran kultur sampai
planlet siap diaklimatisasikan. Dari total kebutuhan media kita dapat
menentukan kebutuhan larutan stok yang akan dibuat. Bila kebutuhan
larutan stok terlalu banyak kita dapat membuat stok pada beberapa
tahap.
Sebagai contoh, kita akan menghitung kebutuhan media dan larutan stok
untuk satu kegiatan, yaitu inisiasi kultur sebagai berikut. Bila kita
menginisiasi biji anggrek, secara berkala (per minggu) dengan target 40
botol yang menggunakan media per botolnya 25 ml, maka kebutuhan
media
per minggu 1 liter. Kita membutuhkan 10 liter untuk 2 1/2 bulan. Oleh
karena itu kita dapat membuat larutan stok 10 kali konsentrasi media
untuk
 B. Cara Perhitungan Kebutuhan Media dan Larutan Stok

Cara perhitungan kebutuhan media dan larutan stok disajikan dibawah ini
dan hasilnya secara lengkap pada Tabel 2 berikut ini. Tabel 2 menyajikan
macam-macam larutan stok yang sebaiknya ada pada pembuatan media
MS, pengelompokan bahan-bahan penyusun larutan stok, perhitungan
kebutuhan bahan-bahan untuk pembuatan larutan stok per 10 liter media,

ukuran volume wadah untuk tempat larutan stok, perhitungan

konsentrasi
masing-masing stok, dan banyaknya pengambilan (volume)
larutan stok
yang diambil untuk keperluan pembuatan media 1 liter.
Perhitungan kebutuhan media dan larutan stok untuk melengkapi tabel
di atas
adalah sebagai beriut:
1. Kebutuhan bahan-bahan untuk 10 liter media MS (kolom 2) = 10 x
bobot
bahan-bahan media MS (mg/l) pada Tabel 1. Contoh: KNO3 = 1900 mg
x 10 = 19.000 mg
2. Volume pengambilan stok untuk setiap pembuatan media 1 liter
menggunakan rumus:
V1 x M1 = V2 x M2
dimana: - V1 adalah volume stok yang dicari
M1 adalah kosentrasi larutan stok
V2 adalah Volume larutan stok
M2 adalah kosentrasi yang diinginkan
 III. Pencampuran Komponen Media

A. Mempersiapkan Bahan dan Peralatan

Bahan-bahan yang diperlukan untuk pembuatan media MS sebanyak
1 liter
sesuai kebutuhan berdasarkan perhitungan di atas adalah:
1. larutan-larutan stok:
- makro: KNO3, NH4NO3, CaCl2.2H2O, MgSO4.7H2O, dan KH2PO4
masing-masing 50 ml
- mikro 1 ( campuran H3BO3, Na2MoO4.7H2O, CoCl2.6H2O, dan KI)
10 ml
- mikro 2 (campuran MnSO4, ZnSO4.7H2O, dan CuSO4.5H2O) 10 ml
- mikro Fe-EDTA (campuran FeSO4.7H2O dan Na2EDTA) 10 ml
- vitamin (campuran glisin, asam nikotin, piridoksin HCl dan Thiamin
HCl) 10 ml
Alat yang diperlukan untuk pembuatan media MS sebanyak 1 liter
sesuai
kebutuhan berdasarkan perhitungan di atas adalah:
1. Botol-botol kultur
2. Timbangan
3. Hot plate dengan pengaduk magnet (magnetic stirer)
4. Alat-alat gelas:
- Erelenmeyer, wadah untuk melarutkan dan mencampur bahan
- gelas piala, tempat aquades
- labu takar atau gelas ukur, untuk menepatkan volume larutan
5. pipet tetes dan botol semprot untuk mengambil larutan stok dan
membilas pipet yang telah digunakan bila akan digunakan untuk
mengambil bahan/larutan stok yang lainnya
6. pH meter, untuk mengukur pH
B. Mencampur bahan media
Ada beberapa prinsip dalam mencampur bahan media kultur jaringan,
yaitu:
1. Prinsip dalam pencampuran larutan pertama-tama adalah menuang
sejumlah air (aquades) kedalam wadah kurang lebih 1/3 volume wadah
sebelum melarutkan sejumlah bahan kedalamnya.
2. Pencampuran bahan media dilakukan satu per satu setelah bahan
satu melarut baru diikuti dengan bahan yang lainnya.
3. Diusahakan selalu mencatat setiap mencampur bahan agar tidak
terjadi kekeliruan.
4. Langkah terakhir dalam membuat larutan adalah menepatkan
volume
larutan, dengan cara menambah aquades sampai tanda tera pada
wadah yang digunakan
Cara mencampur bahan media untuk pembuatan media 1 liter adalah
sebagai berikut. Kedalam erlenmeyer berukuran 1 liter dimasukkan
aquades kira-kira 300 ml, larutkan gula diikuti mio-inositol kedalamnya
setelah gula melarut sempurna dengan diaduk secara merata.
Larutanlarutan stok dimasukkan satu per satu, setelah satu bahan
melarut diikuti
bahan yang lainnya. Larutan-larutan stok yang sudah dipakai
dikembalikan
ke kulkas. Hasil pencampuran media dituangkan dari erlenmeyer ke labu
takar atau gelas ukur untuk ditepatkan volumenya menjadi 1 liter,
dengan
menambah aquades sampai mendekati tanda tera (disisakan sedikit
untuk
keperluan pengecekan pH yang biasanya ada penambahan 3-5 tetes atau
 IV. pH Media dan Cara Pengaturannya

A. pH Media
Faktor pH merupakan hal penting yang harus diperhatikan. Kisaran nilai pH
yang dipandang paling sesuai untuk kebanyakan media kultur jaringan
untuk
mendukung pertumbuhan dan perkembangan sel-sel tanaman antara 5,5 –
5,8. Pada nilai pH yang terlalu asam (< 4,5) agar akan terhidrolisis dan sulit
membentuk gel. Nilai pH harus diatur agar tidak mengganggu membran sel
dan pH sitoplasma. Selain itu pengaturan pH juga ditujukan untuk hal-hal
berikut:
1. Memudahkan kelarutan bahan-bahan kimia dalam pembuatan media
2. Memudahkan pengambilan/penyerapan bahan zat pengatur tumbuh dan
bahan-bahan kimia yang lain
3. Meningkatkan efisiensi pembekuan agar
B. Pengaturan pH
Pengukuran pH media dilakukuan sebelum sterilisasi dengan otoklaf.
Meskipun setelah diotoklaf pH media mengalami penurunan, hal ini tidak
memerlukan lagi pengaturan pH. Pengukuran pH media dapat
menggunakan
pH meter atau
sederhana, kertas
yaitu indikator.
dengan Pengukuran
mencelupkan kertasdengan kertas indikator sangat
indikator/lakmus
kemudian
mencocokkan warna lakmus setelah dicelupkan dengan warna dan nilai
pH
yang tersedia pada pak indikator pH. Nilainya lebih bersifat kualitatif.
Pengukuran dengan pH meter memerlukan kalibrasi setiap periode
waktu.
Biasanya pH meter menggunakan elektroda gelas. Hasil pengukurannya
bersifat kuantitatif. Nilai pH dapat diatur dinaikkan atau diturunkan
sesuai
dengan nilai yang diharapkan. Bila nilai pH lebih tinggi dari nilai yang
 V. Memasak Media

A. Mempersiapkan Bahan dan Peralatan

Bahan dan peralatan yang dipersiapkan meliputi: bahan media yang
sudah
dicampur dan diukur pH-nya, pemanas hot plate dengan pengaduk
magnet
(magnetic stirer) atau menggunakan kompor dengan pengaduk bahan
gelas
atau kayu (digunakan untuk skala besar). Pada skala besar memasak
media dilakukan di atas kompor, misalnya jika kita akan memasak 8
liter
media. Hot plate memiliki tombol pengatur besar kecilnya pemanasan
dan
tombol pengatur besar kecilnya pengocokan menggunakan pengocok
B. Memasak Media
Media dalam wadah erlenmeyer atau wadah lainnya yang sudah diukur
pHnya kemudian dimasak pada hot plte atau kompor sambil diaduk-
aduk.
Ketika media sudah hangat, agar dimasukkan kedalam media sambil
diaduk
terus menggunakan pengaduk magnet atau pengaduk biasa pada
pemanas
kompor. Setelah mendekati keadaan mendidih (sudah mulai keluar titik-
titik
gelembung sebelum menjadi gelembung besar), pemanasan dihentikan.
Kompor atau hot plate dimatikan. Media dibiarkan mendingin beberapa
waktu. Setelah media agak dingin (± 600 C) media siap dibagikan
kedalam
botol-botol kultur.
 VI. STERILISASI MEDIA

Setelah pembuatan media agar selesai, media dibagi-bagi kedalam

botol-botol
penanaman, dalam satu botol tanam berisi kurang lebih 20 – 25 ml.
Selama proses pemindahan media kedalam botol-botol penanaman
tersebut
sangat memungkinkan terjadinya kontaminasi oleh mikroorganisme,
baik bakteri
atau jamur. Kontaminasi bisa disebabkan oleh:
1. Eksplan
2. Organisme kecil yang masuk dalam media
3. Botol kultur serta alat-alat tanam yang tidak steril
4. Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor
5. Pelaksana
Agar mikroorganisme yang masuk kedalam media tidak dapat
berkembang biak
maka perlu dilakukan sterilisasi terhadap media tersebut sebelum
digunakan
untuk menanam.
Sterilisasi media kultur bisa dilakukan dengan menggunakan uap panas
pada
suhu 1210 C, dengan tekanan 15 – 17 psi, selama 20 – 25 menit.
Sterilisasi media tidak boleh terlalu lama karena bisa menyebabkan:
1. Penguraian gula,
2. Degradasi vitamin dan asam-asam amino,
3. Inaktivasi sitokinin dan zeatine ribosida
4. Perubahan PH
Media yang sudah disterilkan bisa langsung digunakan, bisa juga disimpan
terlebih dahulu beberapa waktu pada ruang penyimpanan.