LAPORAN PRAKTIKUM

KIMIA FARMASI ANALISIS Kromatografi Lapis Tipis

Disusun oleh : Novi Lingga Setyaningsih / 3311091057

LABORATORIUM FARMASI FISIKA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI CIMAHI 2011

BAB I PENDAHULUAN

I.1 Prinsip Percobaan

Pemisahan dengan teknik kromatografi lapis tipis didasarkan pada adsorpsi larutan (fase gerak atau eluennya) terhadap adsorben yang digunakan, dimana adsorbens dilapiskan pada lempeng kaca/kertas alumunium yang bertindak sebagai penunjang pada fase diamnya.

I.2 Tujuan Percobaan

Mempelajari dan memahami metode pemisahan dengan metode kromatografi lapis tipis Dapat menentukan nilai Rf komponen-komponen yang dipisahkan dan

mengidentifikasi zat yang dipisahkan.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul) yang berada pada larutan. Molekul yang terlarut dalam fase gerak, akan melewati kolom yang merupakan fase diam. Molekul yang memiliki ikatan yang kuat dengan kolom akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat dipisahkan berdasarkan pergerakan pada kolom. Setelah komponen terelusi dari kolom, komponen tersebut dapat dianalisa dengan menggunakan detektor atau dapat dikumpulkan untuk analisa lebih lanjut. Beberapa alat-alat analitik dapat digabungkan dengan metode pemisahan untuk analisis secara on-line (on-line analysis) seperti: penggabungan kromatografi gas (gas chromatography) dan kromatografi cair (liquid chromatography) dengan mass spectrometry (GC-MS dan LC-MS), Fourier-transform infrared spectroscopy (GCFTIR), dan diode-array UV-VIS (HPLC-UV-VIS). Jenis Kromatografi ;
a. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)

Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner, maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange), partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut melewati kolom. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion chromatography, serta supercritical fluid chromatography. b. Reverse phase chromatography

Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan inert seperti silika. Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa yang tidak mudah menguap (non-volatile). c. High performance liquid chromatography High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi. Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar. d. Size exclusion chromatography Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori.
e. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange Chromatography)

Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal proses keseluruhan.

Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponenkomponensampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Visualisasi, tahap visualisasi. Proses Tahapan berikutnya ini dari sangat kromatografi penting lapis karena harus tipis adalah diperlukan disesuaikan

suatu keterampilan dalam

memilih metode yang tepat karena

dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol. Nilai Rf, Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut : Rf = Jarak yang ditempuh substansi Jarak yang ditempuh oleh pelarut

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya nilai Rf senyawa besar tersebut bila pada plat kromatografi tersebut lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, akan senyawa kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.

Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda.

BAB III METODOLOGI PERCOBAAN

III.1 Alat Percobaan 1. Chamber 2. Plat KL ( Kertas Alumunium) 3. Penotol (Pipa Kapiler) 4. Spayer untuk penampak noda 5. Pipet tetes 6. Mistar 7. Pensil 8. Keping tetes

III.2 Bahan Percobaan

1. Sampel campuran senyawa sulfonamida

2. Eluen (n-butanol yang dijenuhkan dengan amoniak) 3. Zat Pembanding (Sulfadimidin) 4. Aseton (Pelarut) 5. P-DAB (Penampak Noda)

III.3 Prosedur Percobaan

1. Disiapkan larutan pengelusi (eluen) dengan menjenuhkan n-butanol dengan amoniak (NH4OH). 2. Larutan pengelusi dimasukkan kedalam chamber yang ditutup dengan kaca yang dilapisi dengan vaselin album

3. Pada plat KLT (Kertas Alumunium) diberi tanda garis dengan pensil bagian bawah 1,5 cm dan bagian atas 0,5 cm 4. Sampel campuran senyawa sulfonamida dilarutkan dalam aseton hingga larut 5. Pembanding (sulfadimidin) dilarutkan dalam aseton hingga larut 6. Pada bagian bawah plat KLT (Kertas Alumunium) yang diberi tanda garis sebelah kanan ditotolkan larutan pembanding (sulfadimidin) dan sebelah kiri ditotolkan sampel larutan zat dengan menggunakan pipa kapiler 7. Sampel larutan zat dan larutan pembanding ditotolkan dengan diameter 3 mm kemudian ditunggu sampai totolan kering 8. Plat KLT (Kertas Alumunium) dimasukkan kedalam wadah kromatografi chamber yang berisi eluen. Kertas yang tercelup eluen dibawah garis batas bagian bawah plat 9. Dielusi hingga eluen mencapai garis batas bagian atas 10. Plat KLT dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan sampai kering (kira-kira 10 menit 10) 11. Setelah kering plat KLT disemprotkan penampak noda (p-DAB) sebanyak 2 kali dan diamati bentuk noda dan spot yang terbentuk 12. Ditentukan nilai Rf dari masing-masing komponen yang terpisah

III.3 Diagram Alir Percobaan

Siapkan Larutan pengelusi

Jenuhkan dengan amoniak (NH4OH). Masukkan kedalam Chamber Beri tanda garis plat KLT (atas-bawah 0,5 cm) Campuran sulfonamide dan pembanding dilarutkan dalam aseton

 Totolkan dengan pipa kapiler pada plat KLT bagian bawah kanan larutan pembanding (sulfadimidin), bagian kiri ditotolkan sampel larutan zat (sulfonamida) Tunggu sampai kering

Masukkan kedalam kromatografi chamber berisi eluen Elusi hingga eluen mencapai batas garis atas Keluarkan, keringkan Semprotkan penampak noda (p-DAB)

Hasil (Hitung Rf dari sampel dan zat pembanding)

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN IV.1 Hasil Percobaan dan Perhitungan

1. Jarak eluen 2. Jarak noda (sampel) 3. Jarak noda (pembanding) 4. Rf sampel 5. Rf pembanding

: 4,6 cm : 1,6 cm : 1,8 cm : 0,3478 : 0,391

Perhitungan Nilai Rf komponen yang terpisah 1. Rf sampel = Jarak Noda (sampel) Jarak eluen = = 1,6 4,6 0,347

2. Rf Pembanding

= = =

Jarak Noda (pembanding) Jarak eluen 1,8 4,6 0,391

IV.2 Pembahasan Pada percobaan praktikum Kimia Farmasi Analisis ini dilakukan percobaan kromatrogarfi lapis tipis yang mempunyai tujuan untuk mempelajari dan memahami metode pemisahan dengan metode kromatografi lapis tipis dan juga agar dapat mengetahui bagaimana cara menentukan nilai Rf komponen-komponen yang dipisahkan dan mengidentifikasi zat yang dipisahkan. Pengertian dari Kromatografi lapis tipis itu sendiri merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Prinsip kerjanya memisahkan sampel (campuran senyawa sulfonamida) berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel (campuran senyawa sulfonamida) dengan pelarut (Aseton) yang digunakan. Teknik ini biasanya Pada percobaan ini menggunakan teknik fase diam dari bentuk plat KL (Kertas Alumunium) dan fase geraknya dengan sampel (Campuran senyawa sulfonamida )yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen, eluan yang digunakan pada percobaan ini Eluen (n-butanol yang

dijenuhkan dengan amoniak). Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. Pada percobaan metode kromatografi lapis tipis ini dilakukan pengidentifikasian suatu sampel antara campuran senyawa sulfonamida dan zat pembanding sulfadimidin. Percobaan ini dilakukan dengan cara menotolkan masing-masing zat pada plat KLT (kertas Alumunium) yang telah diberi tanda batas tujuannya agar eluen yang ditotoli tidak terendam. Alat yang digunakan untuk menotolkan adalah dengan menggunakan pipa kapiler, pipa kapiler tersebut dapat menarik larutan zat sampel dengan sendirinya karena mempunyai gaya kapilaritas yang baik. Penotolan harus dilakukan secara hati-hati dan diameternya tidak boleh lebih dari 3 mm. Hal-hal yang harus diperhatikan pada saat melakukan penyiapan larutan pengelusi (eluen) n-butanol, terlebih dahulu dilakukan dengan menjenuhkan nbutanol dengan amoniak (NH4OH). Fungsi penjenuhan sendiri adalah untuk membantu mempercepat proses elusi. Ciri karakteristik sulfonamida yang tidak berwarna maka dibantu dengan menyemprotkan penampak bercak noda dengan menggunakan pereaksi p-DAB. Penyemprotan dilakukan dengan jarak kurang lebih 30 cm agar hasilnya terlihat lebih jelas. jika totolan yang dihasilkan tidak begitu jelas atau tidak dapat ditentukan titiknya, maka dapat kita ambil titik beratnya agar dapat ditentukan jarak yang dihasilkan dari sampel maupun zat pembandingnya yaitu sulfadimidin. Dan didapatkan
hasil nilai Rf dari sampel yaitu 0,3478 cm dan zat pembanding sulfadimidin yaitu 0,391 cm.

BAB V KESIMPULAN Pada percobaan yang telah kami lakukan dapat ditarik kesimpulan ternyata : a. Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut. b. Nilai Rf, digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam. Rumusnya : Rf = Jarak yang ditempuh substansi Jarak yang ditempuh oleh pelarut Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis.

c. Didapatkan hasil nilai Rf dari sampel yaitu 0,3478 cm dan zat pembanding sulfadimidin yaitu 0,391 cm. Hal ini menunjukkan bahwa sampel dan zat pembanding tersebut adalah sama. Nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip.

DAFTAR PUSTAKA

1. Skoog DA, West DM, Holler FJ. 1996. Fundamentals of Analytical Chemistry. 7th edition. New York: Saunders College Publishing. Hal. 17-25. 2. Kaiser E, Colescott RL, Bossinger CD, Cook PI. 1970. Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides. Anal Biochem 34:595-598. 3. 2010]. 4. 5. 6. http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi_lapis_tipis http://id.wikipedia.org/wiki/Kromatografi Buku Panduan Pratikum Kimia Farmasi Analisis Feist P. 2010. TLC Retention Factor (Rf). [terhubung berkala] http://orgchem.colorado.edu/hndbksupport/TLC/TLCrf.html [15 Mei

LAMPIRAN