Tujuan percobaan

Memahami pengaruh pH dan inhibitor terhadap aktivitas enzim.

Teori dasar
Enzim merupakan biokatalisator yang bekerja spesifik. Aktivitas katalis yang dimiliki enzim merupakan alat ukur yang selektif dan sensitif terhadap aktivitas enzim. Aktivitas enzim dapat diamati dari sisa substrat, pH, suhu, dan indikator. Aktivitas enzim dapat diamati dari sisa substrat atau produk yang terbentuk. Faktor yang mempengaruhi pengukuran aktivitas enzim antara lain konsentrasi enzim dan substrat, suhu, pH, dan indikator. Aktivitas enzim meningkat bersamaan dengan peningkatan suhu, laju berbagai proses metabolisme akan naik sampai batasan suhu maksimal. Prinsip biologis utama adalah homeostatis, yaitu keadaan dalam tubuh yang selalu mempertahankan keadaan normalnya. Perubahan relatif kecil saja dapat mempengaruhi aktivitas banyak enzim. Adanya inhibitor non kompetitif irreversibel dan antiseptik dapat menurunkan aktivitas enzim. Aktivitas enzim maksimal diperoleh pada pH optimal, untuk saliva (enzim amilase) pHnya 7. Bentuk kurva aktivitas pH ditentukan oleh denaturasi enzim (pada pH tinggi atau rendah) dan penambahan status bermuatan pada enzim dan atau substrat. Enzim dapat pula mengalami perubahan bentuk bila pH bervariasi. Gugus yang bermuatan yang jauh dari daerah terikat substrat diperlukan untuk mempertahankan struktur tersier-kuartener yang aktif. Dengan perubahan muatan pada gugus ini maka protein dapat terbuka sehingga aktivitasnya berubah. Inhibitor non kompetitif irreversibel adalah suatu zat yang menghambat kerja enzim dengan cara berikatan dengan enzim tetapi bukan pada active sidenya, karena inhibitor tidak memiliki kesamaan dengan struktur substrat, maka peningkatan konsentrasi substrat umumnya tidak menghilangkan inhibitor tersebut. Banyak racun yang bekerja sebagai inhibitor non kompetitif irreversibel terhadap aktivitas enzim, antara lain ion logam berat, iodosetamida, dan zat-zat pengoksidatif. Cara kerja enzim dapat dijelaskan dalam dua teori, yaitu: Teori kunci dan gembok (enzim bekerja sangat spesifik. Enzim dan substrat memiliki bentuk geometri komplemen yang sama persis sehingga bisa saling melekat) dan teori ketepatan induksi (enzim tidak merupakan struktur yang spesifik melainkan struktur yang fleksibel. Bentuk sisi aktif enzim hanya menyerupai substrat. Ketika substrat melekat pada sisi aktif enzim, sisi aktif enzim berubah bentuk untuk menyerupai substrat). Namun dalam implementasinya, teori pertama yang dianggap paling sesuai dalam menjelaskan cara kerja enzim.

Alat dan bahan

Alat :
Stopwatch Water batch 38C Tabung reaksi Pipet ukur 1ml, 5ml, 10ml Pipet tetes Pengaduk Penangas air 38C

Bahan :
Larutan buffer pH 8, 7.4, 6.8, 6, 5.2 Larutan amylum 1% Larutan Natrium Klorida 0.1 M Larutan saliva (1:9) Aquadest Larutan iodine 0.01 M Larutan toluene Kloroform Larutan merkuri klorat 1% Larutan phenol 2% Natrium florida Pereaksi benedict

Prosedur percobaan

Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim Siapkan 10 ml larutan buffer dengan pH 8, 7.4, 6.8, 6 dan 5.2 dalam tabung reaksi yang terpisah. Tambahkan 5 ml larutan amilum 1 %, 2 ml larutan natrium klorida 0.1 M dan 2 ml larutan saliva (1:9) pada tiap tabung reaksi. Tempatkan tabung reaksi dalam water bath 380 C selama 10 menit. Tambahkan larutan iodine secukupnya pada tiap tabung reaksi sedikit demi sedikit. Amati dan catat perubahan yang terjadi !! Tentukan tabung mana yang pertama kali mencapai titik akromik (tidak memberikan warna dengan iodine) ! Tabung dengan pH 8 dan 7.4 sebaiknya diasamkan dengan ditambahkan asam asetat sedikit demi sedikit sebelum ditambahkan iodine.

Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim Larutkan 2 ml saliva dengan 8 ml aquadest, campurkan dengan baik. Tambahkan 1 ml larutan saliva yang telah diencerkan pada tiap tabung reaksi yang berbeda sejumlah 6 tabung. Pada tabung yang terpisah tambahkan 5 tetes larutan toluen, 5 tetes kloroform, 5 tetes larutan merkuri klorida 1%, 5 tetes larutan phenol 2%, 0,5 gram natrium florida dan 5 tetes aquadest. Taruh tabung tersebut pada rak tabung selama 10 menit sambil sesekali digojok perlahan-lahan. Tambahkan 5 ml larutan amilum 1% pada tiap tabung reaksi. Tempatkan tiap-tiap tabung tersebut dalam water bath 380C selama 15 menit. Bagi masing-masing tabung menjadi dua bagian untuk dilakukan uji iodine dan Benedict. Catat dan amati perubahan yang terjadi !

Uji kuantitatif enzim ptyalin Campurkan 2ml NaCl 0.1 M dengan 10 ml larutan amylum 1%. Tempatkan pada penangas air 38C. kemudian tambahkan larutan salva (1:9). Diamkan selama 30 detik.(larutan A) Siapkan 8 tabung yang berisi 3ml aquadest dan 3 tetes 0.01M iodine. Pada tabung pertama tambahkan 2 tetes larutan A. catat waktu mulai dari saat penetesan sapaiterjadi perubahan warna larutan (titik akromatik). Tabung kedua tambahkan 1 tetes aquadest dan 2 tetes larutan A. catat waktu hingga terjadi perubahan warna. Tabung ketiga tambahkan dengan 2 tetes aquadest dan 2 tetes larutan A. catat waktunya. Lakukan pengenceran bertahap pada tabung ke 4sampai 8, hingga tercapai perubahan wakt yang di butuhkan untuk tercapainya perubahan warna sama dengan 4 menit. Jika 1 unit amylase dianggap setara dengan 10 ml larutan amylum 1% yang mampu terdigesi pada titik akromik ( 4menit). Tentukan unit amylase yang terkandung dalam larutan saliva sampel.

Data pengamatan
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim : pH 8 7.4 6.8 6 5.2 Larutan iodine 10 tetes 10 tetes 10 tetes 10 tetes 10 tetes Perubahan ++++ +++ ++ + ++++

(+) menandakan adanya kandungan amilum

Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim : Uji iodine. Sampel Perubahan Awal Tidak Berwarna,ada endapan(+) Tidak Berwarna, ada endapan(++) Tidak Berwarna,ada endapan (+) Tidak Berwarna, ada endapan (++) Tidak Berwarna,ada endapan(+) Tidak Saliva + aquadest Berwarna,ada endapan (++) Ungu (++) + Iodine Ungu Pucat (+)

Saliva + toluen

Saliva + kloroform

Ungu (++)

Saliva + HgCl

Biru (+++)

Saliiva + Phenol

Tidak Berwarna (-)

Saliva + Naf

Tidak Berwarna (-)

Uji Benedict Perubahan Awal Tidak Berwarna,ada endapan(+) Saliva + kloroform Tidak Berwarna,ada endapan(++) Tidak Berwarna,ada endapan(+) Biru merah (+) ++ + Benedict Biru merah (+) + Pemanasan +

Sampel

Saliva + toluen

Saliva + HgCl

Biru (+)

Saliiva + Phenol

Tidak Berwarna,ada endapan(++) Tidak Berwarna,ada endapan(+) Tidak Berwarna,ada endapan(++)

Biru merah (+)

+++

Saliva + NaF

Biru merah (+)

Saliva + aquadest

Biru merah (+)

Uji kuantitatif enzim ptyalin Tabung Perubahan waktu 2 tetes larutan A Warna larutan bening 3:57 detik 2tetes larutan A + 1 tetes Warna larutan bening 3:10 detik aquadest 2tetes larutan A + 2 tetes Warna larutan bening 3:05 detik aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes Warna larutan bening 1:19 detik aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes Bening 1:10 detik aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes Bening 1:00 detik aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes Bening 00:58 detik aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes Bening 00:40 detik aquadest bertahap Ket : larutan A adalah campuran 2ml NaCl 0,1 M dengan 10 ml larutan amylum 1% yang dipanaskan 38C dan ditambahkan saliva 1:9.

Pembahasan

Enzim adalah protein yang berperan sebagai katalis dalam metabolisme makhluk hidup. Enzim berperan untuk mempercepat reaksi kimia yang terjadi di dalam tubuh makhluk hidup, tetapi enzim itu sendiri tidak ikut bereaksi. Oleh sebab itu enzim disebut sebagai salah satu katalisator alami. Enzim terdiri dari apoenzim dan gugus prostetik. Apoenzim adalah bagian enzim yang tersusun atas protein. Gugus prostetik adalah bagian enzim yang tidak tersusun atas protein. Gugus prostetik dapat dikelompokkan menjadi dua yaitu koenzim (tersusun dari bahan organik) dan kofaktor (tersusun dari bahan anorganik). Enzim tak hanya ditemukan dalam sel-sel manusia dan hewan, namun sel-sel tumbuhan juga memiliki enzim sebagai salah satu komponen metabolismenya. Enzim amylase adalah enzim yang terdapat pada air liur dan fungsi dari amilase adalah sebuah enzim yang berfungsi untuk memecahkan ikatan glikosidik yang dimiliki oleh poliskarida. Ikatan glikosidik yaitu ikatan khas yang terdapat pada karbohidrat (monosakarida, disakarida , dan polisakarida). Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim penyiapan larutan buffer dengan pH yang bermacam-macam dimaksudkan untuk mengamati pada pH berapa enzim yang ada dalam larutan saliva tersebut paling baik beraktivitas. Baik tidaknya enzim itu beraktivitas diindikasikan dengan cepat lambatnya proses hidrolisis amilum oleh enzim tersebut. Dengan penambahan larutan iodine, amilum akan memberikan warna biru tua. Apabila enzim menghidrolisis amilum menjadi gula yang lebih sederhana, maka warna biru tua yang terbentuk akibat reaksi dengan iodine tersebut lama kelamaan akan berubah menjadi kekuningan dan hilang menjadi bening tak berwarna seiring dengan berkurang dan habisnya amilum dalam larutan (amilumnya habis terhidrolisis menjadi gula sederhana). Lama proses perubahan warna inilah yang kemudian menjadi parameter pH optimum untuk aktivitas enzim yang ada pada laruan saliva. pH Larutan iodine Perubahan 8 10 tetes ++++ 7.4 10 tetes +++ 6.8 10 tetes ++ 6 10 tetes + 5.2 10 tetes ++++ (+) menandakan adanya kandungan amilum

Larutan yang menunjukan perubahan warna paling cepat adalah larutan yang dikondisikan dengan pH 6. Artinya pada tingkat keasaman ini, aktivitas enzim paling

baik bekerja. pH yang baik bagi aktivitas enzimatik ini kemudian disebut sebagai pH optimum enzim. Dalam hal ini, pH optimum bagi enzim yang terkandung pada larutan saliva berarti berada pada pH 6.

Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim

Uji iodine digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya kandungan amilum dalam sampel. Apabila melalui uji ini larutan berubah warna menjadi biru / keunguan, maka dikatakan dalam sampel tersebut terkandung amilum. Pada percobaan ini, amilum yang ditambahkan ke dalam tabung berisi enzim akan terhidrolisis menjadi gula yang lebih sederhana. Namun dengan adanya suatu zat inhibitor tertentu, proses hidrolisis ini menjadi terhambat. Berdasarkan data pengamatan, tabung dengan zat inhibitor HgCl menunjukkan hasil positif dengan pengujian ini berdasarkan perubahan warna yang terjadi menjadi keunguan. Artinya tidak terjadi reaksi hidrolisis pada tabung yang berisi larutan saliva sebagai enzim dan amilum sebagai substrat. Warna biru yang bertahan setelah pemanasan menunjukkan seberapa besar kemampuan HgCl menginhibisi enzim ketika hendak menghidrolisis substratnya. Dengan demikian, HgCl dikatakan merupakan inhibitor yang paling efektif dalam menghambat aktivitas enzim yang terkandung dalam larutan saliva tersebut.

Sampel Saliva + toluen Saliva + kloroform Saliva + HgCl Saliiva + Phenol Saliva + NaF Saliva + aquadest

Perubahan Awal Tidak Berwarna,ada endapan(+) Tidak Berwarna,ada endapan(++) Tidak Berwarna,ada endapan(+) Tidak Berwarna,ada endapan(++) Tidak Berwarna,ada endapan(+) Tidak ada warna,ada endapan(++) + Benedict Biru merah (+) Biru merah (+) Biru (+) Biru merah (+) Biru merah (+) Biru merah (+) + Pemanasan + ++ + +++ + +

Uji Benedict digunakan untuk mendeteksi ada tidaknya kandungan gula pereduksi dalam sampel. Kuntitas endapan yang terbentuk setelah proses pemanasan merupakan indikasi banyaknya jumlah gula pereduksi yang terbentuk akibat hidrolisis

amilum oleh enzim yang terkandung dalam larutan saliva. Semakin sedikit endapan yang terbentuk melalui uji ini menunjukkan bahwa inhibitor yang ditambahkan semakin baik dan bekerja secara efektif. Apabila endapan yang terbentuk sedikit, artinya karbohidrat yang ada dalam tabung masih berada dalam bentuk polisakarida (amilum), itu berarti bahwa amilum tersebut belum terhidrolisis enzim karena terinhibisi oleh senyawa inhibitor. Pada pengujian ini, didapat bahwa HgCl merupakan inhibitor yang paling efektif dalam menghambat aktivitas enzim karena negatif terhadap pengujian benedict.

Uji kuantitatif enzim ptyalin Semakin banyak enzim yang berikatan dengan substrat, kecepatan reaksi semakin meningkat dan semakin banyak kompleks enzim-substrat yang terbentuk. Maka produk yang terbentuk pun semakin banyak. Pada percobaan kali ini dibuat larutan enzim dengan berbagai macam konsentrasi untuk dapat membandingkan kerja enzim pada berbagai konsentrasi. Kadar enzim yang bervariasi dibuat dengan pengenceran dengan aquadest. Pada hasil percobaan, aktivitas enzim tertinggi (kecepatan reaksi enzimatik tertinggi) diperoleh pada kadar enzim terbesar, yaitu saat saliva tidak diencerkan. Hal ini disebabkan banyak enzim yang bereaksi dengan substrat sehingga kecepatan reaksi tinggi dan produk banyak yang dihasilkan. Semakin menurun kadar enzim, aktivitas enzim semakin menurun. Selanjutnya pada pengenceran bertahap diperoleh kecepatan reaksi enzimatik yang lebih kecil daripada tanpa pengenceran. Hal ini disebabkan jumlah enzim yang bereaksi dengan substrat berkurang sehingga aktivitas enzim pun menurun. Begitupun pada pengenceran seterusnya, diperoleh bahwa semakin tinggi pengenceran (semakin encer), semakin menurun pula aktivitas enzim (kecepatan reaksi menurun) Tabung 2 tetes larutan A 2tetes larutan A + 1 tetes aquadest 2tetes larutan A + 2 tetes aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes aquadest bertahap 2tetes larutan A + 2 tetes aquadest bertahap Perubahan Warna larutan bening Warna larutan bening Warna larutan bening Warna larutan bening Bening Bening Bening Bening waktu 3:57 detik 3:10 detik 3:05 detik 1:19 detik 1:10 detik 1:00 detik 00:58 detik 00:40 detik

Kesimpulan

pH optimum untuk aktivitas enzim melalui percobaan uji pengaruh pH terhadap aktivitas enzim didapat pada pH 6. Aktivitas enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti pH, temperatur, konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, konsentrasi produk reaksi, konsentrasi garam inorganik, activator, dan inhibitor. Titik akromatik adalah perubahan warna ketika larutan sudah menjadi bening. Funsi dari penambahan aquadest adalah, untuk mengencerkan substrat supaya menjadi sedikit dan dapat menghidrolisis enzim lebih cepat bereaksi Fungsi dari penambahan iodine adalah mendeteksi adanya kandungan amilum

Daftar pustaka
Anna poedjiadi,1994. Dasar- Dasar Biokimia. Penerbit Jakarta. http://andiscientist.blogspot.com/2010/08/percobaan-pengaruh-ph-daninhibitor.html.di unduh tanggal 25 desember 2010 jam 12.30 wib http://arcturusarancione.wordpress.com/2010/06/28/pengaruh-ph-terhadapaktivitas-enzim-amilase/ Gilvery, et al.1996. Biokimia suatu pendekatan fungsional. Edisi 3. Airlangga university press: Surabaya.