UJI TOKSISITAS SUBKRONIK EKSTRAK DAUN KUMIS KUCING

(Orthosiphon aristatus) TERHADAP GINJAL MENCIT JANTAN

SECARA ORAL





Oleh
ANDI IRAWANSYAH
09311002







JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS TULANG BAWANG
LAMPUNG
2014






2







BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang
Di Indonesia, pemanfaatan tanaman sebagai obat-obatan telah berlangsung ribuan
tahun yang lalu. Tetapi penggunaan belum terdokumentasi dengan baik (Tilaar,
Martha, 2002). Obat tradisional sejak zaman dahulu memainkan peranan penting
dalam menjaga kesehatan, mempertahankan stamina, dan mengobati penyakit.
Oleh karena itu, obat tradisional masih berakar kuat dalam kehidupan masyarakat
hingga saat ini. Semula, untuk kelangsungan hidupnya manusia menggantungkan
semua keperluan pada alam sekitarnya, termasuk untuk menjaga kesehatan.
Sejalan dengan sejarah perkembangan manusia, pengetahuan tentang penyakit dan
pengalaman tentang cara mengatasinya semakin berkembang. Pengetahuan
tentang pengobatan penyakit, semakin lama semakin banyak ragamnya, sesuai
dengan budaya, kemampuan bangsa, rona lingkungan, serta ragam flora dan fauna
yang ada (Soedibyo, B.R.A. Mooryati, 1998).

Pengetahuan tentang khasiat dan keamanan tanaman obat di Indonesia biasanya
hanya berdasarkan pengalaman empiris yang biasanya diwariskan secara turun
temurun dan belum teruji secara ilmiah. Untuk itu diperlukan penelitian tentang
obat tradisional, sehingga nantinya obat tersebut dapat digunakan dengan aman
dan efektif (Jenova, Rika, 2009).

Tanaman kumis kucing mempunyai banyak manfaat untuk pengobatan, antara lain
sebagai antiradang, peluruh air seni (diuretic), dan penghancur batu saluran
kencing (Hariana, Arief, 2013). Dalam penelitian (Astuti, V, C, Y, 2012),
3

pengaruh pemberian ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus) pada
dosis 0,75 dan 1.25 g/kg BB memiliki kemampuan untuk menurunkan kadar
glukosa darah lebih baik pada tikus wistar yang diinduksi aloksan.

Toksisitas didefinisikan sebagai segala hal yang memiliki efek berbahaya dari zat
kimia atau obat pada organisme target. Uji toksisitas terdiri atas dua jenis, yaitu
toksisitas umum (akut, subakut/subkronis, kronis) dan toksisitas khusus
(teratogenik, mutagenik dan karsinogenik) (Amiria, Fita Dwi, 2008). Uji toksisitas
diperlukan untuk menilai keamanan suatu obat, maupun bahan yang dipakai
sebagai siplemen ataupun makanan.

Berdasarkan lama paparan dan dosis, diketahui ada 3 tingkatan uji ketoksikan
yaitu akut, sub kronik, dan kronik. Uji Toksisitas akut dilakukan dengan memberi
senyawa yang sedang diuji sebanyak satu kali atau beberapa kali dalam jangka
waktu 24 jam, kemudian diamati selama 14 hari. Uji toksisitas subkronis
dilakukan untuk mengevaluasi efek senyawa, apabila diberikan kepada hewan uji
secara berulang-ulang. Biasanya diberikan senyawa uji setiap hari selama kurang
lebih 10% dari masa hidup hewan. Uji toksisitas kronis dilakukan dengan
memberikan senyawa uji berulangulang selama masa hidup hewan uji atau
sebagian besar masa hidupnya (Hendriani, Rini, 2007). Uji toksisitas subkronik
merupakan pemberian zat kimia uji secara berganda (dosis harian) bertujuan
untuk mendapatkan data NOEL (no observed effect level) dari suatu bahan uji
(Wirasuta, I.M.A. Gelgel, 2006).

Toksikan tidak mempengaruhi semua organ secara merata, karena dipengaruhi
oleh kepekaan suatu organ, juga tingginya kadar senyawa atau metabolitnya di
organ sasaran. Kadar ini selain bergantung pada dosis yang diberikan juga pada
derajat absorbsi, distribusi, pengikatan, dan ekskresi (Hendriani, Rini, 2007).
Pengikatan suatu senyawa dalam jaringan dapat menyebabkan kadarnya menjadi
tinggi. Hati dan ginjal memiliki kapasitas yang lebih tinggi untuk mengikat
senyawa asing. Hal ini berhubungan dengan fungsi metabolik dan ekskretorik
(Hendriani, Rini, 2007).
4


Organ yang biasa diamati dalam pemeriksaan histopatologi pada hewan uji setelah
pemberian sediaan uji salah satunya adalah ginjal. Secara farmakologik setiap
bahan obat yang masuk kedalam tubuh akan mengalami proses farmakodinamik
dan farmakokinetik. Begitu pula dengan daun kumis kucing yang dikonsumsi
akan diekskresikan melalui ginjal dalam bentuk urine.

Penelitian mengenai efek toksik daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus)
terhadap ginjal merupakan suatu penelitian yang bermanfaat dan perlu dilakukan
karena penggunaan daun kumis kucing sebagai bahan obat (penurun kadar gula
darah) diberikan dalam jangka panjang. Belum ada penelitian yang membahas
tentang efek toksiknya terhadap organ ginjal. Oleh karena itu, peneliti tertarik
untuk melakukan penelitian tentang uji toksisitas subkronik terhadap ginjal mencit
jantan.

1.2 Perumusan Masalah

Apakah ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus) memiliki efek toksik
subkronik terhadap ginjal mencit jantan.

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk membuktikan bahwa daun kumis kucing
(Orthosiphon aristatus) mempunyai efek toksik subkronik terhadap ginjal mencit
jantan.

1.4 Manfaat Penelitian

1. Memberikan informasi kepada masyarakat tentang khasiat daun kumis
kucing sebagai salah satu obat tradisional untuk menurunkan kadar
glukosa darah.

5

2. Memberikan informasi kepada masyarakat tentang keamanan konsumsi
ekstrak daun kumis kucing dan efek toksiknya terhadap ginjal.

1.5 Hipotesis

Ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus) mempunyai efek toksik
subkronik terhadap ginjal mencit jantan.

























6


BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Botani Daun Kumis Kucing (Orthosiphon aristatus)
Tanaman kumis kucing biasanya tumbuh di sepanjang anak sungai atau
selokan. Biasanya ditanam juga di pekarangan rumah untuk digunakan sebagai
tanaman obat keluarga, karena kumis kucing memiliki banyak khasiat dan
mudah ditanam yaitu dengan cara menebar biji atau setek batang. Tanaman
kumis kucing mempunyai nama botani: Orthosiphon stamineus Benth
(Dalimartha, Setiawan, 2000).


Gambar 2.1.1 Daun kumis kucing (Dalimartha, Setiawan, 2000)

2.1.1 Klasifikasi

Klasifikasi Tanaman kumis kucing adalah sebagai berikut (Anonim, 2000) :
Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
7

Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Asteridae
Ordo : Lamiales
Famili : Lamiaceae
Genus : Orthosiphon
Spesies : Orthosiphon aristatus

2.1.2 Sinonim

Orthosiphon aristatus Miq., Orthosiphon spicatus B.Bs, Orthosiphon
grandiflorus Bold, mempunyai nama daerah: Kumis kucing (Sunda), remujung
(Jawa), sesalaseyan (Madura) soengot koceng (Madura), dan nama simplisia:
Orthosiphi Herba (herba kumis kucing) (Dalimartha, Setiawan, 2000).

2.1.3 Morfologi Tumbuhan

Tanaman kumis kucing mempunyai bunga berwana putih seperti kumis kucing.
Kumis kucing merupakan tanaman yang mudah merambat dan berkembang biak
dengan cara generatif dan vegetatif. Cara generatif yaitu dengan biji sedangkan
vegetatif dengan stek. Stek batang yang paling baik adalah batang yang tidak
terlalu tua. Tanaman ini menghendaki suasana lembap, pada saat kemarau perlu
penyiraman intensif (Soeryoko, Hery, 2011). Kumis kucing dapat ditemukan di
dataran rendah pada ketinggian 700 m di atas permukaan laut. Tanaman kumis
kucing tumbuh tegak dengan tinggi antara 50-150 cm. Batang berkayu, segi empat
agak beralur, beruas, bercabang, berambut pendek atau gundul, berakar kuat.
Daun tunggal, bulat telur, elips atau memanjang, berambut halus, tepi bergerigi,
ujung dan pangkal runcing, tipis, panjang 2-10 cm, lebar 1-5 cm, warna hijau.
Bunga majemuk dalam tandan yang keluar di ujung percabangan, berwarna ungu
pucat atau putih, benang sari lebih panjang dari tabung bunga. Buah berupa nuah
kotak, bulat telur, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwarna coklat. Biji
8

kecil, masih muda berwarna hijau, setelah tua berwarna hitam (Dalimartha,
Setiawan, 2000).

2.1.4 Tempat Tumbuh dan Penyebarannya

Kumis kucing sangat mudah untuk dibudidayakan, karena tanaman ini dapat
tumbuh di dataran rendah maupun tinggi. Kumis kucing paling ideal tumbuh di
daerah dengan ketinggian di atas 700 m di atas permukaan laut atau daerah
berhawa sejuk. Daerah yang kurang dari 700 m di atas permukaan laut akan
mengalami kekeringan pada musim kemarau sehingga perlu penyiraman intensif
(Soeryoko, Hery, 2011). Tempat penyebarannya hampir dibeberapa daerah di
indonesia, suka sekali akan keadaan yang sedikit basah (Wulandari, 2011)

2.1.5 Kandungan Kimia dan Penggunaan

Kumis kucing memiliki rasa sedikit pahit, sedikit asin, sepet, dan bersifat sejuk.
Beberapa bahan kimia yang terkandung dalam kumis kucing, diantaranya zat
samak, minyak atsiri, orthosiphonglikosida, minyak lemak, saponin, sapofonin,
garam kalium (0,6-3,5%), dan myoinositol (Hariana, Arief, 2013).

2.2 Toksikologi

Toksikologi dapat didefinisikan sebagai kajian tentang hakikat dan mekanisme
efek berbahaya (efek toksik) berbagai bahan kimia terhadap makhluk hidup dan
sistem biologik lainnya (Wirasuta, I.M.A. Gelgel, 2008). Efek toksik suatu zat
dipengaruhi oleh banyak faktor, mulai dari zatnya, target organ, mekanisme aksi,
besar dosis, dan kondisi fisiologi membran biologi yang terpapar (Priyanto, 2010).

2.2.1 Toksisitas

Toksisitas merupakan istilah relatif yang biasa dipergunakan dalam
memperbandingkan satu zat kimia dengan lainnya, atau bisa dikatakan bahwa satu
9

zat kimia lebih toksik daripada zat kimia lain. Perbandingan sangat kurang
informatif, kecuali jika pernyataan tersebut melibatkan informasi tentang
mekanisme biologi yang sedang dipermasalahkan dan juga dalam kondisi
bagaimana zat kimia tersebut berbahaya (Wirasuta, I.M.A Gelgel, 2008).

Penilaian keamanan suatu obat atau zat kimia merupakan bagian penting dari
toksikologi, karena setiap zat kimia yang baru disintesis dan akan dipergunakan
harus diuji toksisitas dan keamanannya. Bila zat kimia itu merupakan zat
tambahan makanan atau kontaminan yang tanpa sengaja dapat masuk dalam
makanan, maka penilaian keamanannya dilakukan melalui tahap-tahap yang telah
baku (Ganiswarna, Sulistia G, Dkk, 1995). Efek toksik yang ditimbulkan oleh
suatu zat akibatnya sangat bervariasi, tergantung dari zat, target organ, mekanisme
aksi, dan besarnya dosis (Priyanto, 2010).

Efek toksisitas yang ditimbulkan oleh keracunan makanan/minuman dapat bersifat
akut atau kronis. Keracunan akut ditimbulkan oleh bahan-bahan beracun yang
memiliki toksisitas yang tinggi, dimana dengan kuantitas yang kecil sudah dapat
menimbulkan efek fisiologis yang berat. Jenis keracunan ini umumnya mudah
diidentifikasi dan menjadi perhatian masyarakat. Sebaliknya keracunan yang
bersifat kronis efek toksisitasnya baru dapat terlihat atau teridentifikasi dalam
waktu yang lama, umumnya tidak disadari dan tidak mendapat perhatian.
Peningkatan yang berarti terhadap jumlah penderita penyakit yang dapat dipicu
oleh pengaruh bahan beracun seperti tumor (kanker), gangguan enzimatik,
gangguan metabolisme, gangguan sistem syaraf, mungkin saja merupakan akibat
dari penggunaan berbagai jenis bahan kimia yang bersifat toksis dalam makanan
yang dikonsumsi masyarakat (Wirasuta, I.M.A. Gelgel, 2008).

2.2.2 Klasifikasi Toksikologi

Efek toksik dapat diklasifikasikan menurut beberapa cara antara lain berdasarkan
target organ, mekanisme kerja, spektrum dan lain-lain (Priyanto, 2010) :
10

1. Berdasarkan target organ, efek toksik dapat diklasifikasikan menjadi
hepatotoksik, neprotoksik, hemotoksik, genotoksik, ototoksik, neurotoksik,
immunotoksik, dan lain-lain.
2. Berdasarkan waktu dan tempat efek toksik timbul.
3. Efek toksik berdasarkan skala waktu timbulnya efek toksik atau lamanya
paparan.

2.2.3 Gejala Toksisitas

Kondisi efek toksik mempengaruhi atau menentukan keberadaan zat kimia atau
metabolitnya dalam sel sasaran atau tempat kerjanya. Jumlah zat kimia atau
metabolitnya di sel sasaran akan mempengaruhi atau menentukan efek toksiknya.
Yang termasuk dalam kondisi efek toksik adalah (Priyanto, 2010) :
1. Kondisi paparan zat kimia meliputi :
a) Jalur paparan (intravaskuler atau ekstravaskuler)
b) Lama dan kekerapan paparan
c) Saat paparan
d) Paparan akut atau kronis
2. Kondisi mahluk hidup, meliputi :
a) Keadaan fisiologi (berat badan, umur, suhu tubuh, kecepatan pengosongan
lambung, kecepatan aliran darah, status gizi, kehamilan, genetika, dan
jenis kelamin).
b) Keadaan patologi (penyakit saluran pencernaan, kardiovaskuler, hati, dan
ginjal).

2.2.4 Penanganan Toksisitas

Penanganan kasus keracunan harus dilakukan dengan cepat dan dengan terencana.
Penanganan pertama, yang disebut pertolongan pertama terdiri atas (Mutschler,
Ernst, 1991) :
a. Menjaga agar fungsi vital, seperti pernapasan dan sirkulasi tetap ada.
11

b. Menghindari absorpsi racun lebih lanjut. Jika penyebab keracunan diketahui
dan mungkin dilakukan penanganan dengan antidot tertentu, jika zat tersebut
tersedia harus segera diberikan.

Setelah pertolongan pertama, jika penanganan yang dilakukan belum atau kurang
cukup harus dicoba lagi untuk menghentikan absorpsi racun, selanjutnya
diusahakan untuk (Mutschler, Ernst, 1991) :
a. Mempercepat eliminasi racun yang sudah masuk dalam organisme.
b. Menormalkan kembali fungsi tubuh yang terganggu dengan penanganan
simptomatik.

2.2.5 Uji Toksikologi

Obat sebelum dipasarkan atau digunakan harus menjalani serangkaian uji untuk
memastikan keamanan, efektivitas dan mutunya. Uji diawali dari skrining untuk
mencari senyawa aktif, lalu dilanjutkan uji efektivitas atau selektivitas dan
mekanisme kerjanya pada hewan coba atau mikroba (Priyanto, 2010).

Berikut serangkain tes keamanan pada hewan coba (Priyanto, 2010), yang
meliputi :
1. Uji toksisitas akut : Uji untuk mengetahui nilai LD50 dan dosis maksimal
yang masih dapat ditoleransi oleh hewan percobaan, yang hasilnya akan
ditransformasi pada manusia.
2. Uji toksisitas sub akut : Suatu uji untuk menentukan organ sasaran (organ
yang rentan) atau tempat kerjanya. Umumnya dilakukan selama 4 minggu- 3
bulan.
3. Uji toksisitas kronik : Suatu uji yang tujuannya hampir sama dengan uji
toksisitas sub akut. Umumnya dilakukan selama 6 bulan atau lebih. Uji ini
diperlukan jika obat nantinya akan digunakan dalam waktu yang cukup
panjang.
12

4. Uji efek pada organ reproduksi : Suatu uji untuk melihat perilaku yang
berkaitan dengan reproduksi, perkembangan janin, kelainan janin, proses
kelahiran, dan perkembangan janin setelah melahirkan.
5. Uji karsinogenik : Uji untuk mengetahui apakah suatu zat jika dipakai dalam
jangka panjang akan dapat menimbulkan kanker. Uji dilakukan selama 2
tahun pada 2 spesies hewan. Uji ini dilakukan jika obat ini nantinya akan
digunakan dalam jangka panjang.
6. Uji mutagenik : Suatu uji untuk melihat adanya perubahan genetik jika zat
digunakan jangka panjang.

Setelah uji keamanan tersebut memenuhi syarat sebagai obat, obat akan
dibuat dalam formulasi yang diinginkan dan dilakukan uji formulasi. Setelah
semuanya dinyatakan memenuhi syarat, obat masih harus menjalani uji klinik
pada manusia sebelum obat mendapatkan izin edar. Uji klinik yang dimaksud
meliputi :
1. Uji klinik fase I : Uji pada sukarelawan sehat untuk mengetahui keamanan zat
aktif pada manusia dan untuk mengetahui rentang dosis yang aman serta
profil farmakokinetiknya.
2. Uji klinik fase II : Uji pada orang sakit yang sesungguhnya dalam jumlah
sedikit untuk mengetahui efektivitas dari zat aktif.
3. Uji klinik fase III : Uji pada pasien sesungguhnya dalam jumlah yang relatif
besar, dilakukan secara random control dan double blind untuk melihat
efektifitasnya dan kemungkinan timbulnya efek yang tidak diinginkan.
4. Uji klinik fase IV : Uji yang dilakukan pada pasien yang tidak ditentukan
kriterianya setelah obat mendapat izin edar sementara untuk mengetahui
efektivitasnya dan untuk melihat efek yang tidak diinginkan setelah
digunakan secara masal.

2.2.6 Uji Toksisitas Subkronik

Uji Toksisitas Subkronik merupakan pemberian zat kimia uji secara berganda
(dosis harian) bertujuan untuk mendapatkan data NOEL dari suatu bahan uji.
13

Durasi 3 bulan dengan menggunakan dua spesies uji (biasa tikus dan anjing).
Menurut jalur pemberian dimaksud pada pemakaian. Evaluasi yang dilakukan
adalah seluruh hewan ditimbang seminggu sekali, pemeriksaan badan lengkap
seminggu sekali, dan uji kimia darah, analisis air kencing, uji hematologi, dan uji
fungsi dikerjakan atas seluruh hewan yang sakit. Seluruh hewan dapat mengalami
bedah mayat lengkap yang menyangkut histologi seluruh organ (Wirasuta, I.M.A.
Gelgel, 2008).

Pada pemeriksaan setelah kematian hewan uji perlu dilakukan pemeriksaan
histologi organ untuk mengetahui hubungan antara gejala yang terjadi dengan
struktur organ yang mengalami paparan senyawa uji. Pada penelitian ini organ
yang ditimbang dan diperiksa secara histologis yaitu hati, ginjal, anak ginjal,
jantung, limfa, pankreas, paru-paru, otak, testes dan vesika seminalis (jantan),
uterus dan ovarium (betina). Lambung diperiksa secara makroskopis (Hendriani,
Rini, 2007) :
a) Hati adalah organ terbesar dan memberikan proses metabolisme paling
kompleks di dalam tubuh. Organ ini terlibat dalam metabolisme zat makanan
serta sebagian besar obat dan toksikan. Pada pemeriksaan patologi
makroskopik hati, warna dan penampilan sering dapat menunjukkan sifat
toksisitas, seperti perlemakan hati atau sirosis. Berat organ merupakan
petunjuk yang sangat peka dari pengaruh zat uji pada hati. Pada pemeriksaan
mikroskopik hati, dapat dideteksi berbagai kelainan histologi seperti
perlemakan, nekrosis, sirosis, nodul hiperplastik dan neoplasia, selain juga
dapat mendeteksi perubahan dalam berbagai struktur subsel. Data tersebut
digabungkan dengan data uji biokimia sehingga dapat menggambarkan cara
kerja toksikan.
b) Ginjal merupakan organ sasaran utama dari efek toksik selain hati. Ginjal
mempunyai kemampuan kompensasi yang luar biasa. Uji fungsi ginjal selain
dilakukan analisis urin dan darah, juga pemeriksaan secara morfologis dan
histologis. Pada pemeriksaan makroskopis ditentukan berat ginjal. Perubahan
berat organ, bila dibandingkan dengan hewan pembanding, dapat
menunjukkan lesi ginjal. Pemeriksaan histopatologi dapat mengungkapkan
14

tempat, luas, dan sifat morfologik lesi ginjal. Sebagai suatu bagian vital
dalam tubuh, susunan saraf dilindungi dari toksikan dalam darah oleh suatu
mekanisme protektif sawar darah otak. Meskipun demikian, susunan saraf
rentan dari berbagai jenis toksikan. Susunan saraf terdiri atas dua bagian
utama yaitu susunan saraf perifer dan susunan saraf pusat (SSP) yang
mencakup otak dan sum-sum tulang belakang. Pada uji toksisitas perlu juga
dilakukan pemeriksaan histologi otak.
c) Jantung adalah suatu organ yang vital dalam tubuh, meskipun bukan sasaran
utama, organ ini dapat dirusak oleh berbagai senyawa, juga sistem
reproduksi, testis dan vesika seminalis atau ovarium dan uterus, serta
pankreas yang merupakan bagian sistem endokrin. Oleh karena itu perlu
dilakukan pula pemeriksaan histologi pada organ-organ tersebut.

Lima pedoman uji toksisitas (Weil, 1972 dalam Wirasuta, 2008) meliputi :
a. Bila dianggap praktis dan sedapat mungkin menggunakan satu atau lebih
spesies yang secara biologis memperlakukan suatu bahan yang secara
kualitatif semirip mungkin dengan manusia.
b. Bila mudah dikerjakan, gunakan beberapa tingkatan dosis, dengan alasan
aksi/efek pada manusia dan hewan berkaitan dengan dosis.
c. Efek yang ditimbulkan pada tingkat dosis yang lebih tinggi bermanfaat untuk
melukiskan kerja mekanisme aksi, tetapi untuk suatu bahan dan efek
berbahaya, ada tingkat dosis untuk manusia atau hewan dimana efek
berbahaya ini tidak akan muncul
d. Uji statistika untuk signifikansi itu sahih hanya pada satuan eksperimental
yang secara matematika telah dirambang diantara dosis dan kelompok kontrol
bersangkutan.
e. Efek yang diperoleh melalui suatu jalur pemberian kepada hewan uji dapat
diterapkan pada efek, melalui jalur pemberian lain pada manusia. Jalur yang
dipilih pada mana eksposisi akan terjadi.



15

2.3 Ginjal

2.3.1 Anatomi Ginjal

Ginjal adalah sepasang organ saluran kemih yang terletak di rongga
retroperitonial bagian atas. Bentuknya menyerupai kacang dengan sisi cekungnya
menghadap kemedial. Pada sisi ini terdapat hilus ginjal yaitu tempat struktur-
struktur pembuluh darah, sistem limfatik, sistem saraf dan ureter menuju dan
meninggalkan ginjal (Setiadi, 2007).


Gambar 2.3.1. Anatomi ginjal manusia (Guyton, C. dan Hall, E, 2008)

Ginjal merupakan salah satu organ tubuh yang sangat penting bagi manusia
karena organ ini bekerja sebagai alat ekskresi utama untuk zat-zat yang tidak
dibutuhkan oleh tubuh lagi. Dalam melaksanakan fungsi ekskresi, ginjal
mendapat tugas yang berat mengingat hampir 25% dari seluruh aliran darah
mengalir ke ginjal. Besarnya aliran darah yang menuju ginjal menyebabkan
keterpaparan ginjal terhadap bahan/zat-zat yang beredar dalam sirkulasi cukup
tinggi. Akibatnya, bahan-bahan yang bersifat toksik akan mudah menyebabkan
kerusakan jaringan ginjal dalam bentuk perubahan struktur dan fungsi ginjal.
Keadaan inilah yang disebut sebagai nefropati toksik dan dapat mengenai
16

glomerulus, tubulus, jaringan veskuler, maupun jaringan interstial ginjal
(Anonim, 2002).

Ginjal merupakan organ terpenting dalam mempertahankan homeostasis cairan
tubuh secara baik. Berbagai fungsi ginjal untuk mempertahankan homeostatik
dengan mengatur volume cairan, keseimbangan osmotik, asam basa, ekskresi sisa
metabolisme, sistem pengaturan hormonal dan metabolisme (Syaifuddin, Haji,
2011). Ginjal terletak dalam rongga abdomen, retroperitonial primer kiri dan
kanan kolumna vertebralis yang dikelilingi oleh lemak dan jaringan ikat di
belakang peritonium. Batas atas ginjal kiri setinggi iga ke-11 dan ginjal kanan
setinggi iga ke-12 dan batas bawah ginjal kiri setinggi vertebrae lumbalis ke-3.
Setiap ginjal memiliki panjang 11-25 cm, lebar 5-7 cm, dan tebal 2,5 cm. Ginjal
kiri lebih panjang dari ginjal kanan. Berat ginjal pada pria dewasa 150-170 gram
dan wanita dewasa 115-155 gram dengan bentuk seperti kacang, sisi dalamnya
menghadap ke vertebrae thorakalis, sisi luarnya cembung dan diatas setiap ginjal
terdapat sebuah kelenjar suprarenal (Setiadi, 2007).

2.3.2 Histologi Ginjal

Satuan fungsional ginjal disebut nefron. Ginjal mempuyai lebih kurang 1,3 juta
nefron yang selama 24 jam dapat menyaring 170 liter darah dari arteri renalis.
Lubang-lubang yang terdapat pada piramid renal masing-masing membentuk
simpul satu badan malfigi yang disebut glomerulus.

Nefron adalah massa tubulus mikroskopis ginjal yang merupakan satuan
fungsional ginjal. Nefron menyaring darah dan mengontrol komposisinya. Setiap
nefron berawal dari berkas kapiler yang terdiri dari (Syaifuddin, Haji, 2011) :
1. Glomerulus, merupakan gulungan atau anyaman kapiler yang terletak didalam
kapsula Bowman (ujung buntu tubulus ginjal yang bentuknya seperti kapsula
cekung menutupi glomerulus yang saling melilitkan diri). Glomerulus
menerima darah dari arteriola eferen dan meneruskan darah ke sistem vena
melalui arteriola eferen. Natrium secara bebas di filtrasi dalam glomerulus
17

sesuai dengan konsentrasi dalam plasma. Kalium juga di filtrasi secara bebas.
Diperkirakan 10-20% kalium plasma terikat oleh protein dan tidak bebas di
filtrasi sehingga kalium dalam keadaan normal (Syaifuddin, Haji, 2011).

2. Tubulus Proksimal Konvulta, tubulus ginjal yang langsung berhubungan
dengan kapsula Bowman dengan panjang 15 mm dan diameter 55 mm.
Bentuknya berkelok-kelok menjalar dari korteks ke bagian medula dan
kembali ke korteks. Sekitar 2/3 dari natrium yang berfiltrasi diabsorpsi secara
isotonik bersama klorida dan melibatkan transportasi aktif natrium.
Peningkatan reabsorpsi natrium akan mengurangi pengeluaran air dan
natrium. Hal ini dapat mengganggu pengenceran dan pemekatan urine yang
normal. Kalium di resorpsi lebih dari 70%, kemungkinan dengan mekanisme
transportasi aktif akan terpisah dari resorpsi natrium (Syaifuddin, Haji, 2011).

3. Ansa Henle, bentuknya lurus dan tebal, diteruskan ke segmen tipis
selanjutnya ke segmen tebal, panjangnya 12 mm, total panjang Ansa Henle 2-
14 mm. Klorida secara aktif diserap kembali pada cabang asendens Ansa
Henle dan natrium bergerak secara pasif untuk mempertahankan kenetralan
listrik. Sekitar 25% natrium yang difiltrasi diserap kembali karena nefron
bersifat tidak fermeabel terhadap air. Resorpsi klorida dan natrium di pars
asendens penting untuk pmekatan urine karena membantu mempertahankan
integritas gradien konsentrasi medula. Kalium terfiltrasi sekitar 20-25%
diabsorpsi pada pars asendens lengkung henle proses pasti terjadi karena
gradien elektrokimia yang timbul sebagai akibat dari reabsorpsi aktif klorida
pada segmen nefron ini (Syaifuddin, Haji, 2011).

4. Tubulus Distal Konvulta, bagian tubulus ginjal yang berkelok-kelok dan jauh
letaknya dari kapsula Bowman, panjangnya 55 mm. Tubulus distal dari
masing-masing nefron bermuara keduktus koligens yang panjangnya 20 mm.
Masing-masing duktus koligens berjalan melalui korteks dan medula ginjal,
bersatu membentuk suatu duktus yang berjalan lurus dan bermuara kedalam
duktus belini seterusnya menuju kaliks minor menuju kaliks mayor. Akhirnya
18

mengosongkan isinya ke dalam pelvis renalis pada apek masing-masing
piramid medula ginjal. Sekresi kalium terjadi secara murni. Suatu proses pasif
yang terjadi karena gradien elektrokimia yang ditimbulkan oleh perbedaan
besar potensial pada segmen nefron ini. Gradien ini dipertahankan oleh
pertukaran aktif natrium dan kalium pada membran basolateral sel tubulus.
Mekanisme ini dikendalikan oleh aldosteron yang mengendalikan tubulus
distal terhadap sekresi kalium (Syaifuddin, Haji, 2011).

5. Duktus Koligen Medula, bukan merupakan saluran metabolik tidak aktif,
tetapi pengaturan secara halus ekskresi natrium urine terjadi disini dengan
aldosteron yang paling berperan terhadap reabsorpsi natrium. Peningkatan
aldosteron dihubungkan dengan peningkatan reabsorpsi natrium. Duktus ini
memiliki kemampuan mereabsorpsi dan menyekresi kalium. Ekskresi aktif
kalium diperlihatkan pada duktus koligen kortikal dan dikendalikan oleh
aldosteron. Reabsorpsi aktif kalium murni terjadi dalam duktus koligen
medula (Syaifuddin, Haji, 2011).

2.3.3 Fisiologi Ginjal

Dua ginjal terletak pada dinding posterior abdomen, di luar rongga peritoneum.
Setiap ginjal pada orang dewasa beratnya kira-kira 150 gram dan kira-kira
seukuran kepalan tangan. Sisi medial setiap ginjal merupakan daerah lekukan
yang disebut hilum tempat lewatnya arteri dan vena renalis, cairan limfatik, suplai
saraf, dan ureter yang membawa urine akhir dari ginjal ke kandung kemih,
dimana urine disimpan hingga dikosongkan (Guyton, C. dan Hall, E, 2008).

Fungsi ginjal dalam sistem homeostasis urinaria (Syaifuddin, Haji, 2011) :
a) Mengatur volume dan tekanan darah dengan mengatur banyaknya air yang
hilang dalam urine, melepaskan eritropoietin dan melepaskan renin.
b) Mengatur konsentrasi plasma dengan mengontrol jumlah natrium, kalium,
klorida, dan ion lain yang hilang dalam urine dan mengontrol kadar ion
kalsium.
19

c) Membantu menstabilkan pH darah, dengan mengontrol kehilangan ion
hidrogen dan ion bikarbonat dalam urine.
d) Menyimpan nutrien dengan mencegah pengeluaran dalam urine,
mengeluarkan produk sampah nitrogen seperti urea dan asam urat.
e) Membantu dalam mendeteksi racun-racun.
Fungsi utama ginjal adalah untuk mempetahankan milieu interieur dengan
mengubah kecepatan ekskresi berbagai konsituen-konsituen dalam plasma
(termasuk air) (Baron, D.N, 1990).
Jumlah urine sekitar 900-1500 ml/24 jam, dengan komposisi air sekitar 96% dan
bahan-bahan yang terlarut didalamnya (elektrolit terutama natrium dan sisa
metabolisme terutama ureum, asam urat dan creatinin). Dalam urine sering
didapatkan leucocyte dan erytrocite 1-2 buah/lapangan pandang (ini normal). Pada
penderita icterus adanya bilirubin dan urobilin yang menyebabkan urine menjadi
kuning (Setiadi, 2007).

2.3.4 Teori Histopatologi

Histopatologi adalah cabang biologi yang mempelajari kondisi dan fungsi
jaringan dalam hubungannya dengan penyakit. Histopatologi sangat penting
dalam kaitan dengan diagnosis penyakit karena salah satu pertimbangan dalam
penegakan diagnosis adalah melalui hasil pengamatan terhadap jaringan yang
diduga terganggu. Analisis kondisi histologi organ atau jaringan dengan
pengamatan terhadap perubahan morfologi, struktur dan indikasi kerusakan atau
infeksi atau mutasi lainnya akibat pengaruh penyakit, bahan toksik atau proses-
proses mutagenesis lainnya (Anonim, 2009).

Histoteknik adalah metoda atau proses untuk membuat sajian histologi dari
spesimen tertentu melalui suatu rangkaian proses hingga menjadi sajian yang siap
untuk diamati atau dianalisa. Sajian histologi yang baik dapat digunakan untuk
(Jusuf, Ahmad Aulia, 2009) :
a) Bahan pengajaran, guna mempelajari bentuk dan struktur jaringan tubuh
tertentu yang normal.
20

b) Riset, guna mempelajari perubahan jaringan dan organ tubuh hewan
percobaan yang mendapat perlakuan tertentu atau mempelajari pertumbuhan
dan perkembangan jaringan atau organ tubuh tertentu.
c) Membantu menegakkan diagnosa penyakit yang diderita oleh seorang pasien
untuk mencapai ketiga tujuan tersebut sajian histologi yang dibuat harus
dapat memberikan gambaran tentang bentuk dan besar serta susunan sel, inti
sel dan sitoplasma, badan inklusi (glikogen, tetesan lemak, pigmen, dan
sebagainya), susunan serat jaringan ikat, otot dan lain sebagainya sesuai
dengan gambaran jaringan tubuh tersebut dalam kondisi hidup.
Sumber Jaringan atau Organ :
1. Manusia
Jaringan yang berasal dari manusia tentulah yang paling ideal karena struktur
histologi yang harus dipelajari adalah struktur histologi manusia. Jaringan
tubuh ini dapat diambil dari cadaver (jenazah) dengan syarat jaringan atau
organ tersebut diambil kurang dari 3 jam setelah kematian, sebab bila lebih
lama sudah terjadi pembusukan atau autolisis (Jusuf, Ahmad Aulia, 2009).
2. Hewan
Jaringan atau organ yang diambil dari hewan merupakan alternatif. Beberapa
hewan yang sering dipakai adalah (Jusuf, Ahmad Aulia, 2009) :
a. Kera, paling menyerupai jaringan tubuh manusia karena sama-sama
tergolong makhluk primata.
b. Kambing, terutama untuk melihat serat di jantung.
c. Babi, untuk melihat lobulus klasik hepar dan arteri hulsen pada limfa.
d. Kucing dan anjing.
e. Tikus putih.
f. Kelinci.
Jaringan dapat diambil dari hewan yang di fiksasi dalam keadaan hidup (fiksasi
supra atau intravital) atau hewan yang telah mati (fiksasi emersi atau rendam).

Pembuatan sajian histologi yang bersifat massal dan banyak biasanya dilakukan
oleh teknisi laboratorium tetapi harus dikontrol oleh staf pengajar sehingga kualitas
21

sajian histologi yang dihasilkan akan dapat senantiasa dikontrol (Jusuf, Ahmad
Aulia, 2009).
Setelah Jaringan atau organ tubuh yang akan dibuat sajian histologi diisolasi dari
sumbernya, jaringan tubuh tersebut kemudian diproses hingga menjadi sajian
histologi. Rangkaian proses pembuatan sajian histologi terdiri atas (Jusuf, Ahmad
Aulia, 2009) :
1. Fiksasi (Fixation)
2. Dehidrasi (Dehydration)
3. Pembeningan (Clearing)
4. Pembenaman (Impregnasi atau Embedding)
5. Pengecoran (Blocking)
6. Pemotongan jaringan (Sectioning)
7. Pewarnaan (Staining)
8. Perekatan (Mounting)
9. Pelabelan (Labelling)

















22


BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Jurusan Farmasi Fakultas MIPA
Universitas Tulang Bawang Bandar Lampung dan Laboratorium Patologi Balai
Penyelidikan dan Pengujian Veteriner (BPPV) Regional III Bandar Lampung
pada bulan Juli - Agustus 2014.
3.2 Hewan Uji
Pada penelitian ini digunakan satu jenis hewan uji yaitu mencit putih jantan,
normal dan sehat, sebanyak 20 ekor, usia dewasa (2-3 bulan), dengan berat badan
20-30 g.
3.3 Alat dan Bahan
Alat penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (untuk
menimbang berat badan), spuit oral 1 cc, sonde oral, gunting minor set (untuk
membedah perut mencit), kapas, gelas ukur, spatula, batang pengaduk,
erlenmeyer, beaker glass, labu ukur, rotary evaporator dan pembuat preparat
histologi (mikrotom).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ektrak daun kumis kucing
(Orthoshipon aristatus), gentamisin, larutan Bouin untuk fiksasi, garam fisiologis
NaCl (0,9 %), kloroform, formalin 10 %, alkohol, toluol, xylol, paraffin dengan
titik cair 50-55C, canada balsama, pewarna Hematoxylin dan Eosin, aquades,
Meyers albumin (Triwibowo, Angga Wahyu, 2011)

23

3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Pengambilan Bahan Uji
Bahan uji berupa daun kumis kucing diambil di wilayah sukabumi. Ciri-ciri dari
daun kumis kucing yang akan digunakan adalah daun yang berwarna hijau tua.
3.4.2 Determinasi Tanaman
Determinasi daun kumis kucing (Orthosiphon aristatus) untuk mengetahui
klasifikasinya, dilakukan di Laboratorium Botani Jurusan Biologi Fakultas MIPA
Universitas Tulang Bawang Lampung. Adapun kriteria tanaman daun kumis
kucing adalah : Tanaman kumis kucing tumbuh tegak dengan tinggi antara 50-150
cm. Batang berkayu, segi empat agak beralur, beruas, bercabang, berambut
pendek atau gundul, berakar kuat. Daun tunggal, bulat telur, elips atau
memanjang, berambut halus, tepi bergerigi, ujung dan pangkal runcing, tipis,
panjang 2-10 cm, lebar 1-5 cm, warna hijau. Bunga majemuk dalam tandan yang
keluar di ujung percabangan, berwarna ungu pucat atau putih, benang sari lebih
panjang dari tabung bunga. Buah berupa nuah kotak, bulat telur, masih muda
berwarna hijau, setelah tua berwarna coklat. Biji kecil, masih muda berwarna
hijau, setelah tua berwarna hitam.
3.4.3 Pembuatan Ekstrak Daun Kumis Kucing
Pembuatan ekstrak daun kumis kucing dilakukan dengan metode maserasi, yaitu
daun kumis kucing yang telah di ayak, ditimbang sebanyak 50 g lalu diekstraksi
dengan menggunakan etanol 70 % direndam simplisia sampai maserat tersari
sempurna dengan tiga kali penyaringan setiap hari pelarut diganti, ekstrak
kemudian disaring dengan menggunakan kain flanel atau kasa (filtrat 1) dan
sisanya diekstrak kembali. Selanjutnya filtrate dikumpulkan, diuapkan rotary
evaporator pada suhu 70 C sampai pelarutnya tidak menetes lagi untuk
memproleh ekstrak kental (Astuti, V, C, Y, 2012).


24

3.4.4 Persiapan Hewan Percobaan
Hewan percobaan yang digunakan adalah mencit jantan berumur 2-3 bulan
dengan ketentuan berat badan setiap ekornya 20-30 g sebanyak 20 ekor.
Dikelompokkan menjadi 4 kelompok, masing-masing kelompok terdiri dari 5
ekor. Sebelum penelitian dilaksakan hewan diadaptasikan selama 1 minggu dan
diamati kesehatannya. Hewan uji dinyatakan sehat, apabila berat badannya tetap
atau meningkat dan tidak ada perubahan tingkah laku, tidak luka, dan tidak cacat
(Anonim, 1993).
3.4.5 Rancangan Percobaan
Pada penelitian ini rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak
Kelompok (RAK). Rancangan acak kelompok adalah suatu rancangan acak yang
dilakukan dengan mengelompokan satuan percobaan ke dalam grup-grup atau
kelompok yang homogen. Dengan demikian tujuan pengelompokan kedalam
kelompok-kelompok yang seragam adalah untuk mengurangi variasi kesalahan
percobaan dan meningkatkan perbedaan-perbedaan atau variasi diantara kelompok
dan menurunkan perbedaan-perbedaan dalam kelompok. Karena variasi atau
perbedaan dalam kelompok ini nantinya yang akan memberi kontribusi dalam
kesalahan acak (Daha, 2011).
3.4.6 Perencanaan Dosis
Dosis daun kumis kucing yang biasa digunakan untuk manusia secara tradisional
adalah 40 g per hari (Dalimartha, 2000). Pada percobaan dibuat 3 variasi dosis
dengan kelipatan 2. Untuk menghitung volume pemberian sediaan uji pada mencit
jantan digunakan rumus :
VAO =
( mk ) ( k )
( mmL )

3.4.7 Perhitungan Sampel Penelitian
Populasi penelitian ini adalah tikus mencit jantan berumur 2-3 bulan. Sampel
penelitian sebanyak 20 ekor dipilih secara acak. Pada saat pelakuan percobaan,
mencit dikelompokan menjadi 4 kelompok yang setiap kelompok terdiri dari 5
25

mencit putih jantan (sebanyak ulangan) . Hal ini sesuai dengan rumus Federer,
rumus penentuan sampel untuk uji eksperimental.
Diketahui : t = 4
Maka t (n-1) 15
4 (n-1) 15
4 (4n-4) 15
4n 19
n 4,75 5
n 5
Nilai t merupakan jumlah kelompok perlakuan, dan nilai n merupakan jumlah
pengulangan atau jumlah sampel setiap kelompok. Nilai n minimal adalah 5 kali,
dan peneliti menggunakan jumlah sampel atau jumlah pengulangan sebanyak 4
kali (Triwibowo, Angga Wahyu, 2011).
3.4.8 Rancangan penelitian
1. Mencit sebanyak 20 ekor, dikelompokan dalam 4 kelompok yaitu:
a. Kelompok I sebagai kontrol normal, hanya diberi aquades secara oral.
b. Kelompok II dengan dosis ekstrak daun kumis kucing 3640 mg/kg BB
secara oral.
c. Kelompok III dengan dosis ekstrak daun kumis kucing 7280 mg/kg BB
secara oral.
d. Kelompok IV dengan dosis ekstrak daun kumis kucing 14560 mg/kg BB
secara oral.
2. Berikan ekstrak daun kumis kucing pada tiap mencit kelompok II, III dan IV
secara oral menurut dosis yang ditentukan selama 28 hari.
3. Setelah 28 hari, perlakuan dihentikan.
4. 5 mencit dari tiap kelompok dinarkosis dengan kloroform.
26

5. Dilakukan laparotomi, diambil ginjal untuk dibuat sediaan mikroskopis.
Pembuatan sediaan mikroskopis dengan metode paraffin dan pewarnaan
Hematoxylin Eosin. Hematoxylin mempunyai sifat pewarna basa, yaitu
memulas unsur jaringan yang basofilik, eosin memulas unsur jaringan yang
bersifat asidofilik (Junqueira, 2007).
6. Sampel ginjal ini di fiksasi dengan formalin 10%, untuk pembuatan sediaan
mikroskopis jaringan ginjal dilaboratorium BPPV.
7. Metode teknik histopatologi adalah menurut (Triwibowo, Angga Wahyu,
2011) :
1) Fixation
a) Menfiksasi spesimen berupa potongan organ ginjal yang telah dipilih
segera dengan larutan pengawet formalin 10%.
b) Mencuci dengan air mengalir.
2) Trimming
a) Mengecilkan organ 3 mm.
b) Memasukkan potongan organ ginjal tersebut ke dalam embedding
cassette.
3) Dehidrasi
a) Menuntaskan air dengan meletakkan embedding cassette pada kertas
tisu.
b) Berturut-turut melakukan perendaman organ ginjal dalam alkohol
bertingkat 80% dan 95% masing-masing selama 2 jam. Selanjutnya
dilakukan perendaman alkohol 95%, absolut I, II, III selama 1 jam.
4) Clearing
Untuk membersihkan sisa alkohol, dilakukan clearing dengan xilol I, II, III
masing-masing selama 1 jam.
5) Impregnasi
Impregnasi dengan menggunakan paraffin I, II, III masing-masing selama 2
jam.
6) Embedding
a) Membersihkan sisa paraffin yang ada pada pan dengan memanaskan
beberapa saat diatas api dan usap dengan kapas.
27

b) Menyiapkan paraffin cair dengan memasukkan paraffin ke dalam
cangkir logam dan memasukkan dalam oven dengan suhu diatas 58
0
C.
c) Menuangkan paraffin cair dalam pan.
d) Memindahkan satu persatu dari embedding cassette ke dasar pan
dengan mengatur jarak satu dengan yang lainnya.
e) Memasukkan pan dalam air.
f) Melepaskan paraffin yang berisi potongan ginjal dari pan dengan
memasukkan ke dalam suhu 4-6
0
C beberapa saat.
g) Memotong paraffin sesuai dengan letak jaringan yang ada dengan
menggunakan scalpel/pisau hangat.
h) Meletakkan pada balok kayu, ratakan pinggirnya dan buat ujungnya
sedikit meruncing.
i) Memblok paraffin siap dipotong dengan mikrotom.
7) Cutting
a) Melakukan pemotongan pada ruangan dingin.
b) Sebelum memotong, mendinginkan blok terlebih dahulu.
c) Melakukan pemotongan kasar, dilanjutkan dengan pemotongan halus
dengan ketebalan 4-5 mikron.
d) Memilih lembaran potongan yang paling baik, mengapungkan pada air
dan menghilangkan kerutannya dengan cara menekan salah satu sisi
lembaran jaringan tersebut dengan ujung jarum dan sisi yan lain ditarik
menggunakan kuas runcing.
e) Memindahkan lembaran jaringan ke dalam water bath selama beberapa
detik sampai mengembang sempurna.
f) Dengan gerakan menyendok mengambil lembaran jaringan tersebut
dengan slide bersih dan menempatkan di tengah atau pada sepertiga
atas atau bawah, mencegah jangan sampai ada gelembung udara di
bawah jaringan.
g) Menempatkan slide yang berisi jaringan pada inkubator (suhu 37
0
C)
selama 24 jam sampai jaringan melekat sempurna.
8) Staining (pewarnaan) dengan Harris Hematoxylin Eosin
28

Setelah jaringan melekat sempurna pada slide, memilih slide yang terbaik
selanjutnya secara berurutan memasukkan ke dalam zat kimia di bawah ini
dengan waktu sebagai berikut.
Untuk pewarnaan, zat kimia yang pertama digunakan xilol I, II, III
masing-masing selama 5 menit. Kedua zat kimia yang digunakan alkohol
absolut I, II, III masing-masing selama 5 menit. Zat kimia yang ketiga
aquadest selama 1 menit. Keempat, potongan organ di masukkan dalam zat
warna Harris Hematoxylin selama 20 menit.
Kemudian memasukkan potongan organ ginjal dalam aquades selama 1
menit dengan sedikit menggoyang-goyangkan organ. Keenam,
mencelupkan organ dalam asam alkohol 2-3 celupan. Ketujuh, dibersihkan
dalam aquades bertingkat masing-masing 1 menit dan 15 menit.
Kedelapan, memasukkan potongan organ dalam eosin selama 2 menit.
Kesembilan, secara berurutan memasukkan potongan organ dalam alkohol
96% selama 2 menit, Alkohol 96%, alkohol absolut III dan IV masing-
masing selama 3 menit. Terakhir, memasukkan dalam xilol IV dan V
masing-masing 5 menit.
9) Mounting
Setelah pewarnaan selesai menempatkan slide diatas kertas tisu pada
tempat datar, menetesi dengan bahan mounting yaitu kanada balsam dan
tutup dengan cover glass cegah jangan sampai terbentuk gelembung udara.
10) Membaca slide dengan mikroskop
Slide diperiksa dibawah mikroskop sinar dengan pembesaran 100X, 200X
atau 400X.