Isolasi dan
Dosen :
Dr. Tiah Rachmatiah, M.si ,Apt
Disusun oleh :
Galuh Putera Sudewo
(12330026)
(12330029)
Lucy Dahlia A
(12330036)
Mulia Ratna F
(12330040)
KATA PENGANTAR
Segala puji dan syukur penulis panjatkan atas kehadirat dan limpahan rahmat dari
Allah S.W.T. sehingga tugas makalah FITOKIMIA tentang isolasi Alkaoida Indol yang
ditugaskan oleh Ibu Dr. Tiah Rachmatiah, M.si, Apt. dapat terselesiakan. Tugas ini diambil
dari jurnal Pharmacologia 3 (7) : 204-214, 2012, Volume 3 terbitan 7, 2012, ISSN 20444648 / DOI: 10.5567/ pharmacologia.2012.204.214, 2012 Science Reuters, UK yang
berjudul Isolasi dan Penjelasan Struktur Alkaloid indol baru, Erinidine dari
biji
Hunteria umbellata di teliti oleh 1,2Adeneye A. Adejuwon, 2Crooks A. Peter, 3Miller AnneFrances,
Goodman Jack,
Lagos State, Ikeja, Lagos, Nigeria, 2Departement ilmu farmasi, divisi penemuan obat,
fakultas farmasi, Universitas Kentucky, lexington, KY 40536, amerika serikat, 3Fasilitas
Nuclear Magnetic Resonance, Departement kimia, fakultas seni dan ilmu pengetahuan,
Universitas Kentucky, Lexington, KY 40506, amerika serikat, 4Fasilitas spektometri massa
Universitas Kentucky, Gedung ilmu pengetahuan dan teknologi pusat komersialisasi A048
(ASTeCC), Lexington, KY 40506, Amerika serikat, 5Departement farmakologi, Fakultas ilmu
kedokteran dasar, fakultas kedokteran universitas Lagos State, Idi-Araba, Lagos, Nigeria.
Kami menyadari bahwa dalam tugas makalah ini masih terdapat kekurangan, karena
itu kami mengharapkan kritik dan saran yang membangun. Akhir kata penulis berharap
semoga ini dapat memberikan manfaat.
Penyusun
Isolasi dan Penjelasan Struktur Alkaloid indol baru, Erinidine dari biji
Hunteria umbellata
1,2
Fasilitas Nuclear Magnetic Resonance, Departement kimia, fakultas seni dan ilmu
ABSTRAK
Latar Belakang: Penelitian ini melaporkan tentang isolasi dan penjelasan struktural dari
alkaloid bisindole baru, erinidine, diisolasi dari ekstrak biji air Hunteria umbellata (K.
Schum.) Hallier f. (Apocynaceae). Bahan dan Metode: Struktur mutlak erinidine ditentukan
oleh kombinasi dari kromatografi, spectrography massa, Nuklir Magnetic Resonance (NMR),
spektroskopi dan metode komputasi dan dapat dilihat dalam hubungan atropisomeric dengan
erinicine dan erinine yang telah sebelumnya telah diisolasi. Analisis unsur dan spektrometri
massa untuk membentuk rumus molekul untuk senyawa baru erinidine, dilakukan selain
menjelaskan struktur yang didirikan oleh studi spektral. Penempatan konfigurasi yang
dilakukan oleh peneliti dipengaruhi oleh perputaran pasangan yang hilang dari erinidine.
Hasil: Analisis unsur dan spektrometri massa membentuk rumus molekul C22H26O4N2 untuk
erinidine dengan max dari 256 nm dan titik lebur 230C. Senyawa yang baru diisolasi,
erinidine memiliki struktur yang dijelaskan atas dasar data spektroskopi dan korelasi kimia
1
yang diperoleh. Kesimpulan: Penelitian ini melaporkan isolasi dan penentuan struktur
alkaloid bisindole baru yaitu erinidine dari ekstrak biji air Hunteria umbellata yang berkaitan
erat dengan erinine dan sebelumnya congener telah diisolasi dari ekstrak daun tanaman yang
sama.
Kata kunci: biji Hunteria umbellata, NMR, analisis unsur, studi spektral, erinidine.
PENDAHULUAN
Hunteria umbellata (K. Schum.) Hallier f. (Keluarga: Apocynaceae) adalah pohon
yang terdapat di hutan hujan tropis yang terkenal untuk manajemen lokal berbagai penyakit
manusia termasuk diabetes mellitus dan obesitas (Adegoke dan Alo, 1986; Falodun et al,
2006; Adeneye dan Adeyemi, 2009a.). Di Prancis, ini dikenal sebagai Demouain (Boone
2006) sementara di Yoruba (suku lokal di barat daya Nigeria) ini dikenal sebagai "Abeere"
(Falodun et al, 2006; Ibeh et al, 2007; Adeneye dan Adeyemi, 2009a). Di suku Yoruba ( Barat
daya Nigeria), infus air dari biji kering Hunteria umbellata sangat bernilai tinggi dalam
penanganan diabetes dan obesitas (Adegoke dan Alo, 1986; Adeneye dan Adeyemi, 2009a;
Igbe et al, 2009.). Pengobatan oral dengan 50, 100 dan 200 mg kg -1 dari ekstrak biji air
tanaman telah dilaporkan secara efektif mengontrol glukosa darah dan kadar hemoglobin
glikosilasi normal, dengan tikus Wistar diabetes tipe 1 dan 2 yang diperantarai melalui
glukosa usus dapat menghambat penyerapan, penghambatan adrenergik dan peningkatan
resistensi insulin (Adeneye dan Adeyemi, 2009a, b;. Igbe et al, 2009). Ekstrak airnya juga
dilaporkan memiliki anti-obesitas dan efek anti hyperlipidemia dalam eksperiment
hiperlipidemia yang diperantarai melalui penghambatan biosintesis de novo dari kolesterol
dan trigliserida (Adeneye et al., 2010a). Selain itu, studi Toksisitas oral akut dan kronis telah
menunjukkan air dari ekstrak biji tanaman menjadi relatif aman (Ibeh et al, 2007; Adeneye et
al, 2010b).
Bevan et al. (1967) dan Adegoke dan Alo (1986) melaporkan bahwa biji Hunteria
umbellata kaya alkaloid indol yaitu corymine, acetylcorymine, dehydroisocorymine dan
isocorymine yang telah diisolasi. Pada tahun 1960, banyak upaya penelitian mempelajari
alkaloid indol dari ekstrak daun Hunteria umbellata dan ini terdiri dari erinin, erinincin
(Bycroft et al., 1965), isocorymine (Bevan et al., 1967) dan eripine (Morita et al., 1968) dan
umbellamine dari kulit akar (Morita et al., 1968). Kepentingan penelitian lebih lanjut dalam
Hunteria umbellata tidak diperpanjang sampai tahun 1986 ketika Adegoke dan Alo
mengisolasi empat larutan alkaloid indol dari ekstrak etanol biji tanaman. . Alkaloid ini
bernama abereamine 8,11-dihidroksi-14-isopropil-22-deoxy isocorymine, 11-hidroksi-14-
isopropil-22-deoxy isocorymine, 21-hidroksi-14-isopropyl isocorymine dan 11,21-dihidroksi14 -isopropyl-22-deoxy isocorymine. Namun, bertentangan dengan Hunteria umbellata,
upaya penelitian besar telah disalurkan ke dalam isolasi alkaloid indol baru dari Hunteria
zeylenica yang mungkin tampaknya terjadi karena distribusi geografis yang lebih luas dan
aplikasi obat yang terakhir. Kebanyakan alkaloid indol terbaru yang diisolasi dari daun
Hunteria zeylenica ( terkait dekat dengan Hunteria umbellata) adalah bisnicalaterine A (terdiri
dari dua tipe kerangka vobasine) 3-epivobasinol dan 3-O-methylepivobasinol (keduanya
dengan tipe kerangka vobasine) (Nugroho et al., 2009).
Meskipun laporan tentang aplikasi obat dari berbagai bagian Hunteria umbellata
dalam berbagai pengobatan penyakit manusia dan hewan, masih ada kurangnya laporan
tentang isolasi dan penentuan struktur aktif dari phytoconstituent (s) di pabrik, terutama
berkaitan dengan penerapan ekstrak biji dalam pengelolaan diabetes yang bernilai tinggi. Hal
ini menentang latar belakang ini bahwa penelitian ini dirancang dengan pandangan
kemungkinan isolasi dan struktural menentukan senyawa baru dari ekstrak biji air mentah
dari tanaman.
Corporation, kota Kansas, MO., USA) untuk memberikan warna cokelat tua, residu halus
yang harum. Prosedur ini untuk 6 kali dan residu dikumpulkan dalam wadah yang tahan
terhadap air dan uadara dan disimpan di lemari es untuk mencegah pembusukan ekstrak.
Prosedur Isolasi: Sepuluh gram ekstrak biji air Hunteria umbellata (HU) dalam 10 ml air
suling (pH = 4,2) berulang kali dititrasi dengan 50 mL larutan HCl encer 5% (Sigma-Aldrich
Inc, St. Louis, MO, USA .) untuk mengasamkan menjadi pH 2. Larutan
yang asam
diekstraksi dengan etil asetat (150 ml x 3) untuk menghapus senyawa netral (HU n) dalam
larutan mengasamkan HU. Larutan asam HU kemudian dengan hati-hati dibasakan dengan
natrium bikarbonat (Na2CO3) 5% (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO, USA) sehingga
menjadi pH 10. Dengan menggunakan corong pisah berukuran 5 L, campuran berulang kali
diekstrak dengan porsi kecil dengan etil asetat (150 ml x 3) (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis,
MO, USA.) sampai ekstrak terakhir adalah tidak berwarna dan larutan dasar memberi tes
negatif dengan pereaksi (Draggendroff) untuk mendeteksi alkaloid ini. Ekstrak etil asetat
yang diperoleh diuapkan hingga kering menggunakan rotary evaporator ditambah dengan air
(BUCHI Rotavapor Model R-215, BUCHI Labortechnick AG, Flawil, Swiss) yang telah
ditetapkan pada 40 C untuk memberikan fraksi alkaloid (Huaf) (sebuah residu padat kuningcoklat ) dengan berat 0,81 g (hasil: 8,10%). Larutan HUn juga harus benar-benar kering baik
menggunakan prosedur ini sama seperti HU Af memberikan warna cokelat dan serbuk halus
dengan berat 0,378 g (hasil: 3,78%). Prosedur ini diulang lima kali. HU n dan HUAf secara
terpisah dikumpulkan ke dalam wadah yang tertutup rapat dan disimpan di lemari es sampai
diperlukan untuk percobaan.
Tiga ratus lima puluh miligram HUAf dimurnikan dalam kolom silika gel flash
menjadi 40 fraksi menggunakan DCM (Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO., USA) dan MeOH
(Sigma-Aldrich Inc, St. Louis, MO , USA) sistem pelarut (5: 1). Fraksi 16-25 dengan pola
kromatografi yang sama dikumpulkan dan benar-benar dikeringkan dalam kondisi vakum
menggunakan rotor evaporator, menghasilkan bubuk kuning pucat. Prosedur ini diulang
selama 5 kali lebih.
Titik leleh atau isolasi dimurnikan dari fraksi atau isolasi ditetapkan dengan
menggunakan titik pelelehan Fisher-Johns Aparatus ( Thermo Fisher Ilmiah , Park Lane
Drive , Pittsburgh , Amerika Serikat ) sedangkan penentuan gabungan unsurnya dilakukan
pada ESIMS dan HRMS. Resolusi yang tinggi yaitu elektron dampak ( EI ) ionisasi spektrum
massa telah mencatat angka 25 eV JEOL JMS-700T MSstation ( pada sebuah magnet di
sektor alat resolusi yang lebih besar dari 10000) .Sampel yang diperkenalkan melalui
penyelidikan secara inlet langsung dan pemanas perfluorokerosene (PKF) referensi itu
digunakan untuk menghasilkan massa.
Penentuan struktur dan pemurnian: Pemurnian dan karakerisasi penuh dan penentuan
struktur fraksi murni dilakukan dengan menggunakan 1H-NMR, 13C-NMR, IR, spektrometer
UV, LC-MS, HRMS, 2D-NMR, HSQC, TOCSY, NOESY dan COSY spektrofotometri.
Senyawa dimurnikan dari 20 mg HU1625, dikeringkan dan kemudian kembali dilarutkan
dalam kloroform deuterasi kering (Cambridge Isotop Labs DLM-7). 1H spektrum NMR
dikumpulkan pada 600 MHZ untuk 1H pada spektrometer Varian-Agilent Inova dilengkapi
dengan 5 mm bioprobe pada 30 C. Spektrum 13C dikumpulkan pada 100 MHZ untuk 13C
pada Varian-Agilent Inova Spektrometer dilengkapi dengan 5 mm penyelidikan ASW
(switchable otomatis) pada 30C dan 9 kHz pasangan 1H. Data diolah dan dianalisis
menggunakan VnmrJ versi 2.2 D yang disediakan oleh Agilent dan dirujuk ke resonansi
pelarut sisa pada 7.23 ppm 1H dan 77,23 ppm
13
standar yang diberikan oleh pembuat instrumen yang digunakan untuk semua percobaan. 13C
spektrum diproses dengan 0,15-0,18 s Gaussian sebelum Fourier transformasi. NOESY,
TOCSY dan spektrum COSY bekerja pada lebar spektrum 4888 Hz di kedua dimensi
diperoleh melalui perolehan 0,3 detik di F 2 dan 400, 400 atau 700 bertahap di F 1, masingmasing. Spectrum NOESY yang digunakan memerlukan waktu pencampuran 800 m detik
untuk relaksasi silang, kenaikan per 16 scan dan penundaan 5,2 detik antara scan (nilai T 1
berkisar hingga 1,8 detik). Itu diproses dengan 0,3 detik bergeser sinus-bell di F 2 dan dua kali
lipat di F1 dengan prediksi linear sebelum apodisasi dengan 0,133 detik Gaussian dan
kemudian transformasi Fourier untuk poin 8x4 K di F2XF1.
Spektrum TOCSY dapat memutar
pemulihan pemindaian dan 2 scan per kenaikan. Itu diproses dengan 0,3 detik bergeser sinusbell di F2 dan dua kali lipat di F1 dengan prediksi linear sebelum apodisasi dengan 0,075 detik
Gaussian dan kemudian transformasi Fourier untuk poin 8x2 K di F 2XF1. dqfCOSY
dikumpulkan dengan 2 scan per increment dan penundaan 1,8 detik antara scan. Spektrum ini
diproses dengan 0,15 detik sinus-bell di F 2. Dimensi langsung diperpanjang oleh prediksi
linear dan kemudian dikalikan dengan 25 derajat-bergeser bell sinus sebelum Fourier
transformasi poin 8x4 K di F2XF1. ctHSQC menghasilkan 1JHC pasangan konstan 140 Hz dan
lebar sapuan 25.633 Hz dalam dimensi 13C didigitalkan oleh 400 poin kompleks di F 1 dengan
waktu perolehan 0,15 detik, 16 scan per increment dan penundaan 1,4 detik antara scan.
Dimensi F2 diproses dengan 0,44 detik. Jangka panjang pasangan 1H-13C yang terdeteksi
5
melalui urutan CIGAR dengan penekanan pasangan ikatan tunggal dengan 1JHC mulai 130165 Hz dan dioptimalkan untuk deteksi nJHC = 8 Hz pasangan. Dimensi 1H diperoleh di 0,3
detik dan apodized menggunakan unshifted 0,104 kuadrat bell sinus sebelum transformasi
Fourier. Dimensi 13C adalah lebarnya 36.199 Hz dan didigitalkan bertahap menjadi 400. Ini
dua kali lipat dengan prediksi linier sebelum apodisasi menggunakan 0,15 detik Gaussian dan
kemudian transformasi Fourier untuk menghasilkan poin 4x4 K di F2XF1
H, daerah yang terintegrasi dari resonansi lain konsisten dengan 12 resonansi tunggal H
(salah satunya tumpang tindih dekat metil 1,5 ppm) 3 band resonansi metil. Resonansi 1H
dikaitkan dengan pasangan germinal vs posisi C bantalan 1 atau 3 1H melalui konstan-waktu
heteronuklir tunggal kuantum koherensi spektrum (ct-HSQC) yang juga berfungsi untuk
mengahubungkan frekuensi resonansi 1H dengan 13C.
.
Gambar 1: Spektru Infared (IR) fraksi 16-25 dari alkaloida biji Hunteria umbellata
menunjukkan Vmax di 3273, 2910,2872 dan 1734 cm-1.
Gambar 2: Spektrum massa penuh fraksi 16-25 dari alkalioda biji Hunteria umbella.
Semua 1H terlihat di 1H 1D juga terlihat di ct-HSQC menunjukkan bahwa tidak ada
yang diamati 1H terikat untuk O atau N. ct-HSQC (Gbr. 5) mengungkapkan bahwa selain tiga
puncak metil diidentifikasi di 1H 1D berdasarkan intensitas mereka (kontur oranye di ctHSQC), senyawa ini juga mengandung 6 situs di mana H melekat ke C.
Tabel 1: Pergeseran kimia 1H1 dan 13C dan ketetapan pasanagn-J erinidine dalam
deuterated kloroform pada suhu 30C.
.
Gambar. 3: 1H 1D spektrum di deuterasi kloroform. Skala vertikal dipilih untuk menunjukkan
struktur dari puncak lebih pendek tetapi memotong puncak metil yang tinggi dekat 3,75, 2,8
dan 1,5 ppm
Tiga aromatik (antara 6,4 dan 6,7 ppm), satu adalah olefin (dekat 5,5 ppm) dan dua
lainnya muncul di dekat 4,2 dan 3,5 ppm sebagai kontur oranye (Gbr. 5). Lima pasang
germinal yang jelas sebagai pasangan resonansi biru dengan dua 1H pergeseran kimia per
shift 13C kimia (Gbr. 5).
13
C pada spektrum dan analisis DEPT (Gbr. 4) setuju dengan ct-HSQC dan
penambahan menampakkan karboksil C (171 ppm) dan tujuh kuaterner Cs termasuk tiga
8
aromatik kuaterner dan satu resonansi luas dekat 137 ppm. Resonansi 13C lebih luas di 120,6
ppm melekat pada H. Olefin
Melalui obligasi konektivitas antara 1H yang teridentifikasi melalui dua kuantum yang
disaring Cosy (dqf-Cosy) dan spektrum TOCSY (Gbr. 5), menghasilkan 3 fragmen struktur ac di samping sebuah pasangan germinal yang sudah diisolasi dan dua kelompok metil yang
terisolasi (df) ( Skema 1,2). Sebuah sistem memutar aromatik yang mencakup dua 1H
berdekatan satu sama lain (J= 8,4Hz) dan 1H ketiga dipisahkan dari dua bentuk (J= 2,5Hz
untuk satu) (Skema 1,Gambar. 6).
Gbr.4: Spektrum 13C (hitam) dan sub-spektrum yang dihasilkan oleh analisi DEPT
memperlihatkan 13C melekat pada tiga 1H (merah), dua 1H (biru), satu 1H (hijau) atau tidak
ada 1H (kuning).
Gambar. 5: Korelasi homonuclear digunakan mengambil kesimpulan struktur. Kiri: dqfCOSY, kanan bawah: TOCSY 80 msec. dqf-Cosy dijelaskan dengan garis putus-putus
menunjukkan konektivitas antara 1H pada posisi C yang berbeda dan garis putus-putus
menghubungkan resonansi dari 1H terikat pada karbon yang sama.
10
Skema 1 (a-c): Struktur parsial a, b dan c disimpulkan dari korelasi homonuclear. Tanda
panah menunjukkan konektvitas iikatan yang diberi kode warna untuk memudahkan lokasi
yang sesuai lintas puncak di (Gbr. 5). Posisi 1H diberi label menunjukan pergeseran kimia
dari resonansi NMR yang sesuai.
Perpanjanagan sistemyang memutar b dapat dilihat dan ditelusuri dalam dqf-Cosy dengan
garis putus-putus berjalan dari merah melalui biru ke hijau, pada Gambar. 5 dan Skema 1.
Berdasarkan senyawa asal dari Hunteria, komposisi unsurnya dari C 22H26N2O4 dan
sistem yang diputar oleh NMR, senyawa ini tampaknya berkaitan erat dengan erinine dan 19,
20-dihydroerinin (erinicine) (Skema 2) (Bycroft et al., 1965). Dimulai dengan unit bis-indol
(3 cincin pentasiklik yang tersubtitusi) sebagai titik awal dan menggunakan obligasi pasangan
ganda yang ditunjukkan oleh spektrum CIGAR untuk membangun konektivitas antara 1Hs
dalam sistem satu spin dan
13
sistem spin seperti yang ditunjukkan dalam Skema 2. Jarak konektivitas dari 1H di 2.90 ppm
tetap tergantung pada penyelidikan lebih lanjut tetapi sebaliknya struktur yang diusulkan
dapat menampung semua konektivitas ke Kuarter Cs maupun yang ke Cs spin lainnya
(Skema 3). Konektivitas ikatan ganda antara metil pada 2,75 ppm dan aromatik C
menunjukkan bahwa metil ini berdekatan dengan cincin aromatik.
11
Skema 2 (a-f): Konektivitas yang diungkapkan oleh HMBC (CIGAR) seperti konektivitas
satunya antara sistem yang diputar dan Kuarter Cs.
Sementara itu mungkin terlihat bahwa metil yang dekat dengan cincin aromatik
seharusnya memiliki pergeseran kimia lebih besar dari dua gugus metil terisolasi ( 1H = 3,79
13
C = 52,32 vs
H = 2.75
13
12
menyimpang dari nilai-nilai yang dihitung berdasarkan struktur kami dengan lebih
dari dua kali lipat perbedaan rata-ratanya.
Hal ini menunjukkan salah satu reganagan pada posisi ini keliru dari konfigurasi
cincin 6-anggota. Hal ini juga bisa mencerminkan fakta bahwa perhitungan kami
mengasumsikan hanya satu dari dua kemungkinan orientasi tentang ikatan rangkap. Juga,
perhitungan pergeseran kimia atau korelasi pergeseran kimia yang diamati dan dihitung
menunjukkan bahwa dinamika kehidupan waktu senyawa pendek di CDCl3, pada skala hari
di 30 C.
Dalam menentukan struktur untuk senyawa baru, perbandingan yang ditarik antara
spektrum massa erinidine dan erinine dan 19, 20 dihydroerinine (erinicine) seperti yang
sebelumnya dijelaskan oleh Bevan et al. (1967) dan Heatley et al. (1981). Meskipun, alkaloid
diisolasi dari bagian yang berbeda dari tanaman yang sama, perbandingan ini menegaskan
bahwa erinidine memang memiliki tipe struktur dihydroerinine kecuali untuk posisi dari -OH
yang di erinidine terletak pada 10C (Skema 4,Gambar. 8) . Selain itu, meskipun senyawa
erinidine mempunyai karakteristik yang sama \seperti unsur kami dengan rumus (C 22H26O4N2)
dan berat molekul (382) dengan erinicine tetapi max (256 vs 255 nm), titik leleh (230 vs 210
C), sumber ( biji vs daun) sangat berbeda, menunjukkan perbedaan yang halus/ tajam dalam
dua senyawa.
13
Skema 3 (a-b): Jarak konektivitas diamati pada spektrum NOESY (waktu pencampuran 800
msec).
Skema 4: Struktur yang diusulkan dan nomenklatur posisi nomor erinidine ditunjukkan
berdasarkan nomenklatur erinine dan erinicine seperti dilaporkan oleh Heatley et al. (1981)
14
Gambar 8: Tiga dimensi gambaran dari stuktur yang diusulkan dari erinidin.
Kesimpulannya, penelitian ini melaporkan isolasi dan penjelasan struktural dari alkaloid
indol baru, erinidine dari ekstrak biji air Hunteria umbellata yang secara struktural berkaitan
dengan einine dan erinicine.
REFERENSI
Adegoke, E.A. and B. Alo, 1986. Abere-amines: Larutan biji alkaloid dari Hunteria
(K. Schum.) Hallier f. in rodents. Afr. J. Trad., Complement. Altern. Med., 7: 350-369
Bevan, C.W., M.B. Patel and A.H. Rees, 1967. The seed alkaloids of Hunteria
umbellata. Tetrahedron, 23: 3809-3821
15
Boone, M.J., 2006. Hunteria umbellata (K.Schum.) Hallier f. In: Prota 11: Medicinal
Plants/Plantes Medicinales, Schmelzer, G.H. and A. Gurib-Fakim (Eds.). Plant
isocorymine, erinine, erinicine and eripine. J. Chem. Soc. (Perkin) Trans., 2: 725-729
Ibeh, I.N., M. Idu and I.M. Ejimadu, 2007. Toxicological assessment of Abeere seed
16
LAMPIRAN
17