Anda di halaman 1dari 22

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

KULTUR EMBRIO & EMBRIO RESQUE

Disusun Oleh:
Nama

: Frelyta A. Z.

NIM

: 115040201111290

Kelompok

: Selasa, 06.00

Asisten

: Dita Pahlevi

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI


FAKULTAS PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2012

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Persilangan buatan lebih berhasil apabila dilakukan
antartanaman yang masih berkerabat dekat. Proses
penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah
persilangan buatan dijumpai permasalahan yaitu buah yang
gugur saat embrio belum matang, sehingga terbentuk buah
dengan endoserm yang kecil atau embrio yang kecil. Embrio
tersebut sering kalitidak dapt berkecambah secara normal pada
kondisi normal.
Untuk mengatasi hal tersebut maka embrio dapat
diselamatkan dan ditanam dengan teknik secara aseptis dalam
media buatan sehingga dapat berkecambah dan menghasilkan
tanaman utuh. Teknk tersebut dikenal sebagi embrio rescue.
1.2 Tujuan
untuk mengetahui morfologi morfologi biji kacang
tanah dan biji anggrek
untuk mengetahu kondisi optimum untuk tumbuh pada
kedua biji tersebut
untuk mengetahui teknik klutur embrio pada biji
kacang hijau dan embrio rescue pada biji anggrek
untuk mengetahui contoh aplikasi kultur embrio
untuk mengetahui faktor yang mempengaruhi pada
keberhasilan kultur embrio dan embrio rescue
1.3 Manfaat
mahasiswa mampu melaksanakan teknik aplikasi kultur
embrio dan embrio rescue.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Morfologi Kacang Tanah dan Anggrek
2.1.1 Morfologi Kacang tanah
a. Akar
Perakaran tanaman kacang tanah terdiri atas akar
lembaga (radicula), akar tunggang (radix primaria), dan akar
cabang (rudix lateralis). Pertumbuhan akar menyebar ke
semua arah sedalam lebih kurang 30 cm dari permukaan tanah.
Akar berfungsi sebagai organ pengisap unsur hara dan air
untuk pertumbuhan tanaman. Namun, fungsi tersebut dapat
terganggu bila tanah beraerasi jelek, kadar airnya kurang,
kandungan senyawa Al dan Mn tinggi, serta derajat keasaman
(pH) tanah tinggi.
Akar tanaman kacang tanah bersimbiosis dengan
bakteri Rhizobium radicicola. Bakteri ini terdapat pada bintil bintil akar tanaman kacang tanah dan hidup bersimbiosis
saling menguntungkan. Tanaman kacang tanah tidak dapat
menambat nitrogen bebas dari udara tanpa bakteri rhizobium.
Sebaliknya, bakteri rhizobium tidak dapat mengikat nitrogen
tanpa bantuan tanaman kacang tanah. Pada bintil-bintil akar
terdapat unsur nitrogen yang berguna untuk pertumbuhan
tanaman dan ketersediaan unsur N dalam tanah.
b. Batang
Batang tanaman kacang tanah berukuran pendek,
berbuku-buku, dengan tipe pertumbuhan tegak atau mendatar.
Pada mulanya batang tumbuh tunggal. Namun, lambat laun
bercabang banyak seolah-olah merumpun. Panjang batang
berkisar antara 30 cm 50 cm atau lebih, tergantung jenis
atau varietas kacang tanah dan kesuburan tanah.

Buku-buku (ruas-ruas) batang yang terletak di dalam


tanah merupakan tempat melekat akar, bunga, dan buah. Ruasruas batang yang berada di atas permukaan tanah merupakan
tempat tumbuh tangkai daun.
c. Daun
Daun berbentuk lonjong, terletak berpasangan
(majemuk), dan bersirip genap. Tiap tangkai daun terdiri atas
empat helai anak daun. Daun muda berwarna hijau
kekuningan, setelah tua menjadi hijau tua. Daun-daun tua akan
menguning dan berguguran mulai dari bawah ke atas
bersamaan dengan stadium polong tua.
Helaian daun bersifat
nititronic, yakni mampu
menyerap cahaya matahari sebanyak-banyaknya. Permukaan
daunnya memiliki bulu yang berfungsi sebagai penahan atau
penyimpan debu.
d. Bunga
Bunga tanaman kacang tanah berbentuk kupu-kupu,
berwarna kuning, dan bertangkai panjang yang tumbuh dari
ketiak daun. Fase berbunga biasanya berlangsung setelah
tanaman berumur 4 6 minggu. Bunga kacang tanah
menyerbuk sendiri pada malam hari. Dari semua bunga yang
tumbuh, hanya 70% - 75% yang membentuk bakal polong.
Bunga mekar selama sekitar 24 jam, kemudian layu, dan
gugur. Ujung tangkai bunga akan berubah bentuk menjadi
bakal polong, tumbuh membengkok ke bawah, memanjang
dan masuk ke dalam tanah.
e. Buah
Buah kacang tanah berbentuk polong dan dibentuk di
dalam tanah. Polong kacang tanah berkulit keras, dan
berwarna putih biji anggrek kecokelat-cokelatan. Tiap polong
berisi satu sampai tiga biji atau lebih. Ukuran polong
bervariasi, tergantung jenis atau varietasnya dan tingkat

kesuburan tanah. Polong berukuran besar biasanya mencapai


panjang 6 cm dengan diameter 1,5 cm.
f. Biji
Biji kacang tanah berbentuk agak bulat sampai
lonjong, terbungkus kulit biji tipis berwarna putih, merah, atau
ungu. Inti biji terdiri atas lembaga (embrio), dan putih telur
(albumen). Biji kacang tanah yang berkeping dua juga
merupakan alat perbanyakan tanaman dan bahan makanan.
Ukuran biji kacang tanah bervariasi, mulai dari kecil sampai
besar. Biji kecil beratnya antara 250 g 400 g per 1000 butir,
sedangkan biji besar lebih kurang 500 g per 1000 butir.
(Rukmana, 1998)
2.1.2 Morfologi Biji Anggrek
Buah anggrek terbentuk kapsul berwarna hijau dan
jika masak mengering dan terbuka dari samping. Bijinya
sangat kecil dan ringan. Sehingga mudah terbawa angin. Biji
anggrek tidak memiliki jaringan penyimpan cadangan
(endosperm) seperti biji lainnya pada umumnya (Anonymousa,
2012).
2.2 Kondisi Optimum Untuk Tumbuh
Berikut kriteria kondisi optimum untuk pertumbuhan
kedua biji tersebut:

Karbohidrat

Unsur karbohidrat yang dibutuhkan dalam perkecambahan


bisanya ialah gula sederhana golongan oligosakarida dan
yang umum digunkan dlam medium buatan yaitu sukrosa
dan fruktosa. Biasanya digunkan biji sebagai nutrisi
penyimpan cadangan makanan.

Nitrogen

Senyawa ammonia nitrat dan urea dalam perkecambahan


biji digunakan sebagai bahan utama pembentukan sel-sel
tumbuhan.

Mineral

Unsur-unsur seperti K, Mg, Ca dan P adalah mineral yang


dibutuhkan dalam jumlah banyak dan digunakan dalam
bentuk senyawa kompleks. Kadar dalam medium terlalu
pekat akan menjadi racun bagi biji. Kadar unsure-unsur
tersebut dianjurkan 40 mg/L.

Penyinaran

Intensitas yang dibutuhkan antara 400-300 lux. Sinar yang


digunakan dapat bersumber dari cahaya matahari difusi,
lampu neon dan lampu cool white. Namun yang paling
sering digunakan adalah lampu neon putih 40 watt
diletakkan 1,5 m dari rak tempat botol kultur.

Suhu

Temperatur optimal perkecambahan antara 20-25oC. suhu


yang terlalu tinggi akan menyebabkan kelayuan karena
penguapan terlalu besar dan jika suhu terlalu rendah akan
menghambat pertumbuahan.

pH

kelembapan yang dibutuhkan pada media tanam berkisar


antara 4,8-5,2 dengan toleransi berkisar antara 3,6-7,6.
Perlu diketahui selama pertumbuhan tunas anggrek
keasaman media mengalami perubahan.

Vitamin dan Hormon

Keduanya dibutuhkan untuk memacu pertumbuhan tunas.


Selain digunkan dalam bentuk senyawa murni, vitamin

dan hormon didapat melalui zat aditif (Anonymousb,


2012).
2.3 Teknik Kultur Embrio dan Embrio Rescue Biji
Anggrek
2.3.1 Teknik Kultur Embrio
Teknik Embryo Culture dan Embryo Rescue pada
dasarnya melibakan 3 tahapan, yaitu:
a. Sterilisasi Eksplan
Embrio pada prinsipnya berada dalam keadaan steril. Hal
ini disebabkan karena embrio berada di dalam buah (di dalam
biji) terlindung oleh jaringan-jaringan buah dan biji yang
berada di luar embrio, antara lain oleh kulit buah, daging buah
dan kulit biji. Keadaan ini menyebabkan sterilisasi embrio
tidak perlu dilakukan.
Sterilisasi permukaan perlu dilakuakn pada buah ataupun
biji untuk mensterilkan permukaan buah/biji sehingga pada
waktu isolasi embrio tidak terdapat sumber kontaminan.
Karena embrio berada di dalam, sterilisasi dapat dilakukan
dengan pembakaran buah/biji atau dengan sterilan kimia
seperti Sodium hypochlorite dengan konsentrasi cukup tinggi
(>2%).
b. Isolasi dan Penanaman Embrio
Seringkali masalah timbul saat isolasi embrio terutama
untuk embrio berukuran kecil sehingga isolasinya harus
dilakukan di bawah mikroskop. Untuk embrio berukuran
besar, isolasi embrio tidak menjadi masalah. Isolasi harus
dilakukan secara hati-hati agar embrio tidak rusak dan
kehilangan salah satu atau lebih bagian -bagiannya (radicula,
plumula, hypocotil, coleoptyl, dll). Selain itu ha rus tetap
dijaga juga agar isolasi dilakukan dalam kondisi tetap aseptis.

Embrio yang telah diisolasi selanjutnya ditanam pada media


yang telah dipersiapkan.
Media untuk pengecambahan embrio cukup sederhana.
Kebutuhan nutrisi di dalam media untuk pengecambahan
embrio juga lebih sederhana dibandingkan dengan media
untuk tujuan teknik kultur yang lain. Pada prinsipnya media
diperlukan untuk menggantikan peranan endosperm dalam
mendukung perkecambahan embrio dan perkembangan bibit
muda mengingat embrio yang ditanam umurnya telah
memiliki radicula dan plumula.
Media yang umum digunakan untuk pengecambahan
embrio adalah media Knudson dan Vacin & Went (untuk
anggrek), media MS dalam konsentrasi garam-garamnya.
Dalam perkecambahan embrio dewasa umumnya vitamin
tidak ditambahkan pada media, namun sumber karbon tetap
diperlukan meskipun dalam konsentrasi yang lebih rendah
(umumnya 20 g/l).
c. Aklimatisasi
Aklimatisasi dilakukan setelah embrio berkecambah dan
diperoleh plantlet yang siap untuk dipindahkan ke lapangan.
Teknik aklimatisasi untuk plantlet hasil regenerasi kultur
embrio pada prinsipnya sama dengan aklimatisasi plantlet
hasil regenerasi dari teknik kultur jaringan lainnya. (Sugito,
2004)
2.3.2 Teknik Embrio Rescue
Buah anggrek merupakan buah ceatera, artinya
pecah ketika matang. Bagian yang membuka biasanya bagian
tengahnya. Biji annggrek tidak dapat berkecambah begitu saja
karena bijinya tidak memiliki cadangan makanan. Biji anggrek
dapat tumbuh di alam jika mendapatkan tambahan makanan
dari sejenis jamur yang hidup dalam akar anggrek dewasa
yang disebut mikoriza.

Sekarang ini sudah dikembangkan teknik menanam


biji anggrek melalui media tanam buatan yang terdiri dari
senyawa-senyawa kimia yang dibutuhkan biji anggrek untuk
berkecamabah. Dengan menggunakan media buatan dapat
meningkatkan persentae keberhasilan perkecambahan secara
alami dari 5-8% menjadi 60-80%
a. penyebaran biji anggrek
Peralatan yang digunakan harus bersih. Sebelum biji
disebar harus disterilkan dengan 10 gr kaporit yang
dilarutkan dalam 10 cc air kemudian disaring. Biji
dimasukkan dalam botol dan dikocok 10 ml air (biji yang
semula kuning menjadi hijau). Kemudian air dibuang dan
diganti aquades dan digoyang berulang kali.
b. Penyemaian biji anggrek
Persiapan botol yang bening agar dapat meneruskan
cahaya yang didapat dan mudah dilihat. Tutup botol
dengan plastic yang diikat kuat denagn karet atau tali.
Persiapkan lemari kaca (enkasi) yang bersih dari jamur
dan bakteri. Pembuatan media menggunakan Krudson C
(NORTHEN) 2 yaitu Ca(NO3), 2H2O: 1 gr J, KH2PO4:
0,25 gr, MgSO4.7H2O: 0,25 gr, MnSO4: 0,0075 gr, agaragar: 15-17,5 gr,, aquades: 1000 cc. pembuatan media
diperlukan pH 5,2. Sterilisasi dengan menggunakan
autoclave 110oC selama 30 menit. Kemudian diletakkan
pada tempat bersih dengan posisi miring, sehingga media
setinggi 1/2-2/3 tinggi botol (dari atas sampai leher) dan
didiamkan 5-7 jam untuk mendapatkan sterilisasi yang
sempurna.
c. pemindahan bibit anggrek
setelah tanaman berumur 9-12 bulan terlihat besar dan
tumbuh besar. Dalam hal ini bibit sudah bias dipindahkan
ke dalam pot pengemasan bediameter 7 cm, 12 cm/16 cm

yang berlubang. Siapkan pecahan genting dan akar pakis


warna coklat, dipotong dengan panjang 30-50 mm
sehingga serabutnya terlepas. Sebelumnya dicuci bersih
dan dikeringanginkan. Akar pakis direndam dahulu dalam
media selama 24 jam yang berupa urea/ZA: 0,5 gr, OS,TS
atau ES:0,25 mg, K2SO4: 0,25 mg, Air: 1000 cc.
pemindahan bibit ke dalam pot dilakukan dengan
mengeluarkan tanaman dibotol dengan memasukkan air
bersih kedalam botol. Dengan kawat bersih dengan
ujungnya seperti huruf U, tanamn dikeluarkan satu per
satu. Setelah keluar tanaman dicuci kaporit 1% kemudian
dengan air brsih, semaian ditanam dalam pot dengan rapat,
apabila terjadi kontaminasi sebaiknya terlebih dahulu
direndam dalam antibiotic selama 10 menit, lalu ditanam
(Anonymousb, 2012).
2.4 Contoh Aplikasi Kultur Embrio
a. Kultur Embrio Muda (Immature Embryo Culture)
Tujuan mengkulturkan embrio muda ini adalah
menanam embrio yang terdapat pada buah muda sebelum buah
tersebut gugur (mencegah kerusakan embrio akibat buah
gugur) sehingga teknik ini disebut sebagai Embryo Rescue
atau penyelamatan embrio. Kondisi seperti ini biasanya
dijumpai pada buah hasil persilangan, di mana absisi buah
kerap kali dijumpai setelah penyerbukan dan pembuahan.
Contohnya pada persilangan anggrek Vanda spathulata di
mana absisi atau gugur buah pada saat buah masih muda yaitu
setelah berumur 3 bulan setelah persilangan pada buah
anggrek. Vanda spp akan mengalami masak penuh setelah
berumur 6 bulan. Apabila buah ini tidak diselamatkan atau
dipetik dan kemudian dikecambahkan, maka tidak akan
diperoleh buah hasil persilangan.
Perkecambahan biji yang masih muda di lapangan
sangat sulit bahkan pada beberapa kasus hampir tidak
mungkin bisa terjadi. Oleh karena itu, buah yang belum tua (2

4 bulan) pada anggrek Vanda tersebut kemudian dipanen


dan dikecambahkan secara in vitro. Budidaya embrio muda
ini lebih sulit dibandingkan dengan budidaya embrio yang
telah dewasa.
b. Kultur Embrio Dewasa (Mature Embryo Culture)
Kultur
embrio
dewasa
dilakuakan
dengan
membudidayakan embrio yang telah dewasa. Embrio ini
diambil dari buah yang telah masak penuh dengan tujuan
merangsang perkecambahan dan menumbuhkan mebrio
tersebut secara in-vitro, contohnya seperti pada kacang tanah.
Teknik kultur ini umumnya dikenal dengan sebutan kultur
embrio (embryo culture).
Kultur embrio lebih mudah dilakukan dibandingkan
dengan penyelamatan embrio. Hal ini disebabkan karena
embrio yang ditanam adalah embrio yang telah berkembang
sempurna sehingga media tanam yang digunakan juga sangat
sederhana. (Zulkarnain, 2009)
2.5 Faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan Kultur
Embrio dan Embrio Rescue
a. Genotipe Tanaman
Salah satu faktor yang sangat mempengaruhi adalah
genotipe tanaman asal. Pengaryh genotip pada umumnya
berhubungan erat dengan faktor yang mempengaruhi
pertumbuhan biji seperti kebutuhan nutrisi, ZPT dan
lingkungan
b. Media Kultur
Perbedaan komposisi media, komposisi ZPT dan jenis
media yang digunakan akan sangat mempengaruhi
pertumbuhan dan regenerasi biji yang dikulturkan

c. Komposisi Media
Perbedaan
komposisi
media
biasanya
mempengaruhi arah pertumbuhan dan regenerasi biji

sagat

d. Komposisi Hormon Tumbuhan


Komposisi dan konsentrasi hormon ditambahkan ke
dalam media kultur tergantung jenis dan tujuan perlakuan
e. Keadaan Fisik Media
Media umum yang digunakan adalah padat, semi padat
dan cair. Keadaan fisik media mempengaruhi pertumbuhan
kultur, kecepatan pertumbuhan dan diferensiasi (anonymousc,
2012).

BAB III
METODOLOGI
3.1 Alat dan Bahan Kultur Embrio dan Embrio Resque
Alat:

Alat tulis : Mencatat hasil


Kamera : dokumentasi
Kulkas : mendinginkan bahan
Bunsen : mensterilkan bahan
Botol kultur : tempat menaruh eksplan
Scalpel : memotong bahan
Pinset : menjepit bahan
LAFC : tempat memotong bahan
Bahan:

Detergen: membersihkan kotoran makro


Fungisida (benlate) : membersihkan jamur
Bayclean : membunuh bakteri
Aquades : membersihkan sisa ke-3 bahan di atas
Alcohol : merendam bahan
Biji kacang tanah : bahan

3.2 Cara Kerja Kultur Embrio dan Embrio Resque


Siapkan alat dan bahan

Sterilisasi bahan (detergen 5%, Fungisida 0,5%, bayclean 10%

Rendam dengan aquades 5 menit

Masukkan ke dalam kulkas selama 24 jam

Rendam biji ke dalam alcohol

Kemudian ambil biji tersebut dan bakar sebentar

potong sesuai garis biji pada cawan petri dengan


menggunakan scalpel

Ambil embrio dan letakkan pada botol kultur

Pengamatan 2 minggu

hasil
3.3 Analisa Perlakuan
Mula-mula biji disterilkan dengan tiga bahan pensteril
yaitu, detergen untuk membersihkan kotoran makro seperti
tanah atau noda lainnya, kemudian itu dengan menggunakan
fungisida untuk membersihkan kemungkinan jamur yang
hinggap dan terakhir dengan bayclean untuk membersihkan
adanya kemungkinan bakteri yang hinggap dengan masingmasing jeda pensteril menggunakan air untuk menghilangkan
jejak bahan pensteril sebelumnya. Setelah itu biji di rendam
aquades steril dan didinginkan ke dalam kulkas selama 24 jam.
Setelah itu biji direndam alcohol. Untuk mengambil
menggunakan pinset, bakar sebentar taruh pada cawan petri
dan potong sesuai garis biji dengan menggunakan scalpel,

kemudian ambil embrio dan taruh pada botol kultur.


Pengamatan selama 2 minggu.

BAB IV
HASIL dan PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Tanggal 20 November 2012
Botol ke
Kondisi
Ekslan
1.
Sehat

Jenis
Kontaminasi
Tidak ada

Keterangan
ertumbuhan
Tumbuh
tunas & akar

2.

Sehat

Tidak ada

Belum
tumbuh

3.

Sehat

Tidak ada

Tumbuh
tunas

4.

Sehat

Tidak ada

Belum
tumbuh

5.

Sehat

Tidak ada

Tumbuh
tunas & akar

Jenis
Kontaminasi
Tidak ada

Keterangan
Pertumbuhan
Tumbuh
daun, akar &
batang
semakin
memanjang
(tinggi)

Tidak ada

Belum
tumbuh

Tanggal 24 November 2012


Botol ke
Kondisi
Ekslan
1.
Sehat

2.

Sehat

3.

Sehat

Tidak ada

Tumbuh
tunas & akar,
ekslan
semakin
membesar

4.

Kontaminasi

Jamur

Mati

5.

Sehat

Tidak ada

Tumbuh
daun, akar &
batang
semakin
memanjang
(tinggi)

Tanggal 27 November 2012


Botol ke
Kondisi
Ekslan
1.
Sehat

Jenis
Kontaminasi
Tidak ada

Keterangan
Pertumbuhan
Tumbuh
daun, daun,
akar &
batang
semakin
terlihat jelas,
semakin
memanjang
dan

membesar
Belum
tumbuh

2.

Sehat

Tidak ada

3.

Sehat

Tidak ada

Tumbuh daun
& akar,
ekPslan
semakin
membesar

4.
5.

Kontaminasi

Jamur

Sehat

Tidak ada

Mati (Sudah
dibuang)
Tumbuh
daun, daun,
akar &
batang
semakin
terlihat jelas,
dan semakin
memanjang

4.2 Pembahasan
Terllihat bahwa pada pengamatan kedua dan ketiga botol
kulut ke4 (botol 4) mengalami kontaminasi jamur yang
menyebabkan eksplan mati. Hal ini jelas mengindikasikan
bahwa faktor manusia dalam pengerjaan kultur mempengaruhi
hasil tumbuh eksplan. Menurut Wetter (1991), tangan dan alat
yang steril jelas mutlak diperlukan dalam pengerjaan kultur
demi menghindari kontaminasi baik jamur maupun bakteri.

Dan hal itu terlihat pada botol 4, karena jika faktor alat yang
menjadi pemicunya kemungkinan botol lainnyapun akan
terkontaminasi berhubung alat yang digunakan setiap
kelompok sama.
4.3 Pembahasan Kultur Embrio dan Embrio Rescue
Hasil praktikum diatas menyatakan bahwa kultur
embrio dominan berhasil ketimbang embrio rescue. Hal ini
dimungkinkan persentase tingkat keberhasilan lebih memilih
kultur embrio. Analisisnya disamping kultur embrio yang
mudah dalam mengambil embrio kacang tanah mudah terelihat
dalam artian bahwa embrio dari kacang tanah lebih besar dari
biji anggrek. Kemudahan dalam memotong lintang biji dari
biji kacang tanah memungkinkan tingkat keberhasilan dalam
menanam eksplan. Kesukaran dalam memotong lintang biji
anggrek memungkinkan lebih banyak perlakuan sehingga
sesuatu yang tidak diinginkan terjadi seperti kontaminasi
eksplan

BAB V
PENUTUP
5.1 Kesimpulan
Dari 3 botol kultur embrio dan 2 botol embrio rescue
hanya 1 botol embrio rescue yang gagal tumbuh atau
terkontaminasi.
5.2 Saran
Semangat terus!!!

DAFTAR PUSTAKA
Anonymousa. 2012. Orchidaceae. http: //id. wikipedia. org/
wiki/ wikipedia.
Anonymousb. 2012. Anggrek. http: //Indonesia orchids.
Wordpress.com/20/10/00/23/anggrek_budidaya
tanaman.
Anonymousc. 2012. Faktor-faktor penentu keberhasilan. http:
//kulturjaringan.blogspot.com/2009/08/.
Wetter, L.R dan F. Constabel. 1991. Metode Kultur Jaringan
Tanaman Edisi Kedua. Bandung: ITB Press.
Rukmana, Rahmat. 1998. Kacang Tanah. Penerbit Kanisius.
Yogyakarta.
Sugito, H dan A. Nugroho. 2004. Teknik Kultur Jaringan.
Penebar Swadaya: Yogyakarta.
Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Bumi Aksara:
Jakarta.