Anda di halaman 1dari 6

Deaktivasi Termal Enzim

Suatu kriteria penting untuk kinetika enzim adalah enzim stabil atau steady
state sepanjang waktunya dimana aktivitasnya diuji. Dimana laju suatu reaksi
sesuai dengan hukum Arnhenius dengan laju reaksi meningkat dengan
meningkatnya temperatur, sedangkan aktivitas enzimatik berkurang pada paparan
sampai ke temperatur yang lebih tinggi untuk suatu periode waktu yang
berlangsung lama. Hilangnya aktivitas enzimatik menunjukkan perubahan dalam
konformasi enzim dimana ikatan disulfida dan interaksi antara domain hidrofobik
yang terganggu, dan enzim telah mengalami denaturasi.
Ilmu tentang mekanisme deaktivasi protein telah dipelajari melalui ilmu
rekayasa protein. Meskipun semua hukum ataupun aturan mengenai protein
folding belum sepenuhnya dipahami, kestabilan atau ketunakan protein dengan
functions yang ada dapat direkayasa (Branden and Tooze 1991). Sebagai contoh,
kestabilan oxidatif subtilisin, suatu protease alkalin yang diperoleh dari Bacilluss
spp yang dapat digunakan aditif detergen untuk menghilangkan ikatan protein dari
pakaian telah dikembangkan melalui rekayasa protein. Subtilisin Bacillus
amyloliquefaciens asli adalah suatu protease yang terdiri dari 275 asam amino
dengan serin pada sisi aktifnya (active site). Rekayasa protein telah digunakan
untuk menggantikan metionin dengan leucine pada posisi asam amino 222. Varian
leucine 222 telah ditemukan akan stabil dengan adanya 0,3% H
2
O
2
dimana
subtilisin asli dengan metionin 222 sangat sensitif pada kondisi yang sama
(Gambar 1)

Gambar 1. Stabilitas oksidatif subtilisin dengan perbandingan antara wild type dan
leu-22. Wild type subtilisin dicampur dengan 0,3% H
2
O
2
Tris buffer
(pH 8,60. Sampel diambil untuk diindikasi pada berbagai waktu dan
diperiksa untuk aktivitas enzimnya

Hanya terdapat perbedaan kecil dalam total energi antara struktur lipatan
protein dan sejumlah besar yang perbedaan, struktur cepat antar lipatan
mengkonversi (Branden dan Tooze 1991). Branden dan Tooze menyajikan sebuah
studi kasus untuk lysozyme dari bakteriofag T4, di mana teknik rekayasa protein
oleh Brian Mathews dan Eugene dari Universitas Oregon, mengungkapkan
beberapa faktor yang penting untuk stabilitas protein. Entropi dari struktur yang
tidak terlipat disukai karena jumlah yang besar struktur.
Oleh karena itu, bagian yang terlipat harus mengimbangi ini
melalui berbagai jenis interaksi kimia dan fisik, termasuk interaksi hidrofobik
yang membawa rantai samping hidrofobik dari pelarut untuk interior
dari protein, ikatan spesifik hidrogen, interaksi elektrostatik, dan crosslink
kovalen melalui ikatan S - S. Seperti ringkasan oleh Branden dan Tooze (1991,
p. 256): Pengamatan stabilitas dari struktur protein asli adalah hasil dari
perbedaan yang kecil, sekitar 5 sampai 15 kkal / mol, antara energi total lipatan
dan bagian yang tak terlipat, yang masing-masing berada di urutan 10 juta kkal /
mol. Oleh karena itu, sulit untuk memperoleh struktur lipatan asli oleh
perhitungan dari prinsip first order, yang membutuhkan tidak hanya energi yang
cukup baik untuk semua interaksi, tetapi juga menerapkannya pada semua
struktur yang mungkin dari keduanya dalam bentuk terlipat dan tidak terlipat
pada rantai polipeptida. "Perbedaan ini dapat diukur dengan penelitian
kalorimetrik untuk menentukan perbedaan energi, dan dichroism sircular untuk
mengikuti perubahan konformasi protein ketika protein dipanaskan atau terkena
agen denaturasi dan pada titik leleh. Perbedaan dari 1
0
C dalam suhu titik leleh
sesuai dengan perbedaan dalam stabilitas energi sekitar 0,5 kkal / mol.

Gambar 2. Rantai polipeptida dari bakteriofag T4 lisozim terikat menjadi dua
bagian

Bentuk yang paling sederhana dari persamaan deaktivasi enzim
ditunjukkan sebagai proses orde satu:
( )
|
.
|

\
|
=
t
t
e E t E
o
pers. 7.7
Dimana E(t) = aktivitas enzim pada waktu t
E
0
= aktivitas enzim mula-mula
t = time konstan
Deaktivasi Enzim memperumit analisis data kinetik, dan karenanya pada
percobaan kondisi biasanya dipilih dimana deaktivasi enzim diabaikan.
Hal ini ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim pada pH tertentu, setelah
enzim telah terpapar atau terekspos pada temperaur yang dipilih. Sebuah
gambaran umum kurva deaktivasi diilustrasikan untuk -glukosidase pada
Gambar. 7.15. Basis pada plot ini, pengujian enzim dilakukan pada temperatur 50
0
C.
Waktu paruh (half-life) adalah waktu yang telah berlalu sesuai dengan
kehilangan 50% dari keadaan mula-mula enzimatik. Pada t = t
0,5
, E
(t0,5)
= E
0
,
persamaan 7.6 menjadi:
69315 , 0 5 , 0 ln
5 , 0
= =
t
t
atau
69315 , 0
5 , 0
t
= t pers 7.8
Dimana t merupakan waktu konstan untuk deaktivasi. Dalam
permasalahan glukosidase, waktu paruh berkisar antara 5 menit ke beberapa
jam, atau bahkan beberapa hari karena menurunnya temperatur (Gambar. 7.15).
Deaktivasi enzim merupakan fungsi dari lingkungannya, dan diperlambat
atau dipercepat dengan mengubah pH, atau penambahan substrat, produk, atau
inhibitor yang bersifat terikat dengan enzim dan menginduksi konformasi yang
lebih tahan terhadap deaktivasi. Sebagai contoh pada kedelai -galaktosidase
pada 54
0
C, di mana deaktivasi minimal setelah 1 jam pada pH 4,0 dengan adanya
100 mM galaktosa belum 90% dinonaktifkan dalam 30 menit tanpa adanya
galaktosa. Enzim menonaktifkan atau mendeaktivasi lebih cepat pada pH 7,0
dibandingkan pada pH 4,0, dan galaktosa tidak lagi dapat memproteksi terhadap
deaktivasi pada pH yang lebih tinggi. Pada pH 7.0, enzim berdisosiasi menjadi
monomer dengan berat molekul ~40.000, sedangkan pada pH 4.0, bentuk tetramer
yang lebih tahan atau tersisa terhadap deaktivasi. Dalam hal ini, deaktivasi tidak
lagi mengikuti first order (Porter et al 1992.), melainkan mengikuti mekanisme
seri.
2 2 1 1
2 1
o o
E E E
k k
pers 7.9
Dimana k
1
dan k
2
adalah waktu konstan deaktivasi (min
-1
),
1
= E
1
/E dan

2
= E
2
/E (Barclay et al 1990;. Henley dan Sandana 1984, 1985, 1986). E, E
1
, dan
E
2
mewakili tiga bentuk aktivitas enzimatik mana aktivitas intrinsik dari ketiganya
mengikuti bentuk E>E
1
>E
2
dan kemungkinan menggambarkan pemisahan
tetramer menjadi monomer sebagai adanya peningkatan pH dari pH 4,0 sampai
pH 7,0.
Keseluruhan aktivitas fraksional yang tersisa, = E
+
(t)/E, hasil dari ketiga
bentuk enzim dimana ditunjukkan sebagai berikut:
E
+
= E(t)+E
1
(t)+E
2
(t) pers. 7.10
Henley dan Sandana (1986) memberikan persamaan terhadap aktivitas
fraksional enzimatik yang tersisa setelah waktu tertentu sebagai:
) (
2 1
1 2
1
2
) (
1 2
2 2
1 2
1 1
1 1
) ( 1
) (
t k t k
e
k k
k
e
k k
k
k k
k
E
t E

|
|
.
|

\
|

+
(

+ = = o o o
o o
o
pers 7.11
Jika E
2
mewakili inaktif enzim (
2
= 0), maka aktivitas fraksional a adalah:
) (
2 1
1 2
1 ) (
1 2
2 2
1 2
1 1
2 1
) ( 1
t k t k
e
k k
k
e
k k
k
k k
k

|
|
.
|

\
|

+ = o o
o o
o pers 7.12
Dalam hal ini dimana E
1
dan E
2
keduanya mewakili inaktif enzim
sepenuhnya
1
=
2
=0, sehingga persamaan (7.11) menjadi:
) (
1
) (
t k
e
E
t E
a

= = pers 7.13
Dimana ekivalen dengan proses deaktivasi first order yang sebelumnya
ditunjukkan pada persamaan (7.6) dimana 1/t = k
1

Henley dan Sandana menyarankan bahwa langkah pertama dalam Pers.
(7,6) (yaitu, single-step, unimolecular, deaktivasi non-first order), di mana k
1
>>
k
2
mewakili pengaruh agen pelindung terhadap stabilitas enzim, dimana
deaktivasi berhenti pada bentuk E
1
. Aktivitas fraksional E
1
(t) / E = 1 akan
mewakili koefisien stabilitas enzim, dimana:
( ) | |
1
) (
1
1 o o o + =
t k
e pers 7.14
Kembali ke contoh tentang pengaruh penambahan galaktosa pada
stabilitas panas dari - galaktosidase pada pH 4 dan 54 C (Porter et al 1992.),
1

dan
2
dalam Pers. (7.11) adalah nol karena tidak adanya galaktosa.
1
meningkat
dari 0,092 (tanpa galaktosa) ke 0,096 (dengan 100 mM galaktosa). Pada pH 5,5,

1
meningkat dari 0,085 pada 70 C sampai 0,533 pada 56 C dengan adanya 100
mM galaktosa sejak meningkat tingkatan perlindungan dengan penurunan suhu.
Deaktivasi enzim dapat dimoderasi jika enzim amobil atau dapat bergerak
pada support solid atau permukaan solid. Reaktor pada industri yang
memanfaatkan enzim amobil yang telah setengah-hidup dalam beberapa bulan
sampai tahun. Hal ini diperlukan untuk mencapai operasi yang ekonomis.
Estimasi volume reaktor yang diberikan membutuhkan persamaan untuk
deaktivasi enzim dapat digabung ke dalam persamaan kinetik. Untuk menentukan
kinetika dan karakterisasi enzim, bagaimanapun kondisi di mana hilangnya
aktivitas enzimatik diabaikan biasanya, eksperimen ditentukan sebelum
dimulainya studi kinetik. Stabilitas enzim sebagai fungsi waktu atau laju alir,
temperatur, pH, dan konsentrasi substrat, diteliti lebih lanjut setelah kinetika
diketahui.
Analisis berbagai jenis laju kinetika awal reaksi, dan persamaan untuk
sejumlah jenis enzim-katalis dari berbagai rangkaian reaksi, yang diberikan oleh
Segel (1975), Ploughman (1972), dan Cornish-Bowden dan Wharton (1988).
Untuk bagaimana cara menyelesaikan hal ini mungkin dapat diintegrasikan ke
dalam komputasi berbasis model dinamis akan dibahas oleh Dhurjati dan
Mahadevan (2008). Bab berikutnya akan menjelaskan tentang pengenalan model
reaksi enzim tunggal untuk aplikasi dalam industri dan model dalam sistem
biologi.