PERCOBAAN PENENTUAN KADAR KLOROFIL DENGAN

SPEKTROFOTOMETER

LAPORAN PRAKTIKUM
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah
Teknik Laboratorium
yang dibimbing oleh Bapak I Wayan Sumberartha

Oleh :
Kelompok 1
1. Dita Perdana (150341607509)
2. Lelly Luckitasari (150341600339)
3. Luthfianti Fanani (150341603019)
4. Ridadyah Wilujeng (150341600127)
5. Rido Sigit Wicaksono (150341603332)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
DESEMBER 2015

Percobaan Penentuan Kadar Klorofil dengan Spektrofotometer

A. Tujuan
Mahasiswa diharapkan dapat.
1. Mengoperasikan spektrofotometer dengan benar
 2. Mengukur kadar klorofil pada daun dengan menggunakan spektrofotometer

B. Dasar Teori
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur kadar zat
terlarut dalam suatu larutan. Prinsip kerja dari alat ini berdasarkan serapan
cahaya (absorbansi) monokromtik oleh zat terlarut. Spektrofotometer akan
menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang energi secara
relative. Jika energi tersebut ditransmisikan maka akan ditangkap oleh klorofil
yang terlarut tersebut. Pada fotometer filter sinar dari panjang gelombang yang
diinginkan akan diperoleh dengan berbagai filter yang punya spesifikasi
melewati banyaknya panjang gelombang tertentu (Noggle dan Fritz, 1979).
Spektrofotometer terdiri dari :
1. Sumber cahaya.
2. Monokromator.
3. Kompartemen sampel.
4. Detektor dan pengukur intensitas cahaya.
Skema konstruksi spektrofotometer :

Spektrofotometer memiliki beberapa jenis. Jenis-jenis

spektrofotometer :
1. Berdasarkan pada daerah spektrum yang akan dieksporasi,
terdiri dari :
a. Spektrofotometer sinar tampak (Vis).
b. Spektrofotometer sinar tampak (Vis) dan ultraviolet (UV).
2. Berdasarkan teknik optika sinar, terdiri dari :
a. Spektrofotometer optika sinar ganda (double beams
optic).
 b. Spektrofotometer optika sinar tunggal (single beams
optic).
Kadar suatu larutan dapat ditetukan secara spektrofotometrik berdasarkan
hukum Lambert Beer.
Hukum Lambert menyatakan proporsi berkas cahaya yang datang yang
diserap oleh suatu bahan/medium tidak bergantung pada intensitas berka cahaya
yang dating.
Hukum Beer menyatakan absorbansi cahaya berbnding lurus dengan
konsentrasi dan ketebalan bahan/medium. Syarat Hukum Beer :
Konsentrasi harus rendah, zat yang diukur harus stabil, cahaya
yang dipakai harus monokromatis, larutan yang diukur harus
jernih.
Untuk penggunaan analisis kimia pristiwa absorbansi merupakan dasar dari
spetroskopi. Prosedur dasar dalam analisis kuantitatif secara spektroskopi adalah
membandingkan absorbansi energy radiasi sinar monokromastik dengan panjang
gelombang tertentu oleh larutan cuplikan dengan suatu larutan standar atau
dengan larutan blanko.
Cara menggunakan Spektrofotometer tipe SPECTRONIC 21 D dengan benar
adalah sebagai berikut.
- Hidupkan peralatan spektrofotometer dengan cara memutar tombol power
ON dan membiarkan terlebih dahulu sekitar 15 menit sebelum digunakan
agar bagian optical system , yaitu sumber cahaya, phototube, dan detector
mencapai keadaan stabil.
(alat tidak boleh lanngsung dihubungkan dengan sumber arus, tetapi
melalui stavolt).
- Pilihlah panjang gelombang yang diperlukan untuk pengukuran dengan
cara memutar knob yang tersedia.
Untuk 340 599, knob diputar ke kiri
Untuk 600 950, knob diputar ke kanan
- Aturlah mode tampilan pada TRANSMITTANCE dengan cara menekan
tombol mode hingga LED disamping tulisan transmittance bercahaya
- Selanjutnya sesuaikan angka pada tampilan dengan cara memutar power
switch/ zero control, hingga pada tampilan bernilai 0%T (tempat cuplikan
pada adapter harus kosong dan tertutup)
 - Isilah cuvet dengan pelarut blanko, mengusap cuvet dengan tissue untuk
menghilangkan cairan yang menetes, debu atau sidik jari, kemudian cuvet
ditempatkan pada ruang adapter (tanda garis putih pada cuvet diletakkan
berhadapan dengan garis penunjuk pada adapter), tekan bagian permukaan
kuvet perlahan, kemudian ditutup.
- Tekanlah tombol MODE-TRANSMITTANCE, dengan memutar knob
transmittance sehingga menunjukkan nilai 100% T.
- Tekanlah tombol MODE-ABSORBANCE, dengan memutar knob
absorbansi sehingga menunjukkn nilai 0.0 A.
- Keluarkan cuvet blanko dari adapter.
- Masukkan sammpel ke dalam cuvet dan besihkan cuvet tersebut dengan
menggunakan tissue, kemudian masukkan ke dalam ruang adapter, lalu
tutuplah ruang adapter.
- Lakukan pembacaan pada % T atau A
- Keluarkan kuvet sampel
- Setelah pengukuran selesai, putar tombol Power Switch berlawanan arah
jarum jam sampai berbunyi klik.

C. Metodologi Penelitian
1. Alat dan Bahan
Alat
Spektrofotometer Spectronic 21 D
Kuvet
Rak kuvet
Beaker glass 100 ml
Mortar dan pistil
Gelas ukur 10 ml
Gelas ukur 100 ml
Pipet tetes panjang
Neraca digital non teknis
Tissue
Lap meja

Bahan

Daun muda
Daun tua
 Kertas saring
Alkohol 96%
Aquades

2. Cara Kerja
Mengukur kadar klorofil daun muda
Ditimbang daun 0,2 gram daun muda.

Daun dipotong kecil-kecil, digerus dengan mortar dan pistil.

Diambilalkohol
Dimasukkan alkoholmurni
96% sebanyak 10 mlkuvet
96% ke dalam menggunakan gelas ukur.
sebagai larutan blanko

Ditambahkan alkohol 96% Dimasukkan

dalam gelas lautan
ukur keblanko ke dalam
daun sedikit spektofotometer.
demi sedikit untuk mempermudah pen

ncur, dimasukkan Diatur

semua absorbansinya 0, diatur
alkohol 96% dalam pada
gelas ukurpanjang gelombang
10 ml ke 649 berisi
dalam mortar dan 665 nm. daun. D
gerusan

bil larutan blanko,ekstrak

Disaring kemudian diganti
daun dengan dengan
menggunakan larutandan
kertas saring ekstrak dalam kuvet
dimasukkan pertama,
ke dalam gelasdilanjutkan
ukur 100 m

Bila Dicatat
ekstrak absorbansinya. Dihitung kadar
klorofil belum mencapai 20 ml,klorofilnya
ditambahkandngan
lagirumus dari
dengan Wintermans
alkohol dan De
96% hingga Moots
menjadi

Diulang
Dimasukkan cara
ekstrak kerja
klorofil ke untuk
dalam 2pengukuran klorofil
kuvet sekaligus. pada daun
Diusahakan lautantua.
tetap homogen.
D. Data Pengamatan
Tabel Pengukuran Kadar Klorofil Daun Menggunakan Spektrofotometer

Umur Absorbansi pada Kadar Klorofil (mg/lt)

Daun 649 665 a b Total
0,064 0,062
Muda
0,051 0,052 0,73815 1, 0446 0,8023
Rerata 0,0575 0,0570
0,279 0,297
Tua
0,315 0,324 2,54313 5,27175 4,04595
Rerata 0,297 0,3105

E. Analisis Data
Penghitungan kadar klorofil pada percobaan Spektofotometer menggunakan
rumus Wintermans dan De Moots yakni :
Klorofil a (mg/l) = 13,7 (OD665) 5,76 (OD649)
Klorofil b (mg/l) = 25,8 (OD649) 7,7 (OD665)
Klorofil total (mg/l) = 20 (OD649) + 6,1 (OD665)
Keterangan = OD (Optical Density) adalah nilai absorbansi klorofil yang tetera
pada Spektrofotometer.
Penghitungan kadar rata-rata klorofil untuk umur daun muda:
Klorofil a (mg/l) = 13,7 (OD665) 5,76 (OD649)
= 13,7 (0,0570) 5,76 (0,0575)
= 1,0659 0,32775
= 0,73815 mg/lt
Klorofil b (mg/l) = 25,8 (OD649) 7,7 (OD665)
= 25,8 (0,0575) 7,7 (0,0570)
= 1,4835 0,4389
= 1,0446 mg/lt

Klorofil total (mg/l) = 20 (OD649) + 6,1 (OD665)

= 20 (0,0575) + 6,1 (0,0570)
= 1,15 + 0,3477
= 1,4977 mg/lt
Penghitungan kadar rata-rata klorofil untuk umur daun tua:
Klorofil a (mg/l) = 13,7 (OD665) 5,76 (OD649)
= 13,7 (0,3105) 5,76 (0,297)
= 4,25385 1,71072
= 2,54313 mg/lt
Klorofil b (mg/l) = 25,8 (OD649) 7,7 (OD665)
= 25,8 (0,297) 7,7 (0,3150)
= 7,6626 2,39085
= 5,27175 mg/lt
Klorofil total (mg/l) = 20 (OD649) + 6,1 (OD665)
= 20 (0,297) + 6,1 (0,3150)
= 5,94 + 1,89405
= 7,83405 mg/lt
F. Pembahasan
Percobaan ini dilakukan dengan tujuan untuk mengukur kadar klorofil pada
daun secara kuantitatif menggunakan spektrofotometer. Spektrofotometer adalah
instrumen yang digunakan untuk mengukur kadar zat terlaut pada suatu larutan
memanfaatkan sifat absorbansi zat terlarut pada suatu larutan. Spektofotometer
yang digunakan pada percobaan kali ini adalah tipe Spectronic 21 D dan
mengunakan dua spektrofotometer yang digunakan untuk panjang gelombang
649 dan 665 nm. Yakni panjang gelombang yang dapat diserap oleh klorofil
ketika proses fotosintesis pada tumbuhan. Menggunakan dua spektrofotometer
karena untuk mempermudah percobaan dan juga perawatan alat aga tidak rusak
kalibrasinya. Karena jika dalam suatu percobaan spektrofotometer sering diganti
panjang gelombangnya dalam jangka waktu yang pendek, dikhawatirkan dapat
mempengaruhi kalibrasi alat.
Tanaman yang digunakan pada pecobaan kali ini adalah tanaman
Hymenocallis littoralis atau bakung-bakungan dari famili Amaryllidaceae.
Tanaman ini memiliki daun yang tebal, daun mudanya tidak kaku, sedangkan
daun tuanya tebal dan kaku. Tanaman ini berbunga satu tahun sekali dengan
bunga wana putih, merah, hingga orange.
Percobaan I dilakukan untuk mengukur kadar klorofil pada daun muda. Dan
menghasilkan pembacaan absorbansi pada panjang cahaya 649 nm adalah 0,064
dan pada ulangannya sebesar 0,062. Kemudian pada pembacaan dengan panjang
cahaya 665 nm adalah 0,051 dan ulangannya 0,052. Perbedaan nilai absorbansi
pada percobaan I beserta ulangannya menunjukkan bahwa larutan yang terdapat
pada dua cuvet tersebut tidak homogen. Sehingga pada perhitungan dilakukan
dengan mencari rerata nilai absorbansi pada masing-masing panjang cahaya. Dan
diperoleh rerata absorbansi pada panjang gelombang 649 nm adalah 0,0575 dan
pada panjang gelombang 665 nm adalah 0,0570.
Pada percobaan II dilakukan untuk mengukur kadar klorofil daun tua tanaman
bakung-bakungan dan diperoleh data absorbansi pada panjang cahaya 649 nm
adalah 0,279 dan 0,297, kemudian pada panjang cahaya 665 nm adalah 0,315 dan
0,324. Karena pada percobaan kali ini larutan tidak homogen, maka untuk
 menghitung kadar klorofil dicari rerata data yang diperoleh pada masing-masing
penjang gelombang. Dan diperoleh rerata data sebagai berikut, panjang
gelombang 649 nm adalah 0,297 dan panjang gelombang 665 nm adalah 0,3105.
Setelah mendapatkan data tersebut, dicari kadar klorofil a, b, dan klorofil total
menggunakan rumus Wintermans dan De Moots. Dan akhirnya diperoleh kadar
klorofil pada daun muda adalah klorofil a sebesar 0,73815 mg/lt, klorofil b
sebesar 1,0446 mg/lt, dan klorofil totalnya 1,4977 mg/lt. Kadar klorofil pada
daun tua adalah klorofil a sebesar 2,54313 mg/lt, klorofil b sebesar 5,27175
mg/lt, dan kadar klorofil totalnya adalah 7,83405 mg/lt.
Apabila data pada display spektrofotometer berkedip-kedip, itu artinya cuvet
dalam keadaan kotor atau alkohol yang digunakan tidak 96% sehingga
pembacaan absorbansi terganggu. Kemudian apabila larutan dalam dua cuvet
tidak homogen, ini artinya terdapat kesalahan yang dilakukan praktikan
diantaranya, sebelum penuangan larutan pada cuvet, larutan tidak dikocok
terlebih dahulu, kemudian pada penuangan ke dalam cuvet seing kali ditambah
dan dikurangi larutan pada cuvet menggunakan pipet tetes yang kemungkinan
terkontaminasi alkohol cair sehingga mempengaruhi homogenitas larutan,
kemudian penggunaan cuvet yang sudah dicuci menggunakan air dan belum
dikeringkan juga mempengauhi homogenitas larutan yang menyebabkan adanya
perbedan data absorbansi cahaya pada satu larutn yang sama.

G. Diskusi
Pertanyaan :
1. Mengapa blanko yang digunakan pada percobaan ini alkohol 96%?
Jawab : Karena alkohol 96% juga digunakan sebagai pelarut klorofil
sehingga hasil kalibrasinya nanti bisa sangat sesuai dengan sampel dan
menghasilkan hasil yang valid.
2. Jelaskan mengapa sebelum mengukur absorbansi ekstrak, blanko diukur
absorbansinya dan dibuat nilai absorbansinya 0 (T 100%) ?
Jawab : Karena jika kita meletakkan nilai absorbansi pada nilai diatas 0 A
maka saat pengukuran nilai absorbansinya nanti tidak akan menghasilkan
 hasil yang valid karena hasil yang ditunjukkan nanti merupakan hasil
absorbansi ditambah dengan nilai absorbansi sebelumnya.
3. Mengapa ekstrak klorofil diukur pada panjang gelombang 665 dan 649 nm?
Jawab : Karena krofil a dan klorofil b dapat dihitung nilai absorbansinya
secara sempurna pada kisaran panjang gelombang 665 dan panjang
gelombang 649.
H. Kesimpulan

Bedasarkan data pengamatan diatas maka dapat disimpulkan bahwa :

1. Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur kadar

suatu zat dalam larutan.
2. Prinsip kerja dari spektrofotometer adalah melewatkan cahaya monokromatik
ke larutan yang diuji dan menghitung sinar yang keluar.
3. Percobaan tersebut menggunakan panjang gelombang 665 nm dan 649 nm
serta blanko alkohol 69%
4. Berdasarkan hasil perhitungan daun tersebut mengandung klorofil a

mg mg
0,73815
L dan klorofil b 1,0446 L dan klorofil total sebesar

mg
1,4977 L pada daun muda dan daun tua mengandung klorofil a

mg mg
sebanyak 2,54313 L klorofil b 5,27175 L dan klorofil total

mg
7,83405 L .

I. Saran
1. Dalam melakukan percobaan spektrofotometer larutan yang dibuat jangan
diaduk sebelum pecobaan karena hal ini dapat membuat perbedaan
jumlah partikel antara larutan yang berada pada kuvet pertama dan kuvet
kedua sehingga menyebabkan larutan tidak homogen.
 2. Pastikan sebelum memasukkan kuvet dalam adaptor, kuvet dalam
keadaan bersih dari debu, cap jari, tetesan larutan, dsb.
3. Pastikan dalam memasukkan kuvet, tanda garis putih pada kuvet lurus
dengan tanda pada adaptor.
4. Pastiakn setelah melakukan percobaan adaptor bersih dari lautan yang
berasal dari dalam kuvet.

Daftar Rujukan

Anggraini Dian. Yanlinastuti. S. Fatimah. Yusuf Nampira. 2011.

Penentuan Kadar Zirkonium dalam paduan U-ZR
Menggunakan Spektrofotometer UV-VIS dengan Pengompleks
Arsenazo III. Batan-Serpong. Pusat Teknologi Bahan Bakar.

Marawis Rialita Kesia, Gayatri Citraningtyas, Frenly Wehantouw.

2013. Analisis Kafein dalam Kopi Bubuk di Kotab Manado
 Menggunakan Spektrofotometri UV-VIS. Manado : Pogram
study Farmasi FMIPA UNSRAT Manado.

Sabrina Annina. Surjani Wonorahardjo. Neena Zakia. 2012.

Perbandingan Metode Spektrofotometri UV-VIS dan KCKT
(Kromatografi Cair Kinerja Tinggi) pada Analisis Kadar Asam
Benzoat dan Kafein dalam Teh Kemasan. 2011. Malang :
Universitas Negeri Malang