Laporan Pratikum KI 3261

Metabolisme dan Informasi Genetika

Percobaan 02

Pengenalan Teknik Dasar Mikrobiologi (Metoda Aseptik)

Nama : Zizi Jasmin

NIM : 10514049

Kelompok :5

Tanggal pecobaan : 2 Maret 2017

Tanggal pengumpulan : 9 Maret 2017

Asisten : Ira

LABORATORIUM BIOKIMIA

PROGRAM STUDI KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG

2017

Pengenalan Teknik Dasar Mikrobiologi (Metoda Aseptik)

I. Tujuan
Membuat medium padat dalam cawan petri, inokulasi menggunakan jarum ose dan
batang L dengan metoda aseptik.
II. Teori Dasar
Teknik Aseptik atau sterilisasi adalah suatu sistem cara bekerja untuk mejaga
sterilisitas saat menagnai npengkulturan mikroorganisme untuk mecegah kontaminasi terhdap
kultur mikroorganisme yang diinginkan .Untuk mencegah mikroorganisme luar yang tak
dikehendaki masuk ke dalam biakan murni perlu dilakukan teknik aseptik,dimana semua
perlatan dan media pertumbuhan yang akan digunakan harus dalam keadaan steril.
Teknik aseptik dengan metoda sterilisasi dapat dilakukan dengan menggunakan
autuoklaf .saat sumber panas dinyalakan ,air dalam autoklaf lama kelamaan mendidih dan
uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf.setelah semua udara dalam
autoklaf diganti dengan uap air ,katup udara atau uap ditutup sehingga tekanan udara dalam
autoklaf naik dan udara panas dapat menyebabkan mikroba pengganggu tidak dapat hidup.
Selain itu, dapat digunakan alkohol 70 % untuk mensucihamakan meja kerja dan
tangan.alkohol dapat menyebabkan protein dan mambran mikroba menajdi rusak sehingga
mengalami denaturasi.dalam pekerjaan aseptik,sebelum bekerja ,sangat penting untuk
mengatur peralatan dan bahan yang digunakan diatas meja kerja.jika harus memindahkan
cairan dari suatu wadah ke wadah lain , maka harus diusahakan agar penutup masing-masing
wadah dibuka dalam waktu sesingkat mungkin.
III. Alat dan Bahan
Alat :
Cawan petri kosong steril,jarum ose,batang L,peralatan gelas standar, kapas bebas
lemak dan kasa,plastik wrap, botol sempot, mechanical pipetor,shaker, dan api
bunsen.
Bahan :
Nutrient broth (beef ekstrak 0,3 % ,bacto peptone 0,5 % , NaCl 0,5 %) , nutrient Agar
(beef ekstrak 0,3 % ,bacto peptone 0,5 % , NaCl 0,5 % , agar 1,5 %) , etanol 70 % ,
aquades ,sampel air kran.
IV. Cara Kerja
Menyiapkan media padat
Media padat yang dibuat dengan 0,3 % beef ekstrak, 0,5 % NaCl , 0,3 %
pepton dan 2 % agar, dimasukkan ke dalam autoklaf selama 2 jam pada suhu 121
 .dipegang tabung dengan tangan kanan,dibuka tutup tabung labu

erlenmeyer,dipanaskan mulut tabung di api bunsen.dibuka tutup cawan petri dengan

ibu jari tangan kiri.dipanaskan mulut tabung erlenmeyer sebelum ditutup kembali
.cawan petri yang sudah berisi larutan media di tutup dan dibungkus dengan plastik

wrap, inkubasi cawan petri pada suhu 37 selama 24 jam.

Menggunakan jarum Ose

Diambil cawan petri yang berisi kultur murni dan ambil cawan petri yang
sudah berisi media agar.gunakan alkohol 70 % pada tangan dan alat.gunakan api
bunsen untuk memanaskan jarum ose kemudian didiamkan sampai dingin.setelah
itu ,buka cawan petri yang berisi media kemudian panskan pada api bunsen bagian
atasnya dan tutup agar uap air mengering.lalu diambil jarum ose dan didinginkan pada
media, lalu ambil kultur murni pada cawan petri dan digoreskan secara perlahan pada
kuadran masing-masing,lalu dipanaskan kembali cawan petri tersebut,tutup dengan
rapat dan bungkus dengan plastik wrap.Diinkubasi cawan petri pada oven suhu 37
selama 24 jam.jarum ose dipanaskan kembali dan dimasukkan ke dalam etanol

70%.lakukan hal yang sama pada media cair.

Menggunakan batang L
Diambil cawan petri yang berisi media agar,lalu dengan metode aseptik seperti

diatas masukkan 50 L air kran dan aquadest pada masing-masing cawan petri .

kemudian diratakan pada permukaan agar dengan batang L yang telah direndam
dalam etanol dan dipanaskan pada api bunsen.setelah merata , ditutup cawan petri
tersebut dan dibungkus dengan plastik wrap.Dinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
.
V. Data pengamatan
Tabel 1 : Foto pengamatan media tumbuh setelah dilakukan inkubasi

prosedur Foto pengamatan

Pembuatan media
padat agar dalam
cawan petri

Inokulasi dengan
jarum ose pada
cawan petri media
agar (streak)

Inokulasi dengan
jarum ose pada
media cair

Menggunakan
batang L pada cawan
petri media agar
(spread)
VI.Pembahasan
Mikroorganisme memerlukan nutrien pada media tumbuh untuk berkembang.Media
tumbuh yang biasa digunakan berupa media NB (Nutrient brooth) dan NA(Nutrient Agar).
Nutrient brooth berisi 0,3 % beef ekstrak , 0,5 % NaCl , 0,3 % pepton .Pada media agar (NA)
berisi kandungan yang sama dengan NB akan tetapi ditambahkan dengan 2% agar sehingga
pada NA akan berwujud padat sedangkan NB akan berwujud cair.Fungsi dari beef ekstrak
adalah sebagai kandungan karbohidrat sedangkan pepton berfungsi sebagai sumber protein
yang mengandung unsur nitrogen .Garam NaCl berfungsi sebagai ion penyeimbang yang
membantu dalam kegiatan metabolisme dan air yang digunakan untuk menjaga homostatik
dalam sel (Hadietomo,1993).Dalam mempersiapkan media tumbuh harus diperhatikan teknik
sterilisasi yang dilakukan dengan metoda aseptik. Prinsip bekerja dengan metoda aseptik
adalah menghilangkan mikroba pengganggu yang akan mempengaruhi pertumbuhan
mikroorganisme yang diinginkan.Larutan media yang dibuat harus dimasukkan ke dalam
autoklaf, bertujuan agar mikroba yang terkandung dalam larutan media tumbuh dapat mati
dengan adanya uap panas yang ditimbulkan oleh air yang mendidih dalam autoklaf.Pada

pengeporeasian autoklaf digunakan tekanan 15 psi dan suhu 121 .pemilihan suhu ini

didasarkan pada setiap tekanan berbeda, air memiliki suhu didih tertentu.Pada keadaan ini

tekanan yang dipakai adalah 15 psi sehingga suhu yang digunakan adalah 121 agar air

dapat mendidih, sama halnya bila bekerja pada tekanan 1atm maka air akan mendidih pada

suhu 100 ,sehingga suhu autoklaf akan diatur pada suhu tersebut.

Setelah mensterilkan mikroba penggangu yang terdapat dalam larutan media ,

dilakukan sterilisasi terhadap peralatan dan tempat kerja dengan menyemprotkan etanol 70
%. Etanol 70 % dapat membunuh mikroba dikarenakan etanol dapat menyebabkan mambran
lipid pada mikroba menjadi rusak,selain itu protein yang terdapat pada mikroba dapat
mengalami denaturasi sehingga cairan sitosol akan keluar dan akan meyebabkan susunan
DNA rusak.etanol yang dipakai adalah dengan konsentrasi 70 % , dikarenakan 30 % volume
air akan masuk ke dalam mambran berinteraksi dengan protein , etanol dengan 70 % volume
akan cendrung berikatan dengan kuat dengan air sehingga akan menimbulkan kerusakan pada
mambran dikarenakan kekuatan tarikan etanol terhadap air.Etanol dengan konsentrasi yang
sangat tinggi hanya dapat merusak mambran pada bagian luar saja dikarenakan ikatan antara
etanol dengan etanol lebih lemah jika dibandingkan dengan etanol dan air.Etanol juga dipilih
dikarenakan harganya yang murah , tidak berbahaya jika terkena kulit dan mudah menguap
sehingga sangat efisien.
Dalam bekerja juga diperlukan api bunsen yang digunakan sebagai sterilisasi bagian
peralatan yang berinteraksi dengan mikroorganisme.Hal ini dimaksudkan agar steril dari
mikroba yang ada di udara dan tujuan setelah pelakuan dibakar kembali supaya sisa
mikrorganisme yang ada pada alat setelah pemakaian tidak lepas ke lingkungan , yang akan
membahayakan kesehatan dan lingkungan.Selain itu juga , cawan petri yang digunakan juga
di sterilisasikan dengan memasukkannya ke dalam oven dan membungkusnya dengan kertas
(Dry heat sterilization) .Setelah larutan media dimasukkan ke dalam cawan petri, lalu di tutup
dengan membungkusnya dengan plastik wrap yang bertujuan agar kontaminasi udara dapat

diminimalkan.Lalu, dilakukan inkubasi selama 24 jam pada suhu 37 .Waktu 24 jam

dipilih karena bakteri dapat tumbuh dalam waktu 18 jam dan akan sempurna

perkembangannya bila lebih dari 18 jam.Suhu 37 dipakai karena bakteri E coli yang

diduga menjadi kontaminan dalam media tumbuh memilki suhu optimum 37 .

Setelah dilakukan inkubasi terhadap media tumbuh agar, tidak ditemukan adanya
bintik ataupun garis yang menunjukkan pertumbuhan koloni bakteri sehingga dapat
dipastikan bahwa pembuatan media tumbuh agar, sudah berhasil dilakukan dengan metoda
aseptik yang bebas terhadap mikroorganisme pengganggu.

Selanjutnya, dilakukan pemindahan bakteri dari satu media ke media baru yang
dikenal dengan teknik inokulasi.bakteri yang dipindahkan disebut dengan inokulum.
inokulasi mikroba umumnya menggunakan alat yang disebut sebagai jarum ose yang
berfungsi menginokulasi kultur mikroba serta memindahkan suatu kultur mikroba (koloni)
pada suatu media ke media lainnya. Jarum ose terdiri atas dua macam yaitu loop inoculation
dan needle innoculation. Perbedaanya, loop innoculation sering dipakai untuk memindahkan
bakteri sedangkan needle innoculation dipakai untuk memindahkan spora terutama pada
bahagian hifanya.Selain itu, needle innoculation juga dapat dipakai untuk inokulasi dengan
metoda tusuk.Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni ataupun
inokulasi mikroba antara lain:

1. Metoda streak
 Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu,
tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan.
Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum
digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawan petri dengan jarum pindah
(lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup
terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada
medium pembiakan padat bentuk lempeng. Ada beberapa teknik dalam metode
goresan, antara lain:

Gambar 1. Teknik goresan pada medium tumbuh(atlas ,1997)

2. Metoda tebar

Setetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar dalam cawan petri
(petridish) dengan menggunakan batang kaca yang bengkok (batang L) dan steril.
Inokulasi dengan metodaa tebar memiliki keuntungan karena pertumbuhan koloni
menjadi lebih merata.

3. Metode tuang

Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan

pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat
hanya ditemukan satu sel di dalam tabung.

4. Metode tusuk

Metode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum
ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media.
 Selanjutnya, dilakukan pula inokulasi pada media cair dengan menggunakan metoda
aseptik yang sama , perbedaanya hanya terletak pada media tumbuh yang digunakan yaitu
dengan menggunakan media nutrient brooth tanpa menggunakan agar.Setelah proses

inokulasi siap, media dinkubasi pada inkubator selama 24 jam pada suhu 37

sedangkan pada media cair dilakukan inkubasi pada shaker dengan kecepatan 1600 rpm dan

suhu 37 .Perbedaan perlakuan ini disebabkan pada media agar berbentuk padat media

sudah homogen,sedangkan pada media cair ,blarutan media harus selalu homogen sehingga
pertumbuhan bateri semakin optimal.Setalah dilakukan inkubasi , terdapat adanya
kontaminan pada media agar,kontaminan ini dapat disebabkan adanya kontaminan dari udara
yang masuk dan metoda aseptik yang masih kurang baik.Untuk kontaminan yang berasal dari
udara dapat dihindari dengan memakai Laminar Flow dan Biological Cabinet Safety.Kedua
alat ini memiliki prinsip yang sama dimana , udara yang ada pada saat bekerja dalam cabinet
atau kotak selalu dikontrol dengan menyaring udara yang masuk dalam cabinet , sehingga
kontaminan dari udara dapat dihindari.Pada media cair bakteri, dapat tumbuh ditandai
dengan media tumbuh yang keruh setelah inkubasi jika dibandingkan dengan kontrol negatif.
Kekurangan menggunakan media cair adalah tidak dapat membedakan mikroorganisme ada
kontaminan atau tidak, dikarenakan indikator bakteri yang tumbuh hanya dapat dilihat dari
perubahan yang terjadi pada media yang dibandingkan dengan kontrol negatif,sehingga
kemurniannya hanya bisa dilihat dengan bantuan mikroskop.Selain itu ,jika ada kontaminan
sangat sulit memisahkanya secara langsung dan hanya bisa jika mikroorganisme dipindahkan
ke medium agar padat.

Metoda inokulasi lainnya adalah metoda tebar dengan menggunakan batang L.batang
L berfungsi untuk menebarkan mikroorganisme yang ditumbuhkan ke media padat dengan
merata.Mikroorganisme yang akan ditebarkan harus disuspensikan ke dalam larutan sehingga
dapat dinokulasi dengan baik dan merata dengan batang L.Pada percobaan, digunakan sampel
cuplikan dengan air aqua dm dan air kran.Setalah dilakukan inkubasi dengan kondisi yang
sama dengan sebelumnya didapatkan pertumbuhan mikroba yang memiliki morfologi koloni
berbentuk titik putih.Pertumbuhan koloni terbanyak adalah pada air kran.Hal ini
disebabkan,saluran air kran yang tidak dibersihkan dan air yang yang ada pada kran
bahagian mulut kran yang bersentuhan dengan udara kemungkinan besar terdapat mikroba
yang berasal dari udara .Pada aqua dm tumbuh mikroba dikarenakan botol aqua dm yang
digunakan tidak steril dan telah terkontaminasi dengan udara.Hal itulah yang mendasari
mengapa air minum yang berasal dari air mentah (air kran atau air sumur),harus direbus
terlebih dahulu,yakni dengan tujuan agar bakteri yang terdapat didalamnya dapat mati dengan
adanya pemanasan.Aqua dm yang digunakan juga harus di masukkan ke autoklaf sebelum
digunakan dalam percobaan yang menyangkut mikroorganisme supaya kontaminasi dari
mikroorganisme yang tidak diinginkan dapat dihindari.

VII. Kesimpulan
Telah dibuat media padat agar dengan hasil setalah dilakukan inkubasi tidak terdapat
pertumbuhan mikroorganisme.Inokulasi dengan menggunakan jarum ose pada medium agar ,
setelah diinkubasi tedapat mikroorganisme di luar jalur streak, yang menandakan bahwa
terdapat mikroorganisme yang tumbuh selain E coli.Pada medium cair , terjadi adanya
pertumbuhan bakteri setelah dilakukan inkubasi.Aqua dm dan air kran mengandung bakteri
setelah diinokulasi dan di inkubasi pada cawan petri medium agar.
VIII. Daftar Pustaka

Atlas,R.M.1997.Principles of Microbiology.Wm.C.Brown Publisher:Iowa

Hadioetomo,R.S.1993.Mikrobiologi Dasar dalam Praktik.Gramedia: Jakarta halaman 125-

127

Lay,B.1994.Analisis Mikroba di laboratorium.PT Raja Grafindo Persada: Jakarta

Lim.D.1998.Microbiology,2nd edition.MC Graw-Hill book: New york page 214-217