ABSTRAK

KARAKTERISASI PERAN AIF MITOKONDRIA DALAM

REGULASI KEMATIAN SEL TERPROGRAM YANG
DIINDUKSI OLEH MOLEKUL SITOTOKSIK

Oleh
Hesti Lina Wiraswati
NIM: 30511015
(Program Studi Doktor Kimia)

Mitokondria merupakan organel yang memiliki dua fungsi. Pada sel sehat,
mitokondria berperan sebagai pabrik energi yang sangat diperlukan bagi
kelangsungan hidup sel. Pada beberapa kondisi yang ditimbulkan oleh agen stress,
mitokondria mengarahkan sel untuk berada pada fase kematian yang tidak dapat
balik. Molekul sitotoksik dapat mempengaruhi kelangsungan hidup sel, tidak hanya
memprovokasi terjadinya gangguan fungsi mitokondria, tetapi juga menyebabkan
pelepasan protein-protein letal mitokondria ke sitoplasma. Salah satu protein
tersebut adalah Apoptosis-Inducing Factor (AIF), yang awalnya diketahui sebagai
efektor kematian yang bebas kaspase. Pada sel-sel yang terinduksi untuk mati,
melalui permeabilitas membran luar mitokondria, AIF yang semula berada di dalam
mitokondria akan bertranslokasi ke sitoplasma, lalu ke inti sel untuk berpartisipasi
dalam kondensasi kromatin dan degradasi DNA. Disamping regulasinya dalam
kematian sel, AIF memainkan peran vital dalam mitokondria pada sel sehat, yaitu
dengan meregulasi aktivitas rantai respirasi. Baru-baru ini diusulkan adanya fungsi
tambahan pada AIF (dalam konteks regulasinya pada rantai respirasi), AIF
memiliki aktivitas dalam metabolisme senyawa kuinon, salah satunya adalah
menadione (2-methyl-1,4-naphtoquinone; vitamin K3), dengan bertindak sebagai
NAD(P)H : kuinon reduktase, dengan memfasilitasi reaksi reduksi kuinon menjadi
senyawa semikuinon atau hidrokuinon yang bersifat toksik. Reduksi menadion
dikaitkan dengan kecepatan siklus redoks yang berkonsekuensi pada terjadinya
stress oksidatif di dalam sel. Selain reduksi, menadion bisa melakukan arilasi
dengan antioksidan glutation (GSH) dengan membentuk senyawa tiodion yang juga
bersifat toksik. Oleh karena itu, memahami metabolisme seluler kuinon merupakan
hal penting dalam bidang onkologi karena senyawa kuinon telah berhasil
dieksplorasi berkaitan dengan potensi anti kankernya. Selain itu, mempelajari peran
kematian AIF mitokondria sangat penting, khususnya berkaitan dengan
perkembangan resistensi kanker dan kontribusinya dalam penemuan target terapi
baru.

Penelitian ini didedikasikan untuk melakukan karakterisasi AIF mitokondria

sebagai dampak dari sitotoksisitas salah satu jenis senyawa kuinon, yaitu
menadione. Lini sel U2OS yang berasal dari osteosarcoma manusia digunakan
sebagai model sel dalam studi ini. Beberapa percobaan yang bersesuaian untuk

i
mempelajari respon sel terhadap menadione telah dilakukan, diantaranya kultur sel
mamalia, perlakuan sel dengan obat, dan transfeksi sel dengan siRNA (small
interference Ribonucleic Acid). Pendekatan berbasis flow cytometry diterapkan
untuk mengamati dan menganalisa perubahan-perubahan yang terjadi pada sel-sel
U2OS terhadap induksi menadione. Studi komputasi dilakukan untuk mengevaluasi
dan menganalisa interaksi gugus fungsi menadione terhadap residu-residu AIF.
Beberapa perangkat lunak digunakan untuk mendukung studi in silico ini
diantaranya; penjajaran struktur 3D protein menggunakan program FATCAT dan
studi docking menggunakan program AutoDock vina untuk mengevaluasi dan
menganalisa peran AIF mitokondria dalam metabolisme menadion.

Hasil penelitian menunjukkan bahwa AIF berkontribusi pada kematian sel yang
diinduksi oleh menadion, pada kondisi dimana induksi ini tidak menyebabkan
hilangnya permeabilitas membran mitokondria atau dengan kata lain AIF
melakukan aksi letalnya tetap di dalam mitokondria (tidak dengan menggunakan
aktifitas nukleasenya yang menuntutnya untuk keluar dari mitokondria). Tipe
kematian sel yang diinduksi oleh menadion adalah apoptosis, dengan jalur kematian
bebas kaspase. Pengujian dengan inhibitor kompleks I rantai respirasi (rotenone)
mengungkapkan bahwa efek sitoprotektif akibat ketiadaan AIF tidak bergantung
pada aktivitas rantai respirasi. Fenomena ini sekaligus mengungkapkan bahwa aksi
letal AIF tidak ada kaitannya dengan aksinya sebagai NADH:quinone reduktase.
Flow cytometry juga menunjukkan terbentuknya tiodion, yang juga diketahui
sebagai peristiwa yang mendahului kematian sel akibat menadion. Teknik siRNA
mengungkapkan bahwa tingkat tiodion mengalami penurunan pada sel-sel tanpa
AIF. Keterlibatan AIF dalam proses arilasi menadion dikuatkan dengan terjaganya
ketinggian tingkat GSH pada sel-sel tanpa AIF. Semua hasil ini mengungkapkan
bahwa AIF berperan dalam memfasilitasi toksisitas menadion, lebih spesifiknya
dengan meningkatkan arilasi protein sel dan penurunan tingkat GSH. Studi
komputasi mengkonfirmasi keterlibatan AIF pada kematian sel, dengan
mengungkapkan kestabilan interaksi AIF-menadione yang lebih tinggi 20%
dibandingkan dengan NQO1-menadione (enzim mitokondria yang terlibat dalam
reduksi dua-elektron senyawa golongan kuinon). Hasil penjajaran struktur AIF
dengan enzim transferase GST (glutation-S-transferase) menunjukkan bahwa AIF
tidak memiliki residu katalitik transferase. Analisa energi afinitas mengungkapkan
bahwa tiodion memiliki afinitas dengan AIF lebih baik dibandingkan prekursornya;
menadione atau GSH. Lebih lagi, meskipun jumlah residu pengenal tiodion sampai
45 % lebih tinggi dibandingkan dengan prekursornya, lebih dari setengah struktur
tiodion tidak berhimpit dengan FAD, bahkan menjauhi struktur AIF. Sementara itu
struktur menadione/GSH posisinya berhimpitan dg FAD dan bahkan terkubur di
dalam struktur AIF. Hal ini semakin menguatkan kesimpulan bahwa AIF
memfasilitasi proses arilasi menadion dengan melakukan stabilisasi tiodione, bukan
dengan berinteraksi dengan menadion atau GSH secara langsung.

Kata Kunci: apoptosis, mitokondria, AIF, menadion

ii
 ABSTRACT

CHARACTERIZATION OF THE ROLE OF THE

MITOCHONDRIAL AIF IN THE REGULATION OF
PROGRAMMED CELL DEATH INDUCED
BY CYTOTOXIC MOLECULES

By
Hesti Lina Wiraswati
NIM: 30511015
(Doctoral Study Program of Chemistry)

While in healthy cells, through the activity of its respiratory chain, the
mitochondrion acts as an energy factory and is necessary for cell survival, it is
established that in various conditions of stress stimuli, this organelle plays an
important role in the cellular response to death decision. Cytotoxic molecules can
affect cell survival by not only provoking the disruption of vital mitochondrial
functions but also by causing the release of mitochondrial proteins into the
cytoplasm. The lethal action of those proteins can take the cell to the irreversible
phase of death. One of these proteins is AIF (Apoptosis-Inducing Factor) that was
initially as caspase-independent death. In cells induced to die, upon mitochondrial
outer membrane permeabilization, AIF is translocated to the nucleus, where it
fulfills its lethal action by participating to the chromatine condensation and
degradation. AIF plays also an indispensible role in the mitochondrion of the
healthy cell by regulating the activity of the respiratory chain. Recently, it was
proposed that in addition to the regulation of the respiratory chain machinery, the
mitochondrial activity of AIF could also be implicated in the reduction of molecules
belonging to the quinones family by acting as a NADPH:quinone reductase (such
as menadione, 2-methyl-1,4-naphtoquinone), facilitated the formation of
semiquinone radical or hydroquinone that associated with rapid redox cycling to
lead oxidative stress in the cell. Menadione cytotoxicity also associated with its
arylation capacity with an important thiol proteins to form menadione-S-conjugate
compound that toxic to the cell. As the cellular reduction and metabolization of
quinones is established to be an important prerequisite for their cytotoxicity,
understanding their cellular metabolization is of great importance in the field of
oncology because members of this family have been successfully explored for their
anti-tumor activity. Moreover, study the role of mitochondrial AIF is important,
especially related to the development of cancer resistance and could contribute for
finding a new cancer therapies aimed and targeting AIF.

The research program was dedicated to the characterization of the impact of the
mitochondrial activity of AIF on the cytotoxicity of menadione, a compound that
belongs to the quinone family. The U2OS cell line used as model for the study was
derived from a human osteosarcoma. Mammalian cell culture, drug treatment, and

iii
transfection experiments with siRNA (small interference Ribonucleic acid) were
employed in order to study the cell respons to drug. Flow cytometry-based
approaches were applied in order to study the cytotoxic effects of menadione on
U2OS cells. Computational approaches were applied to evaluate and analysis the
interaction of functional groups of menadione to AIF residues. Structural alignment
was employed using FATCAT software. Molecular docking studies were performed
by AutoDock Vina software in order to evaluate and analyze the role of
mitochondrial AIF to menadione metabolism.

The result showed the contribution of AIF to cell death induced by menadione, in
condition this drug does not cause the loss of mitochondrial membrane
permeabilization (MMP). It indicates that AIF stays in mitochondria to act its lethal
activity and does not use its nuclease apoptotic function. Type of death by
menadione induction is apoptosis in caspase-independent manner. Inhibition of
Complex I of respiratory chain revealed that the cytoprotective effect of AIF
depletion is independent-respiratory chain activity. It also suggests that the lethal
action of AIF is not related to NADH:quinone reductase activity. Flow cytometry
analysis showed the appearance of tiodione formation that also early event of cell
death induced by menadione. siRNA technique also showed that AIF depletion
reduced thiodione formation. This cytoprotective effect was accompanied by the
maintenance of high levels of reduced gluthatione (GSH), which are normally
depleted by menadione. Altogether, these results revealed that AIF facilitate
menadione toxicity, thereby precipitating protein arylation and gluthatione
depletion. Finally, computational study confirmed the involvement of AIF in
menadione-induced death that showed AIF-menadione has interaction stability
20% higher than NQO1-menadione (enzyme that responsible to complete reduction
of quinone). Structural alignment between AIF and Gluthatione-S-transferase
(GST) showed that AIF does not have transferase catalytic residues. Binding energy
analysis showed that thiodione has better affinity to AIF compare to GSH or
menadione. Although the number of contact residues that surrounds thiodione is 45
% higher compare to menadione or GSH, more than half of thiodione structure is
not in frame of FAD position, even being outside the AIF. Meanwhile the structure
of menadione and GSH is in frame of FAD position and were buried inside FAD
domain of AIF. It indicated that AIF modulates conjugation process by means of
stabilizing thiodione formation rather than interact with menadione or GSH
directly.

Keywords: apoptosis, mitochondria, AIF, menadione

iv