Analisis Clostridium botulinum pada kornet

daging sapi
(SNI 01-3775-2006)
Prinsip
Pertumbuhan Clostridium Botulinum pada cooked meat
medium yang kemudian diamati adanya kekeruhan, produksi
gas dan bau.Secara mikroskopis menghasilkan Gram positif
dengan spora oval subterminal.
Syarat Mutu
Cemaran mikroba Clostridium botulinum : 0 koloni/g
 Perbenihan, pengencer, dan
Peralatan pereaksi
a) Pembuka kemasan
a) Cooked Meat Broth (Gunakan salah
b) Anaerobik Jars satu liver atau heart medium)
c) Cawan Petri Chopped Liver Broth
d) Tabung reaksi Cooked Meat medium
b) Trypticase Peptone Glucose Yeast
e) Mikroskop Ekstrak (TPGY) Broth atau dengan
f) Pipet Trypsin (TPGYT)
g) Pinset/penjepit c) Liver Veal Egg Yolk Agar atau
Anaerobik Egg Yolk Agar
h) Inkubator terkalibrasi Liver Veal Egg Yolk Agar (LVEY)
i) Refrigerator Anaerobik Egg Agar
j) Mortar d) Gel Phosphate Buffer
k) Loop/ose e) Alkohol absolut steril
f) Pewarnaan Gram.
l) Gelas kultur
m) Lyophilized
 Cara Kerja
Uji pendahuluan
a) Makanan Padat
Pindahkan secara aseptik dengan sedikit atau yang terbebas dari cairan ke
dalam mortar steril. Tambahkan Gel Phosphate Buffer Steril. Atau dengan
cara lain, inokulasikan sebagian kecil contoh uji dengan gunting tang ke
dalam Enrichment broth
b) Makanan Cair
Inokulasikan contoh dengan pipet steril yang dituangkan kedalam
Enrichment Broth.
c) Makanan Kaleng
Contoh dibersihkan dengan larutan alkohol-iodine kemudian kaleng
dibuka
 Uji visual
Penampilan,bau,adanya tanda kebusukan
Produk jangan dirasakan dibawah keadaan
sekitar
 Uji cadangan
Secara aseptik, kultur dipindahkan ke jars
yang steril untuk uji berikutnya yang mungkin
diperlukan
 Deteksi Clostridium botulinum
a) Uji Pengkayaan
Hilangkan oksigen dari media yang akan dipakai sebelum
diinokulasi, dengan cara :
Panaskan media tersebut selama 10 menit sampai15 menit dan
didinginkan dengan cepat tanpa bergejolak
Inokulasikan 2 tabung yang berisi Cooked Meat Broth dengan 1 gr
sampai 2 gr contoh padatan atau 1 ml sampai 2 ml makanan cairan
atau ekstrak/15 ml
Media. Inkubasikan pada 35 C. Dengan cara yang sama inokulasi 2
tabung dengan media TPGY dan diinkubasi pada 26 C.
b) Pengujian
Setelah 5 hari diinkubasi, uji kultur dengan
turbidimetri, adanya produksi gas,
pencernaan partikel daging dan bau busuk.
Lakukan pengujian mikroskopik dengan fase
kontras dengan pewarnaan gram, kristal
violet atau biru methilin
c) Perlakuan Selanjutnya
Biasanya setelah 5 hari inkubasi
menghasilkan pertumbuhan yang subur dan
konsentrasi toxin yang tinggi dengan puncak
spora yang baik. Kultur dikembalikan ke
dalam kulkas untuk isolasi kultur murni
Jika dalam waktu 5 hari tidak ada
pertumbuhan, inkubasi ditambahkan sampai
10 hari untuk melihat adanya germinasi
spora Clostridium botulinum sebelum
dihancurkan secara steril.
 Isolasi kultur murni
Jika spora tumbuh baik, Clostridium botulinum
dapat diisolasi dengan baik dari campuran
flora didalam kultur pengkayaan atau contoh
aslinya.
 1. Perlakuan Awal
Tambahkan dengan volume yang sama alkohol
absolute steril ke dalam 1 ml sampai 2 ml kultur atau
contoh ke dalam tabung yang bertutup ulir. Campur
dengan baik dan inkubasikan pada temperatur kamar
selama 1 jam.
Cara lain, Panaskan 1 ml sampai 2 ml kultur
pengkayaan selama 10 menit sampai15 menit pada
suhu 80C untuk mematikan sel vegetatif.
(Jangan kerjakan pemanasan untuk Clostridium
botulinum type non proteolitik)
 2. Plating
Dengan loop inokulasi, streak 1/2 loop penuh dengan
kultur ke dalam cawan Petri berisi media Liver Veal
Egg Yolk atau Anaerobik Egg Yolk Agar atau
keduanya untuk mendapatkan isolasi koloni.

Inkubasikan cawan Petri selama 48 jam pada suhu

35C dibawah kondisi anaerobik dalam anaerobik jar
atau gas pak atau yang setara.
 3. Seleksi koloni
Koloni tipikal akan tumbuh menumpuk atau membentuk permukaan datar
yang halus atau kasar dan biasanya menunjukan penyebaran yang tidak
beraturan ditepinya.
Pada media Egg Yolk koloni biasanya menunjukan permukaan yang berwarna
warni saat diuji dengan lampu.
Daerah ini biasa dkenal dengan lapisan bermutiara
Daerah ini biasanya meluas dan mengikuti bentuk garis dari koloni yang tidak
beraturan tadi.
Selain daerah seperti mutiara,koloni tipe C,D, dan E biasanya dikelilingi
daerah endapan berwarna kuning selebar 2 mm sampai 4 mm, sedangkan
koloni tipe A dan B umumnya menunjukan daerah endapan yang lebih
pendek
Tidak semua tipe koloni menghasilkan toxin, beberapa keluarga genus
Clostridium botulinum mempunyai sifat bentuk yang khas tetapi tidak
menghasilkan toxin
 4. Kultur
Dengan menggunakan loop steril, inokulasikan setiap
10 koloni terseleksi kedalam tabung medium steril:
1. TPGY Broth untuk Clostridium botulinum tipe E,
inkubasikan 5 hari pada suhu 26 C dan
2. Cooked Meat Broth untuk toxin tipe lain, inkubasikan
selama 5 hari pada suhu 35 C.

Gunakan kultur untuk uji penegasan dan deteksi

serta identifikasi toxin.
 5. Penegasan
Streak kultur dari langkah D secara duplo pada cawan petri yang berisi
media Egg Yolk Agar.
Inkubasikan salah satu petri tersebut secara anaerob dan petri yang lain
secara aerobik pada suhu 35 C.
Jika koloni Clostridium botulinum tumbuh pada cawan Petri yang
anaerobik dan tidak tumbuh pada yang aerobik maka kultur tersebut
murni
Kesalahan isolasi Clostridium botulinum dari koloni yang terseleksi
menunjukan bahwa populasi relatifnya terhadap campuran flora rendah.
Ulangi tahapan pemindahan melalui tahap tambahan pengkayaan.
E(A)/Deteksi Clostridium botulinum. Ini mungkin akan meningkatkan
jumlah koloni yang cukup untuk isolasi.
Simpan Kultur Murni didalam kulkas, pada gelas kultur/glass beads atau
lyophilized.