LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM BIOKIMIA

PERCOBAAN 1

ISOLASI DAN PEMURNIAN AWAL -AMILASE

Disusun oleh: Kelompok 1

Monica Puspita Sari 24030115120004

Asisten : Safiatur Rohmag 24030113120027

DEPARTEMEN KIMIA

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

SEMARANG
2017
 ABSTRAK
Percobaan Isolasi dan Pemurnian Awal Enzim -amilase bertujuan untuk
memperoleh enzim -amilase dari sumber organisme melalui pemurnian awal enzim.
Sampel yang digunakan adalah kecambah. Enzim -amilase merupakan enzim yang
dapat menguraikan amilum dengan memutuskan ikatan -1,4 glikosida dalam pati
secara acak dari bagian dalam molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Prinsip
dari percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang didasarkan pada
pengendapan protein dengan cara salting-out (penambahan ammonium sulfat yang
merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan
protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul air dari permukaan molekul
protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi (yaitu proses pemurnian protein
yang didasarkan pada pengendapan secara bertahap)/ dan sentrifugasi (yaitu proses
pemurnian protein yang didasarkan pada pengendapan dengan cara
sentrifugal/perputaran).Hasil yang diperoleh ialah suatu enzim enzim -amilase yang
telah murni. Dimana semakin besar penambahan ammonium sulfat maka semakin kecil
endapan yang terbentuk, dengan kata lain enzim semakin murni.Hasil uji kualitatif
setelah penambahan amilum dan larutan iodin yaitu,ekstrak kasar berwana merah
kecoklatan menandakan adanya protein, Fraksi I dan II berwanamerah kecoklatan
memudar yang hasil positif adanya enzim -amilase yang menghidrolisis amilum
menjadi glukosa. Tapi pada Fraksi II proses memudarnya warna ungu lebih cepat
dibandingkan pada Fraksi I

Kata kunci: (Enzim -amilase, Sentrifugasi, Fraksinasi, Kecambah)

 LEMBAR PENGESAHAN

Semarang, 1 November 2017

Asisten, Praktikan,

Safiatur Rohmag Monica Puspita Sari

24030113120027 24030150120004
IV. DATA PENGAMATAN
No Perlakuan Hasil
1 Isolasi enzim -amilase Diperoleh ekstrak kasar yan
- 200 g kecambahdi homogenisasi berwarna putih keruh yang
dengan aquades hingga halus setelah ditambahkan amilum
- penyaringan dengan kain warnanya menjadi ungu kebiruan
- Filtrat disentrifugasi pada 3000
rpm selama 10 menit
- Ekstrak kasar di Uji aktifitas -
amilase (Kualitatif : dengan
substrat amilum 1% dan larutan
iodin

2 Pemurnian awal enzim -amilase Diperoleh ekstrak yang berupa

50 ml - Ekstrak kasar 50 ml + ammonium larutan berwarna ungu kental,
sulfat lebih kental daripada ekstrak
- Pengadukan menggunakan kasarnya.
magnetik stirer
- Pendinginan Setelah penambahan iodine
- Campuran disentrifugasi warna larutan menjadi:
- Endapan disuspensi Fraksi 1: merah kecoklatan
- Enzim diuji aktifitas -amilase Fraksi 2: merah kecoklatan
(Kualitatif : dengan substrat
amilum 1%)
VI. PEMBAHASAN

Percobaan ini berjudul Isolasi dan Pemurnian Enzim Amilase dengan tujuan
untuk memperoleh enzim -amilase dari sumber organisme melalui pemurnian
awal. Sampel yang digunakan adalah kecambah karena mengandung enzim
amilase. Enzim -amilase merupakan enzim yang dapat menguraikan amilum
dengan memutuskan ikatan -1,4 glikosida dalam pati secara acak dari bagian dalam
molekul, baik pada amilase maupun amilopektin. Pada proses isolasi enzim
amylase. Prinsip dari percobaan ini yaitu, pemurnian protein tahap awal yang
didasarkan pada pengendapan protein dengan cara salting out(penambahan
ammonium sulfat yang merupakan tahap awal dari pemurnian protein yang
didasarkan pada pengendapan protein dengan tujuan untuk membebaskan molekul
air dari permukaan molekul protein). Metode yang digunakan adalah fraksinasi dan
sentrifugasi. Fraksinasi adalah pemisahan dengan cara pengendapan secara
bertahap. Fraksinasi digunakan sebagai teknik pemisahan komponen organik dan
ionik (larut dalam air) dalam suatu senyawa campuran menjadi dua fraksi.
Sentrifugasi yaitu suatu teknik pemisahan yang dilakukan berdasarkan partikel
dalam medan gaya sentrifugal.

Tabel 1. Kandungan Gizi Kecambah per 100 gram

Kalori (kcal) 22
Jumlah Lemak 0,7 g
Lemak jenuh 0,1 g
Lemak tak jenuh ganda 0,4 g
Lemak tak jenuh tunggal 0,1 g
Kolesterol 0 mg
Natrium 6 mg
Kalium 79 mg
 Jumlah Karbohidrat 2,1 g
Serat pangan 1,9 g
Gula 0,2 g
Protein 4 g
Vitamin A 155 IU Vitamin C 8,2 mg
Kalsium 32 mg Zat besi 1 mg
Vitamin D 0 IU Vitamin B6 0 mg
Vitamin B12 0 g Magnesium 27 mg
(Direktorat Gizi Depkes RI, 1981)

6.1. Isolasi Enzim -amilase

Dalam percobaan ini digunakan kecambah. Kecambah terlebih dahulu

dihaluskan menggunakan blender dengan tujuan agar dinding sel hancur
sehingga semua komponen yang terkandung dalam kecambah dapat keluar
termasuk enzim -amilase. Penghomogenan dengan aquades dikarenakan enzim
-amilase larut dalam pelarut air karena sifat keduanya yang sama-sama polar,
struktur enzim -amilase adalah:

Gugus OH yang terikat pada atom C itulah yang menyebabkan enzim -amilase
menjadi bersifat polar, seingga dapat berikatan dengan molekul air melalui ikatan
hidrogen
 Karena enzim dapat larut dalam aquadest, maka enzim -amilase akan
terkandung didalam filtrat setelah dilakukan penyaringan.

Pelarutan dengan pelarut organik lainnya sebenarnya dapat dilakukan, namun

hal dapat mengganggu karena adanya pendenaturasian dengan gugus-gugus
tertent. Misalnya pelarut alkohol. Pelarut alkohol seperti air tetapi karena pH
yang tidak sesuai yaitu < 7 maka akan menyebabkan enzim terdenaturasi.
Mekanisme pendenaturasian protein:

1. Denaturasi Protein karena Panas

Panas dapat memutuskan ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non polar
yang menopang struktur sekunder dan tersier molekul protein. Hal ini
disebabkan suhu yang tinggi meningkatkan energi kinetik sehingga
menyebabkan molekul penyusun protein bergetar sangat cepat yang
mengakibatkan sisi hidrofobik dari gugus samping molekul polipetida akan
terbuka.
2. Denaturasi Protein karena Asam dan Basa
Asam dan basa dapat memutuskan jembatan garam pada struktur tersier
protein. Hal ini dsebabkankan asam dan basa akan terdisosiasi menjadi
produk bermuatan ionik. Mekanisme denaturasi berlangsung ketika terjadi
reaksi substitusi antara ion positif dan negatif di dalam garam dengan ion
positif dan negatif yang berasal dari asam atau basa yang ditambahkan.
3. Denaturasi Protein karena Logam Berat
Reaksi yang terjadi pada logam berat dengan protein mengakibatkan
terbentuknya protein logam yang tidak larut. Protein akan mengalami
presipitasi bila bereaksi dengan ion logam. Pengendapan oleh ion positif
(logam berat) diperlukan pH larutan di atas pI karena protein bermuatan
negative begitu pula sebaliknya. Ion-ion positif tersebut adalah : Ag+, Ca2+,
Zn2+, Hg2+, Fe2+, Cu2+ dan Pb2+. Sedangkan ion-ion negatif meliputi : ion
salisilat, triklorasetat, piktrat, tanat dan sulfosalisilat. Logam berat juga
merusak ikatan disulfida karena afinitasnya yang tinggi dan kemampuannya
untuk menarik sulfur sehingga mengakibatkan denaturasi protein.
Setelah diperas, kemudian kita ambil filtratnya dan masukan dalam 4
wadah dengan volume yang sama. Filtrat disentrifugasi 2 rpm selama 10
menit untuk memisahkan supernatan dari residunya. Partikel yang berbeda
dalam berat jenis, ukuran, dan bentuk akan mengendap searah dengan gaya
sentrifugal dengan kecepatan yang berbeda. Kecepatan tergantung dengan
gaya sentrifugal yang mengenai partikel searah dengan jari-jari radial ke arah
luar (menjauhi sumbu) (Lehninger, 1999). Partikel yang dihasilkan sedikit
dipengaruhi oleh rpm yang tinggi dan membutuhkan waktu yang lama.

Hal ini berarti molekul/senyawa yang memiliki berat molekul yang

besar akan mengendap sebagai residu sedangkan molekul/senyawa yang
memiliki berat molekul yang kecil akan terkandung di dalam filtrat. Enzim
-amilase akan terkandung di dalam filtrat, sedangkan serat serat kasar dari
sampel kecambah menjadi residunya. Residu yang terbentuk berupa
karbohidrat, kalori, serat zat besi, kalsium, vitamin A, vitamin C dsb.
Supernatan ini merupakan ekstrak kasar enzim yang diperkirakan
mengandung enzim -amylase. Enzim kasar yang diperoleh tersebut
disimpan terlebih dahulu dalam botol vial yang nantinya akan diuji
kualitatif.
6.2 Pemurnian Awal Enzim -amilase
Proses pemurnian tahap awal enzim -amilase dilakukan dengan
fraksinasi dengan menggunakan ammonium sulfat terhadap ekstrak enzim -
amilase yang dilakukan dengan penambahan garam untuk mengendapkan
protein. Prinsip dari fraksinasi ammonium sulfat ini adalah proses pemurnian
protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein dengan
carasalting out.Salting out merupakan keadaan apabila ditambahkan garam
yang berkonsentrasi tinggi maka kelarutan protein akan menurun pada titik
dimana protein akan terpresipitasi dengan sempurna dari larutan (Lehninger,
1999).
Proses pemurnian dilakukan secara bertahap dengan berbagai fraksi
dengan tujuan untuk memperoleh enzim yang benar-benar merupakan enzim -
amilase. Dengan demikian dapat diketahui secara pasti enzim -amilase akan
terendapkan secara optimum pada berapa banyak kadar garam (NH4)2SO4 yang
ditambahkan.
Tahap selanjutnya adalah pemurnian awal enzim -amilase yang
didapatkan dari enzim kasar, sebanyak 50 ml diambil kemudian ditambahkan
amonium sulfat, proses ini disebut sebagai fraksinasi amonium sulfat terhadap
ekstrak enzim -amilase. Fraksinasi amonium sulfat adalah proses pemurnian
protein tahap awal yang didasarkan pada pengendapan protein tahap awal
dengan cara penambahan garam. Pada percobaan ini garam yang digunakan
adalah garam ammonium sulfat, karena garam ammonium sulfat ini merupakan
garam divalent. Dalam hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam ini
mempunyai beberapa keuntungan antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi
(533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan pada umumnya tidak
mempengaruhi struktur proein. Garam ini dapat diganti dengan garam lainnya,
tetapi garam tersebut harus garam divalent misalnya CaCl2 (Brayer, 1995),
tetapi dalam percobaan ini garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, lebih efektif
daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan KCl. Penggunaan garam
yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim didalam air.
Dalam percobaan ini dipilih variasi fraksi amonium sulfat 0-20 dan
fraksi 20-40, dimana variasi fraksi tersebut bertujuan untuk memperoleh enzim
yang benar-benar merupakan enzim -amilase. Dengan demikian dapat
diketahui secara pasti enzim -amilase akan terendapkan secara optimum pada
berapa banyak kadar garam (NH4)2SO4 yang ditambahkan.
Dalam hal ini digunakan garam (NH4)2SO4 karena garam ini
mempunyai beberapa keuntungan antara lain yaitu kelarutan dalam air tinggi
(533g/L) pada suhu 20oC, harganya murah dan pada umumnya tidak
mempengaruhi struktur proein. Garam ini dapat diganti dengan garam lainnya,
tetapi garam tersebut harus garam divalent misalnya BaCl2 (Brayer, 1995).
Penggunaan garam yang berbeda akan mempengaruhi kelarutan enzim didalam
air.
Campuran didinginkan, fungsinya untuk mencegah denaturasi protein
yang mengakibatkan aktivitas enzim menurun. Tetapi jika terlalu dingin maka
aktivitas enzim -amilase juga kurang optimal. Oleh karena itu pendinginan
dilakukan dalam waktu kurang lebih 30 menit. Proses pengadukan dengan
stirer dilakukan dengan tujuan untuk mempercepat proses pelarutan. Semakin
banyak garam ammonium sulfat yang ditambahkan maka semakin sulit atau
semakin lama waktu yang dibutuhkan untuk proses pelarutan tersebut. Karena
semakin besar tingkat fraksinasinya, maka semakin besar konsentrasi enzim
dan garam ammonium sulfatnya. Sehingga dengan semakin besar konsentrasi
enzim tersebut, maka protein akan semakin murni/semakin cepat terhidrolisis.
Dengan semakin murninya protein, maka kemampuam amonium sulfat untuk
mengendapkan protein semakin kecil, karena protein tersebut sudah
mengalami hidrolisis.
 Endapan enzim tersebut dapat dipisahkan dengan melakukan
sentrifugasi kembali. Endapan yang dihasilkan merupakan enzim -amilase
fraksi I, yang kemudian disuspensikan dengan buffer fosfat. Fungsi
penambahan buffer fosfat adalah sebagai larutan penyangga agar pH-nya
tidak berubah. Aktivitas -amilase berada pada range pH 5,4-6,4, maka
digunakan buffer fosfat dengan pH 6,1 (buffer asam), di mana pH ini
merupakan pH optimum aktivitas -amilase.

Filtrat yang dihasilkan dari sentrifugasi fraksi I (0-20) tersebut

kemudian digunakan sebagai bahan fraksinasi yang kedua (20-40). Prosesnya
sama seperti pada proses fraksinasi pertama, namun untuk fraksi kedua ini
ditambahkan amonium sulfat sebesar 5.78 gram karena besarnya volume yang
dihasilkan berbeda.
Setelah diperoleh endapan dari fraksi I dan II, selanjutnya dilakukan
analisis kualitatif terhadap kedua sampel tersebut dan juga pada ekstrak
kasarnya. Analisis kualitatif ini dilakukan dengan menambahkan amilum dan
larutan iodin. Digunakannya amilum karena enzim -amilase sendiri dapat
menghidrolisis amilum. Sedangkan ditambahkannya iodin digunakan untuk
menunjukan terjadinya hidrolisis oleh enzim -amilase.Pada tahap awal
amilum ditambahkan iodin dengan volume yang sama yang nantinya akan
digunakan sebagai larutan pembanding (kontrol). Hasil yang diperoleh
menjukkan bahwa pada fraksi pertama dan kedua saat ditambahkan iodin
tidak terjadi perubahan warna, setelah penambahan amilum terjadi perubahan
warna menjadi merah kecoklatan. Sedangkan untuk ekstrak kasarnya saat
diuji kualitatif didapatkan warna ungu. Dalam ekstrak kasar diperoleh hasil
larutan yang berwarna ungu, dimana hasil tersebut menunjukkan uji positif
dan menandakan bahwa dalam ekstrak kasar masih terdapat enzimnya. Warna
ungu terjadi karena adanya pembentukan kompleks amilum iodin. Setelah itu
larutan ditunggu selama 15 menit untuk melihat terjadinya perubahan warna.
 Setelah diamati perubahan warna untuk fraksi I dan II warna ungunya
menjadi pudar. Sedangkan yang membedakannya adalah proses perubahan
warna pada fraksi I lebih lama dibandingkan fraksi II.

Untuk reaksi-reaksi yang terjadi dapat dilihat dibawah ini:

a. Reaksi uji positif enzim amylase
Warna ungu terjadi karena adanya pembentukan kompleks amilum iodin.
Hasil yang diperoleh adalah terbentuknya warna ungu yang memudar. Hal
ini menunjukan bahwa setelah terhidrolsis amilum akan berubah menjadi
glukosa dan I- akan terlepas. Sehingga warna ungu akan memudar.
CH2 OH CH 2OH

O O
enzim amilase
OH OH + H2O
water
O O O
n
OH OH
2-(((4,5-dihydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(methoxymethyl)tetrahydro-2H -
pyran-3-yl)methoxy)methyl)-6-(hydroxymethyl)-5-(methoxymethyl)-5-
methyltetrahydro-2H -pyran-3,4-diol

CH2 OH

O OH

OH
+ I-
iodide
OH

OH
6-(hydroxymethyl)tetrahydro-2H -pyran-
2,3,4,5-tetraol

(Fessenden, 1999)

b. Reaksi pemecahan (hidrolisis) amilum menjadi glukosa

(Brayer, 1995)
VII. PENUTUP

7.1 Kesimpulan

7.1.1 Enzim -amilase dapat diperoleh dari kecambah

7.1.2 Pemurnian tahap awal enzim -amilase dapat dilakukan dengan fraksinasi

amonium sulfat.

7.1.3 Pada hasil percobaan ekstrak kasar setelah dilakukan penambahan amilum dan
iodin larutan berwana ungu yang memudar sedangkan pada Fraksi I dan II berwana
merah kecoklatan yang memudar. Hal ini menunjukan hasil positif adanya enzim -
amilase.

7.1.4 Lama waktu yang diperlukan untuk Fraksi I mengalami perubahan membutuhkan
waktu yang lebih lama dibandingkan dengan terjadinya perubahan warna pada Fraksi
II.

7.2 Saran

7.2.1 Sebaiknya untuk praktikum selanjutnya dapat digunakan sampel lain selain
kecambah sebagai sumber enzim -amilase nya, sehingga praktikan tidak hanya cuma
mengetahui kandungan enzim -amilase dalam kecambah.

7.2.2 Penghomogenisasian kecambah dengan air harus dilakukan dengan perbandingan

volume yang sesuai, jangan terlalu encer dan jangan terlalu pekat

7.2.3 Untuk semua peralatan yang digunakan pastikan sudah dicuci dan bersih
 DAFTAR PUSTAKA

Brayer GD, Yaoguang L, Withers SG. 1995. The structure of human pancreatic -
amylase at 1.8 A resolution and comparisons with related enzymes. Protein Science
Direktorat Gizi Departemen Kesehatan RI. 1981. Daftar Komposisi Bahan
Makanan: Jakarta

Fessenden, R.1999. Kimia Organik.Erlangga : Jakarta

Lehninger. 1999.Biokimia Dasar. Erlangga :Jakarta

Murray, R. K., Granner, D. K., & Rodwell, V. W. 2009.Biokimia harper (27 ed.).
Jakarta: Buku Kedokteran EGC.

Suarni dan Rauf Patong. 2007. Potensi Kecambah Kacang Hijau sebagai
SumberEnzim -Amilase. J. Chem.7 (3) : 332-336
 LAMPIRAN

A. Perhitungan Fraksinasi Amonium Sulfat

Rumus yang digunakan :

=
1000

Keterangan:
Nilai fraksinasi di sesuaikan dengan tabel fraksinasi dengan garam
ammonium sulfat pada berbagai tingkat kejenuhan.
Tingkat kejenuhan fraksi 1 = 0-20
Tingkat kejenuhan fraksi 2 = 20-40
Fraksi 1
Diketahui :
V filtrat = 50 mL
Fraksinasi (NH4)2SO4 = 114 gram/L
Ditanya : massa (NH4)2SO4=.?
Dijawab :
Fraksi 0 20 = 50/1000L x 114 gram/L = 5,7 gram

Fraksi 2
Diketahui :
V filtrat = 47 mL
Fraksinasi (NH4)2SO4 = 123 gram/L
Ditanya : massa (NH4)2SO4=.?
Dijawab :
Fraksi 20 40 = 47 /1000 L x 123 gram/L = 5,781 gram
 B. Lampiran foto

Sampel yang berisi iodin dan

amilum dan filtrate hasil
sentrifugasi fraksi 2

Sampel yang digunakan untuk

percobaan

Keterangan gambar berdasarkan urutan dari kiri ke kanan :

1. Pembanding : isinya iodin dan amilum

2. Ekstrak kasar : ekstrak kasar yg diperoleh ditambah iodin dan amilum
3. Fraksi 2 : hasil dari sentrifugasi fraksi 2, filtratnya diambil ditambahi
dengan iodin dan amilum. Ditunggu hingga warna ungu nya agak pudar
4. Fraksi 1 : isi dalam tabungnya hanya filtrate dari hasil sentrifugasi
fraksi 1