Journal of Chromatography B, 1017 (2016) 163-173

C
o
n
t
e
n
t
s
l
i
s
t
s
a
v
Pemisahan fragmen IgG manusia
a menggunakan tembaga, nikel, seng, dan
i
kobalt chelated ke CM-Asp-agarosa
l denganpositif dan negatif
a
kromatografi b
l
e
Cecília Alves Mourão, Gabriela Pannunzio
a
Carmignotto, Sonia Maria Alves Bueno*
t
Sekolah Teknik Kimia, Universitas Campinas, UNICAMP, 13083-970 Campinas, SP, Brazil
S
c
i
artikel Info e abstrak
n
Pasal sejarah: c Penelitian ini mengevaluasi kelayakan menggunakan amobil logam-ion
Diterima 16 November 2015
e
D kromatografi afinitas (IMAC) untuk pemisahan fragmen Fab manusia
Diterima dalam bentuk direvisi 20 Januari 2016 Diterima 30 Januari
i 2016 menggunakan empat logam transisi yang berbeda ion tembaga, nikel, seng,
Tersedia online 2 Maret 2016 r dan kobalt chelated ke CM-Asp (carboxymethylaspartate) bergerak pada gel
e
c agarosa. The Fab dan Fc fragmen-fragmen (dari IgG manusia dicerna
Kata kunci:
t dengan papain) berinteraksi secara berbeda dengan chelates dipelajari,
Manusia fragmen Fab IMAC
tergantung pada sistem adsorpsi penyangga. Interaksi antara kelat dan Fc
CM-Asp (carboxymethylaspartate) Adsorpsi
fragmen ini sebagian besar didasarkan pada obligasi koordinasi
kromatografi Negatif
J menggunakan adsorpsi buffer yang mengandung NaCl. Kromatografi
negatif per- dibentuk pada Cu (II) -CM-Asp-agarosa memperoleh 2,9 mg
o Fab per mL adsorben dalam pecahan nonretained (Fc fragmen-gratis tanpa

u uncleaved IgG). Adsorpsi fragmen Fab diatur oleh gaya elektrostatik

dengan tidak adanya NaCl dalam buffer adsorpsi. Selektivitas yang tinggi

r dicapai pada Co (II) -CM-Asp-agarose dan 5,7 mg Fab per mL adsorben

diperoleh dalam pecahan dielusi tanpa fragmen Fc, meskipun memiliki
n uncleaved IgG. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kromatografi pada ion
logam transisi chetated ke cm-Asp-agarosa adalah pendekatan yang
a menjanjikan untuk pemisahan fragmen Fab dari solusi IgG manusia papain-
dicerna.
l © 2016 Elsevier-undang.

1. pengenalan o dalam pengolahan hilir sangat diperlukan untuk mengatasi

kelemahan ini [7].
Fragmenantibodi (Fab, F (ab)j2,dan Fv)f yang
diperoleh oleh Fragmen IgG biasanya puri fi ed oleh afinitas phy chromatogra-
teknologi DNA binant panan atau pencernaan enzimatik dari molekul menggunakan protein A, G, dan L sebagai biospeci fi c ligan [7-9].
antibodi seluruh adalah protein penting saat ini sedang dipelajari Namun, ligan ini mahal dan rentan terhadap kebocoran dan dation
untuk ther- aplikasi apeutic dan diagnostik [1-3]. Massa molekul C degra- karena kondisi elusi drastis dan prosedur pembersihan [8,9].
fragmen antibodi yang berisi daerah antigen-menentukan adalah lebih Untuk mengatasi kelemahan ini, teknik lainnya dan ligan murah
h
kecil dari full-length imunoglobulin G (IgG), karena itu mereka lebih untuk memurnikan fragmen Fab telah dipelajari. Studi telah
cocok untuk aplikasi yang membutuhkan tion penetra- cepat dalam melaporkan penggunaan kalsium-diderivatisasi hydroxyap-
r
jaringan. Selain itu, kurang domain Fc, fragmen ini memiliki kurang kromatografi atite [10], yang Gradi aliran teknologi, [11] dan serap
o
imunogenisitas, sehingga mengurangi risiko efek samping pada pasien sistem pemisah bioreaktor membran reaktan [12] untuk pemurnian
[4,5]. fragmen Fab. Selanjutnya pseudobiospeci fi c ligan seperti ligan
Selama beberapa dekade terakhir beberapa fragmen Fab telah m thiophilic [13], biomimetic protein G [14], dan ion logam bergerak
disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA) untuk digunakan [15,16] juga telah diteliti untuk tujuan ini.
a
dalam bidang pencitraan medis dan kanker, kardiovaskular, dan terapi Ion logam amobil digunakan sebagai ligan dalam amobil logam-
t
penyakit autoimun [4,6]. Untuk aplikasi cal medis dan pharmaceuti-, ion kromatografi afinitas (IMAC), teknik diperkenalkan pada tahun
fragmen Fab harus memiliki tingkat kemurnian yang tinggi. Karena 1975 oleh Porath et al. [17]. IMAC memanfaatkan fi nity af ion logam
o
biaya rekening pengolahan hilir untuk 50-80% dari total biaya produksi bergerak pada matriks padat untuk beberapa residu asam amino
antibodi terapi, yang devel-opment teknik murah dan pengurangan terpapar pada permukaan molekul dalam larutan, khususnya his
unit operasi g tidine. IMAC diakui sebagai teknik selektif, serbaguna, dan murah,
r dan telah diterapkan di puri fi kasi sel, peptida dan protein, dan
penghapusan endotoksin [18,19].
* penulis Sesuai. a
Alamat E-mail: sonia@feq.unicamp.br (SMA Bueno).
p
h
http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2016.01.058 1570-
0232 / © 2016 Elsevier-undang.
164 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173
Gambar. 1. Pengaruh sistem penyangga (yang mengandung NaCl) dan ion logam pada retensi protein total oleh adsorben IMAC. (a) Cu (II) -CM-Asp-agarosa; (b) Ni (II) -CM-Asp-agarosa;
(c) Zn (II) -CM-Asp-agarosa; (d) Co (II) -CM-Asp-agarosa.
Adsorpsi selektif fragmen IgG pada adsorben IMAC telah dipelajari
[20,15]. Hale dan Beidler [20] melaporkan bahwa kehadiran sebuah
daerah yang kaya histidin dalam domain konstan ketiga dari rantai berat
dari murine IgG1 bertanggung jawab untuk IgG adsorpsi pada nikel
chelated menjadi asam iminodiacetic (IDA). Todorova-Balvay et al. [15]
diidentifikasi oleh perhitungan komputer kehadiran histidin klaster
diakses dalam domain Fc dari IgG manusia poliklonal sebagai
bertanggung jawab untuk interaksi antara IgG dan ion bilized logam
transisi immo- chelated ke IDA. Berdasarkan studi yang dilakukan oleh
Hale dan Beidler [20] dan Todorova-Balvay et al. [15], adalah mungkin
bahwa Fc fragmen yang diserap pada kelat logam sejak fragmen ini
memiliki gugus histidin diakses allow- ing pemulihan fragmen Fab
dalam pecahan nonretained (kromatografi negatif). Namun, mekanisme
interaksi dari seluruh IgG dan fragmen-nya (asli atau rekombinan
polyhistidine-tagged) dengan ion logam amobil chelated dengan agen
chelating lainnya telah belum sepenuhnya dijelaskan.
Pemilihan kombinasi yang cocok agen pengkelat dan ion logam
merupakan langkah mendasar dalam mencapai selektivitas protein
logam- mengikat dalam IMAC. Penelitian telah menunjukkan bahwa
tetradentate pengkhelat senyawa seperti carboxymethylaspartate (CM-
Asp) atau Tris (2-aminoetil) amina (TREN) chelated untuk transisi ion
logam yang disediakan kemurnian yang sama atau lebih tinggi dari
tridentate IDA di puri fi kasi protein yang memiliki residu histidin
diakses dan dengan histidin-tagged protein rekombinan [21-23].
Dalam laporan sebelumnya, da Silva et al. mempelajari tion applica-
teknologi Ni (II) -TREN-agarosa untuk memurnikan berduri fragmen
Fab manusia dari ekstrak protein kedelai non-transgenik. Pemisahan
yang efisien dari fragmen Fab diperoleh dengan kromatografi negatif fl
owthrough fraksi, meskipun uncleaved IgG dan fragmen dibelah juga
terdeteksi di fraksi nonretained [24]. Dengan demikian, investigasi agen
IMAC-chelating yang berbeda digunakan untuk Fab fragmen pemurnian
adalah strategi untuk mencoba memecahkan masalah ini.
Karya ini memperluas penerapan studi oleh da Silva et al. [24] pada
manusia Fab pemurnian untuk mendapatkan lebih selec-
tive pemurnian-Fab fragmen dipisahkan dari fragmen Fc dan
uncleaved IgG. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
mengevaluasi karakteristik pengikatan ion logam Cu (II), Ni (II), Zn
(II), dan Co (II) kompleks dengan CM-Asp bergerak pada gel
agarose dengan fragmen IgG, bertujuan pemurnian dari Fab
fragmen dari solusi IgG manusia papain-dicerna. The quadridentate
CM-Asp dipilih sebagai agen chelating karena selektivitas yang
menjadi lebih tinggi dibandingkan dengan tridentate IDA, karena
CM-Asp hanya memiliki dua situs logam untuk interaksi dengan
protein [21-23]. Meskipun CM-Asp dan TREN merupakan ligan
pengkelat tetradentate (tidak ada perbedaan antara jumlah
koordinasi), mereka memiliki jumlah yang berbeda dari N dan O
atom yang terlibat dalam pembentukan cincin chelating. Tujuannya
adalah untuk berkontribusi pada evaluasi yang lebih baik dari
potensi cm-Asp di Fab fragmen pemurnian dibandingkan dengan
TREN, dipekerjakan oleh da Silva et al. [24].
Efek dari sistem penyangga (natrium fosfat, Tris-HCl, dan
Hepes) dan garam (NaCl) diselidiki untuk mengevaluasi
kemampuan ion logam transisi chelated ke CM-Asp untuk mengikat
fragmen Fc dan uncleaved IgG dan memurnikan fragmen Fab.
Kurva terobosan dan keseimbangan mengikat data yang ditentukan
untuk mendapatkan titik terobosan, kapasitas dinamis, dan eters
param- termodinamika adsorben yang dibutuhkan untuk
pengembangan proses skala besar.
2. Bahan dan metode
2.1. Bahan
Agarose gel (Sepharose 4B), glycin, papain, polietilen glikol 6000
(Mw 5400-6600), Iodoacetamide, l-sistein, N- [2- hidroksietil]
piperazine-N- [asam 2-ethanesulfonic] (Hepes ), tris
(hydroxymethylamino metana) (Tris), natrium klorida, zole imida-,
Coomassie brilian biru R-250, kristal bovine serum albumin (BSA),
protein A-Sepharose (4B Arus Cepat), protein L- agarosa dari
Peptostreptococcus magnus, anti-manusia IgG (Fab
 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173 165

Gambar. 2. Electrophoretical pro fi le dari nonreducing SDS-PAGE (a) dan (b), dan Barat analisis blot ( c) dan (d) dari fraksi kromatografi pada Cu (II) -CM-asp- dan Ni (II) -CM- Asp-agarosa
pada Hepes dan tidur siang buffer, masing-masing, baik yang mengandung NaCl M:. penanda massa molekul (GE Healthcare ); Mc: full-range pelangi penanda molekuler massal (12 pada 225
kDa, GE Healthcare); IgG: IgG penanda (Aventis Behring); I: disuntikkan dicerna IgG solusi; W: pecahan mencuci; E: dielusi fract ion.

spesifik) antibodi -peroxidase diproduksi di kambing (A0293), anti
manusia IgG (Fc spesifik) antibodi -peroxidase diproduksi di kambing
(A0170), hidrogen peroksida, dan 3,3-diaminobenzidin (DAB)
diperoleh dari Sigma-Aldrich (St Louis, USA). Manusia imunoglobulin
G dibeli dari CSL Behring (Mar- burg Jerman). Epiklorohidrin, Fab
fragmen (95% kemurnian dengan SDS-PAGE), asam bromoacetic,
≥ asam
l-aspartat, disodium ethylene- asam diaminetetraacetic (EDTA),
natrium borohidrida, nikel, kobalt, tembaga, dan seng sulfat yang
dibeli dari Merck (Darmstadt, Jerman). Akrilamida, bis-akrilamida,
natrium dodesil sulfat (SDS), dithiotrietol, tetramethyl etilen diamin
(TEMED) untuk analisis SDS-PAGE, dan membran nitroselulosa
diperoleh dari Bio-Rad (Hercules, USA). The isoelektrik fokus gel
(PHAST Gel pH 3 9), yang Superdex 75 ukuran media kromatografi
eksklusi,
− kit elektroforesis kalibrasi untuk penentuan massa molekul
(14,4 pada 97 kDa), dan full-range pelangi penanda massa molekul (12
di 225 kDa) untuk western blot disediakan oleh GE Healthcare
(Pennsylvania, USA). The Amicon ultra-4 Unit sentrifugal fi lter
dengan membran Ultracel-10 diperoleh dari Mil- lipore (Massachusetts,
USA). Ultra murni air (Milli-Q, Millipore, Massachusetts, USA)
digunakan di seluruh percobaan. Semua bahan kimia lainnya adalah
dari analisis reagen kelas.
2.2. Aktivasi agarosa dan imobilisasi dari CM-Asp
gel agarosa (Sepharose 4B) diaktifkan dengan epiklorohidrin
seperti yang dijelaskan oleh Porath dan Olin [25]. CM-Asp imobilisasi
dilakukan sesuai dengan Mantovaara et al. [26]. Pertama, l-aspartat
asam (l-Asp) telah kovalen digabungkan ke epichlorohydrin- gel
diaktifkan oleh linkage eter dan kemudian l-Asp nitrogen mengalami
reaksi karboksimetilasi. Gel diderivatisasi disebut sebagai CM-Asp-
agarose dalam penelitian ini.
2.3. Pencernaan manusia IgG
pencernaan IgG manusia (30 mg mL-1)dilakukan pada 100 mmol
-1
L sodium fosfat (NAP) penyangga pH 7,4 yang mengandung 40
mmol L-1 EDTA sesuai dengan Ternynck dan Avrameas dan da Silva
et al. [24,27]. Secara singkat, pencernaan dimulai dengan penambahan
papain yang sebelumnya telah diaktifkan dengan 200 mmol L-1 l-
cysteine, untuk solusi IgG untuk mendapatkan rasio papain /
antibodi dari 1% (b / b). Solusi ini diinkubasi pada 37 ◦ C selama 2
jam. Setelah ini, 400 mmol L-1 solusiIodoacetamide digunakan untuk
menghentikan tion reac-. Buffer pertukaran produk dicerna dilakukan
dengan PD10 Sephadex G-25 kolom (GE Healthcare, Pennsylvania,
USA).
166 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173

Tabel 1
Jumlah protein dan fragmen Fab untuk fraksi kromatografi pada Cu (II) -CM-asp- dan Ni (II) -CM-Asp-agarose dengan tidur siang dan Hepes penyangga, masing-masing.
Cu (II) -CM-Asp-agarosa-NAP dengan 1,0 mol L-1 NaCl

Langkah Bradford RID

TP (mg) Massb (mg) Yieldc (%) Kemurniand (%) FPe

Injection 5,88 ± 0,31 3,2 ± 0.0 54 1.0

cuci 1,42 ± 0,03 1,3 ± 0,0 41 92 1,7
Elusi 4,69 ± 0,11 1,8 ± 0,0 56 38 0,7
Regenerasi 0.00 0,0
Jumlah recovery (%) 104,2 ± 4,5 96,8 ± 0,0

Ni (II) -CM-Asp-agarosa-Hepes dengan 1,0 mol L-1 NaCl

Injeksi 5.22 ± 0,07 3,5 ± 0,4 67 1,0

cuci 3,38 ± 0,36 3,6 ± 0,4 105 106 1,6
Elusi 1,92 ± 0,01 0,3 ± 0,1 8,6 16 0,2
Regenerasi 0.00 0.0
Jumlah recovery (%) 101,5 ± 5,4 112,8 ± 2,7
TP: Jumlah protein: massa ditentukan dari konsentrasi protein dengan metode Bradford [28]. IgG manusia sebagai protein referensi.
b Fab dan uncleaved IgG: massa ditentukan dari RID.
c Yield: persentase Fab dan uncleaved IgG.
d Kemurnian: rasio massa Fab dan uncleaved IgG total protein 100.
×
e PF: puri fi kasi faktor.

2.4. Kromatografi dan kurva terobosan prosedur
prosedur kurva kromatografi dan terobosan yang per- dibentuk
menggunakan sistem kromatografi otomatis (Akta Prime Plus, GE
Healthcare, Pennsylvania, USA). Semua eksperimen yang mobil- Ried
keluar pada 25 ◦ C dalam kolom (20,0 cm × 1,0 cm ID, GE Healthcare,
Pennsylvania, USA) dengan 3,0 ml gel CM-Asp-agarose pada tingkat alir
0,5 mL min-1 (a linear fl ow tingkat 38,2 cm h-1).Tembaga, nikel, seng,
atau ion logam kobalt dimuat ke CM-Asp-agarosa dengan melewati 50
mmol L-1 solusi sulfat ion logam yang spesifik di dalam air melalui
kolom sampai saturasi tercapai. Non secara khusus terikat logam
dihapus dengan mencuci gel dengan air dan elusi penyangga. Kemudian
adsorben itu diseimbangkan dengan adsorpsi buffer pada pH 7,5 (25
mmol L-Hepes, Tris-HCl,
dan tidur siang dengan atau tanpa 1,0 mol L-1 NaCl. Setelah
imbang, IgG solusi papain-dicerna (1 mL, sekitar 3,5 mg protein
total mL-1)dalam adsorpsi penyangga yang tepat disuntikkan ke
dalam UMN kumpulkan. Dalam rangka untuk menentukan titik
terobosan dan kapasitas dinamis adsorben, percobaan kurva
terobosan dilakukan oleh overloading adsorben dengan IgG solusi
papain-dicerna (0,97 atau 2,09 mg protein total mL-1).Setelah itu
kolom dicuci dengan adsorpsi penyangga untuk menghilangkan
protein non terserap sampai nilai-nilai absorbansi eluat yang
mendekati nol. Elusi itu dilakukan dengan penambahan agen
imidazol bersaing (100 mmol L-1)ke buffer adsorpsi. The UMN
kumpulkan itu diregenerasi dengan mencuci gel dengan 100 mmol
L-1 EDTA pH 7,0, diikuti dengan air Milli-Q dan buffer adsorpsi.
Tions Frac- dari 1,0 mL dikumpulkan selama percobaan. Protein
dalam pecahan nonretained dan ditahan dianalisis dengan metode
Bradford [28], SDS-PAGE, western blotting, dan radial immunodif-
fusion. Rasio konsentrasi total protein (C) di outlet dengan yang di
umpan (C0)diplot dalam kurva terobosan sebagai fungsi dari volume
larutan protein throughput yang.

2.5. Percobaan kesetimbangan adsorpsi

kesetimbangan adsorpsi percobaan untuk menentukan fragmen

1):.Gambar 3. IEF dari (a) manusia Fab dan Fc fragmen dan (b) fragmen Fab teradsorbsi ke Co
(II ) -CM-Asp-agarosa. M: IEF pI 3-9 penanda (GE Healthcare); Fab(WA):fragmen Fab manusia
diperoleh di fraksi nonretained di kromatografi klasik solusi IgG dicerna protein A-Sepharose
diikuti oleh gel fi kromatografi filtrasi pada Superdex 75; Fc (EA):fragmen fc manusia diperoleh di
fraksi elusi dalam kromatografi klasik solusi IgG dicerna protein A-Sepharose diikuti oleh gel fi
kromatografi filtrasi pada Superdex 75; Fab (Co(II)):fragmen Fab diperoleh di fraksi elusi dalam
kromatografi solusi IgG dicerna di Co (II) -CM-Asp-agarosa diikuti oleh gel kromatografi filtrasi
pada Superdex 75.
Fab manusia isoterm dilakukan dalam batch exper- imental set-up
dalam rangkap dua di 25 ◦ C. Fab fragmen solusi yang digunakan
untuk percobaan adsorpsi kesetimbangan kolam pecahan dielusi
dari protein l-agarosa kromatografi makan dengan solusi IgG
manusia papain-dicerna. Kolam ini mengandung 53% fragmen Fab
dan 47% uncleaved IgG (ditentukan dengan memindai SDS-PAGE
gel pada densitometer, Molecular Imager GS-800 USB dikalibrasi
Densitometer, Bio-Rad, Hercules, USA).
Jumlah 50 μL Co (II) -CM-Asp-agarosa diperkenalkan ke dalam
tabung eppendorf dan diseimbangkan dengan 25 mmol L-1 Hepes
buffer pada pH 7,5. Kemudian 1,0 mL Fab solusi fragmen manusia
yang ditambahkan ke dalam tabung eppendorf (diencerkan dalam
buffer adsorpsi untuk konsentrasi total protein mulai 0,07-1,3 mg
mL-1).Tabung itu diputar akhir lebih akhir pada 6 rpm selama 2 jam
untuk memungkinkan keseimbangan yang akan didirikan. Pada
akhir periode ini, membungkuk adsor- dan fase cair dipisahkan
dengan sentrifugasi dan konsentrasi protein yang terikat dalam fase
cair(c*)diukur dengan metode Bradford [28]. Jumlah fragmen Fab
terserap dan uncleaved IgG, q*,ditentukan sebagai ference dif-
antara jumlah total protein pada awalnya ditambahkan dan
 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173 167

Tabel 2
Jumlah protein dan Fab untuk fraksi kromatografi pada Co (II) -CM-Asp-agarosa dengan Hepes penyangga.

Injeksi 3,70 ± 0,07 2,0 ± 0,0 54 1,0

cuci 2,94 ± 0,09 1,3 ± 0,0 67 46 0,8
Elusi 0,68 ± 0,05 0,6 ± 0,0 31 91 1,7
Regenerasi 0,09 ± 0,01 0,0
Jumlah recovery (%) 100,3 ± 4,1 97,9 ± 1,4
TP: Jumlah protein : massa ditentukan dari konsentrasi protein dengan metode Bradford [28]. IgG manusia sebagai protein referensi.
b Fab dan uncleaved IgG: massa ditentukan dari RID.
c Yield: persentase Fab dan uncleaved IgG.
d Kemurnian: rasio massa Fab dan uncleaved IgG total protein 100.
×
e PF: puri fi kasi faktor.

yang hadir dalam fase cair setelah kesetimbangan itu dicapai dibagi 2.6. Metode analisis
dengan millilters adsorben. Merencanakan q * terhadap c *
menghasilkan isoterm keseimbangan. Parameter Langmuir 2.6.1. total protein kuantifikasi
(Persamaan. (1)) dan Langmuir-Freundlich (Persamaan. (2)) model konsentrasi protein total dari fraksi dikumpulkan dalam
isotherm adalah fi tted dengan data eksperimen menggunakan metode percobaan kurva kromatografi dan terobosan itu dikuanti fi kasi
fi tting berulang Levenberg-Marquardt menggunakan Asal (Microcal, dengan menggunakan metode Bradford [28] dengan BSA atau IgG
USA). manusia sebagai protein referensi.

q* = qmc* Kd + c* (1)
2.6.2. Sodium dodecyl sulfat
qm(c*)n poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-
PAGE) dan isoelektrik fokus (IEF)
= + (c*)n (2) Fraksi kromatografi dianalisis dengan
q*
d (LF)
SDS-PAGE (10% akrilamida gel) di bawah
kondisi nonreducing menggunakan sistem
K Mini Protean III (BioRad, Hercules, USA).
Gel perak bernoda.
dimana qm adalah kapasitas pengikatan protein maksimum (mg mL-1); The PhastSystem (Pharmacia, Upsala, Swedia) dan pH 3-9 gel ent
Kd gradi- (GE Healthcare, Pennsylvania, USA) digunakan untuk IEF
adalah konstanta disosiasi (mol L-1); Kd(LF) adalah jelas dissoci- asi untuk menentukan pI dari manusia Fab dan Fc fragmen. Gel diwarnai
konstan; dan n dapat digunakan sebagai empiris koefisien, mewakili dengan perak nitrat sesuai dengan metode yang disediakan oleh
jenis dan tingkat kooperatititas dalam interaksi mengikat (berdimensi). produsen.

Langkah Bradford RID

TP (mg) Massb (mg) Yieldc (%) Kemurniand (%) FPe
Gambar. 4. Pengaruh sistem penyangga (tanpa NaCl) dan ion logam pada retensi protein total oleh adsorben IMAC. (a) Cu (II) -CM-Asp-agarosa; (b) Ni (II) -CM-Asp-agarosa; (c) Zn (II) -CM-
Asp-agarosa; (d) Co (II) -CM-Asp-agarosa.
168 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173

Gambar. 5. Nonreducing analisis SDS-PAGE (a) dan (b), dan bercak Barat (c) dan (d) dari fraksi dari kromatografi pada Co (II) -CM-asp- agarose di Hepes dan Tris-HCl, masing-masing. M:
marker massa molekul (GE Healthcare); Mc:full-range pelangi molekul penanda massa (12 pada 225 kDa, GE Healthcare); IgG: IgG penanda (Aventis Behring); Saya: disuntikkan dicerna solusi IgG;
W: mencuci pecahan; E: dielusi fraksi.

2.6.3. Penentuan jumlah logam bergerak ion (0,003%) dan chromogene 3,3j-diaminobenzidine (1,0 mg mL-1 di 50
Kapasitas pengkhelat dari gel CM-Asp-agarosa untuk Cu (II), Ni (II), mmol L-1 Tris-HCl penyangga pH 7,4) digunakan untuk menodai
Zn (II), dan Co (II) ion logam ditentukan sesuai dengan metode yang
spesifik pita protein.
dijelaskan oleh Bresolin et al. dan de Goes et al. [21,22]. Secara singkat,
logam ion-loaded kolom dicuci dengan 10 volume kolom dari 25 mmol
L-1 Hepes pH 7,5 yang mengandung 100 mmol L-1 imidazol diikuti
dengan penghapusan ion logam dengan 100 mmol L-1 EDTA pH 7,0.
Jumlah total Cu (II), Ni (II), Zn (II), dan Co (II) dalam eluat yang
ditentukan dengan eters emisi optik spectrom- dengan induktif
ditambah plasma (ICP plasma, Spectro, Kleve, Jerman) .

2.6.4. Analisis Western blot

Kolam renang dari nonretained dan fraksi dipertahankan diperoleh
dalam percobaan kurva kromatografi dan terobosan dianalisis dengan
SDS-PAGE (12% akrilamida gel) di bawah kondisi nonreducing. Band
protein dipindahkan electrophoret- ically dari gel ke membran
nitroselulosa dalam Detection System Mini Transblotting (Bio-Rad,
Hercules, USA) seperti yang dijelaskan oleh Towbin et al. dan da Silva et
al. [24,29]. Sebuah IgG anti-manusia (Fab spesifik) antibodi -peroxidase
diproduksi di kambing dan anti IgG manusia (Fc spesifik) antibodi -
Gambar. 6. Nonreducing analisis SDS-PAGE dari fraksi dari kromatografi pada Co (II) -
peroxidase diproduksi di kambing digunakan sebagai antibodi
NTA-agarose dalam buffer Hepes. M: massa molekul penanda (GE dengan kesehatan
sekunder. Substrat hidrogen peroksida perawatan, USA); IgG: IgG penanda (Aventis Behring); Saya: Disuntik solusi IgG dicerna;
W: mencuci pecahan; E: dielusi pecahan, R: pecahan regenerasi.
 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173 169

Gambar 7. (a) kurva Terobosan untuk Cu (II) -CM-Asp-agarose dalam buffer tidur siang yang mengandung 1,0 mol L -.1 NaCl pH 7,5. B volume 3,0 mL; Tingkat fl ow 0,5 mL min-1.Pakan dari
89,0 mL larutan IgG dicerna (0,99 mg protein total mL -1).(b) W: cuci dengan tidur siang buffer yang mengandung 1,0 mol L -1 NaCl pH 7,5; E: Elusi dengan tidur siang buffer yang mengandung
1,0 mol L-1 NaCl dan 0,1 mol L-1 imidazol pH 7,5; R: Regenerasi dengan 0,1 mol L -1 EDTA pH 7,0. (c) dan (d) bercak Barat pecahan dari kurva terobosan untuk Cu (II) - CM-Asp-agarosa. Mc: full-
range pelangi molekul penanda massa (12 pada 225 kDa, GE Healthcare); 9-40: aliran-melalui pecahan; W: pool mencuci pecahan; E: kolam fraksi elusi.

2.6.5. Radial immunodiffusion assay (RID)
Konsentrasi fragmen Fab di nonretained dan fraksi dipertahankan
diperoleh dalam percobaan kurva kromatografi dan terobosan
ditentukan dengan alat tes RID, menurut metode yang dijelaskan oleh
Lu dan Miller dan da Silva et al. [24,30].
2.6.6. Potensial zeta untuk Cu (II) -, Ni (II) -, Zn (II) -,
dan Co (II) -CM-Asp-agarosa
adsorben IMAC disiapkan untuk ion logam sesuai dengan prosedur
yang diuraikan dalam butir kromatografi dan kurva terobosan
Prosedur. Analisis potensi zeta dilakukan dengan analisa elektrokinetik
(Melampaui, Anton Paar GmbH, Graz,
Austria) dengan menggunakan sel silinder untuk mengukur.
Pengukuran diulang empat kali dengan 25 mmol L-1 Hepes pada pH
7,5 sebagai elektrolit.
3. Hasil dan diskusi
3.1. Pengaruh ion logam pada Fab pemurnian: kromatografi dengan
buffer yang mengandung kromatografiNaCl-negatif
Empat ion logam- Cu (II), Ni (II), Zn (II), dan Co (II) - chelated ke
CM-Asp mengandung kepadatan ion logam yang sama (7,8, 7,5, 4,3,
dan
7,4 μmol ion logam mL-1 dari gel, masing-masing) dibandingkan
untuk pemurnian fragmen Fab manusia. IMAC berjalan kromatografi
dilakukan dengan tiga sistem buffer yang berbeda pada pH 7,5: Hepes,
Tris-HCl, dan tidur siang, semua mengandung 1,0 mol L-1 NaCl. Total
protein dalam fraksi nonretained dan dielusi dianalisis dengan
metode Bradford [28]. Gambar. 1 menunjukkan protein
dipertahankan dalam kromatografi pada Cu (II) -, Ni (II) -, Zn (II) -,
dan Co (II) -CM-asp- agarosa.
Untuk semua buffer dipelajari, hasil menunjukkan bahwa Cu (II) -
CM-asp- dan Ni (II) -CM-Asp-agarosa diserap sekitar 70% dan 35%
dari jumlah total protein disuntikkan, masing-masing. Namun,
persentase protein terserap ke Zn (II) -CM-asp- dan Co (II) -CM- Asp-
agarosa adalah diabaikan (sekitar 1% dari total disuntikkan protein).
Dengan demikian, Zn (II) -CM-Asp dan Co (II) -CM-Asp adsorben
tidak suit- mampu untuk pemurnian fragmen Fab manusia.
Dalam kondisi tinggi ion kekuatan terkait dengan nilai-nilai pH di
mana residu histidin yang terdeprotonasinya (pK6,5), obligasi
∼ negara
koordinator mendominasi di adsorpsi protein pada IMAC [17].
Menurut Sulkowski [31], di bawah kondisi kekuatan ion yang tinggi,
tembaga dan nikel chelated untuk IDA membutuhkan setidaknya
satu dan lebih dari satu residu histidin diakses, masing-masing,
dalam struktur mensional tridi- mereka untuk obligasi koordinasi
dengan protein. Di sisi lain, ion kobalt dan seng logam transisi
chelated ke IDA membutuhkan kehadiran sekelompok residu histidin
diakses untuk koordinasi [31].
Hale dan Beidler [20] menggambarkan sebuah wilayah yang kaya
histidin dalam domain konstan ketiga dari rantai berat (CH 3)dari
murine IgG1.Todorova-Balvay et al. [15] identifikasi ed oleh
perhitungan komputer kehadiran histidin klaster diakses (Nya 433-X-
Nya 435) di CH3 domain dari rantai berat manusia IgG1.Dengan
demikian, kehadiran cluster histidin harus memungkinkan adsorpsi
uncleaved IgG dan Fc fragmen ke logam transisi bergerak
170 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163-173

Gambar. 8. (a) kurva Terobosan untuk Co (II) -CM-Asp-agarose di Hepes penyangga pH 7,5. B volume 3,0 mL; Tingkat fl ow 0,5 mL min -1.Pakan dari 86,0 mL larutan IgG dicerna (2,09 mg
protein total mL-1).(b) W: cuci dengan Hepes penyangga pH 7,5; E: Elusi dengan Hepes buffer yang mengandung 0,1 mol L-1 imidazol pH 7,5; R: Regenerasi dengan
0,1 mol L-1 EDTA pH 7,0. (c) bercak Barat pecahan dari kurva terobosan untuk Co (II) -CM-Asp-agarosa. Mc: full-range pelangi molekul penanda massa (12 pada 225 kDa, GE Healthcare);
Saya: disuntikkan dicerna solusi IgG; F: kolam aliran-melalui pecahan; W: pool mencuci pecahan; E: kolam fraksi elusi.

ion, seperti yang diamati oleh penulis untuk adsorpsi IgG manusia ke Zn
(II) dan Co (II) chelated ke tridentate IDA. Namun, dalam penelitian ini,
meskipun residu histidin diakses di ture struc- nya, uncleaved IgG dan
Fc fragmen tidak dipertahankan pada Zn (II) -CM-asp- dan Co (II) -CM-
Asp-agarosa. Alasannya adalah bahwa khelat logam (II) -CM-Asp hanya
memiliki dua situs koordinasi tersedia untuk interaksi dengan protein,
sementara Logam (II) -IDA memiliki tiga situs. Hasil yang diperoleh
dalam penelitian ini adalah sesuai dengan Chaga [32], di mana urutan
kapasitas adsorpsi protein pada polidentate chelating ligan adalah
tridentate> tetradentate> pentadentate.
Selektivitas Cu (II) - dan Ni adsorben (II) -CM-Asp-agarosa dievaluasi
berdasarkan kemurnian cuci dan fraksi terelusi (diperiksa secara
kualitatif dengan SDS-PAGE dan Western blot, Gambar2.).Menurut
bercak Barat, band sekitar 150, 50, dan 30-15 kDa dapat dianggap
molekul uncleaved IgG, Fab atau Fc, dan fragmen dibelah, masing-
masing(Gambar.2c dan d).
Kondisi eksperimental yang paling disukai pemurnian fragmen Fab
adalah penggunaan tidur siang dan Hepes buffer untuk chelated Cu (II)
dan Ni (II), masing-masing(Gambar.2).Dengan kondisi tersebut, fragmen
Fab itu ditemukan dalam pecahan nonretained di ikatan puri- melebihi
90% untuk kedua adsorben (kromatografi negatif)(Tabel1). Sebuah hasil
yang lebih tinggi dicapai dengan Ni (II) -CM-Asp-agarosa(Tabel1),
karena Fab fragmen yang buruk teradsorbsi ke ion logam chelated Ni
(II). Kemurnian fragmen Fab di cuci fraksi lebih tinggi dari 100% untuk
Ni (II) -CM-Asp-agarosa karena sensitivitas rendah dari metode
Bradford ke IgG molekul [33].
3.2. Pengaruh ion logam pada Fab pemurnian: kromatografi dengan
penyangga tanpa NaCl
Dalam IMAC klasik, adsorpsi protein dilakukan di tinggi ion
kekuatan penyangga (biasanya 0,1-1,0 mol L-1 NaCl). Namun, penelitian
eral sev- telah menunjukkan perbaikan dalam selektivitas
dan adsorpsi kapasitas adsorben ketika buffer dengan- keluar NaCl
digunakan [21,23,34,35]. Dalam hal ini, efek gabungan dari interaksi
elektrostatik dan obligasi koordinasi memainkan peran [36]. Semua
adsorben IMAC dipelajari bermuatan negatif pada pH 7,5, dengan
potensi zeta − 5,877 0,224, 4,941 0,983,
− 6,071 0,045 dan 6,223 0,169 mV untuk Cu (II) -, Ni (II) -, Zn (II),
±
dan Co ( II) -CM-Asp-agarosa, masing-masing. The Fab dan Fc
±fragmen dari solusi IgG manusia papain-dicerna yang puri fi ed oleh
−
−kromatografi klasik solusi IgG dicerna protein A- Sepharose diikuti
±
oleh gel kromatografi filtrasi padaSuperdex
±kisaran75. pI bertekad untuk menjadi 6,0-9,3 untuk fragmen Fab dan
6,3-6,9 untuk fragmen Fc(Gambar.3a). Karena Fab dan Fc fragmen
memiliki rentang yang berbeda dari titik isoelektrik, adalah
mungkin bahwa Fc dan sebagian besar fragmen Fab memiliki biaya
yang berlawanan pada pH 7,5. Dengan demikian Fc dan Fab
fragmen dapat berinteraksi secara berbeda dengan ion logam bilized
immo- dalam buffer dengan kekuatan ion rendah. Oleh karena itu,
percobaan dilakukan dengan solusi IgG dicerna dalam buffer tanpa
NaCl untuk membandingkan kinerja Cu (II), Ni (II), Zn (II), dan Co
(II) chelated ke CM-Asp di adsorpsi fragmen .
Untuk semua buffer tanpa NaCl dipelajari, lebih dari 87% dari
protein dimuat (dicerna solusi IgG) pada kolom dipertahankan di
Cu (II) -CM-Asp-agarosa(Gambar.4a). Untuk kelat ini, pemisahan
fragmen Fab tidak tercapai, karena hampir semua protein dimuat
dipertahankan dalam adsorben ini. Mungkin baik interaksi
elektrostatik dan ikatan koordinasi antara protein dan Cu (II) -CM-
Asp berlangsung.
Untuk ion logam lainnya dipelajari, adsorpsi protein lebih tinggi
pada percobaan kromatografi dilakukan dengan Hepes penyangga
dibandingkan pada mereka − dengan Tris HCl dan NAP
buffer(Gbr.4b, c, dan d). Ada kemungkinan bahwa muatan negatif
dari gugus fosfat dan muatan positif dari NH3+ di Tris berinteraksi
dengan protein melalui biaya-biaya sehingga masking situs
pengikatan untuk Ni (II) -, Zn (II) -, dan Co ( II) -CM-Asp kelat.
 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163–173 171

Table 3
Breakthrough chromatography of digested IgG solution on Cu(II)-CM-Asp- and Co(II)-CM-Asp-agarose: mass balance of total protein and Fab fragments. Step

Bradford RID

TP (mg)a Mass (mg)b Yieldc (%) Purityd (%) FPe

Cu(II)-CM-Asp-agarose—NaP with 1.0 mol L−1 NaCl
Feed 110.27 ± 3.12 63.4 ± 5.0 57 1.0
Frations #3−31f 8.13 ± 0.05 8.6 ± 0.5 14 106 1.9
Fractions #3-115 70.78 ± 0.77 43.1 ± 2.9 68 61 1.1
Elution 36.11 ± 0.41 19.5 ± 0.8 31 54 0.9
Regeneration 0.00 0.0
Total recovery (%) 104.3 ± 6.4 112.3 ± 2.7

Co(II)-CM-Asp-agarose—Hepes without NaCl

Feed 224.67 ± 0.81 128.2 ± 2.4 57 1.0
Fractions #4-150 189.78 ± 1.40 102.5 ± 0.7 80 54 0.9
Elution 17.88 ± 0.08 17.1 ± 0.3 13 96 1.5
Regeneration 0.00 0.0
Total recovery (%) 92.4 ± 0.5 93.1 ± 1.8
a TP: total protein: mass determined from protein concentration by Bradford method [28]. Human IgG as reference protein.
b Fab and uncleaved IgG: mass determined with RID.
c Yield: percentage of Fab and uncleaved IgG.
d Purity: mass ratio of Fab and uncleaved IgG to total protein 100.
×
e PF: purification factor.
f Breakthrough point (negative chromatography).

For Ni(II)- and Zn(II)-CM-Asp-agarose, Fab fragments were not

separated from Fc fragments since both were obtained in retained and
nonretained fractions in the chromatography (data not shown). The
results obtained in this study differ from those obtained by da Silva et
al. [24]. These authors studied the purification of Fab fragments from
papain-digested human IgG solution by negative chromatography on
Ni(II)-TREN-agarose. The purity of Fab frag- ments obtained in the
flow-through fractions was 105% while for Ni(II)-CM-Asp-agarose Fab
fragments were not separated from Fc fragments. The difference
between the results obtained with the two adsorbents is probably due
to the type of atoms involved in the chelate rings of chelating ligands.
Athough both TREN and CM-Asp are tetradentates, TREN binds to the
metal ion with four nitrogen atoms, whereas CM-Asp binds to the
metal ion with three oxygen atoms and just one nitrogen atom
[23,25,38].
However, when Hepes and Tris–HCl buffers were employed in
chromatographic experiments on Co(II)-CM-Asp-agarose, some of the
Fab fragments and uncleaved IgG were adsorbed without any Fc
fragments (Fig. 5). This result differs from that of classical IMAC (high
NaCl concentration in the adsorption buffer) in which the Fab
fragments were obtained in nonretained fractions (Fc fragments- free, Fig. 9. Comparison of the Langmuir and Langmuir-Freundlich isotherm models for Fab
negative chromatography). Using Hepes buffer without salt, Fab fragments and uncleaved IgG adsorption onto Co(II)-CM-Asp-agarose at 25 ◦ C. The solid and
fragments were recovered in eluted fractions of chromatogra- phy on dashed lines correspond to nonlinear regression of experimental data in accordance with the
Langmuir and Langmuir-Freundlich models, respectively.
Co(II)-CM-Asp-agarose at a purity of 91% (Table 2).
According to Zachariou and Hearn, the metal chelate could be
working as an ion exchanger under low ionic strength condi- tions [36]. (Fig. 6) showed that both Fab and Fc fragments were obtained in
In order to verify whether electrostatic interaction can be involved in nonretained and retained fractions of the chromatography on Co(II)-
the retention of Fab fragments on Co(II)-CM-Asp- agarose, IEF was NTA-agarose, and Fab fragments were recovered without Fc
performed. The Fab fragments obtained in the eluted fraction of the fragments only in fractions in the regeneration step (100 mmol L−1
chromatography on Co(II)-CM-Asp-agarose, separated by gel filtration EDTA pH 7.0). This is probably due to the number of chelate rings
(Sephadex 75) from uncleaved IgG, were used for IEF analysis. The formed between the chelating agent and the cobalt metal ion [37].
results showed the presence of Fab molecules with high pI in the range Both CM-Asp and NTA chelating agents have one nitrogen and three
of pH 8.0–9.3, which were therefore positively charged at pH 7.5 (Fig. oxygen atoms available for binding to the Co(II) [38]. However, CM-
3b). Thus, electro- static interactions are the most important factor for Asp forms a system of two five-membered and one six-membered
adsorption of Fab fragments on Co(II)-CM-Asp-agarose (negatively rings with Co(II), while NTA forms a system of three five-membered
charged at pH 7.5), but the coordination bonds should not be rings. The number of atoms involved in a chelate ring formation
completely excluded. influences the affinity of the adsorbent for proteins [39].
In order to evaluate whether the selective adsorption of Fab
fragments takes place in other tetradentate chelating agents com- 3.3. Breakthrough point and dynamic adsorption capacity
plexed with Co(II), chromatographic experiments were performed with
Co(II)-NTA (nitrilotriacetic acid)-agarose under the same conditions As chromatographic experiments showed a possible separation of
(Hepes without NaCl as adsorption buffer). SDS-PAGE Fab fragments from digested IgG solution, the breakthrough curve
experiments were performed to determine the breakthrough
172 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163–173
point and dynamic adsorption capacity of these adsorbents. The
experiments were carried out with chelates and chromatographic
conditions under which Fab fragments were separated from Fc frag-
ments and recovered with high purity.
For negative chromatography on Cu(II)- and Ni(II)-CM-Asp- agarose,
a 3.0 mL bed volume column was overloaded with about
1.0 mg mL−1 of digested IgG solution in NaP and Hepes buffer,
respectively, both containing NaCl at pH 7.5. The breakthrough point
was defined as the fraction in which Fc fragments were detected by
Western blot analysis. Fig. 7a and b shows the total protein breakthrough
curves for digested IgG solution on Cu(II)- CM-Asp-agarose and the
washing and elution steps, respectively. The Fab fragments detected for
Cu(II)-CM-Asp-agarose were from fraction 9 up to fraction 31 in the
flow-through fractions (Fig. 7c and d). The breakthrough point started in
fraction 32, where Fc frag- ments were detected. These flow-through
fractions correspond to
8.6 mg of nonretained Fab fragments (2.9 mg of Fab fragments mL −1
of gel) with 106% purity (determined by RID, Table 3). For Ni(II)-CM-
Asp-agarose, the Fab fragments with uncleaved IgG were detected in
fraction 7 in the flow-through fractions. The breakthrough point started
in fraction 18, corresponding to only 3.4 mg of nonretained Fab
fragments (data not shown).
For determination of breakthrough curves for Co(II)-CM-Asp-
agarose, the column was overloaded with 2.09 mg mL−1 of digested IgG
solution in Hepes buffer without NaCl at pH 7.5 (Fig. 8).
The Western blots of eluted fractions showed that Fab fragments were
detected without Fc fragments although with uncleaved IgG (Fig. 8c).
The chromatographic fractions were further analyzed by the Bradford
[28] and RID methods to determine Fab fragments con- tent and purity.
The dynamic adsorption capacity reached 17.1 mg
(5.7 mg of Fab fragments and uncleaved IgG mL−1 of gel) with 96%
purity (Table 3).
For Cu(II)-CM-Asp-agarose, 8.6 mg of high purity Fab fragments (Fc
fragments-free) were obtained in flow-through (nonretained) fractions, in
contrast with Co(II)-CM-Asp-agarose, in which 17.1 mg of high purity
Fab fragments (Fc fragments-free) were obtained in eluted fractions.
Based on the RID analysis, both adsorbents had similar Fab fragments
purities. However, the Cu(II)-CM-Asp- agarose was able to recover the
Fab fragments without uncleaved IgG from fractions 9–29 in the flow-
through (traces of uncleaved IgG were detected by Western blots from
the fraction 30, Fig. 7c and d).
The Co(II)-CM-Asp-agarose showed a dynamic adsorption capacity
(5.7 mg of Fab fragments and uncleaved IgG mL −1 of gel) similar to that
of the biospecific ligand protein L (from P. mag-
nus) immobilized in agarose gel (3 to 10 mg of Fab fragments or
uncleaved IgG mL−1 of adsorbent, Sigma-Aldrich product informa- tion).
However, protein L binds human immunoglobulin (Ig) light
chains, primarily Ig with a variable domain of human kappa light chains,
without interacting with the lambda light chain [40,41].
3.4. Isotherm adsorption studies
In order to evaluate the maximum binding capacity of Co(II)- CM-
Asp-agarose for Fab fragments (qm),an adsorption isotherm was
determined using experimental data obtained in batch adsorp- tion
experiments at 25 ◦ C. The Langmuir and Langmuir-Freundlich models
satisfactorily described the experimental data on adsorp- tion onto
Co(II)-CM-Asp-agarose (correlation coefficients of 0.978 and 0.979,
respectively, Fig. 9). According to the Langmuir and Langmuir-
Freundlich models, the maximum adsorption capacities (qm) of Co(II)-
CM-Asp-agarose were 7.33 0.55 and 6.85 1.14 mg of both Fab fragments
±
and uncleaved IgG per mL of adsorbent, respectively. These values of
maximum capacity are of the same order of ±magnitude of experimental
data reported for human IgG
adsorption onto protein L-agarose (7.7± 0.3 and 7.2 0.2 mg of IgG
mL−1, according Langmuir and Langmuir-Freundlich models) [42].
±
The adsorption of Fab fragments and uncleaved IgG onto Co(II)-
CM-Asp–agarose did not deviate from Langmuirean behavior. The
value of the cooperativity parameter n of the Langmuir-Freundlich
isotherm model was 1.11, with a degree of cooperativity n
approaching 1.0, indicating that the adsorption sites of the Co(II)-
CM-Asp–agarose adsorbent are relatively homo- geneous, ie,
multisite interactions, and/or multipoint attachment
are negligible.
The values of dissociation
± constants (Kd = 0.219 0.052 mg mL−1 or Kd(LF) = 0.153
0.144 mg mL−1)
could not ±be analyzed since the adsorption isotherm was con-
structed using human Fab fragments and whole IgG, a binary
mixture.
4. Conclusions
The performance of CM-Asp-agarose complexed with transition
metal ions Cu(II), Ni(II), Zn(II), and Co(II) for the purification of Fab
fragments from digested human IgG solution was investigated in
detail. This study shows that Fab fragment purification is greatly
influenced by the nature of the buffer system and the absence or
presence of NaCl in the adsorption buffer. The binding behavior of
fragments, and consequently the separation of Fab fragments is
predominantly based on the coordination bonds or electro- static
interactions between the chelate and protein, depending on the
adsorption buffer system. The Fab fragments can be purified by
negative chromatography with only traces of uncleaved IgG on
Cu(II)-CM-Asp-agarose when the adsorption buffer containing
1.0 mol L−1 NaCl is used (coordination bonds are more important
for adsorption). Since Cu(II)-, Ni(II)-, Zn(II)-, and Co(II)-CM-Asp-
agarose are negatively charged at pH 7.5, the Fab fragments were
adsorbed onto these adsorbents without NaCl in the adsorption
buffer, but high-purity Fab fragments (91%) were obtained only in
eluted fractions of the chromatography on Co(II)-CM-Asp-agarose
(electrostatic interactions are more important for adsorption). For
Co(II)-CM-Asp-agarose, Fab fragments were obtained in eluted
fractions having undigested IgG. The maximum adsorption capac-
ity of Co(II)-CM-Asp-agarose IgG was 8.52 mg of Fab fragments
and uncleaved IgG mL−1 of adsorbent and the equilibrium adsorp-
tion data could be described by the Langmuir adsorption isotherm
model.
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge the scholarships received
from CNPq and CAPES and the financial support received from
CNPq and CAPES/PROEX, Brazil.
References
[1] G. Erturk, L. Uzun, MA Tumer, R. Say, A. Denizli, Fab fragments imprinted SPR
biosensor for real-time human immunoglobulin G detection, Biosens. Bioelectron. 28
(2011) 97–104.
[2] V. Pillay, HK Gan, AM Scott, Antibodies in oncology, New Biotechnol. 28 (2011)
518–529.
[3] H. Hyytia, ML Jarvenpaa, N. Ristiniemi, T. Lovgren, K. Pettersson, A
comparison of capture antibody fragments in cardiac troponin I
immunoassay, Clin. Biochem. 46 (2013) 963–968.
[4] P. Holliger, PJ Hudson, Engineered antibody fragments and the rise of single
domains, Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1126–1136.
[5] P. Chames, M. van Regenmortel, E. Weiss, D. Baty, Therapeutic antibodies:
successes, limitations and hopes for the future, Br. J. Pharmacol. 157 (2009) 220–
233.
[6] A. Elbakri, PN Nelson, RO Abu, The state of antibody therapy, Hum.
Immunol. 71 (2010) 1243–1250.
[7] ACA Roque, CR Lowe, MA Taipa, Antibodies and genetically engineered related
molecules: production and purification, Biotechnol. Prog. 20 (2004) 639–654.
 CA Mourão et al. / J. Chromatogr. B 1017 (2016) 163–173
[8] ACA Roque, CSO Silva, MA Taipa, Affinity-based methodologies and ligands for
antibody purification: advances and perspectives, J. Chromatogr. A 1160 (2007) 44–55.
[9] BV Ayyar, S. Arora, C. Murphy, R. O'Kennedy, Affinity chromatography as a tool for
antibody purification, Methods 56 (2012) 116–129.
[10] P. Gagnon, CW Cheung, PJ Yazaki, Reverse calcium affinity purification of Fab with
calcium derivatized hydroxyapatite, J. Immunol. Methods 342 (2009) 115–118.
[11] L. Coleman, SM Mahler, Purification of Fab fragments from a monoclonal antibody
papain digest by Gradiflow electrophoresis, Protein Expr. Purif. 32 (2003) 246–251.
[12] DQ Yu, R. Ghosh, Integrated fragmentation of human IgG and purification of Fab using
a reactant adsorptive membrane bioreactor separator system, Biotechnol. Bioeng. 104
(2009) 152–161.
[13] D. Lutomski, R. Joubertcaron, P. Bourin, D. Bladier, M. Caron, Use of thiophilic
adsorption in the purification of biotinylated Fab fragments, J. Chromatogr. B 664 (1995)
79–82.
[14] GE Khoury, CR Lowe, A biomimetic Protein G affinity adsorbent: an Ugi ligand for
immunoglobulins and Fab fragments based on the third
IgG-binding domain of protein G, J. Mol. Recognit. 26 (2013) 190–200.
[15] D. Todorova-Balvay, O. Pitiot, M. Bourhim, T. Srikrishnan, MA Vijayalakshmi,
Immobilized metal-ion affinity chromatography of human antibodies and their
proteolytic fragments, J. Chromatogr. B 808 (2004) 57–62.
[16] T. Zimmerman, CP Frere, M. Satzger, M. Raba, M. Weisbach, K. Dohn, A. Popp,
M. Donzeau, Simultaneous metal chelate affinity purification and endotoxin clearance of
recombinant antibody fragments, J. Immunol. Methods 314 (2006) 67–73.
[17] J. Porath, J. Carlsson, I. Olsson, G. Belfrage, Metal chelate affinity chromatography, a new
approach to protein fractionation, Nature 258 (1975) 598–599.
[18] R. Gutierrez, EM Martın del Valle, MA Galan, Immobilized metal-ion affinity
chromatography: status and trends, Sep. Purif. Rev. 36 (2007) 71–111.
[19] RCF Cheung, JH Wong, TB Ng, Immobilized metal ion affinity chromatography: a review
on its applications, Appl. Microbiol. Biotechnol. 96 (2012) 1411–1420.
[20] JE Hale, DE Beidler, Purification of humanized murine and murine monoclonal
antibodies using immobilized metal-affinity chromatography, Anal. Biochem. 222
(1994) 29–33.
[21] ITL Bresolin, M. Borsoi-Ribeiro, WMSC Tamashiro, EFP Augusto, MA Vijayalakshmi,
SMA Bueno, Evaluation of immobilized metal-ion affinity chromatography (IMAC)
as a technique for IgG1 monoclonal antibodies purification: the effect of chelating
ligand and support, Appl. Biochem. Biotechnol. 160 (2010) 2148–2165.
[22] LC de Góes, EA Miranda, SMA Bueno, Interaction of histidine-tagged human proinsulin
with immobilized nickel ion: effect of chelating ligand and thermodynamics analysis,
Colloid Surf. A 369 (2010) 176–185.
[23] GL Pavan, ITL Bresolin, M. Borsoi-Ribeiro, MA Vijayalakshmi, SMA Bueno, The effect of
NaCl on the adsorption of human IgG onto CM-Asp-PEVA hollow fiber membrane-
immobilized nickel and cobalt metal ions, Adsorption 20 (2014) 677–688.
[24] LC da Silva, MM Serracchiani, EA Miranda, SMA Bueno, Separation of human Fab
fragments on negative mode Ni(II)-TREN-agarose chromatography, Process
Biochem. 49 (2014) 715–723.
173
[25] J. Porath, B. Olin, Immobilized metal ion affinity adsorption and immobilized metal ion
affinity chromatography of biomaterials. Serum protein affinities for gel-immobilized
iron and nickel ions, Biochemistry 22 (1983) 1621–1630.
[26] T. Mantovaara, H. Pertoft, J. Porath, Carboxymethylated aspartic-acid agarose a
selective adsorbent for calcium-binding proteins, preliminary studies, Biotechnol.
Appl. Biochem. 13 (1991) 315–322.
[27] T. Ternynck, S. Avrameas, Techniques Immunoenzymatiques: Techniques en
Immunologie, Les Editions INSERM France, 1987.
[28] MM Bradford, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72
(1976) 248–254.
[29] H. Towbin, T. Staehelin, J. Gordon, Electrophoretic transfer of proteins from poly-
acrylamide gels to nitrocelulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76 (1979) 4350–4354.
[30] X. Lu, CJ Miller, Concentration of IgG in the sera of normal rhesus macaques as
determined by a species-specific radial immunodiffusion assay, J. Immunol. Methods
197 (1996) 193–196.
[31] E. Sulkowski, The saga of IMAC and MIT, Bioessays 10 (1989) 170–175.
[32] GS Chaga, Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography:
past, present and future, J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001) 313–334.
[33] MCM de Souza, ITL Bresolin, SMA Bueno, Purification of human IgG by negative
chromatography on omega-aminohexyl-agarose, J. Chromatogr. B 878 (2010) 557–
566.
[34] G. Serpa, EFP Augusto, WMSC Tamashiro, MB Ribeiro, EA Miranda,
SMA Bueno, Evaluation of immobilized metal membrane affinity chromatography for
purification of an immunoglobulin G1 monoclonal antibody, J. Chromatogr. B 816 (2005)
259–268.
[35] MB Ribeiro, MA Vijayalakshmi, D. Todorova-Balvay, SMA Bueno, Effect of IDA and
TREN chelating agents and buffer systems on the purification of human IgG with
immobilized nickel affinity membranes, J. Chromatogr. B 861 (2008) 64–73.
[36] M. Zachariou, MTW Hearn, Adsorption and selectivity characteristics of several
human serum proteins with immobilised hard Lewis metal
ion-chelate adsorbents, J. Chromatogr. A 890 (2000) 95–116.
[37] J. Porath, Immobilized metal ion affinity chromatography, Protein Expr. Purif. 3 (1992)
263–281.
[38] V. Gaberc-Porekar, V. Menart, Perspectives of immobilized-metal affinity
chromatography, J. Biochem. Biophys. Methods 49 (2001) 335–360.
[39] E. Hochuli, Large-scale chromatography of recombinant proteins, J.
Chromatogr. 444 (1988) 293–302.
[40] BHK Nilson, L. Logdberg, W. Kastern, L. Bjorck, B. Akerstrom, Purification of
antibodies using protein L-binding framework structures in the light chain variable
domain, J. lmmunol. Methods 164 (1993) 33–40.
[41] R. Vola, A. Lombardi, L. Tarditi, L. Bjorck, M. Mariani, Recombinant proteins L and
LG: Efficient tools for purification of murine immunoglobulin G fragments, J.
Chromatogr. B 668 (1995) 209–218.
[42] IS Duarte, RL Zollner, SMA Bueno, Protein L-agarose for adsorption of autoantibodies:
a potential tool for extracorporeal treatment, Artif. Organs 29 (2005) 313–323.