LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

ACARA II

DASAR – DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

Disusun oleh :
Nama : Dina Christin Ayuning Putri
NIM : 098114015
Kelompok : A3
Tgl praktikum : 15 Februari 2010
PJ Laporan :

LABORATORIUM MIKROBIOLOGI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2010
 ACARA II
DASAR – DASAR TEKNIK MIKROBIOLOGI

A. TUJUAN
Mempelajari cara-cara pembuatan media dan syarat-syarat yang
dibutuhkan suatu media untuk pertumbuhan mikrobia.
Mempelajari macam-macam teknik sterilisasi.
Mempelajari cara-cara pemindahan mikrobia secara aseptis.
Mempelajari teknik-teknik isolasi dan penanaman mikrobia.
Mempelajari teknik pembuatan pulasan bakteri untuk pengecatan atau
pewarnaan bakteri
Mengenal bermacam-macam mikrobia di alam

B. DASAR TEORI
Media adalah suatu substrat makanan yang mengandung unsur-unsur
makanan yang diperlukan untuk menumbuhkan mikroorganisme. Unsur-unsur
makanan dapat berupa: garam-garam anorganik dan senyawa-senyawa organik
seperti protein, pepton, aseton, asam amino, vitamin. Kultur media adalah
bahan-bahan nutrien yang disediakan untuk menumbuhkan mikroorganisme di
dalam laboratorium. Kultur adalah mikroorganisme yang tumbuh dan
berkembang biak pada suatu kultur media ( Tarigan, 1988 ).
Syarat-syarat medium supaya mikroba dapat tumbuh biak:
 Medium harus mengandung semua nutrisi yang mudah digunakan
oleh mikroba.
 Medium harus mempunyai tekanan osmose, tegangan muka, pH.
 Medium tidak mengandung zat-zat penghambat.
 Medium harus steril ( Jutono,dkk, 1980 ).
Sterilisasi merupakan proses untuk membunuh semua jasad renik yang
ada, sehingga jika ditumbuhkan didalam suatu medium tidak ada lagi jazad
renik yang dapat berkembang biak. Sterilisasi harus dapat membunuh jazad
renik yang paling tahan terhadap panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992).
 Macam-macam cara sterilisasi yaitu:
a. sterilisasi dengan panas, dibagi menjadi 3 macam yaitu:
 Dengan pemijaran, misalnya untuk mensterilkan jarum platina, ose
 Dengan udara panas, misalnya untuk mensterilkan alat alat gelas
(Erlenmeyer, Petri, dll)
 Dengan uap air panas bertekanan tinggi, misalnya untuk mensterilkan
media kultur, alatnya disebut autoklaf
b. sterilisasi dengan penyaringan
Digunakan pada bahan yang sangat peka terhadap pemanasan, sehingga
digunakan filter bakteri, misalnya serum, antibiotika, toksin.
c. sterilisasi dengan bahan kimia
Untuk bahan yang rusak pada suhu tinggi dapat digunakan radiasi atau gas
secara kimiawi.
Selain itu ada bermacam-macam teknik sterilisasi lain yaitu:
1. Suhu tinggi : panas lembab dan panas kering
2. Suhu rendah : pendinginan dan suhu dibawah nol
3. Pengeringan
4. Tekanan osmotic
5. Radiasi filtrasi : UV, sinar-X, sinar gamma, sinar katode
6. Pembersih fisik : ultrasonic dan pencucian (Pelcsar dan Chan, 1988).
Inokulasi adalah suatu pemindahan mikroba-mikroba dari suatu suspensi
ke suatu media pertumbuhan lain yang steril. Pemindahan secara aseptis
dimaksudkan memindahkan biakan murni, mikroorganisme secara steril tidak
menimbulkan tercemarnya biakan murni (Tarigan, 1988)
Untuk mengisolasi mikroba dari satu media, digunakan metode:
 Metode taburan ( pour plate method )
Suspensi dicampur dengan ”agar” yang sudah dileburkan pada suhu ±
50°C. ”agar” dituang ke cawan petri, diinkubasi.
 Metode sebaran ( spread plate method )
Suspensi bakteri diencerkan dalam cairan tertentu.
  Metode goresan ( steak plate method )
Inokulasikan suspensi bakteri pada NA dengan menggunakan ose, lalu
digores lagi, sehingga didapat satu macam mikroba saja ( Tarigan, 1988 ).
Langkah utama dalam mempersiapkan spesimen mikroba yang akan
diwarnai untk pemeriksaan mikroskpk adalah:
Penempatan olesan atau lapisan tipis spesimen, pada kaca objek
Fiksasi olesan pada kaca objek, biasanya dengan pemanasan,
menyebabkan mikrorganisme tersebut melekat pada kaca objek
Aplikasi pewarna Tunggal atau serangkaian larutan pewarna
(Pelczar, 2005)
Mikroba di alam, merupakan flora kuman normal pada mulut terdiri dari
bakteriodes, streptokokus, batang berfilamen, Neisseria, dan sel-sel ragi.
Susunan jasad renik ini dipengaruhi oleh kebiasaan makan dan patologik gigi
dan gusi ( Bonang, 1982 ).

C. ALAT DAN BAHAN

1. Medium dan Cara Pembuatan Medium
Media Nutrien Agar (NA) Oxoid
Media Nutrien Broth (NB) Oxoid
Aquades
Cawan Petri
Tabung reaksi
Batang pengaduk, pipet volume, Erlenmeyer
Pemanas
2. Sterilisasi (dengan cara filtrasi)
Seperangkat filter bakteri
Media ( Urea Broth atau NB )
Batang bengkok / spreader
Media Nutrien Agar (NA) (OXOID) dalam cawan petri
Alkohol 70 %
3. Teknik-teknik pemindahan kultur mikroba
Media NA miring dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
Media NA tegak dalam tabung reaksi (hasil percobaan 1)
Media nutrien cair atau NB dalam tabung reaksi
(hasil percobaan 1)
Jarum ose
Jarum inokulasi
Kultur murni bakteri E. coli
Lampu Bunsen
Vortex mixer
4. Teknik-teknik Isolasi dan Penanaman Mikroba
 Spread Plate Method ( Cara Tebar/ Sebar )
Spreader/ batang bengkok/ batang Drigalsky
Pipet volume, lampu Bunsen
Media NA dalam cawan Petri
Kultur murni bakteri E. coli
Larutan pengencer (BPW atau Nacl fisiologis 0,9%)
 Pour Plate Method ( Cara Tabur )
Media NA dalam tabung reaksi ( hasil
percobaan 1 )
Cawan Petri steril
Kultur murni bakteri E. coli
Pipet volume dan lampu bunsen
 Steak Plate ( Cara Gores )
Media NA dalam cawan Petri
Kultur murni bakteri E. coli
Jarum ose
Lampu Bunsen
 5. Pembuatan pulasan bakteri
Gelas benda
Jarum ose
Lampu bunsen
Label preparat
Aquadest steril
Kultur murni bakteri E. coli
Penjepit gelas benda
6. Pengenalan mikroba di alam
Media NA dalam cawan Petri (hasil percobaan A)
Aquades steril
Cotton bud
Spidol

D. SKEMA KERJA
1. Medium dan Cara Pembuatan Medium
media NA (Oxoid) dan NB (Oxoid) ditimbang sesuai prosedur dikemasan

Aquades ditambahkan, diaduk sampai rata dengan batang pengaduk

Media dipanaskan sampai tercampur homogen jangan sampai terbentuk buih
berlebihan

media NA dituangkan dalam tabung reaksi dengan volume tertentu ( 5ml untuk
NA miring, 10ml untuk NA tegak, dan 15ml untuk cawan petri untuk percobaan
4b, sisanya untuk cawan petri untuk percobaan 5).

Media NB dituang ke dalam tabung reaksi

Tabung reaksi ditutup rapat dengan kapas
 
Seluruh media disterilkan dengan menggunakan autoklaf selama 15 menit tekanan
1 atm 121oC

media NA dituang ke dalam cawan petri, biarkan memadat

media NA dituang dalam tabung reaksi tegak, biarkan memadat

Media NB dalam tabung reaksi dibiarkan dingin

2. Sterilisasi
pada media NA dilakukan spread plate (0.1 ml) dalam cawan petri dengan kultur
murni bakteri

kultur disaring dengan filter bakteri diameter pori 0,1-0,2 µm

dilakukan spread plate kembali pada media cawan agar lain

Cawan petri diinkubasikan secara terbalik selama 24 jam pada suhu kamar

pertumbuhan pada kedua cawan petri diamati dan dibandingkan

hasil percobaan dengan hasil teknik spread plate method dibandingkan

3. Teknik-teknik Pemindahan mikrobia

tutup masing-masing tabung reaksi dilonggarkan(jangan dilepaskan)

tabung reaksi yang mengandung kultur bakteri dipegang di tangan kiri

jarum ose dipegang menggunakan tangan kanan

Jarum ose dibakar di atas nyala lampu bunsen dari pangkal ke ujung hingga kawat
memijar

jarum ose dipegang menggunakan ibu jari dan jari telunjuk

tutup tabung reaksi dibka menggunakan jari kelingking

mulut tabung reaksi dibakar

jarum ose dimasukkan dan biakan bakteri diambil 1 ose

mulut tabung reaksi dibakar dan ditutup

tabung reaksi yang akan diinokulasi diambil dengan tangan kiri, dengan cara yang
sama buka tutup tabung reaksi, kemudian mulut tabung reaksi dibakar lagi

biakan bakteri diinokulasikan pada tabung reaksi dengan cara zigzag

mulut tabung reaksi dibakar dan ditutup kembali

Ose dibakar

Tabung reaksi diberi label dengan tanggal percobaan, nama bakteri, teknik
pemindahan, dan nama kelompok

Tabung reaksi berisi bakteri diinkubasikan selama 24 jam pada suhu kamar dan
amati pertumbuhannya

untuk media nutrien cair (NB) dilakukan dengan cara yang sama
 4. Teknik-teknik Isolasi dan Penanaman Mikrobia
a. Spread Plate Method ( Cara tebar/ sebar )
Kultur murni bakteri diencerkan suspensi bakteri 10 1 - 10 6


tabung reaksi yang mengandung kultur murni bakteri diambil

Tabug reaksi dibuka tutupnya dan leher tabung dibakar

kultur bakteri dipindahkan 0.1 ml ke media NA dalam cawan petri

spreader yang telah dicelupkan ke alkohol dibakar, lalu biarkan dingin

kultur bakteri ditebarkan secara merata, biarkan sampai permukaan kering

inkubasikan selam 24 jam pada suhu kamar secara terbalik

pertumbuhan tiap-tiap pengenceran diamati dan dibandingkan

b. Pour Plate Method ( Cara Tabur )

tabung reaksi berisi media nutrien agar didinginkan sampai suhu ± 45 - 50° C

tutup tabung yang mengandung kultur bakteri dibuka

leher tabung dibakar

1 ml kultur bakteri dipindahkan ke tabung reaksi yang mengandung NA secara
aseptis

tutup tabung dibuka, leher tabung dibakar, media NA yang mengandung kultur
murni bakteri dituang ke dalam cawan petri

 Cawan petri digoyang perlahan

Menuangkan agar ke cawan petri

agar yang sudah memadat diinkubasi terbalik pada suhu kamar selama 24 jam

pertumbuhannya diamati

c. Streak Plate ( Cara Gores )

jarum ose dipanaskan di atas nyala Bunsen hingga memijar

1 ose kultur bakteri diambil dan digoreskan pada media agar, dimulai dengan satu
ujung

ose dipanaskan terlebih dahulu

ose digoreskan pada media agar untuk kuadran berikutnya

Media diinkubasikan secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam

pertumbuhannya diamati

5. Pembuatan Pulasan Bakteri

Gelas benda yang kering dan bersih dilabeli

jarum ose dipijarkan di atas bunsen

Untuk kultur cair, ambil 1 ose penuh,letakkan di tenah gelas benda dan ratakan
seluas 1cm2

untuk kultur padat,ambil 1 bagian kecil kultur, letakkan di tengah gelas benda
yang telah diberi aquadest steril dan ratakan

Gelas benda diangin-anginkan

pulasan bakteri difiksasi dengan melewatkannya di atas bunsen

plasan bakteri siap untuk diwarnai

6. Pengenalan Mikrobia di Alam

cawan NA dibagi menjadi 4 bagian

cotton bud dibasahi dengan air

permukaan lantai diusap dengan cotton bud tersebut

inokulasikan pada cawan petri ( ¼ bagian, beri kode 1 )

jari diletakkan pada cawan petri bagian 2 ( kode 2 )

cotton bud lainnya dibasahi, lalu diusapkan pada bagian dalam pipi

inokulasikan pada cawan petri ( kode 3 )

cotton bud lain dibasahi, inokulasikan pada tempat-tempat di sekitar ( kode 4 )

seluruh cawan petri diinkubasi secara terbalik pada suhu kamar selama 24 jam

diamati dan dibedakan mikroba yang tumbuh tersebut merupakan bakteri, yeast
atau fungi