A.

JUDUL PERCOBAAN : Isolasi DNA Epithelial Mulut

B. TANGGAL PERCOBAAN : Senin, 12 November 2018 pukul 13.00-
16.00 WIB
C. TUJUAN PERCOBAAN : Mampu mempelajari isolasi DNA sesuai
prosedur dengan sampel DNA diambil dari
sel epithelial mulut
D. DASAR TEORI :
DNA
DNA ditemukan pada tahun 1869 oleh seorang dokter muda Friedrich
Miescher yang percaya bahwa rahasia kehidupan dapat diungkapkan melalui
penelitian kimia pada sel-sel. Ia memilih sel yang terdapat pada nanah untuk
dipelajari dan ia mendapatkan sel-sel tersebut dari bekas pembalut luka yang
diperolehnya dari ruang bedah. Sel-sel tersebut dilarutkan dalam asam encer
dan dengan cara ini diperolehnya inti sel yang masih terikat pada sejumlah
protein. Kemudian dengan menambahkan enzim pemecah protein ia dapat
memperoleh inti sel saja dan dengan cara ekstraksi terhadap inti sel ini ia
memperoleh suatu zat yang larut dalam basa tetapi tidak larut dalam asam.
Pada waktu itu ia belum menemukan rumus kimia dari zat tersebut, sehingga
ia menamakannya nuklein. Sebenarnya apa yang ia peroleh dari ekstrak inti
sel tersebut adalah campuran senyawa-senyawa yang mengandung 30% DNA
(Rian, 2013).
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan
(Tim Dosen Biokimia, 2018). DNA merupakan kependekan dari
deoxyribonucleic acid yang dikenal sebagai asam deoksiribonukleat dalam
bahasa indonesia. DNA adalah sejenis biomolekul yang menyimpan dan
menjandi instruksi-instruksi genetika setiap organisme dan banyak jenis
virus. Instruksi-instruksi genetika ini berperan penting dalam pertumbuhan,
perkembangan, dan fungsi organisme dan virus. DNA merupakan asam
nukleat; bersamaan dengan protein dan karbohidrat, asam nukleat adalah
makromolekul esensial bagi seluruh makhluk hidup yang diketahui. DNA
pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat

1
 didalam inti sel, dan beberapa organ lain didalam sel seperti mitokondria dan
kloroplas (Klug & Cummings, 1994).
Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan
bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan. Genom adalah set lengkap
dari materi genetik DNA( yang dimiliki suatu organisme dan terorganisasi
menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi, baik pada manusia maupun
tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi melalui darah. Komponen darah
yang diisolasi yaitu sel darah putih, karena memiliki nukleus dimana terdapat
DNA di dalamnya (Priyani, 2004).
Kebanyakan molekul DNA terdiri dari dua unting biopolimer yang
berpilin satu sama lainnya membentuk heliks ganda. Dua unting DNA ini
dikenal sebagai polinukleotida karena keduanya terdiri dari satuan-satuan
molekul yang disebut nukleotida. Tiap-tiap nukleotida terdiri atas salah satu
jenis basa nitrogen (guanina (G), adenina (A), timina (T), atau sitosina (C)),
gula monosakarida yang disebut deoksiribosa, dan gugus fosfat. Nukleotida-
nukelotida ini kemudian tersambung dalam satu rantai ikatan kovalen antara
gula satu nukleotida dengan fosfat nukelotida lainnya. Ketika Guanin berikatan
dengan Sitosin, maka akan terbentuk tiga ikatan hidrogen, sedangkan ketika
Adenin berikatan dengan Timin maka hanya akan terbentuk dua ikatan
hidrogen. Satu komponen pembangun (building block) DNA terdiri atas satu
gula pentosa, satu gugus fosfat, dan satu pasang basa yang disebut nukliotida
(Lewis, 2003). Jika diilustrasikan, DNA memiliki struktur heliks seperti pada
gambar 1.

2
 Gambar 1. Struktur heliks molekul DNA.
Struktur heliks setiap molekul DNA disebabkan karena adanya ikatan
hidrogen, seperti pada gambar 2.

Gambar 2. Struktur kimia molekul DNA dengan ikatan hidrogennya yang

ditunjukkan oleh garis putus-putus.
Ikatan Hidrogen DNA terjadi pada bagian-bagian yang bersifat basa.
Ikatan terjadi antara atom H dengan atom N atau O. Ikatan hidrogen ada yang
berjumlah dua (pada pasangan GC) dan 3 (pada pasangan AT).

Gambar 3. Pasangan basa GC dengan tiga ikatan hidrogen.

3
 Gambar 4. Pasangan basa AT dengan dua ikatan hidrogen.

Gambar 5. Struktur DNA

(Sumber:Priyani, 2004)

Menurut Priyani (2004), DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat

penting bagi tubuh kita. Hal tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul
kehidupan utama di dalam sel makhluk hidup. Fungsi-fungsi tersebut adalah :

1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk

hidup.
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan
pembuatan molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi
autokatalis, yaitu fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri.
Menurut Darnell dkk (1994), ada tiga struktur DNA yang dikenal selama
ini. Struktur-struktur DNA tersebut adalah sebagai berikut:
a. Struktur primer
DNA tersusun dari monomer-monomer nukleotida. Penulisan urutan basa
dimulai dari kiri yaitu ujung 5’ bebas (tidak terikat nukleotida lain) menuju
ujung dengan gugus 3’ hidroksil bebas atau dengan arah 5’ →3’.
b. Struktur sekunder
Salah satu sifat biokimia DNA yang menentukan fungsinya sebagai
pembawa informasi genetik adalah komposisi basa penyusun. Pada tahun
1949-1953, Edwin Chargaff menggunakan metode kromatografi untuk
pemisahan dan analisis kuantitatif keempat basa DNA, yang diisolasi dari

4
 berbagai organisme. Kesimpulan yang dapat diambil dari data yang
terkumpul adalah sebagai berikut:
1. Komposisi basa DAN bervariasi antara spesies yang satu dengan
spesies yang lain
2. Sampel DNA yang diisolasi dari berbagai jaringan pada spesies yang
sama mempunyai komposisi basa yang sama.
3. Komposisi DNA pada 1 spesies tidak beurbah oleh perubahan usia,
keadaan nutrisi maupun perubahan lingkungan.
4. Hampir semua DNA yang diteliti mempunyai jumlah residu adenin
yang sama dengan jumlah residu timin (A=T) dan jumlah residu
guanin yang sama dengan jumlah residu sitosin (G=C), maka (A+G)
= (C+T), yang disebut aturan Chargaff.
5. DNA yang diekstraksi dari spesies-spesies dengan hubungan
kekerabatan yang dekat mempunyai komposisi basa yang hampir
sama.
Pada tahun 1953, James D. Watson dan Francis H.C. Crick berhasil
menguraikan struktur sekunder DNA yang berbentuk heliks ganda melalui
analisis pola difraksi sinar X dan membangun model strukturnya (Darnell, et
al. dalam T. Milanda, 1994). Heliks ganda tersebut tersusun dari dua untai
polinukleotida secara antiparalel (arah 5’→3’ saling berlawanan), berputar ke
kanan dan melingkari suatu sumbu. Unit gula fosfat berada di luar molekul
DNA dengan basa-basa komplementer yang berpasangan di dalam molekul.
Ikatan hidrogen di antara pasangan basa memegangi kedua untai heliks ganda
tersebut. Kedua untai melingkar sedemikian rupa sehingga keduanya tidak
dapat dipisahkan kembali bila putaran masing-masing untai dibuka.

5
 Gambar 6. Struktur DNA
Keterangan : a. Struktur primer DNA
b. Struktur sekunder DNA
Jarak di antara kedua untai hanya memungkinkan pemasangan basa
purin (lebih besar) dengan basa pirimidin (lebih kecil). Adenin berpasangan
dengan timin membentuk dua ikatan hidrogen sedangkan guanin berpasangan
dengan sitosin membentuk tiga ikatan hidrogen. Dua ikatan glikosidik yang
mengikat pasangan basa pada cincin gula, tidak persis berhadapan. Akibatnya,
jarak antara unit-unit gula fosfat yang berhadapan sepanjang heliks ganda tidak
sama dan membentuk celah antara yang berbeda, yaitu celah mayor dan celah
minor
c. Struktur Tersier
Kebanyakan DNA virus dan DNA mitokondria merupakan molekul
lingkar. Konformasi ini terjadi karena kedua untai polinukleotida membentuk
struktur tertutup yang tidak berujung. Molekul DNA lingkar tertutup yang
diisolasi dari bakteri, virus dan mitokondria seringkali berbentuk superkoil,
selain itu DNA dapat berbentuk molekul linier dengan ujung-ujung rantai yang
bebas.

Gambar 7. Struktur tersier DNA

Keterangan : a. Konformasi DNA sirkular
b. Konformasi DNA linear
DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan
tumbuhan terdapat didalam intisel, dan beberapa organ lain didalam sel seperti
mitokondria dan kloroplas. Penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi
asalnya. DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari mitokondria.
DNA genome kloroplas berasal dari kloroplas (Rian, 2013). Perbedaan dari
ketiganya adalah DNA nukelus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat

6
dengan protwin histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk
sirkular dan tidak berasosiasi dengan protei histon. Selain itu DNA
mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-
sifat yang berasal dari ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang
memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua (Klug& Cummings, 1994).

Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan

struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan
berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki
protein histon (Klug& Cummings, 1994). Sel eukariotik berukuran jauh lebih
besar dari molekul DNA didalam prokariotiknya Molekul DNA di dalam
eukarotik bergabung dengan protein dan dikelompokkan menjadi serabut
kromatin di dalam nukleus, yang disekelilingi oleh sistem membran ganda
yang bersifat kompleks. Selain itu prokariot juga mengandung satu atau lebih
plasmid. Plasmid merupakan molekul DNA sirkular dengan ukuran yang jauh
lebih kecil dibanding kromosom. Pada organisme tingkat rendah, DNA
penyusun kromosom dan plasmid dibungkus oleh dinding sel (pada bakteri)
atau dibungkus oleh protein tertentu (pada virus) (Rian, 2013).
Secara struktural, DNA merupakan polimer nukleotida, di mana untuk
setiap nukleotida tersusun atas gula deoksiribosa, pospat, dan basa. Polimer
tersebut membentuk struktur double heliks, di mana kedua heliks disatukan
oleh ikatan hidrogen yang terjadi antara basa-basa yang ada. Ada empat macam
basa yang terdapat di dalam DNA, yaitu Adenin, Sitosin, Guanin, dan Timin.
Adenin akan membentuk dua ikatan hidrogen dengan Timin, sedangkan

7
Guanin akan membentuk tiga ikatan hidrogen dengan Sitosin. Kombinasi
jumlah dan susunan yang terjadi antara ikatan-ikatan basa ini memungkinkan
setiap organisme memilik cetak biru genetik yang spesifik (khas) yang
membedakannya dari cetak biru milik organisme lainnya. DNA pada makhluk
hidup dapat ditemukan di inti sel (nukleus), mitokondria, dan klorofil. Namun
pada manusia, DNA hanya ditemukan di nukleus dan mitokondria. Jumlah
pasang basa pada DNA nukleus adalah sekitar tiga milyar. Pengorganisasian
DNA di nukleus diawali oleh perikatan DNA dengan oktamer histon
membentuk nukleosom. Sepotong sekuens DNA dengan panjang sekitar 146-
147 pasang basa akan mengelilingi delapan histon sebanyak 1.67 kali.
Nukleosom-nukleosom akan berpolimerisasi membentuk polinukleosom yang
kemudian disimpan di dalam kromosom. Kromosom-kromosom inilah yang
berada di dalam DNA, yang akan menggandakan dirinya pada saat pembelahan
sel. Sedangkan DNA yang berada di mitokondria (atau lebih dikenal dengan
nama mtDNA) berbentuk sirkuler (melingkar). Jumlah pasang basa pada
mtDNA lebih sedikit daripada jumlah pasang basa pada DNA nukleus, yaitu
sekitar 160.000. Namun apabila terjadi mutasi pada mtDNA akan
mengakibatkan kerusakan pada sistem yang peka terhadap kebutuhan energi
seperti sistem saraf dan otot.

RNA hampir sama dengan DNA, perbedannya terletak pada :

1. Basa utama RNA adalah Adenin, Guanin, Sitosin dan Urasil, dengan
panjang molekul 70 sampai 10.000 pb.
2. Unit gula RNA adalah D-ribosa.

8
3. Molekul RNA berupa untai tunggal, kecuali pada beberapa virus.
Asam Nukleat
Asam nukleat (bahasa Inggris: nucleic acid) adalah makromolekul
biokimia yang kompleks, berbobot molekul tinggi, dan tersusun atas rantai
nukleotida yang mengandung informasi genetik. Asam Nukleat merupakan
suatu polinukleotida, yaitu polimer linear yang tersusun dari monomer-
monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfodiester. Fungsi utama
asam nukelat adalah sebagai tempat penyimpanan dan pemidahan informasi
genetik. Informasi ini diteruskan dari sel induk ke sel anak melalui replikasi.
Sel memiliki dua jenis asam nukelat yaitu asam deoksiribonukleat
(deoxyribonucleic acid/DNA) dan asam ribonukelat (ribonukleic acid/RNA).
Selain memiliki komponen penyusun yang berbeda, DNA dan RNA memiliki
struktur yang berbeda juga, dimana RNA memiliki satu untaian polinukloetida,
sedangkan DNA memiliki dua untaian polinukloetida. Perbedaan struktur dari
keduanya dapat dilihat pada gambar 6.

Gambar 6. Perbandingan dari dua asam nukleat utama: RNA (kiri) dan
DNA (kanan).

9
DNA merupakan asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun
beratkering setiap organisme (Suryo, 2010).
Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air.
Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang
mengakibatkan protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini,
terdapat beberapa metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut
organik. iasanya pelarut organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform
yang mengandung 4% isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol
(CIA) berdasarkan perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat
bercampur dengan air dan kemampuannya untuk mendeproteinisasi
berdasarkan kemampuan rantai polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk
atau termobilisasi ke dalam fasea antara kloroform-air. Konsentrasi protein
yang tinggi pada fasa antara tersebut dapat menyebabkan protein mengalami
presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa organik lain akan terpisah pada
lapisan kloroform (Lubis, 2013).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara
kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air
dan kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau
sentrifugasi yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air.
Isoamil alkohol berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform
untuk membantu pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan
kloroform-air yang mana protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan
kloroform isoamil alkohol ini memungkinkan untuk didapatkan DNA yang
sangat murni, namun dengan ukuran yang terbatas (20.000-50.000 bp).
Faktor-Faktor Penyebab DNA Rusak :
1. Tekanan
Adanya tekanan terkadang dapat merusak DNA jika tekanan yang
diberikan sampai menembus ke sel DNA melalui membran sel. Tekanan
itu antara lain tumbukan menggunakan mortal dan pestel.
2. pH Tinggi
Peningkatan pH akan menyebabkan perubahan struktur guanin dari
bentuk keto menjadi bentuk enolat karena molekul tersebut kehilangan

10
 seluruh proton. Selanjutnya, perubahan ini akan menyebabkan terputusnya
sejumlah ikatan hidrogen sehingga pada akhirnya rantai ganda DNA
mengalami denaturasi. Derajat keasaman (pH) yang ekstrim (pH˂3 atau
pH˃10) maka DNA akan mengalami denaturasi.
3. Suhu (Panas)
Panas juga dapat menyebabkan rusaknya DNA, karena padanya
panas yang ekstrim sehingga molekul rantai ganda (pada dsDNA) akan
berubah menjadi molekul rantai tunggal, dan suhu yang dapat merusak
DNA berkisar dari 80˚C hingga 100 ˚C untuk molekul-molekul DNA yang
panjang.
4. Radiasi
Radiasi yang bersifat mutagenetik antara lain berasal dari sinar
kosmis, sinar ultraviolet, sinar gamma, sinar X, partikel beta, pancaran
netron ion-ion berat, dan sinar-sinar lain yang mempunyai daya ionisasi.
Radiasi dapat memicu kerusakan DNA. Radiasi pengionan seperti sinar
kosmik yang dapat menyebabkan break dalam DNA strands. Kerusakan
yang terjadi akibat radiasi pengionan dapat berupa: DNA sama sekali
putus (Double Strand Brake), satu back bone DNA putus (Single Strand
Break), kerusakan base (Base Damage), dan kerusakan gula ribosa pada
backbone DNA.
5. Tidak Tersedianya Senyawa Kromatin Kompleks
Tidak tersedianya senyawa kromatin kompleks yang dapat
berperan sebagai pelindung dari serangan senyawa O2 reaktif, aktivitas
DNA repair berubah dan terdapat kerusakan pada rantai transfer elektron
sehingga merangsang pembentukan senyawa O2 reaktif sekunder.
6. Konsentrasi Iso Elektrolit
Konsentrasi iso elektrolit seperti Na+ dan K+ serta ratio kandungan
antara basa nukleotida GC terhadap AT, misal tingginya kandungan GC
akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA.
Isolasi DNA
Isolasi DNA pertama kali dilakukan oleh ilmuwan asal Swiss bernama
Friedrich Miescher pada tahun 1869. Ia menemukan senyawa asam yang

11
mengandung nitrogen dan fosfat pada inti sel dari sel darah putih. Senyawa ini
diberi nama nuklein, namun pada tahun 1889 muridnya yaitu Richard Altmann
menamainya asam nukleat. Metode yang digunakan oleh Miescher adalah
alkalyne lysis untuk memecahkan sel dan mengisolasi DNA (Muladno, 2002).
Isolasi DNA adalah metode untuk mendapatkan asam deoksiribonukleat
dari molekul lain seperti dinding sel, membran sel, membran inti dan berbagai
jenis senyawa lain pada sel makhluk hidup. Menurut Yuwono (2008) Pada
proses isolasi DNA dilakukan proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada
(ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan
buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk melisiskan DNA. DNA dapat diisolasi
baik dari sel hewan, manusia, bakteri mapun dari tumbuhan. Isolasi DNA
secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran
plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi,
sehingga isolasi DNA merupakan langkah tepat untuk mempelajari DNA dan
memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam
jaringan.

Gambar 7. Rusaknya membran sel karena deterjen

Penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena
deterjen dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang
dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada
membran membentuk senyawa “lipid protein-deterjen kompleks”. Senyawa
tersebut dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan

12
hidrofobik, demikian juga dengan deterjen, sehingga dapat membentuk suatu
ikatan kimia.

Gambar 8. Struktur Deterjen

Terdapat dua metode dalam mengisolasi DNA yaitu metode
sentrifugasi dan presipitasi. Sentrfiugasi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai
berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan
akan berada pada bagian atas tabung. Untuk mendapatkan DNA yang
berkualitas, setiap step harus dilakukan dengan benar.
DNA juga dapat diisolasi baik pada manusia mapun pada
tumbuhan.Isolasi DNA merupakan langkah tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua yaitu:
a. Sentrifugasi
Merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung. Teknik sentrifugasi dilakukan oleh mesin yaitu mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua maca, fraksi yang terpisah, yaitu supernatant dibagian
atas dan pelet di bagian bawah (Tim Dosen Kimia, 2018).
b. Presipitasi
Merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapan suatu
komponen dari campuran (Tim Dosen Kimia, 2018).
Langkah-langkah isolasi DNA:
a. Pengumpulan sel-sel
b. Pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan protein
c. Pengendapan DNA

13
 (Tim Dosen Kimia, 2018).
Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam mengisolasi DNA:
a. Harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan
RNA
b. Metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies
c. Metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul
DNA
d. Metodenya harus sederhana dan cepat
Isolasi DNA bergantung pada:
a. Banyaknya DNA yang ingin didapatkan dari isolasi
b. Jenis organisme yang akan diisolasi DNA nya.
Perusakan dinding sel biasanya menggunakan nitrogen cair yang
memiliki suhu -169˚C. Menggunakan nitrogen cair ini dimaksudkan untuk
membekukan sel, setelah sel beku lalu sel dirusak (digerus) sampai benar-benar
halus dengan mortar agar dinding sel rusak. Lisis membran sel yaitu proses
untuk meluruhkan membran sel pada nukleus. Teknik ini umumnya dilakukan
menggunakan larutan deterjen kationik CTAB. Hal ini dikarenakan waktu
isolasi yang relatif cepat serta tahapan metode yang relatif lebih mudah. Bufer
CTAB merupakan detergen kationik yang dapat melisis membran sel dan
mampu mengendapkan polisakarida serta senyawa-senyawa fenolik (Faatih,
2009).
Reagen-reagen yang umum digunakan dalam teknik isolasi DNA yaitu
nitrogen cair, polyvinyl pyrrolidone (PVP), buffer CTAB, mercaptoethanol,
CHISAM, isopropanol dingin, buffer Tris-EDTA (TE), RNAse, dan ethanol
70%. Penggunakan CTAB berfungsi untuk mengurangi kontaminan,
mengurangi browning dan untuk menjaga DNA agar tidak rusak. Komponen-
komponen yang terkandung dalam bufer CTAB adalah Tris-Cl, EDTA, NaCl,
CTAB, PVP, dan merkaptoetanol. Tris-Cl ber!ungsi untuk mendenaturasi
protein. NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat DNA. EDTA
berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion magnesium yang
diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel secara keseluruhan.
Larutan CTAB, PVP, dan merkaptoetanol berfungsi untuk mendegradasi

14
senyawa-senyawa metabolit sekunder sekaligus mengurangi browning akibat
oksidasi (Lubis, 2013)

Gambar 9. Tahapan Isolasi DNA (Faatih, 2009)

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau

penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan
tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel.
Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni dengan
cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle
dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing/thawing dan
iradiasi. Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.
Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen
yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi
membran sel. Sementara cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K
seperti untuk melisiskan membran pada sel darah serta mendegradasi protein
globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Lubis, 2013).

Konsentrasi dan pH dari buffer yang digunakan harus berada dalam

rentang pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan
depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fasa fenol selama proses
deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan
mengakibatkan pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah
untuk menjaga struktur DNA selama proses penghancuran dan purifikasi

15
sehingga memudahkan dalam menghilangkan protein dan DNA serta
mencegah aktivitas enzim pendegradasi DNA dan mencegah perubahan pada
molekul DNA. Untuk mengoptimalkan fungsi larutan buffer, dibutuhkan
konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan inhibitor DNAase dan
detergen (Lubis, 2013).

Gambar 10. Fasa-Fase pada Isolasi DNA (Lubis, 2013).

Prinsip Dasar isolasi DNA

Dengan memecah dan mengekstraksi jaringan tersebut sehingga akan

terbentuk ekstrak sel yang terdiri dari DNA, RNA, dan substansi dasar lainnya.

1. Pelisisan
Untuk memecah dinding dan membran sel
2. Sentrifugasi
Untuk memisahkan hasil lisisan (dinding sel, dan kloroform) dari DNA
dengan kecepatan tertentu.
3. Ekstraksi
Untuk memisahkan senyawa DNA dari protein, lipid dengan cara
pengocokan.
4. Puriikasi
Untuk memurnikan DNA dari kontaminan seperti senyawa sekunder
(fenol), polisakarida.
5. Sentrifugasi
Untuk memisahkan senyawa DNA dari pengotornya dengan kecepatan
tertentu.
6. Presipitasi
Untuk mengendapkan DNA

16
Manfaat Isolasi DNA

a. Visualisasi DNA dengan elektroforesis gel.

b. Peninjauan pola fragmen DNA hasil pemotongan secara enzimatik melalui
teknik hibridisasi southerm.
c. Isolasi DNA genomik dalam rangka pembuatan pustaka genomik.
d. Isolasi plasmid atau DNA fage dalam prosedur rutin peminakan DNA.
e. Isolasi DNA yang diperlukan sebagai cetakan (template) dalam prosedur
perbanyakan DNA secara in vitro melalui teknik PCR (Anggie, 2011).
Sel Epithel

Istilah ephitelium berasal dari kata ephi yang berarti upon atau di atas
dan thele yang berarti nipple atau punting. Istilah tersebut untuk pertama kali
digunakan terhadap suatu lapisan pada permukaan bibir yang tembus cahaya.
Di bawah lapisan tersebut terdapat punting-punting atau papillae jaringan
pengikat yang banyak mengandung kapiler darah. Punting jaringan pengikat
tadi menonjol-nonjol ke lapisan penutup permukaan yang bersifat tembus
cahaya, dan lapisan inilah yang sebenarnya berbentuk sebagai epitel.
Selanjutnya penggunaan istilah epitel meluas untuk semua bentuk lapisan yang
terdiri atas lembaran sel-sel (cellular membrane) baik yang bersifat tembus
cahaya ataupun yang tidak. Membaran sel tersebut terdapat menutupi dan
membatasi di luar ataupun di luar tubuh (Subowo, 2002).

Struktur jaringan epitel antara lain:

1. Pada umumnya, salah satu permukaan epithelium bersifat bebas dan

menghadap ke cairan atau udara.
2. Epitelium tidak memiliki suplai darah. Nutrisinya berasal dari difusi
pembuluh dasar (lamina basalis) yang tidak hidup.
3. Sel-sel epitel tersusun rapat dengan sedikit materi intra seluler.
4. Sel-sel epitel bereproduksi dengan cepat untuk mengganti sel yang rusak
atau hilang.

Rongga mulut mempunyai berbagai fungsi, yaitu sebagai mustikasi,

fonetik, dan juga estetik. Hal tersebut mengakibatkan rongga mulut

17
merupakan tempat paling rawan dari tubuh karena merupakan pintu masuk
berbagai agen berbahaya, seperti produk mikroorganisme, agen karsinogenik,
selain rentan terhadap trauma fisik, kimiawi, dan mekanis.

Rongga mulut merupakan tempat berkumpulnya bakteri. Rongga mulut

dapat memberikan kontribusi yang cukup berarti dalam menimbulkan
bakterimia. Pada keadaan penurunan imunitas, bakteri rongga mulut yang
semula komensal dapat berubah menjadi pathogen sehingga dapat
menyebabkan bakterimia dan infeksi sistemik. Bakteri yang biasanta terdapat
dalam mulut diantaranya adalah Steptococcus mutans, Streptococcusviridians,
Stapylococcus aureus epidermidis, Stapylococcus pneumonia dan
Stapylococcus aurens.

Jaringan epithelium (ephitelial tissue) terdapat dalam wujud lapisan-

lapisan sel yang terkemas dengan rapat. Pada banyak epithelium, sel-sel
tersebutmenjadi satu oleh tight junction (persambungan ketat). Permukaan
bebas pada epitelium itu terpapar ke udara atau cairan, sementara sel-sel yang
berada bagian dasar rintangan itu melekat ke suatu membran basal (Campbell,
2004).

Jaringan lunak mulut terdiri dari mukosa pipi, bibir, ginggiva, lidah
palatum, dan dasar mulut. Mukosa pipi merupakan lapisna epitel dengan
bentuk sel skuamosa (sisik), disepanjang pipi sebelah dalam melebar depan
hingga bibir dalam atas dan bawah. Fungsi mukosa adalah merupakan barier
(pelindung), sebagai bagian dari sistem imun non spesifik agar mikroba atau
faktor penjejas tidak masuk kedalam tubuh. Mukosa sangat berperan pada
kesehatan di dalam rongga mulut karena pada keadaan normal, integritasnya
berfungsi untuk menahan penetrasi mikroorganisme. Daerah yang agak rawan
di dalam rongga mulut adalah pertemuan antara gusi dan gigi.

Sel-sel epithel mukosa mulut terdari dari 4 lapisan berturut-turut dari

yang paling dalamke permukaan yaitu germinativum/basalis, lapisan
spinosum, lapisan gronulosum dan lapisan corneum. Stratum basalis terdiri
dari selapis sel berbentuk kubus yang berbatasan dengan lamina propia dan

18
mengandung sel-sel induk yang secara kontinyu bermitosis dan anak selnya
dikirimkan ke lapisan yang lebih superfisal. Strotum spinosum terdiri dari
beberapa lapis sel berbentuk bulat atau oval mempunyai karalteristik sel yang
mulai matang. Strotum granulosum terdiri dari beberapa lapis sel yang lebih
gepeng dan lebih matang dari strotum spinosum dan mengandung banyak
granula keratohyalin yang merupakan bakal sel keratin. Strotum corneum
terdiri dari selapis atau berlapis-lapis sel (tergantung regio) berbentuk pipih
yang tidak berstruktur dan tidak mempunyai inti sel (Puspitawati, 2003).

Mukosa mulut dapat dikelompokkan menjadi tiga tipe yaitu mukosa

pengunyahan, mukosa penutup dan mukosa khusus. Mukosa pengunyahan
terdapat di regio rongga mulut yang menerima tekanan kunyah seperti gusi
dan palatanu durum. Jaringan epitelnya parakeratinised (mempunyai lapisan
keratin tipis yang beberapa selnya ada yang mesih memiliki inti sel yang tidak
sempurna). Mukosa penutup terdapat pada dasar mulut, permukaan inferior
lidah, permukaan dalam bibir dan pipi, palatum molle dan mukosa alveolaris
kecuali gusi. Tipe epitelnya nonkeratinised (tidak memiliki lapisan keratin).
Mukosa khusus terdapat pada dorsum lidah, tipe epitelnya ortokeratinesed
(memiliki lapisan keratin yang tebal yang terdiri dari sel-sel yang sudah tidak
berinti) (Puspitawati, 2003). Perbandingan antara basal-parabasal, sel
intermediet, dan sel superfisial disebut indeks maturasi. Pada kondisi normal,
jumlah sel superfisial sesuai dengan jumlah sel pada lapisan sel basal.

Jaringan Epitel menjalankan berbagai fungsinya, antara lain :

1. Perlindungan terhadap dehidrasi, trauma, iritasi mekanik, dan zat toksik.

2. Absorspsi gas atau nutrient, seperti dalam paru-paru atau saluran
pencernaan.
3. Transpor cairan, mucus, nutrient, atau zat partikulat lain.
4. Sekresi produk-poduk yang telah disintesis, seperti hormone, enzim, dan
perspirasi yang dihasilkan dari epithel glandular.
5. Ekskresi sisa metabolisme seperti urin melalui filtrasi.
6. Penerimaan sensorik oleh sel-sel epitel khusus pada ujung pengecap,
hidung, dan telinga (Sloane, 2003)

19
 Epitel mukosa mulut termasuk dalam epithelium skuamosa simpel,
adalah lapisan tunggal sel gepeng dengan nukleus sentral seperti lempengan.
Distribusi epithelium skuamosa simpel terdapat pada area:

1. Melapisi pembuluh darah dan pembuluh limfe (endothelium).

2. Melapisi rongga tubuh (mesotelium).
3. Saluran terkecil dari banyak kelenjar.
4. Bagian tubulus ginjal.
5. Duktus terminal dan kantong udara pada sistem respirasi.

Penampakan dalam sebuah potongan melintang mikroskopik adalah

selembar gabungan sel gepeng yang terlihat seperti sepiring telur goring
(Sloane, 2003).

Gambar 11. Sel Epithelium

Preparat epithelium mukosa mulut dapat diamati bentuk

selnyamenggunakan mikroskop. Berdasarkan hasil pengamatan" sel
epithelium” terwarna dengan baik. Warna nukleus lebih gelap dibandingkan
sitoplasma. Sel epithelium menggerombol dan masih bertumpuk-tumpuk tetapi
masih dapat diamati. Sitoplasma berwarna biru transparan sedangkan nukleus
berwarna biru gelap. Preparat ini cukup baik karena tidak terdapat kotoran dan
gelembung yang dapat mengganggu pengamatan.

20
E. ALAT DAN BAHAN
Alat :
- Gelas kimia 3 buah
- Gelas ukur 1 buah
- Pipet mikro 1 buah
- Tabung mikrosentrifuge 1 buah
- Tabung reaksi 1 buah
- Sentrifuge 1 buah
- Vortex 1 buah
- Kertas adsorben 3 buah

Bahan :

- Sampel isotonik 10 mL
- Sampel air mineral 10 mL
- Sampel aquades 10 mL
- Bufer Tris-EDTA 3 mL
- Etanol dingin 3 mL
- Larutan NaCl 100 Μl

F. ALUR PERCOBAAN
1. Pengumpulan sel-sel
± 10 mL larutan ± 10 mL Aquades ± 10 mL air mineral
Isotonik

- Digunakan berkumur selama 1 menit

ditampung digelas kimia masing-
masing

Larutan sampel sel

epitel isolasi DNA

21
2. Pemecahan Sel

1,5 mL larutan sampel sel epitel

- Diambil dengan pipet mikro

- Dimasukan kedalam tabung mikrosentrifuge
- Disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm
selama 1 menit
- dipisahkan

Endapan Filtrat

- Ditambah 1,5 mL larutan sel epitel

- Disentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 1 menit
- Diulangi penambahan sel epitel 2 kali
- Disentrifuge dan dipisahkan

Endapan Filtrat

- Ditambah 1 mL larutan buffer tris-EDTA

- Divortex tabung mikrosentrifuge selama 1 menit
- Diamati hasil
Larutan sel lisis

22
3. Pengendapan DNA

Larutan sel lisis dalam

tabung mikrosentrifuge

- Ditambah 100 𝜇L NaCL 2,5 M

- Dicampur dengan dibolak-balik
- Dipindahkan ke tabung lain dengan hati-hati
- Ditambah 1 mL etanol dingin
- Didiamkan selama 5 menit
DNA menggumpal diantara batas buffer dan
etanol (melayang seperti benang putih)

23
 G. HASIL PENGAMATAN
No. Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan

Sebelum Sesudah
1. Pengumpulan Sel-sel - Aquades cairan - Larutan sampel Larutan DNA Pada sampel isotonik,
tidak berwarna aquadest tidak keruh diduga mineral dan aquades diuji
Aquades, air mineral, isotonik 10 mL
- Air mineral larutan berwarna DNA yang untuk menentukan adanya
- Dibuat kumur selama 1 menit tidak berwarna - Larutan sampel menggumpal pada DNA pada epitel mulut.
- Ditampung dalam beaker
- Larutan isotonik : air mineral tidak larutan isotonik,
Glass yang berbeda
larutan keruh berwarna air mineral dan
Larutan sampel berwarna putih - Larutan sampel aquades
isotonik : larutan
keruh berwarna
putih

24
2. Pemecahan Sel (isis sel) dan Pencernaan - Larutan sampel Disentrifuge  Buffer tiris- Pemecahan sel epitel mulut
Protein aquadest tidak - Sampel aquades EDTA : menghasilkan sampel bebas
1,5 mL larutan Sampel berwarna terbentuk digunakan protein ditandai dengan
- Larutan sampel air endapan putih untuk endapan yang larut.
- Di masukkan kedalam
mineral tidak (++) mempertahanka
tabung mikrosentrifuge
- Di sentrifuge pada berwarna - Sampel air n harga pH agar
kecepatan 10.000 rpm - Larutan sampel mineral terbentuk struktur DNA
selama 1 menit
isotonik : larutan endapan putih tidak mudah
keruh berwarna (++) rusak
putih - Sampel isotonik :  Divortex :
1,5 mL larutan Sampel Filtrat - Larutan buffer tiris- terbentuk digunakan
EDTA : tidak endapan putih untuk
- Di tambah larutan sampel sel lagi
sebanyak 1,5 mL pengulangan 2x berwarna (+) menghomogenk
- Di tambah dengan 1 mL buffer Ditambah sel epitel an larutan atau
tris-EDTA kedalam
2 kali medium khusus
mikrosentrifuge
- Di vortex selama 1 menit - Sampel aquades dalam tabung
terbentuk mikrosentrifuge
Hasil Pengamatan endapan putih dan
(+++) mengendapkan

25
- Sampel air pengotor yang
mineral terbentuk ada dalam
endapan putih larutan
(+++)  Disentrifuge :
- Sampel isotonik : untuk
terbentuk memisahkan
endapan putih atau
(++) mengendapkan
Ditambah buffer protein
tris-EDTA :
- Sampel aquades
larutan tidak
berwarna dengan
endapan putih
(+++)
- Sampel air
mineral larutan
tidak berwarna
dengan endapan

26
 putih (+++)
- Sampel isotonik :
larutan tidak
berwarna dengan
endapan putih
(++)
Di vortex :
- Isotonik :
endapan pecah
(larutan tidak
berwarna namun
keruh)
- Air mineral :
endapan pecah
(larutan tidak
berwarna namun
keruh)
- Aquades :
endapan pecah

27
 (larutan tidak
berwarna namun
keruh)
3. Pengendapan DNA - NaCl larutan tidak NaCl + larutan  NaCl : Berdasarkan percobaan
berwarna sampel : berfungsi yang telah dilakukan dapat
100 mikroLiter NaCl 2,5 M
- Etanol larutan tidak - Aquades : larutan untuk disimpulkan bahwa tidak
- Dimasukkan kedalam tabung berwarna tidak berwarna menghilangka terdapat DNA pada semua
mikrosentrifuge
- Dipindahkan ke tabung lain yang - Larutan sampel - Air mineral : n komponen sampel epitel yang ditandai
bersih dan kering aquadest tidak larutan tidak lain selain dengan tidak adanya
- Ditambah 1 mL etanol secara berwarna berwarna DNA seperti benang tipis yang melayang
perlahan dibiarkan selama 5 menit
- Larutan sampel air - Isotonik : larutan karbohidrat – layang diantara larutan
100 mikroLiter NaCl 2,5 M mineral tidak tidak berwarna dan protein buffer & etanol.
berwarna Dibolak-balik  Etanol :
- Larutan sampel larutan sedikit berfungsi
isotonik : larutan keruh untuk
keruh berwarna Ditambah etanol memperjelas
putih larutan sedikit DNA yang
keruh tampak
- Sampel aquades : (menggumpal

28
 campuran tidak di batas etanol
berwarna (tidak dan buffer)
terdapat benang  Adanya DNA :
– benang yang terbentuk
melayang) benang tipis
- Sampel air panjang
mineral : berwarna putih
campuran tidak yang disebut
berwarna (tidak DNA.
terdapat benang
– benang yang
melayang)
- Sampel isotonik :
campuran tidak
berwarna (tidak
terdapat benang
– benang yang
melayang)

29
H. ANALISIS DAN PEMBAHASAN

Pada percobaaan isolasi DNA epithelial mulut ini memiliki tujuan

mampu mengerjakan isolasi DNA sesuai prosedur dengan sampel DNA
diambil dari sel epithelial mulut. Ada 2 macam asam nukleat yaitu DNA dan
RNA. DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehiddupan secara
seluler. Prinsip dari isolasi DNA ada 2 yaitu Sentrifuge dan Presipitasi.
Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan
berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung. Teknik sentrifugasi dilakukan oleh mesin yaitu mesin
sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Hasil sentrifugasi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan di bagian atas
dan pelet di bagian bawah. Sedangkan presipitasi merupakan langkah yang
dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. DNA
memiliki struktur helix utas ganda, yang mengandung komponen-komponen
gula pentosa (deoksiribosa), gugus fosfat, dan pasangan basa. Satu sel
memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan akan diturunkan pada
keturunannya. DNA merupakan polimer dari nukleotida yang tersusun dari
monomer-monomer nukleotida yang berikatan melalui ikatan fosfat diester.
Nukleotida terdiri dari gugus fosfat, gula deoksiribosa, dan basa nitrogen
(purin dan pirimidin), yang mana tersusun berpasangan pada baris panjang
berbentuk spiral yang sering disebut double helix. Fungsi dari DNA yaitu
pembawa informasi genetik, menyimpan, mereplikasi, dan mentranskripsi
informasi genetika, sebagai koenzim, berperan dalam proses metabolisme,
dan penyimpan energi. Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari
tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan
homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk
mencegah DNA terdenaturasi. Pada percobaan ini terdapat tiga tahap
percobaan yang harus dilakukan, yakni pengumpulan sel-sel, pemecahan sel
(lisis sel), dan pengendapan DNA.

30
1. Pengumpulan Sel-Sel
Percobaan ini bertujuan untuk mengumpulkan sel-sel yang terdapat
pada epithelial mulut. Langkah awal yang dilakukan sebelum percobaan
dimulai adalah menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan. Alat-alat
yang akan digunakan dicuci bersih dan dikeringkan. Sampel DNA yang
digunakan diambil dari sel epithelial mulut sehingga salah satu praktikan
sebelum percobaan dimulai harus berkumur terlebih dahulu untuk
memperoleh sel-sel DNA. Larutan yang digunakan untuk berkumur ada 3
yaitu 10 mL aquades (larutan tidak berwarna), 10 mL air mineral (larutan
tidak berwarna) dan 10 mL larutan isotonik (larutan berwarna putih keruh).
Masing-masing larutan digunakan untuk berkumur selama 1 menit. Hasil
dari berkumur di tampung dalam gelas kimia. Dalam percobaan ini urutan
larutan yang digunakan berkumur adalah aquades terlebih dahulu kemudian
air mineral dan terakhir adalah larutan isotonik. Digunakan 3 jenis minuman
bertujuan untuk membandingkan jumlah DNA yang dapat diisolasi apabila
digunakan 3 jenis minuman tersebut. Pada larutan isotonik dihasilkan
larutan berwarna putih keruh dan terdapat busa di atasnya (++); pada larutan
air mineral dihasilkan larutan tak berwarna, keruh, dan terdapat busa (+);
pada larutan aquades dihasilkan larutan tak berwarna, keruh, dan terdapat
busa (+). Larutan yang keruh diduga DNA yang menggumpal. Tahap
percobaan ini merupakan tahap isolasi jaringan, dimana jaringan yang
diisolasi adalah jaringan yang memiliki sel inti yakni jaringan epithelium
mulut. Larutan tersebut digunakan sebagai sampel isolasi DNA karena
sudah mengandung sel-sel ephitelial di dalamnya.
2. Pemecahan Sel (Lisis Sel) dan Pencernaan Protein
Pada percobaan ini bertujuan untuk memecah sel dan mencerna
protein agar DNA terpisah dari pengotornya karena hanya DNA yang akan
diisolasi, sehingga zat-zat pengotor itu harus dihilangkan. Langkah awal
yang dilakukan pada tahap ini adalah larutan sampel hasil berkumur
(aquades, air mineral dan larutan isotonik) masing-masing diambil sebanyak
1,5 mL menggunakan pipet mikro. Cara menggunakan pipet mikro adalah
mengatur volume yang diinginkan dengan cara memutar knop pengatur

31
volume. Tip yang sudah disediakan dan sesuai dipasang diujung mikropipet.
Langkah selanjutnya ditekan tombol penyedot pipet sampai batas pertama.
Dimasukkan ujung pipet kedalam larutan dan dilepas tekanan sampai proses
menyedot larutan selesai dengan sendiri. Dalam percobaan ini ada 3 sampel
larutan maka dengan itu tip yang digunakan ada tiga. Larutan yang sudah
selesai dipipet dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuge. Ketiga larutan
sel ephitel kemudian disentrifuge dengan keceepatan 10.000 rpm selama 1
menit. Tujuan dari sentrifuge ini adalah untuk memisahkan atau
mengendapkan protein yang ada pada larutan sel epithelial. Selain itu juga
berfungsi untuk melisiskan atau memecah dinding dan membran sel. Inti sel
harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.
Proses ini akan memberikan gaya sentrifugal sehingga molekul-molekul
akan terpisah berdasarkan berat jenisnya. Molekul yang mempunyai berat
molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan
berada pada bagian atas tabung. Pada saat dilakukan sentrifuge digunakan
kecepatan 10.000 rpm karena merupakan kecepatan maksimum untuk
memisahkan atau mengendapkan protein. Apabila kecepatannya kurang dari
10.000 rpm maka sel epithel tidak akan memisah dengan sempurna dan
tidak akan terbentuk endapan. Apabila kecepatan lebih dari 10.000 rpm
boleh dilakukan tetapi ditakutkan dapat merusak sel yang mengandung
DNA, apabila sel DNA sudah rusak sebelum ditambah Tris-EDTA, otomatis
DNA keluar dari sel dan bercampur dengan filtrat, sedangkan filtrat tersebut
dibuang dikarenakan yang dibutuhkan endapannya yang mana pada endapan
tersebut sudah tidak terdapat DNA karena DNA sudah tercampur pada
filtrat. Setelah disentrifuge, maka menghasilkan endapan putih yang sangat
sedikit pada ketiga tabung. Langkah tersebut dilakukan sebanyak 3 kali agar
mendapatkan endapan yang lebih banyak. Setelah dilakukan sentrifuge yang
ketiga kalinya, maka pada ketiga tabung tersebut terdapat endapan putih
yang lebih banyak. Pada tabung minuman isotonik terdapat endapan putih
(++), pada tabung air mineral terdapat endapan putih (+) dan pada tabung
aquades terdapat endapan putih (+). Endapan yang dihasilkan oleh isotonik
lebih banyak dibandingkan dengan endapan yang dihasilkan oleh aquades

32
dan air mineral, dikarenakan pada larutan isotonik mengandung ion Na+
yang akan mengikat gugus fosfat pada DNA, sehingga DNA yang
dikeluarkan oleh sel itu juga banyak. Tujuan dilakukan sentrifuge sebanyak
3 kali agar endapan yang diperoleh lebih banyak sehingga DNA dapat
diisolasi lebih banyak. Selain itu juga untuk mempermudah isolasi DNA,
karena apabila endapan yang diperoleh sedikit, maka akan lebih susah
dalam hal pengamatan isolasi DNA. Kemudian pada masing-masing larutan
yang terdapat pada tabung mikrosentrifuge di dekantasi untuk memisahkan
endapan dan filtrat. Endapan yang dihasilkan akan digunakan untuk tahap
selanjutnya sedangkan filtrat akan dibuang.
Kemudian langkah selanjutnya, endapan yang dihasilkan pada
masing-masing pelarut ditambahkan larutan buffer Tris-EDTA tidak
berwarna sebanyak 1 mL dan menghasilkan larutan tak berwarna dan
endapan putih pada semua larutan. Fungsi penambahan larutan buffer tris
EDTA ini adalah untuk mengkondisikan pH larutan yaitu pada pH 8, karena
protein dapat hidup dan bekerja pada pH tersebut, apabila tidak sesuai
dengan kondisi pH tersebut maka protein dapat mati karena kondisinya
terlalu asam maupun terlalu basa. Buffer Tris EDTA juga berfungsi sebagai
ion pengkhelat yang mengikat ion Mg2+ yang merupakan kofaktor enzim
endonuklease yang mana dalam hal ini terdapat proses difusi, didalam sel
terdapat Mg2+ yang dapat keluar karena berkonsentrasi tinggi daripada
konsentrasi di luar sel sehingga lebih mudah keluar dan membantu proses
pelisisan/mengkondisikan protein agar DNA tetap pada struktur awal
sehingga dapat terus berkembang secara optimal. Selain itu EDTA juga
merupakan suatu deterjen, penambahan detergen dapat menyebabkan
rusaknya atau ada lubang dalam membran sel dalam skala kecil melalui
ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik detergen dengan protein dan
lemak pada membran membentuk senyawa “lipid protein-deterjen
kompleks” yang mana ketika akan divortex menyebabakan lubang tersebut
semakin besar atau melebar sehingga DNA dapat terlepas. Senyawa tersebut
dapat terbentuk karena protein dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan

33
 hidrofobik, demikian juga deterjen, sehingga dapat membentuk suatu ikatan
kimia.

Gambar 1. Rusak/berlubangnya dinding sel akibat penambahan

deterjen
Selanjutnya masing-masing tabung mikrosentrifuge tersebut divortex
selama 1 menit dengan kecepatan 1500 rpm. Fungsi dari divortex adalah
membantu pemecahan sel dan untuk menghancurkan sel-sel yang ada di
dalam endapan atau lubang dalam membran sel tersebut melebar yang mana
agar DNA bisa dikeluarkan dari dalam sel tersebut. Pada percobaan ini
didapatkan hasil endapan yang terbentuk hancur atau larut setelah divortex
yang menandakan bahwa sel epithelial tersebut telah bebas protein dan
DNA dapat keluar dari sel epithelial dan larut dalam larutan buffer tris
EDTA sehingga DNA dapat diisolasi. Dilakukan vortex dengan kecepatan
1500 rpm karena apabila terlalu cepat akan merusak DNA nya dan apabila
terlalu pelan maka proses lisisnya kurang sempurna.
3. Pengendapan DNA
Pada percobaan ini bertujuan untuk memperoleh untai DNA yang
tidak menggulung lagi dan tidak lagi berikatan dengan protein sehingga
menjadi terlihat. Langkah pertama yaitu ditambahkan 100 μL NaCl tidak
berwarna dengan konsentrasi 2,5 M ke dalam masing-masing tabung
mikrosentrifuge. Fungsi penambahan NaCl bertujuan untuk mengikat DNA
yang bermuatan negatif yaitu pada ikatan fosfat DNA, untuk

34
memaksimalkan pemisahan DNA dengan zat pengotor sebagai
pengkondisian DNA agar tetap pada strusktur awal, merusak DNA, dan
ngelisis dengan peristiwa osmosis. Saat ion Na+ dari garam tersebut
berikatan fosfat, pada saat itulah DNA akan berkumpul atau memekat
sehingga DNA dapat diamati. Ion positif Na+ pada NaCl akan menyelimuti
DNA dan akan berikatan dengan sisi DNA yang bermuatan negatif sehingga
DNA yang dihasilkan nantinya tidak terkontaminasi dengan ion alkali atau
mineral sehingga keberadaan polisakarida harus dihilangkan dengan cara
mengendapkannya dengan penambahan NaCl.

Keterangan :
1. Pengambilan tiga ion Na+ dari dalam sel dan menempati situs
pengikatan pada protein integral.
2. Energi diperlukan untuk mengubah bentuk protein integral pada
membran yang sebelumnya membuka ke arah dalam sel menjadi
membuka ke bagian luar sel.
3. Selanjutnya, ion Na+ terlepas dari situs pengikatan dan keuar dari
protein integral menuju ke luar sel.
4. Kemudian dari luar sel, dua ion K+ menempati situs pengikatan di
protein integral. Bentuk protein integral berubah, dari sebelumnya

35
 membuka ke arah luar menjadi membuka ke arah dalam sel dan ion
kalium dilepaskan ke dalam sel.

Kemudian ketiga tabung mikrosentrifuge dicampur dengan cara

membolak-balikkan tabungnya sebanyak 3 kali. Hal ini bertujuan agar larutan
menjadi homogen secara sempurna. Lalu ketiga larutan tersebut di pindahkan
ke dalam tabung reaksi lain yang bersih dan kering, yang dilakukan dengan
hati hati agar tidak timbul busa. Busa dapat membuat DNA akan
terperangkap dalam busa tersebut sehingga pengamatan akan susah
dilakukan. Langkah selanjutnya ditambahkan 1 mL etanol dingin tidak
berwarna ke dalam masing-masing tabung reaksi dan menghasilkan larutan
tak berwarna pada semua sampel larutan (isotonik, air mineral, dan aquades).
Fungsi penambahan etanol adalah untuk mengendapkan, memekatkan DNA
dan untuk mem-presipitasi DNA pada fase aquos sehingga DNA
menggumpal membentuk struktur fiber yang mana untuk mengendapkan
protein histon sehingga untaian-untaian DNA tidak lagi menggulung dan
berikatan dengan protein histon yang menyebabkan DNA dapat terlihat.
Prinsip presipitasi antara lain menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air.

Etanol yang digunakan dingin karena jika dalam keadaan panas DNA
akan mengalami denaturasi sehingga tidak bisa diamati karena DNA
memiliki sifat yang hampir sama seperti protein, karena salah satu faktor
penyebab DNA rusak yaitu suhu terlalu panas. Setelah ditambahkan dengan
etanol dingin, larutan tersebut didiamkan selama 5 menit agar proses
presipitasi dapat berjalan dengan baik dan untuk menghasilkan batas yang
jelas. Hasil yang didapatkan yaitu sebagai berikut:

 Minuman isotonik : larutan tidak berwarna dan tidak terdapat benang

halus putih tipis melayang
 Air mineral : larutan tidak berwarna dan tidak terdapat benang halus
putih tipis melayang
 Aquades : larutan tidak berwarna dan tidak terdapat benang halus
putih tipis melayang

36
 Berdasarkan teori, percobaan hasil isolasi DNA yang terbaik
menggunakan minuman isotonik karena benang halus terlihat jelas
melayang-layang, dibandingkan dengan menggunakan pelarut air mineral,
dan aquades. Sehingga urutan banyaknya jumlah DNA terbanyak terdapat
dalam pelarut isotonik>air mineral>aquades. Hal ini terjadi karena pada
pelarut isotonik terdapat ion-ion NaCl, Na+ dari NaCl dapat mengikat dengan
sempurna gugus fosfat DNA sehingga DNA yang terlepas dari protein cukup
banyak dan akan menggumpal yang mana DNA akan terkumpul. Tetapi
berdasarkan hasil percobaan yang sudah dilakukan tidak sesuai teori karena
tidak membentuk benang halus diantara ketiga pelarut tersebut. Hal tersebut
dikarenakan karena faktor berkumur untuk mendapatkan sel epithel dari
mulut, sehingga pada saat isolasi DNA tidak didapatkan benang-benang halus
yang melayang.
I. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa:
1. Isolasi DNA dapat dilakukan dengan metode sentrifuge
2. Tidak terdapat DNA pada semua sampel epithel yang ditandai dengan
tidak adanya benang-benang halus yang melayang-layang diantara
larutan bufer dan etanol.
J. JAWABAN PERTANYAAN
1. Gambarkan Struktur DNA!
Jawaban :

37
 2. Bagaimana cara menentukan jumlah DNA hasil isolasi tersebut
menggunakan spektofotometer!
Jawab :
Penentuan jumlah DNA hasil isolasi secara kuantitatif dapat
dilakukan dengan cara mengukur absorbansi larutan menggunakan
instrumen spektrofotometri UV. Pada spektrofotometri ini nantinya akan
digunakan dua panjang gelombang yaitu 260 nm dan 280 nm. Kualitas
DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminasi
protein dapat dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada
panjang gelombang tersebut. Nantinya akan dilakukan dua kali
perhitungan absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer yaitu
blanko dengan sampel yang telah dibuat. Hasilnya akan diplotkan dalam
sebuah grafik yang menghasilkan persamaan y= ax + b dan R sebagai
nilai regresi. Melalui perhitungan tersebut dengan mensubstitusikan nilai
absorbansi sampel ke dalam persamaan y = ax + b, maka akan
didapatkan kadar DNA dalam sampel dari proses isolasi.
K. DAFTAR PUSTAKA
Anggie, 2011. Manfaat Isolasi DNA.
(online)http://anggiemyblog.blogspot.com/2011/04/laporan-isolasi-
dna.html diakses tanggal 17 November 2018.
Campbell, N.A. 2004. Biologi. Edisi Kelima Jilid 3. Jakarta: Erlangga.
Darnell, J.,Lodish, H., dan Baltimore, D. 1994. Moleculer Cell Biology, and
edition, Scientific American Book Inc. New York,.99-76.

Faatih, M. 2009. Isolasi dan Digesti DNA Kromosom. Jurnal Penelitian Sains
dan Teknologi, Vol. 10, No. 1 , 61-69.

Klug, W.S. and M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. Fourth

Edition. USA: Englewood Cliff.
Lewis, A.R. 2003. Human Genetics: Concepts and Application. The
McGraw-Hills Company, Inc. Boston.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka
Wirausaha Muda.

38
Priyani, N. 2004. Sifat Fisik dan Kimia DNA. Online Web:
http://library.usu.ac.id/download/fmipa/biologi-nunuk2.pdf .Diakses
pada tanggal 17 November 2018.
Puspitawati Ria. 2003. Struktur Makroskopik dan Mikroskopik Jaringan
Lunak Mulut. Jurnal Kedokteran Gigi Universitas Indonesia, 10
(Edisi Khusus) : 462-467.
Rian. 2013. Struktur DNA. Website:
http://web.unair.ac.id/admin/file/f_3569_PCR.pdf. Diakses Sabtu, 10
November 2018 pukul 20.00 WIB.
Sloane, Ethel. 2003. Anatomi dan Fisiologi untuk Pemula. Jakarta: EGC.
Subowo. 2002. Histologi Umum. Jakarta: PT Bumi Aksara.
Suryo. 2010. Genetika Strata 1. WH Freeman: San Fransisco.

Tim. 2018. Petunjuk Praktikum Biokimia. Surabaya: Fmipa UNESA.

Yuwono, T. 2008. Biologi Molekuler. Jakarta : Erlangga.

39
 LAMPIRAN FOTO

No. Gambar Keterangan

1. Persiapan alat dan bahan A. Alat-alat yang
digunakan : tanumg
mikrosentrifuge,
tabung reaksi, rak
tabung reaksi, pipet
volum, gelas ukur,
gelas kimia
B. Bahan-bahan yang
A
digunakan : larutan
isotonik, air mineral,
aquades
C. Larutan NaCl 2,5 M
D. Etanol 96%
E. Larutan Tris-EDTA
F. Pipet mikro
B G. Mikrosentrifuge
H. vortex

C D E

F G H

40
2. Pengumpulan Sel-sel I. larutan sampel yang
digunakan untuk
berkumur diambil
menggunakan gelas
ukur dan masing-
masing dimasukkan
ke dalam gelas kimia
100 mL
I
J. Hasil larutan sampel
yang telah digunakan
untuk berkumur
mengambil sel
epithelial mulut

3. Pemecahan Sel (lisis sel) dan Pencernaan K. Pengambilan 1,5 mL

Protein larutan sampel 1
L. Pengambilan 1,5 mL
larutan sampel 2
M. Dimasukkan larutan
sampel ke dalam
masing-masing
tabung
K L
mikrosentrifuge
N. Sebelum di sentrifuge
larutan tidak ada
endapan

41
 O. Tabung
mikrisentrifuge di
tempatkan ke dalam
sentrifuge
P. Disentrifuge dengan
kecepatan 10.000
M N O
rpm selama 1 menit
Q. Endapan pada sampel
air mineral
R. Endapan pada sampel
aquades
S. Endapan pada sampel
P Q R larutan isotonik
T. Ditambahkan dengan
larutan tris-EDTA
U. Di vortex masing-
masing tabung
dengan kecepatan

S T U 1500

4. Pengendapan DNA V. Hasil setelah di

vortex endapan pecah
W. Ditambahkan larutan
NaCl 2,5 M
mengguankan pipet
mikro
X. Di pindahkan larutan
V W X
ke dalam tabung
reaksi yang bersih
dan kering
Y. Ditambahkan larutan
etanol 96% 1 mL ke

42
 dalah tabung reaksi
Z. Di diamkan selama 5
menit
AA. Hasil isolasi DNA
pada masing-masing
tabung tidak
Y Z
terbentuk benang
berwarna putih di
antara etanol dan tris-
EDTA

AA

43