TEKNIK LABORATORIUM TERAKHIR DI DIAGNOSIS, PENELITIAN, DAN

PENCEGAHAN RABIES

Abstrak

Inokulasi tikus adalah salah satu metode klasik untuk isolasi lyssavirus. Meskipun kultur sel
dapat menggantikan penggunaan hewan dalam banyak aplikasi, hewan masih paling sesuai
bila titer virus yang tinggi harus diperkuat tanpa adanya kelalaian yang berlebihan, dalam
berbagai studi patogenisitas pada model hewan, atau untuk evaluasi potensi biologis rabies.
Untuk tujuan diagnostik, inokulasi biasanya dilakukan pada tikus menyusui atau penyapihan
(10-15 atau 30. μL inokulum, masing-masing) secara intrakranial. Inokulum disiapkan
sebagai suspensi jaringan homogen 5-20% atau supernatan kultur sel, dan disuntikkan oleh
jarum suntik insulin dengan jarum pengukur 26-27. Teknik inokulasi yang tepat akan
membantu meminimalkan trauma dan refluks inokulum dari tengkorak. Pengamatan harus
dilanjutkan selama 14 hari, dan hewan yang sakit secara klinis harus diberi euthanasia
berdasarkan skor nyeri. Diagnosis rabies harus dikonfirmasi dengan mendeteksi antigen
lyssavirus atau RNA pada otak tikus.

Isolasi Virus pada Hewan: Uji Inokulasi Mouse (PDF Download Available). Tersedia dari:
https://www.researchgate.net/publication/282884391_Virus_Isolation_in_Animals_The_Mou
se_Inoculation_Test [diakses 13 Nov 2017].
Google Terjemahan untuk Bisnis:Perangkat PenerjemahPenerjemah Situs Web

Isolasi patogen pada model hewan, termasuk uji inokulasi tikus (MIT) untuk
diagnosis rabies, telah digunakan dalam praktik laboratorium global selama lebih dari satu
abad.1 Munculnya kultur sel memfasilitasi pengurangan penggunaan hewan secara
signifikan. Namun, masih belum ada alternatif di banyak bidang penelitian penyakit menular,
termasuk: studi patogenisitas, 2 evaluasi keamanan dan kemanjuran biologis dan sediaan
farmasi lainnya, 3 dll Meskipun tikus penyadap dan dewasa menunjukkan kerentanan yang
kurang terhadap lyssavirus daripada beberapa mamalia lainnya. (seperti hamster Suriah,
terutama melalui rute inokulasi perifer), mereka menawarkan kenyamanan operasional karena
ukuran tubuh kecil, yang memungkinkan perumahan beberapa hewan di kandang, peternakan
yang relatif murah, dan kemudahan penanganan karena ekornya yang panjang. Inokulasi
intrakranial, tikus (terutama 1-3 hari) menunjukkan kerentanan yang sangat tinggi terhadap
lyssavirus, yang serupa dengan kerentanan garis sel neuronal. Isolasi lyssavirus pada tikus
memiliki beberapa kelebihan dan kekurangan dibandingkan dengan isolasi dalam kultur sel.

Sebagai contoh, tikus adalah

Ivan V. Kuzmin14
biasanya lebih tahan terhadap kontaminan bakteri dan zat beracun, yang mungkin ada di
bidang bahan diagnosa yang didapat dari hewan mati. Tikus memungkinkan akumulasi titer
virus yang tinggi pada inokulasi pertama, karena infeksi tersebut akan menyebabkan penyakit
hanya setelah replikasi virus yang signifikan di otak tikus. Sebaliknya, mayoritas kultur sel
konvensional yang digunakan untuk uji inokulasi kultur jaringan cepat (RTCIT) 4 harus
dipecah setiap 3-5 hari, sehingga tidak memberikan waktu yang cukup untuk akumulasi virus
sampai beberapa bagian (kadang-kadang 10 atau lebih) telah dilakukan. . Sebenarnya, sisi
berlawanan dan tidak menguntungkan dari perbedaan ini adalah MIT membutuhkan waktu
yang jauh lebih lama untuk penyelesaian uji dibandingkan dengan RTCIT untuk memastikan
hasil negatif. Dalam studi penemuan patogen, inokulasi hewan akan memungkinkan
pengisolasian agen infeksi yang berbeda yang menyebabkan penyakit.5 Agen ini dapat
dilewatkan dalam kultur sel jika tidak menghasilkan efek sitopatik dan tidak ditunjukkan
dengan teknik spesifik. MIT tidak memerlukan lingkungan steril atau inkubator CO2. Hal ini
dapat dilakukan di laboratorium lapangan yang relatif dasar dengan standar vivarium. Oleh
karena itu, pilihan operasional antara MIT dan RTCIT tergantung pada tujuan penelitian,
kualitas sampel, dan kapasitas laboratorium.

2.2 PILIHAN MICE DAN HUSBANDRY MEREKA

Semua strain tikus albino laboratorium konvensional menunjukkan kerentanan yang

hampir sama terhadap lyssavirus. Tikus mencekik (berumur 1-3 hari) lebih disukai karena
keroposnya yang tinggi. Seperti yang ditunjukkan pada beberapa strain virus rabies (RABV)
yang dilemahkan, tikus berumur 1-7 hari rentan terhadap tantangan intrakranial dan
intramuskular, sedangkan tikus berumur 3 minggu mungkin tidak rentan terhadap virus yang
diinokulasi oleh rute manapun. Meskipun demikian, tikus penyapihan (3-4 minggu) dapat
digunakan untuk isolasi rutin lyssavirus dari sampel lapangan. Penggunaan tikus yang lebih
tua tidak dianjurkan karena keracunannya yang menurun, dan karena tengkorak mereka
terlalu tebal untuk tantangan konvensional melalui jarum kecil (26-29 G). Penggunaan paksa
jarum pada tengkorak tebal akan segera meningkatkan efek traumatis. Tikus dari kedua jenis
kelamin sama-sama rentan, namun untuk menghindari pembiakan yang tidak diinginkan,
perhatian harus diberikan untuk tidak menempatkan tikus dewasa dari jenis kelamin yang
berbeda dalam satu kandang. Juga, laki-laki dapat sering bertengkar; Oleh karena itu
penggunaan betina lebih praktis.

Hewan harus berada dalam kesehatan umum yang baik. Ini akan membuat mereka
lebih tahan terhadap efek samping dari inokulasi intrakranial, dan akan menghilangkan
morbiditas dan mortalitas nonspesifik selama pengujian. Secara umum,
Isolasi Virus pada Hewan: Uji Inokulasi Tikus 15
paling tidak 3-7 hari pengamatan karantina diperlukan untuk tikus setelah mereka melahirkan
dari fasilitas pengembangbiakan ke laboratorium diagnostik untuk adaptasi terhadap
lingkungan baru, penurunan tekanan yang disebabkan oleh transportasi, dan identifikasi
beberapa masalah kesehatan potensial. Jika tikus menjadi sakit dan menunjukkan tanda klinis
yang tidak terduga selama percobaan (misalnya diare, lesi kulit, dll.), Mereka harus segera
dikeluarkan dari percobaan dan diserahkan ke vendor atau ke laboratorium hewan untuk
tujuan diagnostik (jika tikus telah diinokulasi dengan lyssavirus, laboratorium dimana
diagnosis semacam itu dilakukan harus dilisensikan untuk bekerja dengan patogen ini, dan
petugas diagnostik harus divaksinasi dengan tepat). Perumahan tikus tergantung dari ukuran
kandang yang digunakan. Transmisi horisontal lyssavirus di antara tikus yang diinokulasi
tidak mungkin, oleh karena itu tikus yang diberi tanda dengan benar diinokulasi dengan
spesimen yang berbeda dapat ditempatkan bersama. Namun, untuk menghindari salah label,
selalu lebih baik menyimpan setiap kandang sehingga tikus hanya diinokulasi satu spesimen.
Sekelompok 5-10 tikus weanling biasanya digunakan per spesimen. Tikus yang tersendat
ditampung dengan sebuah bendungan, satu liter per sangkar, dan diinokulasi dengan satu
spesimen (tanda tikus menyusui sulit dan tidak dapat diandalkan). Jika serasah besar dan
beberapa tikus menyusui tidak digunakan untuk inokulasi, mereka harus melakukan
euthanasia untuk menghindari salah tafsir hasil tes

2.3 PERSIAPAN INOKULUM

Suspensi jaringan, supernatan kultur sel, cairan serebrospinal (CSF), atau air liur
biasanya digunakan untuk MIT. Jaringan harus dihomogenisasi secara ketat dengan
menggunakan sarana yang tersedia. Semua peralatan non-pakai yang digunakan untuk
homogenisasi harus disterilkan dengan autoklaf. Idealnya, semua langkah untuk persiapan
inokulum harus dilakukan dalam kabinet keamanan hayati agar mengandung dispersi tetesan.
Jaringan otak lunak dan mudah dihomogenkan. Organ lain, terutama yang memiliki jaringan
ikat dalam jumlah signifikan, seperti kelenjar ludah, dapat menimbulkan kesulitan. Mortar
dan alu adalah alat homogenisasi "klasik" dan dapat digunakan secara efisien jika jumlah
jaringan relatif besar (0,3 g atau lebih). Abrasives seperti pasir steril atau pecahan kaca dapat
ditambahkan untuk memperbaiki homogenisasi jaringan keras. Untuk sejumlah kecil jaringan
otak, stik kayu atau plastik steril dapat digunakan untuk homogenisasi sampel di mikrotube
dengan dasar datar atau kerucut (tabung Eppendorf 1,5-2,0 mL; tabung anti bocor dengan
tutup ulir adalah
Ivan V. Kuzmin16
lebih baik).

Untuk sejumlah kecil jaringan keras, perlu menggunakan manik-manik kaca atau
polimer yang ditempatkan di mikrotube bersama-sama dengan sampel jaringan, dan untuk
mengarahkan tabung ke getaran kecepatan tinggi dalam homogenizer listrik selama 5-10
menit. Persediaan homogenisasi, instrumen, dan pengencer harus didinginkan pada suhu 4 °
C untuk mengurangi kerusakan enzimatik selama pembuatan inokulum. Salah satu pengencer
yang paling umum digunakan untuk pembuatan suspensi adalah larutan NaCl isotonik steril,
walaupun tikus tahan bahkan untuk inokulasi dengan air suling. Penambahan serum hewan 2-
20% akan meningkatkan stabilitas virus. Namun, hewan donor serum tidak boleh divaksinasi
terhadap rabies. Jika informasi seperti itu tidak tersedia, anjing, kucing, dan sera sapi tidak
boleh digunakan untuk persiapan inokulum. Serat kuda, domba, atau kelinci biasanya aman
untuk digunakan. Serum harus diberi panas pada suhu 56 ° C selama 30 menit. Pengencer
harus disaring melalui filter penahan bakteri. Banyak laboratorium secara rutin menggunakan
media kultur sel (misalnya media esensial minimum, MEM) untuk persiapan inokulum
hewan. Biasanya mengandung serum sapi 2-15% bovine bersertifikat karena tidak adanya
antibodi rabies dan zat beracun. Meskipun obat antimikroba dan antijamur tidak diperlukan
untuk inokulasi tikus dengan bahan otak steril segar, penggunaannya disarankan untuk
inokulasi dengan suspensi kelenjar ludah atau sampel lainnya, yang dapat terkontaminasi
bakteri atau jamur. Secara historis, campuran penisilin (500 IU / mL) dan streptomisin (1.500
IU / mL) telah digunakan untuk tujuan tersebut, dan beberapa antibiotik lain tersedia di pasar
saat ini. Biasanya antibiotik mungkin ada di MEM dan media kultur sel lainnya.

Suspensi sepuluh persen (berat) biasanya digunakan untuk inokulasi hewani,

walaupun ini adalah pilihan operasional, dan konsentrasinya dapat meningkat atau menurun
2x tanpa perubahan signifikan dalam sensitivitas uji atau efek samping bagi hewan yang
diinokulasi. Jumlah pengencer yang dibutuhkan biasanya ditambahkan ke spesimen jaringan
secara bertahap selama homogenisasi. Dalam kasus dimana homogenisasi dilakukan dengan
manik-manik dalam tabung tertutup, sejumlah pelarut dapat ditambahkan ke tabung di awal.
Setelah homogenisasi, suspensi harus disentrifugasi untuk menghilangkan partikel kotor.
Bahkan jika partikel semacam itu mungkin tidak mempengaruhi hewan yang diinokulasi
dengan tidak baik, mereka mungkin menyumbat jarum suntik saat inokulasi. Sentrifugasi
biasanya dilakukan pada 150-200 g selama 10-15 menit, idealnya dalam sentrifugasi
pendingin (4 ° C). Jika kontaminasi bakteri diharapkan dalam spesimen, suspensi yang
diklarifikasi juga dapat dikenai penyaringan melalui filter syringe 0,22 μm.
Isolasi Virus pada Hewan: Uji Inokulasi Tikus 17
Inokulum yang disiapkan harus disimpan di es atau paket es pra-dingin sampai digunakan.
Namun, pembekuan harus dihindari karena setiap siklus pembekuan-pencairan mengurangi
titer virus.

2.4 PROSEDUR INOKULASI

Karena sulit menginokulasi hewan di dalam kabinet keamanan hayati, prosedur ini
biasanya dilakukan di bangku cadangan. Bangku dan semua permukaan dan instrumen
disekitarnya harus bisa dicuci, dan alat pelindung diri yang tepat (PPE) harus digunakan
untuk menghindari paparan sendiri. APD minimum mencakup mantel laboratorium dengan
lengan panjang, sarung tangan karet ganda, pelindung wajah, dan tutup rambut untuk
perlindungan terhadap tetesan inokulum. Tidak ada cara yang efisien untuk melindungi
operator dari tongkat sendiri melalui jarum suntik kecuali dengan perilaku hati-hati dan
kemampuan inokulasi yang baik. Untuk tujuan ini, tangan tidak boleh disilangkan selama
prosedur: kandang tikus dan tikus ditempatkan di satu sisi, dan jarum suntik dan wadah benda
tajam di sisi lain operator. Untuk mengurangi risiko jarum suntik, jarum suntik tidak boleh
ditutup kembali dengan tangan.

Idealnya, tikus harus diberi obat penenang sebelum injeksi intrakranial. Eter,
fenobarbital atau ketamin dapat digunakan untuk efek ini. Namun, pada praktiknya tikus
sering diinokulasi tanpa sedasi. Kita harus mempertimbangkan bahwa jarum suntik itu sesaat,
sedangkan rasa sakit dan efek samping yang lama, jika terjadi, disebabkan bukan oleh jarum
suntik tapi oleh trauma. Oleh karena itu, obat penenang jangka pendek tidak akan melindungi
tikus dari rasa sakit dan efek samping tersebut. Sebagai gantinya, tindakan pencegahan harus
dilakukan untuk menghindari trauma yang berlebihan; teknik yang dijelaskan di bawah ini
dapat membantu dalam hal ini. Volume standar inokulum yang digunakan untuk inokulasi
intrakranial tikus penyapih adalah 30 μL, dan untuk tikus menyusui adalah 10-15 μL.
Inokulasi intramuskular atau subkutan pada tikus biasanya dilakukan dalam volume ~ 50 μL.
Dosis ini dapat diukur secara akurat dalam jarum suntik insulin 0,5 mL. Jarum harus
berdiameter 0,40-0,45 mm (26 atau 27 gauge) dan panjang 1-2 cm. Jarum yang lebih besar
menimbulkan trauma otak secara substansial, sedangkan semprit yang lebih besar tidak
memungkinkan pengukuran dosis inokulasi yang akurat. Idealnya, jarum suntik harus sekali
pakai, dengan jarum tetap terpasang yang tidak memiliki ruang mati yang cukup besar.
Penggunaan jarum suntik semacam itu akan membantu mengisi tanpa gelembung udara. Jika
gelembung terjadi, harus dilepaskan ke zat lembut steril (seperti kapas) untuk menghindari
aerosolisasi. Alat suntik kaca steril dengan jarum yang bisa dilepas juga bisa digunakan,
meski kurang nyaman. Idealnya, jarum dan jarum suntik individu harus digunakan
Ivan V. Kuzmin18
untuk setiap binatang Hal ini sangat penting untuk jarum suntik sekali pakai karena jarum
mereka terbuat dari logam lembut dan menjadi tumpul setelah setiap injeksi intrakranial.
Meskipun tidak disarankan, bahkan jika satu jarum suntik digunakan untuk inokulasi
sekelompok beberapa tikus, dalam keadaan apapun sebaiknya jarum suntik yang sama
digunakan untuk inokulasi sampel lain tanpa sterilisasi (untuk menghindari kontaminasi
silang). Biasanya, tangan kanan menangani mouse di tangan kiri dan jarum suntik di tangan
kanan. Sangat mudah untuk memegang mouse di ujung ekor dengan ibu jari dan jari kedua,
meletakkan hewan itu di bangku cadangan, mencengkeram bagian dasar ekor di antara jari
keempat dan kelima, lepaskan ibu jari dan jari kedua, dan pegang. dengan tengkuk leher
tikus. Tikus yang menempel erat di dasar ekor dan di bagian belakang leher cukup tidak
bergerak untuk memungkinkan manipulasi pada kepala, bahkan tanpa sedasi. Jarum suntik
diambil dengan tangan kanan, dan didorong melalui tengkorak tikus dengan dorong pendek
yang cepat. Meskipun inokulasi dapat dilakukan di berbagai daerah tengkorak, biasanya
mudah untuk menyuntikkan di samping garis tengah (untuk menghindari tusukan sinus vena),
di tengah garis imajiner antara mata kanan mouse dan telinga kanan. Jarum harus menembus
tengkorak dengan mudah, dan harus dimasukkan 1-3 mm ke dalam jaringan otak. Terlalu
dalam penetrasi, dan injeksi inokulum ke area basal otak bisa sangat traumatis bagi mouse.
Setelah injeksi volume inokulum yang diinginkan, jarum harus dilepas dengan lembut dan
perlahan (beberapa detik) untuk mencegah refluks inokulum. Jika terjadi refluks seperti itu,
akan terlihat pada bulu tikus sebagai setetes cairan transparan atau berdarah, dan akan berarti
bahwa jumlah inokulum di otak tikus berkurang.

Inokulasi perifer jarang dilakukan untuk tujuan diagnostik, karena kerentanan tikus terhadap
lyssavirus yang disuntikkan melalui rute perifer terbatas. Contoh ketika inokulasi perifer
dapat digunakan untuk tujuan diagnostik adalah kontaminasi bakteri yang signifikan atau
toksisitas inokulum yang akan membunuh tikus jika disuntikkan secara intrakranial.
Tantangan intramuskular biasanya dilakukan pada otot deltoid atau gastrocnemius. Asisten
diperlukan untuk meregangkan kaki binatang untuk imobilisasi. Inokulasi subkutan dapat
dilakukan di bawah area kerang leher saat hewan ditangani seperti yang dijelaskan di atas
untuk tantangan intrakranial. Kontaminasi permukaan kerja, keausan pelindung, dan
instrumen selama prosedur dapat terjadi melalui tetesan inokulum dari alat suntik atau dari
bulu tikus. Untuk menghindari paparan potensial dan penyebaran virus lebih lanjut, semua ini
harus didekontaminasi secara ketat oleh desinfektan segera setelah selesai inokulasi. Sarung
tangan luar (yang
Isolasi Virus pada Hewan: Uji Inokulasi Tikus 19
juga bisa terkontaminasi) harus diganti sebelum prosedur dekontaminasi. Jarum suntik sekali
pakai harus dibuang dalam wadah benda tajam dan diautoklaf bersamaan dengan persediaan
sekali pakai lain yang digunakan untuk inokulasi. Jarum suntik dan jarum suntik non-pakai
harus didesinfeksi secara kimiawi, dibilas di air, dan diautoklaf sebelum digunakan
selanjutnya. Kandang harus diberi label segera dan hati-hati, menunjukkan umur hewan,
tanggal inokulasi, inokulum yang digunakan, jumlah hewan, dan informasi bermanfaat
lainnya. Biasanya, label yang hilang atau tidak lengkap berarti spesimen yang hilang.

2.5 PENGAMATAN

Tikus yang diinokulasi harus diamati secara ketat selama 2 jam setelah prosedur.
Jangka waktu ini biasanya cukup untuk pemulihan dari anestesi atau dari trauma inokulasi.
Jika tikus terus berperilaku tidak normal (gerakan rendah, ataksia, rotasi satu sisi terus-
menerus, dll.), Pengamatan dekat harus dilanjutkan selama satu jam lagi, dan keputusan
tentang eutanasia dibuat. Masa inkubasi rabies pada tikus yang diinokulasi intrakranial
biasanya 4-20 hari. Selama periode ini, hewan harus diperiksa dua kali sehari untuk
mendaftarkan tanda klinis awal. Di lain waktu (mulai dari hari inokulasi pertama) mereka
harus diperiksa setidaknya setiap hari. Periode pengamatan harus diperpanjang paling sedikit
45 hari, kecuali strain RABV tetap dengan periode inkubasi singkat, seperti Standar Virus
Tantangan (CVS), digunakan. Jumlah hewan yang sehat, sakit, dan mati harus dicatat setiap
hari pada kartu yang ditunjuk atau lembar catatan. Tanda klinis harus dicatat untuk hewan
yang sakit. Tanda klinis berikut ini menunjukkan adanya rabies: bulu yang mengacak-acak;
tremor saat ditangani; agitasi meningkat dengan gerakan cepat dan lompatan yang cepat;
Kurangnya koordinasi di kaki, paling baik dicatat saat mouse ditempatkan di bangku dan
mulai bergerak; ataxia; paresis; kelumpuhan; sujud.

Tanda klinis dan kematian yang terjadi selama 2 hari pertama postinokulasi biasanya
disebabkan oleh trauma, atau kontaminasi inokulum dengan bakteri atau patogen virus
lainnya. Kapan pun tanda klinis terjadi, keputusan tentang euthanasia harus dilakukan segera
berdasarkan skor nyeri yang disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee
(IACUC). Biasanya tanda klinis ringan (skor nyeri 1-2) memerlukan pengamatan yang
meningkat, sedangkan tanda berat (skor nyeri 3-4) memerlukan segera
Ivan V. Kuzmin20
euthanasia Eritanasia dilakukan melalui intoksikasi dengan karbon dioksida, kloroform, atau
obat lain. Tikus bawah sadar yang mabuk juga dapat mengalami dislokasi serviks untuk
memastikan euthanasia. Setelah menyelesaikan setiap percobaan, kandang harus dibersihkan
dengan hati-hati dengan desinfektan dan diautoklaf.

2.6 PEMERIKSAAN POSTMORTEM

Bahkan jika tikus mengembangkan tanda neurologis klinis atau meninggal dalam
jangka waktu yang diharapkan setelah inokulasi, diagnosis rabies tidak boleh diasumsikan
tanpa konfirmasi laboratorium. Tanda klinis serupa mungkin disebabkan oleh sejumlah
patogen virus atau bakteri lainnya. Paling sering konfirmasi dibuat dengan mendeteksi
antigen lyssavirus di otak tikus melalui tes antibodi fluorescent langsung, walaupun metode
lain untuk deteksi antigen atau RNA juga dapat diterapkan. Penghapusan otak harus
dilakukan di dalam lemari keamanan hayati. Bangkainya ditempatkan pada bahan penyerap
bersih (seperti kain kasa atau handuk kertas), permukaan ventral ke bawah. Untuk operator
tangan kanan kepala mouse harus diarahkan ke kiri. Kulit leher dan kepala ditarik oleh forsep
dan dipotong. Tengkorak itu digenggam oleh forceps di orbitnya, dan tengkorak dipotong
oleh gunting yang melengkung atau pisau bedah untuk mengekspos otak. Otak dihubungkan
oleh gunting atau pisau bedah yang sama, dikeluarkan dari tengkorak, dan diletakkan di
cawan petri atau di atas kain kasa bersih atau handuk kertas. Bagian otak di anterior
cerebellum digunakan untuk membuat kesan pada slide mikroskop.

2.7 PENELUSURAN KESALAHAN

Biasanya MIT menghasilkan hasil yang dapat diterima, namun dalam beberapa kasus
gagal. Di bawah ini kami membahas alasan paling umum untuk kegagalan tersebut dan
menyarankan koreksi yang tepat. Jika tikus tidak pulih sepenuhnya setelah inokulasi dan mati
segera setelahnya, ini mungkin akibat trauma atau toksisitas inokulum. Trauma biasanya
menghasilkan pola morbiditas / mortalitas yang berbeda pada tikus yang berbeda, sedangkan
toksisitas inokulum menghasilkan hasil yang seragam pada semua hewan yang diinokulasi.
Untuk mengurangi trauma, seseorang sebaiknya tidak memasukkan jarum terlalu dalam
selama inokulasi, seperti yang dijelaskan di atas, dan jarum tebal seharusnya tidak
Isolasi Virus pada Hewan: Uji Inokulasi Tikus 21
bekas. Selain itu, tikus muda biasanya sembuh setelah inokulasi lebih baik daripada tikus
yang lebih tua. Jika toksisitas inokulum adalah penyebab kegagalan MIT, orang harus
menentukan apakah pengencer atau spesimen jaringan bersifat toksik. Jika pengencernya
beracun, semua sampel yang disiapkan dengan pengencer ini akan menghasilkan pola
mortalitas seragam. Inokulasi mouse tiruan dengan pengencer yang sama dapat dilakukan
untuk mengkonfirmasi toksisitas tersebut. Jika demikian, pengencer harus diganti. Jika
toksisitas berasal dari sampel jaringan tertentu (dan hanya tikus yang diinokulasi dengan
sampel ini yang menunjukkan morbiditas atau mortalitas dini), sampel dapat diencerkan, dan
beberapa pengenceran 10 kali lipat digunakan untuk inokulasi tikus. Meskipun pengenceran
semacam itu akan mengurangi sensitivitas MIT, ini mungkin satu-satunya cara untuk
mengisolasi virus.

Kadang tikus pulih setelah inokulasi, namun kembangkan tanda klinis dan kambuh
dalam 48 jam, atau lebih baru, namun jika tidak ada antigen lyssavirus di otak mereka. Ini
biasanya akibat kontaminasi bakteri atau virus inokulum. Untuk menghilangkan kontaminasi
bakteri, inokulum dapat disaring melalui filter syringe 0,22 μm. Dalam kasus kontaminasi
virus, tidak ada cara yang realistis untuk memisahkan virus yang tidak diinginkan dari
lyssavirus yang ada dalam sampel, kecuali jika diketahui dan antiserum spesifik
dipertimbangkan. Pengecualian juga mencakup beberapa virus tikus yang tidak patogen
untuk hewan lain. Dalam kasus seperti itu inokulum dapat disuntikkan secara intrakranial
atau intramuskular ke spesies mamalia lainnya (misalnya dengan menggunakan tikus atau
hamster Suriah) dimana virus tikus tidak akan meniru tetapi lyssavirus akan melakukannya.
Jika lyssavirus tidak dapat diisolasi dari sampel yang menunjukkan adanya antigen virus atau
asam ribonukleat (RNA) yang melimpah, ini dapat terjadi akibat degradasi virus menular
yang signifikan (misalnya karena penyimpanan yang tidak tepat) atau dari titer antibodi
penawar virus yang tinggi ( VNA) dalam spesimen. Jika sampel terdegradasi, konsentrasi
inokulum yang lebih tinggi dapat digunakan (misalnya 20% suspensi jaringan), dan tikus
yang baru lahir (1-3 hari) diinokulasi untuk meningkatkan sensitivitas MIT. Jika VNA hadir
dalam sampel, beberapa pengenceran 10 kali lipat dari inokulum dapat meningkatkan
kemungkinan isolasi virus. Pengenceran harus dilakukan segera setelah persiapan inokulum
asli, dan pengencer dingin harus digunakan pada setiap langkah untuk mengurangi
pengikatan antibodi terhadap virus yang dilepaskan dari sel selama proses homogenisasi.
2.8 TITRASI VIRUS

Kuantitas virus melalui penentuan dosis menular atau mematikan dapat dilakukan
dengan menggunakan teknik RTCIT dan MIT. Titer yang diperoleh
Ivan V. Kuzmin22
pada model hewan dan dalam kultur sel biasanya berkorelasi, walaupun titer virus menular
mungkin tidak berkorelasi dengan muatan antigen yang ditentukan oleh enzyme-linked
immunosorbent assay (ELISA) atau dengan jumlah salinan genom yang ditentukan oleh real-
time polymerase chain reaction (PCR ). Kultur sel menawarkan beberapa keuntungan untuk
titrasi virus dibandingkan dengan model hewan. Tes dalam kultur sel lebih cepat, dan
akhirnya lebih murah. Namun, dibutuhkan fasilitas kultur sel. Inokulasi tikus dapat dilakukan
di laboratorium biosafety level 2 yang lebih mendasar dengan vivarium. Contoh lain dimana
penentuan dosis mematikan hewan lebih baik termasuk evaluasi kerentanan in vivo dan studi
patogenesis, tes potensi biologis, perbandingan virulensi melalui rute intrakranial dan perifer,
dan lain-lain. Beberapa pengenceran serial inokulum virus digunakan untuk titrasi. Paling
sering, pengenceran 10 kali lipat digunakan untuk menentukan titer virus pada tikus,
walaupun faktor pengenceran lainnya (misalnya 2 kali lipat, 3 kali lipat, 5 kali lipat) dapat
digunakan juga. Faktor pengenceran yang lebih rendah, yang lebih tepat adalah titer yang
ditentukan. Namun, penurunan faktor pengenceran akan meningkatkan jumlah hewan yang
digunakan. Sebagai contoh, tujuh pengenceran 10 kali lipat (tujuh kelompok tikus) biasanya
cukup untuk menentukan titer lyssavirus pada sebagian besar sampel lapangan. Untuk
menutupi rentang titer yang sama melalui pengenceran 5 kali lipat, dibutuhkan 10 kelompok
tikus. Bahkan 21 kelompok tikus perlu untuk mencakup rentang ini melalui pengenceran 2
kali lipat. Ukuran kelompok yang diinokulasi dengan satu pengenceran juga bisa bervariasi.
Biasanya 4-5 tikus per kelompok digunakan untuk titrasi kasar, namun kelompok sebanyak
10 atau bahkan 20 tikus mungkin diperlukan untuk prosedur penting seperti penentuan nilai
potensi vaksin. Semua pengenceran diinokulasi pada tikus mengikuti prosedur standar MIT
yang dijelaskan di atas. Sebaiknya inokulasi dilakukan oleh satu operator untuk
meningkatkan komparabilitas hasil antar kelompok. Periode pengamatan untuk tikus yang
diinokulasi secara intrakranial biasanya dapat dikurangi sampai 30 hari. Masa inkubasi yang
lebih lama jarang terjadi, dan bahkan jika 1-2 tikus dilewatkan karena pemendekan
pengamatan, mereka tidak akan mempengaruhi nilai titer yang diperoleh secara signifikan.
Namun, untuk tikus yang diinokulasi perifer, pengamatan harus paling sedikit 45 hari (lebih
disukai 60 hari) karena masa inkubasi yang lama pada hewan tersebut lebih sering terjadi.

Setelah menyelesaikan percobaan, tikus dari pengenceran titik akhir yang menyebabkan
kematian, dan dari setidaknya satu pengenceran di atas, diperiksa adanya antigen virus di
otak mereka. Titernya
Isolasi Virus pada Hewan: Uji Inokulasi Tikus 23
dihitung melalui metode Reed dan Muench atau Spearman-Karber, seperti yang dijelaskan
dalam bab uji potensi National Institutes of Health (NIH).
REFERENCES

1. Koprowski H. The mouse inoculation test. In: Meslin F-X, Kaplan MM, Koprowski H, editors.
Laboratory techniques in rabies 4th ed. Geneva: World Health Organization; 1996. p. 80–7.

2. Markotter W, Kuzmin IV, Rupprecht CE, Nel LH. Lagos bat virus virulence in mice inoculated by the
peripheral route. Epidemiol Infect 2009;137:1155–62.

3. Faber M, Li J, Kean RB, Hooper DC, Alugupalli KR, Dietzschold B. Effective preexposure and
postexposure prophylaxis of rabies with a highly attenuated recombinant rabies virus. Proc Natl
Acad Sci USA 2009;106:11300–5.

4. Bourhy H, Rollin PE, Vincent J, Sureau P. Comparative field evaluation of the fluorescent-antibody
test, virus isolation from tissue culture, and enzyme immunodiagnosis for rapid laboratory diagnosis
of rabies. J Clin Microbiol 1989;27:519–23.

5. Shope RE, Murphy FA, Harrison AK, Causey OR, Kemp GE, Simpson DI, et al. Two African viruses
serologically and morphologically related to rabies virus. J Virol 1970;6:690–2.