VALIDASI METODE BIOANALISIS

BERDASARKAN FDA DAN EMEA

Disusun oleh :
Kelas : A
Kelompok 4

1. Frida Romauli 2016210097

2. Hannan Sakinah 2016210105
3. Indah Gita Saputri 2016210110
4. Intania Cahya 2016210116
5. Irene Intan Permata 2016210118
6. Jelita 2016210120
7. Jimmy Gunawan 2016210121
8. Kemala Bella Syavira 2016210127
9. Kharinta Adella 2016210131
10. Lia Oktavia 2016210138

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS PANCASILA

JAKARTA

2019
I. Latar Belakang
Salah satu tahap yang penting dalam pengembangan obat baru adalah
analisis obat dalam cairan biologis atau bisa disebut bioanalisis. Hal ini perlu
dilakukan untuk memperoleh data yang akan dijadikan pedoman dalam studi klinis
dan studi keamanan obat (Harahap, 2010). Studi klinik menunjukkan adanya
hubungan antara konsentrasi obat dalam darah dengan efek terapi dan efek toksik
yang ditimbulkan. Penetapan kadar obat dalam plasma merupakan salah satu
parameter yang berguna dalam uji bioavailabilitas suatu obat. Uji bioavailabilitas
merupakan ukuran kecepatan dan jumlah obat yang diabsorpsi oleh tubuh. Karena
bila obat bebas atau aktif dalam cairan biologis dapat ditentukan dengan tepat, maka
dapat memberikan informasi yang paling obyektif tentang bioavailabilitas. (Shargel,
et al., 2005). (2)
Validasi perlu dilakukan agar hasil analisis yang diperoleh terpercaya, cermat,
handal dan dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah. Suatu metode analisis
harus divalidasi untuk melakukan verifikasi bahwa parameter-parameter kinerjanya
cukup mampu untuk mengatasi masalah analisis (Gandjar & Rohman, 2007).
(2)Metode analisis yang telah dipublikasikan seringkali dimodifikasi untuk
menyesuaikan kondisi dengan peralatan yang tersedia di laboratorium pengujian dan
modifikasi tersebut harus divalidasi untuk memastikan pelaksanaan pengujian yang
sesuai dari metode analisis (FDA, 2001). Pedoman yang digunakan untuk validasi
metode bioanalisis pada umumnya mengacu pada Food and Drug Administration
(FDA, 2001) dan juga European Medicines Agency (EMEA, 2011). Namun, penelitian
yang mengacu pada EMEA masih jarang dilakukan karena EMEA masih tergolong
baru dalam revisi metode validasi bioanalisis. Parameter validasi yang ditambahkan
pada EMEA adalah dilution integrity, carry over, matrix effect, dan pada pengujian
akurasi serta presisi menggunakan 4 parameter, yaitu yakni Lower Limit of
Quantification (LLOQ), konsentrasi rendah, sedang, dan tinggi; dengan nilai dari
LLOQ. (1)
Validasi metode analisis bertujuan untuk memastikan dan mengkonfirmasi
bahwa metode analisis tersebut sudah sesuai untuk peruntukannya. Validasi
biasanya diperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan dikembangkan,
sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku (misal: AOAC,
ASTM dan lainnya) tidak perlu dilakukan validasi, hanya verifikasi. Beberapa
parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode analisis
adalah accuracy (kepekaan), precision (ketelitian), selektivitas (spesifisitas), linieritas,
rentang, batas deteksi dan kekuatan (robustness) [1,2,3]. Kepekaan adalah ukuran
yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar analit yang
 sebenarnya. Kepekaan dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery)
analit yang ditambahkan. Kepekaan dapat ditentukan melalui dua cara, yaitu metode
simulasi (spiked-placebo recovery) atau metode penambahan baku (standard
additionmethod) [1,2,3]. Ketelitian adalah ukuran yang menunjukkan derajat
kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari
rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampelsampel yang diambil
dari campuran yang homogen. Ketelitian diukur sebagai simpangan baku atau
simpangan relatif (koefisient variasi). Ketelitian dapat dinyatakan sebagai
keterulangan (repeatability) atau ketertiruan (reproducibility). Keterulangan adalah
ketelitian metode jika dilakukan berulang kali oleh analis yang sama pada kondisi
yang sama dan dalam interval waktu yang pendek (intraassay). Ketertiruan adalah
ketelitian metode jika dikerjakan pada kondisi yang berbeda, biasanya dilakukan
dalam laboratoriumlaboratorium yang berbeda menggunakan peralatan, pereaksi,
pelarut dan analis yangberbeda serta sampel yang dianalisa diduga identik sama dari
batch yang sama, tetapi dapat juga dilakukan dalam laboratorium yang sama dengan
menggunakan peralatan, pereaksi dan analis yang berbeda (inter assay)
[1,2,3].Selektifitas suatu metode adalahkemampuannya yang hanya mengukur
zattertentu saja secara cermat dan seksama dengan adanya komponen lain yang
mungkin ada dalam matriks sampel, dinyatakan sebagai derajat penyimpangan
(degree of bias).Selektivitas metode ditentukan dengan membandingkan hasil
analisis sampel yang mengandung cemaran, hasil urai, senyawa sejenis, senyawa
asing lainnya dengan analisis sampel tanpa penambahan bahan-bahan tadi [1,2,3].
Linieritas adalah kemampuan metode analisis memberikan respon proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Rentang metode adalah pernyataan batas
rendah dan tertinggi analit yang sudah ditunjukkan dapat ditetapkan dengan
kecermatan, keseksamaan dan linieritas yang dapat diterima. Batas deteksi adalah
jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan
respon signifikan dibandingkan dengan blangko. (3)

II. Tujuan
Tujuan utama validasi metode adalah untuk menunjukkan keandalan metode
tertentu untuk penentuan konsentrasi analit dalam matriks biologis tertentu, seperti
darah, serum, plasma, urin, atau saliva. Selain itu, jika antikoagulan digunakan,
validasi harus dilakukan dengan menggunakan antikoagulan yang sama seperti
sampel penelitian. Umumnya validasi penuh harus dilakukan untuk setiap spesies
dan matriks yang bersangkutan.Metode analisis yang telah dipublikasikan seringkali
dimodifikasi untuk menyesuaikan kondisi dengan peralatan yang tersedia di
 laboratorium pengujian dan modifikasi tersebut harus divalidasi untuk memastikan
pelaksanaan pengujian yang sesuai dari metode analisis (FDA, 2001). Pedoman
yang digunakan untuk validasi metode bioanalisis pada umumnya mengacu pada
Food and Drug Administration (FDA, 2001) dan juga European Medicines Agency
(EMEA, 2011). Namun, penelitian yang mengacu pada EMEA masih jarang
dilakukan karena EMEA masih tergolong baru dalam revisi metode validasi
bioanalisis. (1)
Validasi biasanyadiperuntukkan untuk metode analisa yang baru dibuat dan
dikembangkan, sedangkan untuk metode yang memang telah tersedia dan baku
(misal: AOAC, ASTM dan lainnya) tidak perlu dilakukan validasi, hanya verifikasi.
Beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam validasi metode
analisis adalah accuracy (kepekaan), precision (ketelitian), selektivitas (spesifisitas),
linieritas, rentang, batas deteksi dan kekuatan (robustness). (3)
III. Teori Dasar
A. Pengertian Validasi Metode
Bioanalisis menganalisis identifikasi dan kuantifikasi analit dalam
berbagai matriks biologis. Validasi metode analitis apa pun membantu
mencapai hasil yang andal yang diperlukan untuk pengambilan keputusan
yang tepat tentang dosis obat dan keselamatan pasien. Dalam kasus metode
bioanalitik, validasi juga mencakup langkah-langkah studi farmakokinetik dan
toksikologi - seperti pengumpulan sampel, penanganan, pengiriman,
penyimpanan, dan persiapan.
Keunggulan dari metode menurut FDA dan EMA adalah dokumen
FDA dan EMA serupa, tetapi tidak identik. EMA menggambarkan tindakan
praktis dari eksperimen yang lebih tepat, sementara FDA menyajikan
rekomendasi pelaporan yang lebih komprehensif. Ada juga perbedaan dalam
parameter validasi yang disarankan.
B. FDA (Food And Drug Administration)
 Pendahuluan
Panduan ini membantu para sponsor untuk mengaplikasikan investigasi
obat baru (IND) atau aplikasi obat baru (NDA), disingkat aplikasi obat baru
(ANDA), lisensi biologisaplikasi (BLA), dan suplemen dalam memvalidasi
metode bioanalitik yang digunakan dalam studi farmakologi klinis pada
manusia, bioavailabilitas (BA), dan bioekivalensi (BE) yang
membutuhkanevaluasi meliputi konsentrasi farmakokinetik, toksikokinetik,
atau biomarker.2 Pedoman ini juga dapat menginformasikan perkembangan
metode bioanalitik yang digunakan untuk studi nonklinis yang
memerlukandata konsentrasi toksikokinetik atau biomarker. Untuk penelitian
yang berkaitan dengan obat hewan, proses persetujuan seperti investigasi
aplikasi obat hewan baru (INAD) dan disingkat aplikasi obat hewan baru
(ANADA), pedoman ini mungkin berlaku untuk BA darah dan urine, BE, dan
studi farmakokinetik.
Informasi dalam panduan ini berlaku untuk prosedur bioanalitik seperti
kromatografiassay (CCs) dan ligand binding assay (LBA) yang secara
kuantitatif menentukan tingkat konsentrasi obat,metabolitnya, protein terapi,
dan biomarker dalam matriks biologis seperti darah,serum, plasma, urin, dan
jaringan seperti kulit.
Metode yang divalidasi ini menyediakan data penting untuk
mendukungkeamanan dan efektivitas obat-obatan dan produk biologis.
Memvalidasi metode analitikmemastikan bahwa data dapat diandalkan
dengan menjawab pertanyaan kunci tertentu, termasuk:
1. Apakah metode ini mengukur analit yang dimaksud? Misalnya,
apakah ada yang mengganggudalam proses pengukuran, dan apakah
metode ini spesifik atau selektif untuk analit?
2. Apa variabilitas yang terkait dengan pengukuran ini? Misalnya, apa
sajakahakurasi dan ketepatan metode?
3. Berapa kisaran dalam pengukuran yang menyediakan data yang
andal? Misalnya, apa itusensitivitas metode (mis., apa batas bawah
kuantitasi (LLOQ) darimetode, dan apa batas atas kuantitasi metode
(ULOQ)?)
4. Apakah pengumpulan, penanganan, dan penyimpanan sampel
memengaruhi keandalan data darimetode bioanalitik? Misalnya,
langkah apa yang perlu diikuti saat mengumpulkansampel? Apakah
sampel harus dibekukan selama pengiriman? Berapa
temperaturnyadiperlukan untuk menyimpan sampel, dan berapa lama
sampel disimpan?
Ketika perubahan dilakukan pada metode yang divalidasi, harus
dilakukan validasi tambahan (misalnya, validasi sebagian atau silang).
Konsep fit-for-purpose (FFP) menyatakan bahwa tingkat validasi harus
sesuai untuk tujuan penelitian. Pertanyaan kunci yang tercantum di atas
harus dievaluasi relatif terhadap tahap pengembangan obat. Studi penting
diajukan dalam NDA, BLA, atau ANDA yang membutuhkan pengambilan
keputusan untuk pengaturan mengenai persetujuan, keamanan atau
pelabelan, seperti BE atau studi farmakokinetik, harus mencakup metode
bioanalitik yang sepenuhnya divalidasi. Konsep FFP ini berlaku untuk obat,
metabolitnya, dan biomarker.
 Pengembangan dan Validasi Metode Bioanalisis
1. Prinsip-prinsip Panduan
Tujuan pengembangan metode bioanalitik adalah untuk menentukan
desain, kondisi operasi,keterbatasan, dan kesesuaian metode untuk tujuan
yang dimaksudkan dan untuk memastikan bahwa metode tersebut sudah
optimal untuk digunakan.
Sebelum pengembangan metode bioanalitik, harus dipahami
mengenai analit yang digunakan (mis., menentukan sifat fisikokimia obat,
metabolism in vitro dan in vivo, dan pengikatan protein) dan pertimbangkan
aspek-aspek metode analitik sebelumnya yang mungkin berlaku.
Pengembangan metode melibatkan pengoptimalan prosedur dan
kondisi yang terlibat dengan pencarian dan mendeteksi analit.
Pengembangan metode mencakup optimalisasi, berikut ini parameter
bioanalitik (yang dibahas secara lebih rinci di bagian III.B) untuk memastikan
bahwa metode ini cocok untuk validasi:
• Standar referensi(Baku Pembanding)
• Pereaksi kritis
• Kurva kalibrasi
• Sampel kontrol kualitas (QC)
• Selektivitas dan spesifisitas
• Sensitivitas
• Akurasi
• Presisi
• Pemulihan (Recovery)
• Stabilitas analit dalam matriks
Pengembangan metode bioanalitik tidak memerlukan pencatatan atau
notasi yang luas. Namun, pihak tersebut harus mencatat perubahan pada
prosedur serta masalah masalah yang muncul dan resolusi selama
pengembangan metode bioanalitik untuk memberikan alasan bagi siapa pun
mengenai perubahan selama pengembangan metode.
 Parameter Bioanalisis untuk CC(Chromatography Assay) dan LBA’s
(Ligan Binding Assay)
1. Standar Referensi dan Reagen Kritis
Peneliti harus mencirikan dan mendokumentasikan dengan tepat (mis.
Menentukan identitas, kemurnian,dan stabilitas) semua standar referensi dan
reagen kritis, seperti antibodi, analit berlabel, dan matriks serta
penyimpanannya dalam kondisi yang ditentukan.
a. Standar Referensi (Baku Pembanding)
Kemurnian standar referensi (Baku Pembanding) yang digunakan
untuk proses kalibrasi dan QC dapat memengaruhi data penelitian. Oleh
karena itu, peneliti harus menggunakan standar referensi analitik
terstandarisasi dan yang diketahuiidentitas dan kemurnian untuk
mendapatkan konsentrasi yang sesuai. Standar referensiharus identik
dengan analit; namun, ketika hal tersebut tidak memungkinkan, peneliti
dapatvmenggunakan bentuk kimia yang serupa (mis., basa bebas, asam
bebas, atau garam) dengan kemurnian yang diketahui.
Peneliti harus memberikan sertifikat analisis (CoA), termasuk sumber,
nomor lot, dan tanggal kedaluwarsa (dengan pengecualian standar
Farmakope Amerika Serikat (USP)) untuk standar referensi yang tersedia
secara komersial. Untuk standar referensi yang dihasilkan secara internal
atau eksternal standar yang tidak memiliki CoA, peneliti harus memberikan
bukti identitas standar dan kemurnian di samping sumber dan nomor lot.
b. Reagen Kritis
Peneliti harus mencirikan dan mendokumentasikan dengan tepat
(mis., Menentukan identitas, kemurnian dan stabilitas) pereaksi kritis. Validasi
pengujian penting ketika ada perubahan pada reagen kritis, seperti
mengubah atau beralih ke reagen lain. Misalnya, jika ada perubahan pada
analit berlabel, reagen detektor, atau antibodi, peneliti harus:
• Mengevaluasi tes mengikat dan mengoptimalkan kembali
• Verifikasi kinerja dengan kurva standar dan QC
• Mengevaluasi reaktivitas silang
2. Kurva Baku
Selama pengembangan metode, peneliti harus memilih rentang
kuantitasi pengujian dankonsentrasi standar kalibrasi berdasarkan rentang
konsentrasi yang diharapkan padasebuah studi tertentu. Peneliti harus
menggunakan model paling sederhana yang secara memadai
menggambarkan respons-konsentrasi hubungan, serta skema pembobotan
yang tepat dan persamaan regresi.
Ketika metode ini telah divalidasi, kurva kalibrasi harus kontinu dan
dapat direproduksi. Maka peneliti harus menyiapkan standar kalibrasi dalam
matriks biologis yang sama dengan sampel pada studi yang dimaksud.
Sampel penelitian dapat mengandung lebih dari satu analit. Peneliti harus
menghasilkan kurva kalibrasi untuk setiap analit dalam sampel. Ketika
matriks pengganti sesuai yang diperlukan, peneliti harus memvalidasi kurva
kalibrasi.
3. Quality Control Samples
Kontrol kualitas digunakan untuk menilai ketepatan dan ketelitian
suatu pengujian dan stabilitas sampel. Peneliti harus menyiapkan QC dalam
matriks yang sama dengan sampel penelitian yang akan diuji dengan metode
yang divalidasi. QC yang baru disiapkan direkomendasikan agar presisi dan
akurasi untuk menganalisis selama pengembangan metode, karena data
stabilitas umumnya tidak tersedia saat ini. Selama validasi metode, QC
mengevaluasi kinerja suatu metode dan stabilitas suatu analit. Kinerja QC
termasuk dalam validasi adalah untuk menentukan presisi dan keakuratan
metode.
QC mengevaluasi stabilitas analit dalam berbagai kondisi tekanan
(Lihat bagian III.B untuk pemilihan konsentrasi QC). Peneliti harus
menyiapkan standar kalibrasi dan control kualitas dari solusi stok terpisah.
Namun, jika peneliti dapat menunjukkan ketepatan dan keakuratan dalam
satu proses yang divalidasi menggunakan kalibrasi dan QC disiapkan dari
solusi stok terpisah, maka peneliti dapat menggunakan kalibrasi dan QC
dipersiapkan dari solusi stok yang sama pada putaran berikutnya. Peneliti
harus menguji kalibrasi dan QC di banyak matriks kosong yang bebas dari
gangguan atau efek matriks.
4. Selektivitas dan Spesifisitas
Selama pengembangan metode, peneliti harus memastikan bahwa
substansi yang diukur adalahanalit yang dimaksudkan untuk meminimalkan
atau menghindari gangguan. Selektivitas metode ini secara rutin diperiksa
dengan menganalisis sampel kosong dari matriks biologis yang sesuai (mis.,
plasma) dari berbagai sumber. Tergantung pada tujuan penggunaan uji,
dampak hemolysis sampel, sampel lipemik, atau sampel dari populasi khusus
dapat dimasukkan dalam penilaian selektivitas. Saat menggunakan metode
kromatografi cair / spektrometri massa (LC / MS), metode yang digunakan
harus menentukan efek dari matriks pada penindasan ion, peningkatan ion,
atau efisiensi ekstraksi. Standar internal harus dinilai untuk menghindari
gangguan dengan analit. Zat yang berpotensi mengganggu dalam matriks
biologis meliputi komponen matriks endogen seperti metabolit, produk
penguraian seperti obat-obatan bersamaan dan xenobiotik lainnya. Jika
stabilizer atau inhibitor enzim digunakan selama pengumpulan sampel,
peneliti harus mengevaluasi potensi gangguan pada kuantitasi analit. Peneliti
harus membuat penilaian ilmiah tentang perlunya menilai gangguan potensial
ini (dan lainnya) selama pengembangan metode.
Selama proses validasi, peneliti harus mengkonfirmasi bahwa
pengujian bebas dari gangguan potensial zat termasuk komponen matriks
endogen, metabolit, zat xenbiotik yang bersama dengan obat-obatan, dll. Jika
sampel penelitian mengandung lebih dari satu analit dan analitnya adalah
dimaksudkan untuk dikuantifikasi dengan metode yang berbeda, peneliti
harus menguji setiap gangguan dari analit pada metode lainnya.
5. Sensitifitas
LLOQ mendefinisikan sensitivitas metode yang harus ditentukan
selama pengembangan metode. Metode ini harus dikembangkan dan
divalidasi sedemikian rupa sehingga dapat dipenuhipersyaratan yang
diperlukan untuk studi sampel yang dimaksudkan. Evaluasi LLOQ dapat
dilakukansecara terpisah atau sebagai bagian dari penilaian presisi dan
akurasi untuk rentang kalibrasi.
6. Akurasi, Presisi dan Recovery
Mengevaluasi keakuratan dan ketepatan melewati rentang kuantitasi
selama pengembangan metode sangat penting untuk menentukan apakah
metode ini siap untuk divalidasi dan melibatkan analisis mengikuti QC pada
berbagai konsentrasi di seluruh rentang pengujian. Secara khusus, peneliti
harusmengevaluasi kinerja di LLOQ, QC rendah, menengah dan tinggi (dan
ULOQ untuk BBL) sampai menentukan apakah metode ini cocok untuk
menganalisis sampel penelitian.
Peneliti harus mengoptimalkan pemulihan analit untuk memastikan
bahwa ekstraksi tersebut efisien dan dapat direproduksi. Pemulihan tidak
harus 100 persen, tetapi tingkat pemulihan analitharus konsisten dan dapat
direproduksi. Penelitiharus melakukan percobaan pemulihan dengan
membandingkan hasil analisis sampel yang diekstraksi dengan ekstrak yang
digunakan saat analit akan diekstraksi (mis., untuk mewakili pemulihan 100
persen).
7. Stabilitas
Selama pengembangan metode, peneliti harus menentukan stabilitas
kimia analit dalam matriks yang digunakan, termasuk efek pengumpulan
sampel, penanganan, dan penyimpanan analit. Peneliti harus menilai
autosampler, benchtop, sampel yang diproses atau diekstraksi,
dicairkan,solusi stok, dan stabilitas analit jangka panjang. Peneliti harus
menilai stabilitas di dalam matriks yang sama dengan yang dimaksudkan
untuk sampel dalam penelitian; Namun, ketika matriks jarang, maka peneliti
dapat meneliti dengan penggunaan matriks pengganti yang sesuai.
8. Efek Pelarutan
Jika metode ini mengukur sampel yang diencerkan, integritas
pengenceran harus dipantau selamavalidasi dengan mengencerkan sampel
QC di atas ULOQ dengan matriks serupa untuk dibawa ke dalamrentang
kuantisasi, dan keakuratan dan presisi QC yang diencerkan ini harus
ditunjukkan.Pengenceran yang digunakan selama validasi harus meniru
pengenceran yang diharapkan dalam penelitian.
9. Validasi Silang dan Sebagian
a. Validasi Sebagian
Validasi parsial mengevaluasi modifikasi metode bioanalitik yang telah
divalidasi. Validasi parsial dapat berkisar dari sesedikit satu keakuratan dan
penentuan presisi intra-assay untuk validasi hampir penuh. Data mentah
tentang validasi parsial harus disimpan di situs analitik untukinspeksi saat
diminta. Modifikasi metode bioanalitik khas atau perubahan yang termasuk
dalamkategori ini termasuk, tetapi tidak terbatas pada, yang berikut:
1. Transfer metode bioanalitik antar laboratorium
2. Perubahan dalam metodologi analitik (mis., Perubahan dalam sistem
deteksi)
3. Perubahan dalam prosedur pemrosesan sampel
4. Perubahan volume sampel (mis., Volume sampel anak yang lebih kecil)
5. Perubahan instrumen dan / atau platform perangkat lunak
6. Ekstensi rentang pengujian
7. Perubahan antikoagulan (tetapi bukan perubahan counter ion) dalam
pemanenan biologiscairan (mis., heparin ke EDTA)
8. Perubahan dalam matriks di dalam spesies (mis., Beralih dari plasma
manusia ke darah manusia) atau perubahan spesies dalam matriks (mis.,
beralih dari plasma tikus keplasma tikus)
9. Perubahan pada matriks (mis., Cairan serebrospinal)
10. Mendemonstrasikan selektivitas analit dengan adanya obat yang
bersamaan
11. Perubahan reagen kritis LBA (mis., Perubahan lot-ke-banyak, perubahan
reagen)

b. Validasi Silang
 Validasi silang adalah perbandingan parameter validasi dua atau lebih
metode bioanalitik atau teknik yang digunakan untuk menghasilkan data
dalam studi yang samaatau lintas studi yang berbeda. Juga, validasi silang
diperlukan ketika analisis sampel dalam satu studi dilakukan di lebih dari satu
situs atau lebih dari satu laboratorium. Dalam kasus seperti itu, validasi silang
dengan dibagikan Matriks QC dan sampel subjek yang tidak dikumpulkan
harus dilakukan di setiap lokasi atau laboratorium membangun keandalan
antar laboratorium.
 
C. EMEA (European Medicines Agency)

Validasi metode lengkap harus dilakukan untuk metode analitik apa

pun baik baru atau berdasarkan literatur.

Tujuan utama validasi metode adalah untuk menunjukkan keandalan

metode tertentu untuk penentuan konsentrasi analit dalam matriks biologis
tertentu, seperti darah, serum, plasma, urin, atau saliva. Selain itu, jika
antikoagulan digunakan, validasi harus dilakukan dengan menggunakan
antikoagulan yang sama seperti sampel penelitian. Umumnya validasi penuh
harus dilakukan untuk setiap spesies dan matriks yang bersangkutan.

Dalam beberapa kasus, mungkin bermasalah untuk keperluan validasi

untuk mendapatkan matriks yang identik dibandingkan dengan matriks
sampel penelitian. Matriks alternatif yang cocok dapat digunakan, mis. cairan
serebrospinal yang disiapkan secara sintetis, jika dibenarkan.

Karakteristik utama dari metode bioanalitik yang penting untuk

memastikan penerimaan kinerja dan keandalan hasil analitis adalah:
selektivitas, batas kuantifikasi yang lebih rendah, fungsi respons dan rentang
kalibrasi (kinerja kurva kalibrasi), akurasi, presisi, efek matriks , kestabilan
analit dalam matriks biologis dan stabilitas analit dan standar internal dalam
stok dan solusi kerja dan dalam ekstrak di bawah seluruh periode
penyimpanan dan kondisi pemrosesan.

Biasanya satu analit atau obat harus ditentukan, tetapi kadang-

kadang mungkin tepat untuk mengukur lebih dari satu analit. Ini mungkin
melibatkan dua obat yang berbeda, tetapi juga dapat melibatkan obat induk
dengan metabolitnya, atau enansiomer atau isomer dari suatu obat. Dalam
kasus ini, prinsip validasi dan analisis berlaku untuk semua analit yang
menarik.

1. Selektivitas

Metode analitis harus dapat membedakan analit yang diminati dan IS

dari komponen endogen dalam matriks atau komponen lain dalam sampel.
Selektivitas harus dibuktikan menggunakan setidaknya 6 sumber individu dari
matriks kosong yang sesuai, yang dianalisis dan dievaluasi secara individual
untuk gangguan. Penggunaan sumber yang lebih sedikit dapat diterima jika
terjadi matriks langka. Biasanya, tidak adanya komponen yang mengganggu
diterima di mana responsnya kurang dari 20% dari batas bawah kuantifikasi
untuk analit dan 5% untuk standar internal.

Mungkin juga perlu untuk menyelidiki sejauh mana gangguan yang

disebabkan oleh metabolit obat, gangguan dari produk degradasi yang
terbentuk selama persiapan sampel, dan gangguan dari kemungkinan obat
yang diberikan bersama. Co-obat yang biasanya digunakan dalam populasi
subjek yang diteliti yang berpotensi mengganggu harus diperhitungkan pada
tahap validasi metode, atau pada basis spesifik studi dan senyawa spesifik.
Kemungkinan konversi balik metabolit menjadi analit induk selama langkah-
langkah analisis berturut-turut (termasuk prosedur ekstraksi atau dalam
sumber MS) juga harus dievaluasi, bila relevan (misalnya, metabolit yang
berpotensi tidak stabil misalnya metabolit asam menjadi ester, N oksida yang
tidak stabil atau metabolit glukuronida, struktur cincin lakton). Tingkat
konversi balik harus ditetapkan dan dampaknya pada hasil studi yang
dibahas. Diakui bahwa evaluasi ini tidak akan mungkin dilakukan awal
selama pengembangan obat dari suatu entitas kimia baru ketika metabolisme
belum dievaluasi. Namun, diharapkan bahwa masalah ini diperhitungkan dan
validasi parsial dilakukan jika relevan karena pengetahuan lebih lanjut
mengenai metabolisme zat aktif diperoleh selama pengembangan obat.

Diakui bahwa dalam beberapa kasus sangat sulit untuk memperoleh

metabolit yang diinginkan. Atau, konversi kembali metabolit dapat diperiksa
dengan menerapkan reanalisis sampel yang terjadi. Namun, dalam hal ini
konversi balik potensial selama pemrosesan sampel tidak dapat
dikesampingkan.

2. Carry-Over

Carry-over harus diatasi dan diminimalkan selama pengembangan

metode. Selama validasi, akumulasi harus dinilai dengan menyuntikkan
sampel kosong setelah sampel konsentrasi tinggi atau standar kalibrasi pada
batas atas kuantifikasi. Dibawa dalam sampel kosong mengikuti standar
konsentrasi tinggi tidak boleh lebih besar dari 20% dari batas bawah
kuantifikasi (LLOQ; lihat di bawah) dan 5% untuk standar internal. Jika
tampaknya carry-over tidak dapat dihindari, sampel penelitian tidak boleh
diacak. Langkah-langkah spesifik harus dipertimbangkan, diuji selama
validasi dan diterapkan selama analisis sampel penelitian, sehingga tidak
mempengaruhi akurasi dan presisi. Ini dapat mencakup injeksi sampel
kosong setelah sampel dengan konsentrasi tinggi yang diharapkan, sebelum
analisis sampel penelitian berikutnya.

3. Batas Bawah Kuantifikasi

Batas bawah kuantifikasi (LLOQ) adalah konsentrasi analit terendah

dalam sampel yang dapat dikuantifikasi secara andal, dengan akurasi dan
presisi yang dapat diterima. LLOQ dianggap sebagai standar kalibrasi
terendah (lihat Akurasi dan Presisi). Selain itu, sinyal analit dari sampel LLOQ
harus sekurang-kurangnya 5 kali sinyal sampel kosong. LLOQ harus
disesuaikan dengan konsentrasi yang diharapkan dan untuk tujuan penelitian.
Sebagai contoh, untuk studi bioekivalensi, LLOQ tidak boleh lebih tinggi dari
5% dari Cmax, sedangkan LLOQ yang rendah mungkin tidak diperlukan
untuk studi farmakokinetik eksplorasi.

4. Kurva Kalibrasi

Respon instrumen berkenaan dengan konsentrasi analit harus

diketahui, dan harus dievaluasi pada rentang konsentrasi yang ditentukan.
Standar kalibrasi harus disiapkan dalam matriks yang sama dengan matriks
sampel penelitian yang dimaksudkan dengan spiking matriks kosong dengan
konsentrasi analit yang diketahui. Seharusnya ada satu kurva kalibrasi untuk
setiap analit yang dipelajari dalam validasi metode dan untuk setiap proses
analitik. Idealnya, sebelum melakukan validasi metode analitis, harus
diketahui kisaran konsentrasi apa yang diharapkan. Kisaran ini harus dicakup
oleh rentang kurva kalibrasi, yang didefinisikan oleh LLOQ sebagai standar
kalibrasi terendah dan batas atas kuantifikasi (ULOQ), menjadi standar
kalibrasi tertinggi. Kisaran harus ditetapkan untuk memungkinkan deskripsi
yang memadai dari farmakokinetik dari analit yang menarik.

Minimal enam level konsentrasi kalibrasi harus digunakan, selain

sampel kosong (sampel matriks yang diproses tanpa analit dan tanpa IS) dan
sampel nol (matriks yang diproses dengan IS). Setiap standar kalibrasi dapat
dianalisis secara berulang.

Suatu hubungan yang dapat dengan sederhana dan memadai

menggambarkan respon instrumen sehubungan dengan konsentrasi analit
harus diterapkan. Sampel kosong dan nol tidak harus dipertimbangkan untuk
menghitung parameter kurva kalibrasi.

Parameter kurva kalibrasi harus dilaporkan (kemiringan dan intersep

jika cocok linier). Selain itu, konsentrasi standar kalibrasi yang dihitung
kembali harus disajikan bersama dengan nilai akurasi rata-rata yang dihitung
(lihat definisi Akurasi di bawah). Semua kurva yang tersedia (atau dapat
diterima) diperoleh selama validasi, dengan minimal 3 harus dilaporkan.

Konsentrasi standar kalibrasi yang dihitung kembali harus berada

dalam ± 15% dari nilai nominal, kecuali untuk LLOQ yang seharusnya berada
dalam ± 20%. Paling tidak 75% dari kalibrasi standar, dengan minimum enam
tingkat standar kalibrasi, harus memenuhi kriteria ini. Dalam kasus ulangan
digunakan, kriteria (dalam ± 15% atau ± 20% untuk LLOQ) juga harus
dipenuhi untuk setidaknya 50% dari standar kalibrasi yang diuji per tingkat
konsentrasi. Jika standar kalibrasi tidak memenuhi kriteria ini, sampel standar
kalibrasi ini harus ditolak, dan kurva kalibrasi tanpa standar kalibrasi ini harus
dievaluasi kembali, termasuk analisis regresi. Jika semua ulangan LLOQ atau
standar kalibrasi ULOQ ditolak maka bets harus ditolak dari validasi, sumber
kegagalan yang mungkin ditentukan dan metode yang direvisi (jika perlu).
Jika kumpulan validasi berikutnya juga gagal, maka metode harus direvisi
sebelum memulai kembali validasi.
 Meskipun kurva kalibrasi sebaiknya dipersiapkan menggunakan
sampel berduri yang baru, ia diizinkan untuk menggunakan sampel kalibrasi
yang sebelumnya disiapkan dan disimpan, jika didukung oleh data stabilitas
yang tepat.

5. Akurasi

Keakuratan metode analitik menggambarkan kedekatan nilai yang

ditentukan yang diperoleh metode dengan konsentrasi nominal analit
(dinyatakan dalam persentase). Akurasi harus dinilai pada sampel yang
dibubuhi jumlah analit yang diketahui, sampel kontrol kualitas (sampel QC).
Sampel QC harus dibubuhi secara terpisah dari standar kalibrasi,
menggunakan larutan stok yang disiapkan secara terpisah, kecuali jika
konsentrasi nominal larutan stok telah ditetapkan.

Sampel QC dianalisis terhadap kurva kalibrasi, dan konsentrasi yang

diperoleh dibandingkan dengan nilai nominal. Akurasi harus dilaporkan dalam
persentase dari nilai nominal.

Akurasi harus dievaluasi untuk nilai-nilai sampel QC yang diperoleh

dalam satu kali proses (akurasi dalam proses) dan dalam proses yang
berbeda (akurasi antara proses).

Untuk memungkinkan evaluasi tren apa pun dari waktu ke waktu

dalam satu kali run, disarankan untuk menunjukkan akurasi dan presisi
sampel QC selama setidaknya satu kali jalan dalam ukuran yang setara
dengan langkah analitik prospektif sampel studi.

Akurasi dalam Proses

Akurasi dalam proses harus ditentukan dengan menganalisis dalam

satu putaran minimal 5 sampel per level pada minimum 4 level konsentrasi
yang mencakup rentang kurva kalibrasi: LLOQ, dalam waktu tiga kali LLOQ
(QC rendah), sekitar 30 - 50% dari rentang kurva kalibrasi (QC sedang), dan
setidaknya 75% dari rentang kurva kalibrasi atas (QC tinggi). Konsentrasi
rata-rata harus dalam 15% dari nilai nominal untuk sampel QC, kecuali untuk
LLOQ yang harus berada dalam 20% dari nilai nominal.

Akurasi antara Proses

Untuk validasi akurasi antara proses, LLOQ, sampel QC rendah,

sedang dan tinggi dari setidaknya tiga berjalan dianalisis pada setidaknya
dua hari yang berbeda harus dievaluasi. Konsentrasi rata-rata harus dalam
15% dari nilai nominal untuk sampel QC, kecuali untuk LLOQ yang harus
berada dalam 20% dari nilai nominal.

Data validasi metode yang dilaporkan dan penentuan akurasi dan

presisi harus mencakup semua hasil yang diperoleh kecuali kasus-kasus di
mana kesalahannya jelas dan didokumentasikan.
IV. CONTOH SOAL DAN JAWABAN

Tahun akademik 2017 / 2018

Tipe 1.

1. Validasi metode bioanalisis memiliki beberapa parameter, salah satu parameter

analitik yang harus divalidasi adalah dengan uji akurasi. Apakah tujuan uji tersebut ?

A. Membandingkan respon alat

B. Untuk meliat efisiensi ekstraksi dari metode analisis

C. Melihat kedekatan hasil dengan nilai yang sebenarnya

D. Melihat senyawa pengganggu eksogen

E. Untuk melihat pengaruh kondisi penyimpanan

2. Merode validasi ini bertujuan membandingkan parameter validasi dengan

menggunakan 2 atau lebih metode bioanalisis untuk mendapatkan data pada studi
yang berbeda. Apakah metode validasi yang dimaksud ?

A. Validasi lengkap C. Cross validation E. Ruggedness

B. Validasi parsial D. Repeatabilitas

Tipe2 :

A. Jika jawaban 1, 2 dan 3 benar

B. Jika jawaban 1 dan 3 benar

C. Jika jawaban 2 dan 4 benar

D. Jika jawaban 4 benar

E. Jika semua jawaban benar

3. Salah satu parameter validasi adalah uji perolehan kembali. Apakah definisi ddari
pengujian ini ?
 1. Memberikan informasi mengenai efisiensi ekstraksi dari metode analisis

2. Dillakukan pengukuran pada 3 konsentrasi

3. Hasil yang diperoleh tidak perlu 100%, namun sebaiknya harus konsisten, presisi,
dan rprodusibel

4. Relatif diperoleh dengan membandingkan konsentrasi terukur dengan konsentrasi

yang sebenarnya.

4. Uji presisi merupakan metode penting yang dilakukan dalam validasi metode
bioanalisis. Apakah pernyataan yang sesuai untuk uji tersebut ?

1. Menggambarkan kedekatan antara hasil pengujian analit satu dengan yang lain

2. Persyaratan CV setiap konsentrasi didaerah LLoQ tidak boleh lebih dari 15%

3. Dilakukan minimal 5 (lima) replikasi untuk tiap kadar

4. Uji hanya dilakukan antar hari

5. Uji selektivitas adalah salah satu parameter analitik yang divalidasi. Apa
menggambarkan uji ini ?

1. Untuk mengetahui adanya senyawa pengganggu yang hanya berasal dari

komponen endogen matrik

2. Untuk mengetahui kemampuan metode analisis mengukur kadar analit dengan

adanya komponen lain dalam sampel

3. Pengukuran menggunakan 3 plasma blanko yang sama

4. Pengukuran dilakukan pada 6 plasma blangko yang berbeda

6. Dalam FDA dijelaskan berbagai jenis validasi yang dapat dilakukan dalam rangka
pengembangan metode bioanalisis, salah satu tipe dan tingkatan validasi merupakan
validasi parsial. Apa jenis yang dikategorikan dalam validasi tersebut ?
1. metode bioanalitik yang ditransfer antar laboratorium atau analis

2. Ada perubahan antikoagulan

3. Ada perubahan prosedur proses sampel

4. Ada metabolit yang ditentukan

7. Dalam melakukan validasi metode, perlu dibuat larutan kontrol. Konsentrasi QCL
adalah mewakili konsentrasi analit yang rendah. Ada dasar penentuan konsentrasi
tersebut ?

1. 2 LLoQ 3. 2-3 LLoQ

2. 4 LLoQ 4. 3-5 LLoQ

Tahun akademik 2016 / 2017

Tipe 1.

8. Dalam FDA dijelaskan tentang berbagai jenis validasi yang dapat dilakukan dalam
rangka pengembangan metode bioanalisis. Salah satunya adalah cukup melakukan
validasi parsial. Hal ini dapat dilakukan jika pengembangan merupakan :

A. Implementasi metode bioanalitik untuk pertama kali

B. Untuk New drug entity

C. Metode bioanalitik baru

D. Penetapan senyawa metabolit

E. Modifikasi metode bioanalitik valid

9. Dalam FDA dijelaskan berbagai jenis validasi yang dapat dilakukan dalam rangka
pengembangan metode bioanalisis, salah satu tipe dan tingkatan validasi merupakan
validasi parsial. Apa jenis yang dikategorikan dalam validasi tersebut ?

A. metode bioanalitik yang ditransfer antar laboratorium atau analis

B. Ada perubahan antikoagulan

C. Ada perubahan prosedur proses sampel

D. Ada metabolit yang ditentukan

10. Matriks biologi adalah matriks yang kompleks dan sangat tinggi variasinya. Untuk
itu, metode bioanalisi yang dipilih harus memiliki kemampuan untuk mengukur kadar
analit dengan adanya komponen - komponen lain dalam sampel. Penilaian terhadap
kemampuan tersebut dapat diketahui setelah dilakuka uji :

A. Sensitivitas C. Reprodusibilitas E. Presisi

B. Selektivitas D. Akurasi

11. Uji stabilitas merupakan uji yang perlu dilakukan pada validasi metode bioanalisis
mengingat stabilitas sampel biologi sangat tergantung pada kondisi
penyimpanannya. Salah satunya adalah uji stabilitas jangka pendek. Pada uji
tersebut perlakuan analit dalam matriks plasma disimpan pada suhu :

A. - 20℃ C. 4℃ E. 30℃

B. B. -5℃ D. 20℃

12. Perhitungan kadar dalam bioanalisi adalah dengan cara kurva kalibrasi.
Konsentrasi analit yang harus disiapkan pada perbuatannya terdiri dari :

A. 3-8 konsentrasi C. 5-8 konsentrasi E. 7-8 konsentrasi

B. 4-8 konsentrasi D. 6-8 konsentrasi

13. Syarat hasil uji presisi pada daerah LLOQ pada validasi metode bioanalisis
adalah :

A. SBR ≤ 20 % C. SBR san SB ≤ 20 % E. SB ≤ 20 %

B. SBR < 20% D. SB < 20%

 14. Baku internal baik diaplikasikan pada sampel :

A. Penentuan kandungan vitamin C dalam tablet lepas cepat

B. Penentuan kandungan vitamin C dalam tablet lepas lambat

C. Penetapan kadar vitamin C dalam buah apel

D. Uji kuantitatif vitamin C dalam serum wajah

E. Analisis vitamin C dalam biskuit bayi

15. Dalam studi bioavailabilitas tablet atorvastatis, pengukuran konsentrasi analit

setelah konsentrasi maksimum dalam darah sering timbul kesalahan akibat adanya
sisa analit pada pengukuran sebelumnya. Kesalahan tersebut tidak boleh lebih dari
20% dari nilai LLoQ yang divalidasi pada uji :

A. Semsitivitas C. Selektivitas E. Carry over

B. Akurasi D. Matriks effect

V. DAFTAR PUSTAKA
1) Letitia Tania, Eme Stepani Sitepu, Yahdiana Harahap. 2016. Validasi Metode
Analisis Ofloksasin dalam Plasma Kromatograf Cair Kinerja Tinggi-
Fluorosensi Mengacu pada European Medicines Agency Guideline. 3(2):61-
71
2) Ermi Nofriyelli. 2018. Validasi Metode Analisis Mengiferin Dalam Plasma In
Vitro secara Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri [Skripsi]. Padang (ID):
Universitas Andalas
3) Puji Widayati, Agus Ariyanto, Triningsih, Veronika Yulianti Susilo, Wening
Lestari. 2018. Validasi Kita Radioimunnoassay Aflatoksin B1. 21-28
4) U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug
Administration. 2018 .Bioanalytical Method Validation Guidance for Industry.
5) EMA, 2011, Guideline in Bioanalytical Method Validation, European Medicine
Agency, UK.