KARAKTERISASI LIPASE DAN KLONING GEN α/β HIDROLASE

DARI Acinetobacter junii ASAL TANAH TERKONTAMINASI

OLI BEKAS KENDARAAN BERMOTOR

WISMO REJA SUBROTO

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018
 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Karakterisasi Lipase dan
Kloning Gen α/β Hidrolase dari Acinetobacter junii Asal Tanah Terkontaminasi Oli
Bekas Kendaraan Bermotor adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2018

Wismo Reja Subroto

NIM G34140059
 ABSTRAK
WISMO REJA SUBROTO. Karakterisasi Lipase dan Kloning Gen α/β Hidrolase
dari Acinetobacter junii Asal Tanah Terkontaminasi Oli Bekas Kendaraan
Bermotor. Dibimbing oleh ANTONIUS SUWANTO dan NISA RACHMANIA
MUBARIK.

Lipase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis proses hidrolisis

senyawa trigliserida menjadi asam lemak dan gliserol. Pemanfaatan lipase sudah
banyak digunakan dalam produksi skala industri, terutama lipase yang bersumber
dari mikrob. Lipase mikrob memiliki aktivitas katalitik unik, mudah dimanipulasi
genetik, dan murah. Tujuan penelitian ini adalah mengkarakterisasi lipase dan
kloning gen α/β hidrolase dari Acinetobacter junii yang diisolasi dari tanah
terkontaminasi oli bekas kendaraan bermotor. Karakterisasi dilakukan
menggunakan metode pNP-ester dan kloning menggunakan vektor pGEM-T Easy.
Hasil karakterisasi menunjukkan lipase A. junii memiliki suhu dan pH optimum
berurutan yaitu 50⁰ C dan 8.5. Substrat spesifik lipase bakteri ini adalah heksanoat
dan dapat ditingkatkan aktivitasnya dengan penambahan CaCl2 dan menggunakan
pelarut n-heksana. Keberhasilan gen α/β hidrolase diklon juga mendukung bahwa
lipase A. junii berpotensi untuk diaplikasikan skala industri.

Kata kunci: Acinetobacter junii, kloning, lipase

ABSTRACT

WISMO REJA SUBROTO. Lipase Characterization and Gene α/β Hydrolase

Cloning of Acinetobacter junii from Used Oil Engine Motorized Vehicles
Contaminated Soil. Supervised by ANTONIUS SUWANTO and NISA
RACHMANIA MUBARIK.

Lipase is an enzyme that can catalyze the hydrolysis of triglycerides

compounds into fatty acids and glycerol. Utilization of lipase is already widely used
in the production of industrial scale, mainly sourced from mikrob lipase. Catalytic
activity of lipase mikrob has a unique, easily manipulated genetic, and inexpensive.
The objectives of this research are to characterize the lipase and clone α/β hidrolase
gene of Acinetobacter junii which isolated from contaminated used oil soil from
motorized vehicles. Characterization is performed using the method of the pNP-
Esther and using pGEM-T Easy as the vector cloning. The result of characterization
shows that A. junii lipase has optimum temperature 50⁰ C and pH 8.5. Substrate
specifity of the lipase is hexanoat. The lipase activity can be increased by the
addition of CaCl2 and using n-hexane solvent. Then, the success of cloned α/β
Hydrolase genes also supports that lipase of A. junii has the potential to be applied
on an industrial scale.

Keywords: Acinetobacter junii, cloning, lipase

KARAKTERISASI LIPASE DAN KLONING GEN α/β HIDROLASE
DARI Acinetobacter junii ASAL TANAH TERKONTAMINASI
OLI BEKAS KENDARAAN BERMOTOR

WISMO REJA SUBROTO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2018
 Judul Skripsi : Karakterisasi Lipase dan Kloning Gen α/β Hidrolase dari
Acinetobacter junii Asal Tanah Terkontaminasi Oli Bekas
Kendaraan Bermotor
Nama : Wismo Reja Subroto
NIM : G34140059

Disetujui oleh

Prof Dr Ir Antonius Suwanto, MSc Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi

Pembimbing I Pembimbing II

Diketahui oleh

Dr Ir Miftahudin, MSi
Ketua Departemen

Tanggal Lulus:
 PRAKATA

Bismillahirrahmanirrahim.
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta’ala atas
segala karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang
dilaksanakan sejak bulan Februari 2018 sampai bulan Juli 2018 ini berjudul
“Karakterisasi Lipase dan Kloning Gen α/β Hidrolase dari Acinetobacter junii Asal
Tanah Terkontaminasi Oli Bekas Kendaraan Bermotor”.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Ayah (Wisnu Subroto), Ibu (Daryati),
dan Adik-adik (Wisdya Asih Sulastri dan Wisam Subroto) atas segala do’a dan
dukungannya. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir
Antonius Suwanto, MSc dan Ibu Dr Nisa Rachmania Mubarik, MSi selaku
pembimbing, Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku penguji, serta Ibu Esti
Puspitasari, MSi yang telah banyak memberi didikan, bimbingan dan saran. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Pak Jaka, Ibu Heni, dan Mas
Aldi selaku staf teknisi laboratorium mikrobiologi IPB; Ria Yelvi Ningsih, M.
Azwar Syah, dan Ludwinardo Putra, selaku rekan sebimbingan; serta Andreas Adhi
Satya Putra dan staf lainnya di R&D Bioteknologi PT Wilmar Benih Indonesia
Cikarang yang telah membantu selama pengumpulan data. Terima kasih juga
penulis ucapkan kepada keluarga Biologi Phoenix 51, keluarga Rumah Tahfidz Al-
Fathon, keluarga organisasi dan kepanitiaan yang selalu memberi do’a, semangat,
dan motivasi selama menjalani proses penyelesaian skripsi.
Semoga karya ilmiah ini membawa berkah dan manfaat.

Bogor, Oktober 2018

Wismo Reja Subroto

 DAFTAR ISI

DAFTAR TABEL vi
DAFTAR GAMBAR vi
DAFTAR LAMPIRAN vi
PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Perumusan Masalah 2
Tujuan Penelitian 2
Manfaat Penelitian 2
TINJAUAN PUSTAKA 2
Enzim 2
Lipase 2
Acinetobacter junii 3
Gen α/β Hidrolase 3
METODE 4
Bahan 4
Alat 4
Prosedur Penelitian 4
HASIL DAN PEMBAHASAN 8
Isolasi Bakteri Lipolitik pada Tanah Terkontaminasi Oli 8
Identifikasi Molekuler Bakteri Terpilih 10
Pengukuran Aktivitas Lipase Ekstrak Kasar 11
Karakterisasi Lipase Ekstrak Kasar 12
Kloning Gen α/β Hidrolase 15
Analisis Hasil Kloning 16
SIMPULAN DAN SARAN 16
Simpulan 16
Saran 17
DAFTAR PUSTAKA 17
LAMPIRAN 20
RIWAYAT HIDUP 24
 DAFTAR TABEL
1 Pengamatan morfologi bakteri dan hasil pewarnaan Gram 9
2 Analisis bioinformatika isolat potensial berdasarkan sekuen gen 16S
rRNA 11
3 Analisis bioinformatika hasil penyejajaran gen α/β hidrolase di
GeneBank 16

DAFTAR GAMBAR
1 Hasil isolasi bakteri lipolitik dari tanah terkontaminasi oli
pada suhu 37oC dan suhu ruang 9
2 Nilai indeks lipolitik setiap isolat 10
3 Hasil elektroforesis gen 16s rRNA yang diamplifikasi dengan PCR 11
4 Aktivitas lipase ekstrak kasar setiap isolat 12
5 Karakterisasi aktivitas lipase ekstrak kasar pada berbagai
suhu dan pH 13
6 Kestabilan penyimpanan lipase ekstrak kasar pada berbagai
suhu dan pH 14
7 Karakterisasi aktivitas lipase ekstrak kasar terhadap
substrat spesifik, ion logam, dan pelarut organik 15
8 Hasil analisis penyejajaran protein α/β hidrolase 16

DAFTAR LAMPIRAN
1 Urutan basa nitrogen hasil analisis gen 16s rRNA
isolat PAR1, PAR2, dan PAR9 20
2 Kurva standar pNP 22
3 Urutan basa nitrogen hasil analisis kloning
gen α/β hidrolase dengan primer M13 22
4 Urutan asam amino hasil analisis kloning gen α/β hidrolase dengan
primer M13 23
 PENDAHULUAN

Latar Belakang

Lipase (EC 3.1.1.3) merupakan enzim kelompok hidrolase yang dapat

mengkatalisis proses hidrolisis senyawa trigliserida menjadi digliserida,
monogliserida, asam lemak dan gliserol (Almeida et al. 2013). Lipase merupakan
enzim yang tergolong famili α/β hidrolase (Pouderoyen et al. 2001). Kelompok ini
memiliki situs aktif berupa triad katalitik yang mengandung serin, asam
aspartat/glutamat, dan histidin sebagai residu (Jaeger et al. 1999). Selain menjadi
katalis dalam reaksi hidrolisis, lipase juga dapat mengkatalis reaksi esterifikasi,
interesterifikasi (asidolisis, alkoholisis dan transesterifikasi) dan aminolisis (Patil et
al. 2011).
Pemanfaatan lipase sudah meluas dalam kegiatan industri. Lipase dapat
ditemukan di berbagai makhluk hidup seperti hewan, tumbuhan dan mikrob (Pahoja
dan Sethar 2002). Namun, pemanfaatan mikrob sebagai sumber lipase lebih banyak
digunakan daripada lipase dari hewan atau tumbuhan (Anbu et al. 2011). Hal ini
disebabkan lipase mikrob mudah didapatkan dalam jangka waktu yang pendek
karena memiliki sifat tumbuh yang cepat daripada hewan atau tumbuhan dengan
perlengkapan produksi yang lebih sederhana (Hasan et al. 2006). Lipase mikrob
juga bersifat lebih stabil terhadap pH basa dan netral (Gokbulut dan Arslanoglu
2013), pelarut organik dan pengaruh ion logam (Preeti et al. 2014). Selain itu, sifat
lain dari lipase mikrob adalah memiliki aktivitas katalitik yang bervariasi, mudah
dimanipulasi genetiknya, dan dapat tumbuh lebih cepat pada media kultur yang
murah dengan menghasilkan produk yang tinggi (Wiseman 1995).
Lipase mikrob telah banyak digunakan secara komersial. Lipase mikrob telah
secara luas digunakan sebagai biokatalis untuk proses biosintesis (Jaeger dan Reetz
1998) dan sifat katalitiknya telah memberikan banyak manfaat dalam industri
makanan, kosmetik, deterjen, farmasi, dan energi (Andualema dan Gessesse 2012),
terutama dari kelompok bakteri. Beberapa contoh bakteri yang telah digunakan
secara komersial adalah Achromobacter, Alcaligens, Arthrobacter, Bacillus,
Burkholderia, Chromobacterium, dan Pseudomonas (Gupta et al. 2004). Selain itu,
beberapa studi juga telah meneliti tentang genus Acinetobater sebagai mikrob
penghasil lipase. Beberapa spesies diantaranya adalah Acinetobacter radioresistens
(Liu dan Tsai 2003), A. junii (Anbu et al. 2011), A. johnsonii LP28 (Wang et al.
2011), dan A.baumannii (Huda 2013).
Genus Acinetobacter merupakan salah satu spesies yang dapat hidup di tanah
terkontaminasi oli kendaraan bermotor (Jorgensen et al. 2000). Genus ini dapat
menggunakan rantai hidrokarbon dalam oli sebagai sumber karbon (Basuki et al.
2011). Penelitian ini menggunakan bakteri lipolitik yang berasal dari tanah
terkontaminasi oli bekas kendaraan bermotor. Bakteri yang diisolasi teridentifikasi
sebagai Acinetobacter junii. Karakterisasi lipase dari bakteri tersebut bertujuan
untuk mengetahui potensi karakter enzim dan mengklon gen α/β hidrolase yang
merupakan gen penyandi lipase untuk mengetahui kemudahan gen tersebut
diperbanyak.
2

Perumusan Masalah

Mikrob sebagai sumber lipase sudah banyak diaplikasikan skala industri.

Lipase mikrob dapat diproduksi dalam jumlah banyak dengan waktu yang relatif
singkat. Karakter lipase yang bervariasi juga berpotensi menghasilkan produk yang
bervariasi. Eksplorasi bakteri penghasil lipase dalam kegiatan bioprospeksi enzim
dalam menemukan sumber penghasil lipase unik merupakan solusi meningkatkan
mutu dan nilai jual produk lipase.

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi lipase dan mengklon gen α/β

hidrolase dari Acinetobacter junii yang berasal dari tanah terkontaminasi oli bekas
kendaraan bermotor.

Manfaat Penelitian

Manfaat yang didapatkan antara lain data karakter lipase Acinetobacter junii
dan pengklonan gen α/β hidrolase yang berpotensi diaplikasikan skala industri serta
sumber pustaka yang berkaitan dengan karakter lipase Acinetobacter junii dan
kemudahan gen α/β hidrolase diperbanyak.

TINJAUAN PUSTAKA

Enzim
Enzim merupakan biokatalisator yang dapat mengkatalisis atau mempercepat
berbagai macam reaksi kimia pembentukan atau pemisahan senyawa tertentu (Neet
1998). Enzim memiliki efektifitas tinggi dalam mengkatalis suatu reaksi dan
aktivitasnya berkaitan langsung dengan struktur enzim. Enzim dapat bereaksi
dengan substrat yang spesifik untuk menghasilkan suatu produk. Kespesifikan
enzim dipengaruhi dengan adanya sisi aktif enzim yang hanya dapat berikatan
dengan substrat tertentu. Misalnya, lipase dapat bereaksi dengan senyawa
trigliserida sebagai substrat dan mengkatalisis proses hidrolisis untuk memotong
ikatan ester menjadi asam lemak dan gliserol. Reaksi tersebut tidak mengubah
struktur enzim sehingga enzim dapat berikatan dan bereaksi lagi dengan substrat
spesifik lainnya (Mantsala dan Niemi 2015).
.
Lipase
Lipase atau triasilgliserol hidrolase merupakan enzim yang dapat
mengkatalis reaksi hidrolisis senyawa triasilgliserol (trigliserida) menjadi asam
lemak dan gliserol (Sharma et al. 2001). Lipase juga dapat melakukan reaksi balik
(esterifikasi) membentuk senyawa triasilgliserol atau reaksi transesterifikasi
(alkoholisis, asidolisis, aminolisis, dan interesterifikasi) apabila kurang tersedianya
air pada lingkungan (Patel et al. 1996). Lipase merupakan anggota kelompok famili
enzim α/β hidrolase. Kelompok ini memiliki struktur triad katalitik yang disusun
dari asam amino serin, asam aspartat, dan histidin (Ollis et al. 1992).
 3

Lipase memiliki beberapa macam sifat selektivitas terhadap substrat, yakni

kemospesifik, regiospesifik, dan enantioselektif. Kemospesifik ialah sifat yang
dapat menunjukkan kespesifikan asam lemak dan kespesifikan kelas lipid suatu
lipase. Kespesifikan asam lemak dapat dilihat ketika terbentuknya asam lemak
dengan panjang tertentu setelah proses hidrolisis. Sedangkan kepesifikan kelas lipid
ditunjukkan dari kemampuan lipase yang tidak hanya mampu mengkatalisis
triasilgliserol, tetapi juga diasilgliserol dan monogliserol. Regiospesifik terbagi
menjadi non-spesifik lipase, spesifik 1,3 lipase dan lipase selektif asam lemak. Non-
spesifik lipase dicirikan dengan kemampuannya mengkatalisis proses hidrolisis
triasilgliserol dengan acak dan menghasilkan mono- dan diasilgliserol. Spesifik
lipase 1,3 hanya dapat mengkatalisis triasil gliserol pada C1 dan C2 ikatan gliserol,
sehingga dapat menghasilkan asam lemak, 2-monoasilgliserol dan 1,2- atau 2,3-
diasilgliserol. Lipase spesifik asam lemak dapat mengkatalisis hidrolisis dengan
posisi yang asam lemak yang spesifik pada triasilgliserol. Enantioselektif adalah
sifat lipase yang dapat membedakan molekul enansiomer dalam campuran rasem.
Kespesifikan lipase ini bergantung jenis substrat yang berhubungan langsung
dengan senyawa ester di alam (Villeneuve 2003).

Acinetobacter junii
Acinetobacter junii memiliki ciri umum dengan spesies anggota genus
Acinetobacter lainnya yaitu bersifat Gram negatif, oksidase negatif, dan termasuk
bakteri aerobik (de Berardinis et al. 2009). Spesies Acinetobacter tersebar luas pada
berbagai lingkungan, terutama tanah, air tawar, laut, sedimen dan tanah
terkontaminasi minyak (Mahjoubi et al. 2013). Secara morfologi, Acinetobacter
junii pada media tryptocasein soy agar memiliki bentuk koloni sirkular, elevasi
cembung, permukaan halus, dan berwarna sedikit buram pada tepian koloni
(Bouvet dan Grimont 1986). Spesies ini telah dipublikasikan memiliki potensi
sebagai agen produksi biosurfaktan (Ohadi et al. 2017), biodegradasi senyawa
hidrokarbon dari oli bekas (Basuki et al. 2011), bioaugmentasi dan biostimulasi
(Singh et al. 2018).

Gen α/β Hidrolase

Lipase merupakan anggota enzim kelompok famili α/β hidrolase. Selain
lipase, enzim sejenis yang merupakan anggota famili ini adalah esterase, peptidase,
dan haloalkana dehalogenase (Holmquist 2000). Famili α/β hidrolase memiliki ciri
komposisi triad katalitik yang mengandung satu residu nukleofilik (serin, sistein,
asam aspartat), satu residu katalitik asam (asam aspartat, asam glutamat), dan satu
histidin yang merupakan residu katalitik basa umum (Carr dan Ollis 2009). Lipase
memiliki ketiga susunan triad katalitik tersebut dengan residu nukleofilik khusus
yaitu serin dan selalu ditemukan pada sekuen asam amino dalam formasi G-X-S-
X-G (G=glisin, S=serin, X=asam amino lain) (Borrelli dan Trono 2015).
4

METODE

Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel tanah
terkontaminasi oli kendaraan bermotor. Sampel ini diambil dari bengkel motor,
mobil, dan tempat pembongkaran mesin mobil di Kecamatan Parung, Kabupaten
Bogor, Jawa Barat. Bahan lainnya adalah media tumbuh Luria Bertani (LB) (tripton
1%, ekstrak khamir 0.5%, NaCl 1%) agar 2%, minyak zaitun, polyvinyl alcohol
(PVA) 2%, rhodamine B 0.1%, Nutrient Broth (NB) (ekstrak daging 0.1%, pepton
0.5%, NaCl 0.5%, ekstrak khamir 0.2%), GoTaq Green Master Mix 2x (Promega®,
USA), TAE (Tris-Asetat-EDTA) 1x, agarose 1%, primer 65F dan 1387R (Marchesi
et al. 1998), Presto™ Mini gDNA Bacteria Kit (Geneaid), p-nitrophenyl decanoat,
Eschericia coli DH5α (Invitrogen, California, USA), ampisilin, plasmid pGEMT
Easy (Promega, USA), X-gal, dan High Fidelity Phusion DNA Polimerase 2U/µl
(Thermo).

Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini ialah autoklaf, Laminar Air Flow
Cabinet (LAFC), cawan petri, neraca analitik, incubator shaker, mesin Polymerase
Chain Reaction (PCR) Applied Biosystems® 2720 Thermal Cycler, sentrifus
(Sorvall Primo Biofuge R), tabung falkon steril, spektrofotometer SmartSpec™
Plus, cooling/heating dry block, mikropipet, shaker, Sanger Sequenser (Applied
Biosystems HITACHI 3130 Genetic Analyzer), perangkat elektroforesis BIORAD,
dan perangkat lunak analisis sekuen Geneious R9.

Prosedur Penelitian

Isolasi Bakteri Lipolitik dari Tanah Terkontaminasi Oli Bekas

Pengambilan sampel tanah dilakukan menggunakan teknik purposive
sampling dengan kriteria tanah tercemar oli bekas di tiga lingkungan bengkel yang
berbeda. Kontaminan oli bekas tersebut berasal dari tanah di 3 lokasi di Kecamatan
Parung, Kabupaten Bogor. Sampel tanah diambil pada kedalaman 3-5 cm pada tiga
titik untuk setiap lokasi bengkel. Sampel tanah yang terkontaminasi dilakukan
pengenceran hingga 10-7 untuk menentukan tingkat pengenceran yang tepat.
Sebanyak 0.1 mL larutan sampel kemudian disebar dalam media agar. Media yang
digunakan ialah Luria Agar Olive oil Rhodhamine B (LAOR). Media ini selektif
terhadap bakteri lipolitik. Hasil sebaran tersebut diinkubasi pada suhu ruang dan
inkubator 37oC selama 48 jam. Kemudian, koloni yang tumbuh diamati di bawah
sinar UV pada panjang gelombang 365 nm. Koloni bakteri lipolitik akan
menghasilkan pendaran jingga disekitar koloni. Koloni yang tumbuh dihitung
berdasarkan standar statistik dengan jumlah 30-300 koloni. Sedangkan, koloni yang
tidak memenuhi persyaratan tidak dihitung (Hadioetomo 1993).
Purifikasi dilakukan dengan metode goresan (streak method) pada media
selektif LAOR. Koloni yang dipurifikasi adalah koloni terseleksi yang memiliki
daya pendaran yang terang dan luas. Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan
 5

koloni tunggal bakteri. Jumlah koloni yang terbentuk dalam penelitian ini (colony
forming unit /CFU) dihitung menggunakan persamaan:

CFU 𝐽𝑢𝑚𝑙𝑎ℎ 𝑘𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖 𝑡𝑒𝑟𝑎𝑚𝑎𝑡𝑖

= × 𝐹𝑎𝑘𝑡𝑜𝑟 𝑝𝑒𝑛𝑔𝑒𝑛𝑐𝑒𝑟𝑎𝑛
𝑚𝐿 𝑉𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒 𝑠𝑒𝑏𝑎𝑟

Pengamatan Morfologi, Pewarnaan Gram, dan Indeks Lipolitik

Pengamatan morfologi koloni dilakukan pada media Nutrient Agar (NA).
Isolat bakteri terpilih digores kuadran pada media NA dan diinkubasi selama 24
jam pada suhu ruang. Pengamatan koloni meliputi bentuk, elevasi, tepian, warna
koloni serta dilakukan pewarnaan Gram untuk mengetahui jenis Gram dan bentuk
sel bakterinya.
Pewarnaan Gram dilakukan dengan menggores tipis koloni berumur 24 jam
pada preparat steril yang sebelumnya ditambahkan satu tetes akuades steril.
Preparat difiksasi dengan api pada udara terbuka dan ditetesi zat warna kristal
violet. Kemudian, preparat dibiarkan selama 1 menit. Preparat dibilas
menggunakan akuades dan dikeringkan. Lalu, preparat ditetesi iodin dan dibiarkan
selama 2 menit. Preparat dibilas kembali dengan akuades dan alkohol 96%.
Selanjutnya, preparat diwarnai dengan safranin dan dibiarkan selama 30 detik.
Setelah diwarnai, preparat dibilas dengan akuades dan dibersihkan dari sisa akuades
menggunakan tisu. Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop dengan
bantuan minyak imersi pada perbesaran tinggi.
Indeks lipolitik diukur dengan menginokulasikan 1 lup biakan murni setiap
isolat dalam media LAOR dan diinkubasi selama 48 jam pada suhu ruang.
Kemudian, diukur indeks lipolitiknya menggunakan rumus:

𝐷𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝑍𝑜𝑛𝑎 𝐵𝑒𝑛𝑖𝑛𝑔 − 𝐷𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖

𝐼𝑛𝑑𝑒𝑘𝑠 𝐿𝑖𝑝𝑜𝑙𝑖𝑡𝑖𝑘 (𝐼𝐿) =
𝐷𝑖𝑎𝑚𝑒𝑡𝑒𝑟 𝐾𝑜𝑙𝑜𝑛𝑖

Identifikasi Molekular Gen 16S rRNA

Koloni bakteri tunggal dengan nilai indeks lipolitik tinggi diseleksi dan setiap
isolat yang terseleksi tersebut diinokulasikan sebanyak 1 lup ke dalam tabung yang
berisi Nutrien Broth (NB). Selanjutnya biakan ditumbuhkan selama 24 jam pada
suhu ruang menggunakan penggoyang. Biakan yang tumbuh dipindahkan ke tabung
1.5 mL dan disentrifuse dengan kecepatan 13000 rpm selama 1 menit sebanyak tiga
kali pengulangan. Supernatan yang terbentuk dibuang dan pelet yang mengendap
dilakukan ekstraksi DNA menggunakan kit Geneaid. Kemudian, Sebanyak 1 µL
sampel DNA ditambahkan 5 µL GoTaq Green Master Mix 2x, masing-masing 1 µL
1 µmol primer 63F atau 38F dan 1 µmol 1387R. Identifikasi dilakukan dengan
mengamplifikasi gen penyandi 16S rRNA menggunakan primer 63F (5’-CAG GCC
TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387R (5’-GGG CGG WGT GTA CAA GGC-
3’) pada mesin PCR (Marchesi et al. 1998). Setelah itu dilakukan program PCR
pada suhu pra-PCR 95°C selama 3 menit, dilanjutkan dengan 25 kali proses
denaturasi pada suhu 95°C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 55°C
selama 30 detik, proses pemanjangan pada suhu 72°C selama 1 menit 15 detik, dan
pasca-PCR pada suhu 72°C selama 5 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel
agarosa 1% dalam bufer TAE 1x dengan tegangan 90V selama 60 menit. Pita DNA
diwarnai dengan Ethidium Bromida (EtBr) 5 µg/mL dan diamati dengan UV
6

transiluminator. Target pita gen 16S rRNA berukuran sekitar 1300 pb. DNA
amplikon kemudian dianalisis urutan basa nitrogennya mengunakan Sanger
sequenser. Sekuen DNA gen 16S rRNA kemudian disejajarkan dengan sekuen yang
ada di Genbank (NCBI) menggunakan BLAST-N untuk analisis gen 16S rRNA
sehingga didapatkan berbagai sekuen lain yang memiliki kemiripan terdekat.

Produksi Lipase Ekstrak Kasar

Produksi lipase ekstrak kasar diawali dengan pembuatan starter yang dibuat
dengan cara menginokulasikan 1 koloni tunggal bakteri ke dalam 10 mL LB dan
diinkubasi pada suhu 25oC dengan kecepatan agitasi 200 rpm overnight. Setelah
itu, biakan cair yang tumbuh diinokulasikan dengan nilai Optical Density (OD)
sebesar 0.1 ke dalam 50 mL LB dan biakan cair tersebut diinkubasi kembali pada
suhu 25oC dengan kecepatan agitasi 200 rpm selama 24 jam. Setelah itu, biakan cair
bakteri yang tumbuh disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm selama 5 menit.
Supernatan yang mengandung lipase ekstraseluler ekstrak kasar lalu dipindahkan
ke dalam tabung amicon®ultra-15 centrifugal filter devices (Merck Millipore).
Sebanyak 15 mL ekstrak kasar enzim dimasukkan ke dalam falkon amicon (50 mL)
dan disentrifuse (Thermo Scientific Sorvall Biofuge Primo R Centrifuge) dengan
kecepatan 4000 rpm pada suhu 20°C selama 15 menit. Tahap ini bertujuan
memekatkan lipase ekstra kasar dan menghilangkan beberapa pengotor seperti
karbohidrat. Bagian pengotor akan turun ke bagian bawah dan ekstrak kasar enzim
akan terkonsentrat dibagian atas. Lipase ekstrak kasar tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam tabung falkon steril untuk diukur aktivitas enzim ekstrak
kasar.

Pengukuran Aktivitas Lipase Ekstrak Kasar

Pengukuran aktivitas lipase ekstrak kasar dilakukan menggunakan substrat
pNP-dekanoat (C10) 20 mM yang telah dilarutkan dalam asetonitril. Sebanyak 940
µl bufer Tris-Cl 0.1 M pH 8 dimasukkan ke dalam tabung 1.5 mL dan
dihomogenkan dengan 40 µl etanol. Larutan tersebut ditambahkan 10 µl ekstrak
lipase dan 10 mL substrat. Kemudian, larutan diinkubasi pada suhu 30°C
menggunakan cooling/heating dry block selama 5 menit. Setelah itu, absorbansi
larutan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 405 nm.

Karakterisasi Lipase Ekstrak Kasar

Karakterisasi lipase ekstrak kasar dilakukan untuk menentukan nilai
optimum aktivitas lipase terhadap faktor suhu dan pH, pengaruh substrat, pengaruh
pelarut organik, pengaruh ion logam, dan kestabilan penyimpanan pada suhu dan
pH tertentu. Penentuan suhu optimum dilakukan dengan pengujian pada suhu 10-
80°C dan penentuan pH optimum dilakukan dengan pengujian pada pH 6-11.
Kemudian, penentuan substrat spesifik dilakukan dari rantai pendek hingga panjang
(C4-C18), penentuan pengaruh penambahan pelarut organik menggunakan
metanol, etanol, isopropanol, butanol, n-heksana, dan asetonitril; serta penentuan
pengaruh penambahan ion logam menggunakan CaCl2, MgCl2, CuCl2, MnCl2,
ZnCl2, dan FeCl3, terhadap aktivitas lipase.
Penentuan suhu optimum dilakukan menggunakan larutan uji yang
mengandung 940 µl bufer Tris-Cl 0.1 M pH 8, 40 µl etanol, 10 µl sampel lipase,
dan 10 µl substrat pNP-dekanoat. Kemudian, larutan uji tersebut diinkubasi dengan
 7

suhu yang berbeda-beda mulai dari 10°C hingga 80°C selama 5 menit. Setelah itu,
absorbansi larutan hasil reaksi diukur menggunakan spektrofotometer dengan
panjang gelobang 405 nm. Penentuan pH optimum dilakukan menggunakan larutan
uji dengan komposisi yang sama seperti penentuan suhu optimum kecuali pada
bufer yang digunakan. Bufer yang digunakan meliputi bufer fosfat (pH 6-8), bufer
Tris-Cl (pH 8-9), dan bufer Glisin-NaOH (pH 9-11). Kemudian, larutan uji tersebut
diinkubasi pada suhu optimum selama 5 menit dan diukur absorbansi dengan
panjang gelombang 405 nm.
Penentuan substrat spesifik dilakukan dengan larutan uji yang mengandung
940 µl bufer pH optimum, 40 µl etanol, 10 µl sampel lipase, dan 10 µl substrat
paranitrofenil dengan panjang rantai karbon C4-C18 (pNP-butirat, pNP-heksanoat,
pNP-oktanoat, pNP-dekanoat, pNP-dodekanoat, pNP-miristat, pNP-palmitat, pNP-
stearat). Substrat paranitrofenil dengan panjang rantai karbon C4-C12 dilarutkan
dengan asetonitril. Sedangkan, substrat dengan panjang gelombang C14-C18
dilarutkan dengan isopropanol. Kemudian, setiap larutan uji diinkubasi pada suhu
optimum selama 5 menit dan diukur absorbansi dengan panjang gelobang 405 nm.
Penambahan pelarut organik dan ion logam juga dapat mempengaruhi
aktivitas lipase. Penentuan aktivitas lipase dengan penambahan pelarut organik
dilakukan dengan menginkubasi 50 µl sampel lipase dan 50 µl berbagai pelarut
organik selama 30 menit. Kemudian, larutan tersebut dijadikan sebagai sampel
enzim dengan pengenceran 2x dan dilakukan proses pengujian aktivitas lipase pada
suhu dan pH optimum selama 5 menit. Sedangkan, penentuan pengaruh
penambahan ion logam diukur dengan menginkubasi terlebih dahulu campuran 50
µl sampel lipase, 49 µl bufer optimum, dan 1 µl larutan ion logam pada suhu
optimum selama 30 menit. Kemudian, larutan tersebut dijadikan sebagai sampel
enzim dengan pengenceran 2x dan dilakukan proses pengujian aktivitas lipase pada
suhu dan pH optimum selama 5 menit.

Desain Primer dan Amplifikasi Gen Penyandi Lipase Acinetobacter junii

Primer didesain berdasarkan sekuen penyandi (CDS) α/β hydrolase
Acinetobacer junii strain 65 di GeneBank menggunakan aplikasi Geneious R9 dan
didapatkan hasil desain primer yakni dengan primer forward: 5’-TCG GAA AGA
ACA AGA ATT ATG AAC-3’ dan primer reverse: 5’-GGC ATT TTT TGA ATC
AGC TAT G-3’. Komposisi reaksi PCR meliputi 10 µl bufer HF 5x, 1 µl dNTP 10
mM, 1.5 µl 1 µmol primer forward, 1.5 µl 1 µmol primer reverse, 0.6 µl
PhusionTaq, 35 µl ddH2O, dan 1 µl DNA genom. Kondisi PCR yang digunakan
untuk amplifikasi gen penyandi lipase yaitu pra-PCR 98°C selama 30 detik,
denaturasi 98°C selama 10 detik, penempelan primer 55°C selama 30 detik, dan
pemanjangan 72°C selama 1.5 menit. Hasil PCR menghasilkan sekuen-sekuen gen
dengan ujung tumpul. Gen-gen hasil amplifikasi tersebut kemudian ditambahkan
ekstra satu adenosin pada ujung 5’ dengan melakukan reaksi 5 µl bufer Termopol
10x, 1 µl NEB Enzyme Taq 2x, 20 µl sampel hasil PCR, 0.5 µl dATP 0.2 mM dan
23.5 µl ddH2O pada suhu 72°C selama 30 menit dan suhu 12°C selama 30 menit di
mesin PCR.

Ligasi, Transformasi dan Kloning

Produk PCR setelah ditambahkan ekstra satu adenosin kemudian
diligasikan ke dalam plasmid pGEM-T Easy (Promega) menggunakan T4 ligase
8

dan diinkubasikan pada suhu 4°C overnight. Selanjutnya, produk ligasi

diintroduksikan ke dalam sel kompeten E. coli DH5α. Verifikasi keberhasilan
pengklonan dilakukan dengan metode seleksi biru-putih. Hasil transformasi
ditumbuhkan pada media LA yang mengandung ampisilin dan X-Gal dalam
inkubator suhu 37°C overnight. Koloni transforman dengan plasmid rekombinan
dicirikan dengan penampakan koloni berwarna putih. Koloni transforman tersebut
kemudian diverifikasi dengan reaksi PCR koloni menggunakan primer M13
forward (5’-GTA AAA CGA CGG CCA G-3’) dan M13 reverse (5’-
CAGGAAACAGCTATGAC-3’). Komposisi reaksi PCR meliputi 5 µl GoTaq
Green Master Mix 2x, 1 µl primer 1 µmol M13 forward, 1 µl primer 1 µmol M13
reverse, 3 µl sampel koloni yang telah diencerkan dengan 20 µl NFW (nuclease-
free water). Kondisi PCR yang digunakan adalah pra-PCR 95°C selama 5 menit,
denaturasi 95°C selama 30 menit, penempelan 50°C selama 30 detik, pemanjangan
72°C selama 1 menit, dan pasca pemanjangan 72°C selama 5 menit. Produk PCR
dielektroforesis untuk diverifikasi pada gel agarosa 1% dalam bufer TAE 1x dengan
tegangan 100 V selama 90 menit. Pita DNA diwarnai dengan EtBr 1% dan
penghilangan EtBr pada agar dengan perendaman di air selama 20 menit. Gel
kemudian diamati dengan UV transiluminator. Setelah itu, plasmid koloni
transforman rekombinan tersebut diisolasi dengan menggunakan Qiaprep Spin
Miniprep Kit. Plasmid rekombinan yang telah diisolasi kemudian dianalisis urutan
basa nitrogennya mengunakan sequenser. Sekuen plasmid rekombinan tersebut
kemudian disejajarkan dengan sekuen yang ada di Genbank (NCBI) menggunakan
BLAST-P untuk analisis gen penyandi dan deduksi protein sehingga didapatkan
berbagai sekuen lain yang memiliki kemiripan terdekat.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Bakteri Lipolitik pada Tanah Terkontaminasi Oli

Hasil inkubasi selama 24 jam pada suhu ruang dan suhu 37°C menunjukkan
koloni bakteri lipolitik dengan ciri berpendar pada media rhodamin B ketika diamati
dengan sinar UV pada panjang gelombang 365 nm (Gambar 1). Kemudian, koloni
tersebut diseleksi berdasarkan tingkat pendaran dan luas lingkaran pendaran. Hasil
penyeleksian didapatkan tujuh koloni dari media yang diinkubasi pada suhu ruang
dan tiga koloni dari media yang diinkubasi pada suhu 37°C. Kesepuluh koloni
tersebut menunjukkan pendaran yang paling terang dan luas daripada koloni
lainnya dalam media. Pendaran koloni yang lebih terang dan lebih luas
memungkinkan adanya bakteri lipolitik yang memiliki aktivitas lipase tinggi atau
unik.
Kepadatan jumlah bakteri lipolitik di tanah terkontaminasi oli bekas pada
suhu inkubasi 37°C sebesar 6,3 x 107 CFU/g. Sedangkan, pada inkubasi suhu ruang
sebesar 7,8 x 107 CFU/g. Kepadatan total populasi jumlah bakteri yang diinkubasi
pada suhu 37°C yaitu mencapai 1.12 x 108 CFU/g, sedangkan pada inkubasi suhu
ruang sebesar 1,16 x 108 CFU/g. Persentase jumlah bakteri lipolitik terhadap total
bakteri pada inkubasi suhu 37°C dan suhu ruang berurutan sebesar 56,25% dan
67,24%. Hal ini menunjukan dominansi bakteri lipolitik terhadap bakteri non-
lipolitik di tanah terkontaminasi oli bekas kendaraan bermotor. Besarnya persentase
 9

(a) (b)
Gambar 1 Hasil isolasi bakteri lipolitik dari tanah terkontaminasi oli: (a) inkubasi suhu
37°C; (b) inkubasi suhu ruang
jumlah bakteri lipolitik berhubungan dengan kemampuan bakteri lipolitik
memanfaatkan senyawa hidrokarbon untuk menstimulasi pertumbuhannya (Breuil
et al. 1978).
Berdasarkan hasil pengamatan morfologi didapatkan bahwa dari kesepuluh
isolat memiliki warna, elevasi, tepian dan bentuk koloni yang sama. Sedangkan,
pada pengamatan Gram teramati bahwa isolat 3 dan 4 memiliki sifat Gram positif
dan isolat lainnya memiliki sifat Gram negatif. Setiap isolat hanya teramati dua
jenis bentuk yaitu kokus dan kokobasil (Tabel 1).
Tabel 1 Pengamatan morfologi bakteri dan hasil pewarnaan Gram
Diameter Bentuk
No. Isolat Warna Elevasi Tepian Gram Bentuk sel
(cm) koloni
Putih
1 PAR1 0,15 Cembung Licin Bundar - Coccobasil
kecoklatan
Putih
2 PAR2 0,2 Cembung Licin Bundar - Coccobasil
kecoklatan
Putih
3 PAR3 0,2 Cembung Licin Bundar + Coccus
kecoklatan
Putih
4 PAR4 0,15 Cembung Licin Bundar + Coccus
kecoklatan
Putih
5 PAR5 0,15 Cembung Licin Bundar - Coccus
kecoklatan
Putih
6 PAR6 0,2 Cembung Licin Bundar - Coccus
kecoklatan
Putih
7 PAR7 0,1 Cembung Licin Bundar - Coccus
kecoklatan
Putih
8 PAR8 0,1 Cembung Licin Bundar - Coccus
kecoklatan
Putih
9 PAR9 0,15 Cembung Licin Bundar - Coccobasil
kecoklatan
Putih
10 PAR10 0,1 Cembung Licin Bundar - Coccus
kecoklatan
10

1,2

1,0

0,8
Indeks lipolitik

0,6

0,4

0,2

0,0
PAR1 PAR2 PAR3 PAR4 PAR5 PAR6 PAR7 PAR8 PAR9 PAR10
Isolat
Gambar 2 Nilai indeks lipolitik setiap isolat
Berdasarkan nilai indeks lipolitik, tiga isolat yang memiliki nilai tertinggi
adalah PAR1, PAR2, dan PAR9. Nilai indeks lipolitik PAR1, PAR2, dan PAR9
berurutan adalah 0.770, 0.920, dan 0.744 (Gambar 2). Nilai indeks lipolitik yang
tinggi menunjukkan tingkat aktivitas lipase yang tinggi. Terbentuknya pendaran
lingkaran jingga menandakan terjadinya proses hidrolisis lipase terhadap substrat
minyak zaitun dalam media selektif lipase (Guehi et al. 2007). Tiga isolat terpilih
kemudian dilanjutkan ke tahap identifikasi molekular gen 16S rRNA.

Identifikasi Molekuler Bakteri Terpilih

Ketiga isolat yang terpilih (PAR1, PAR2, PAR9) diidentifikasi
menggunakan gen 16S rRNA. Hasil ampilifikasi gen 16S rRNA kemudian
diverifikasi dengan elektroforesis dan menunjukkan pita DNA berukuran 1300 pb
(Gambar 3). Semua isolat pada saat amplifikasi PCR mengunakan primer 63F dan
1387R (PAR1, PAR2, PAR9a), sedangkan pada isolat PAR9b digunakan primer
38F dan 1387R karena pada saat proses optimasi, hasil elektroforesis isolat PAR9b
tidak menunjukkan pita DNA yang jelas dengan primer 63F dan 1387R. Semua Pita
DNA masing-masing isolat yang teramati pada hasil proses elektroforesis berada
pada kisaran besaran panjang pita 1000-1500 pb (Gambar 3). Pita DNA yang
teramati kemudian dibandingkan dengan gen 16S rRNA yang telah diamplifikasi
dari Burkholderia cepacia.
Identitas hasil sekuensing isolat PAR1, PAR2, dan PAR9 berdasar gen 16S
rRNA menunjukkan kemiripan dengan Acinetobacter junii (Tabel 2) (Lampiran 1).
Query Cover adalah parameter untuk menilai persen sekuen dalam database yang
menutupi sekuen sampel. Persentase yang dapat diterima minimal 95%. Sedangkan,
E-value mewakili seberapa cocok sekuen sampel dengan sekuen database. Semakin
rendah E-value, atau semakin mendekati nol, maka semakin tinggi kecocokannya.
Nilai Identity menunjukkan tingkat kecocokan antara basa sampel dan database
pada saat penyejajaran. Semakin besar nilai identity, maka semakin tinggi pula
kecocokan antara DNA sampel dengan DNA pada database (Narita et al. 2012).
 11

1kb a b c d e

1500pb 1300 bp
1000pb

Gambar 3 Hasil elektroforesis gen 16s rRNA yang diamplifikasi dengan PCR:
(a) PAR1; (b) PAR2; (c) PAR9a; (d) PAR9b; (e) kontrol +

Tabel 2 Analisis bioinformatika isolat potensial berdasarkan sekuen gen 16S rRNA
Kode Identity/
No. Deskripsi E-Value No. Akses
Isolat Query cover
1 PAR1 Acinetobacter junii 0.0 99/100 NR_117623.1
strain ATCC 17908
16S ribosomal RNA,
partial sequence
2 PAR2 Acinetobacter junii 0.0 99/100 NR_117623.1
strain ATCC 17908
16S ribosomal RNA,
partial sequence
3 PAR9 Acinetobacter junii 0.0 99/100 NR_117623.1
strain ATCC 17908
16S ribosomal RNA,
partial sequence

Pengukuran Aktivitas Lipase Ekstrak Kasar

Berdasarkan hasil uji aktivitas menggunakan substrat paranitrofenil dekanoat
diperoleh aktivitas lipase tertinggi dihasilkan oleh isolat PAR9 (Gambar 4).
Pengukuran aktivitas lipase menggunakan substrat pNP-dekanoat pada suhu 30°C
dan pH 8 dengan visualisasi spektrofotometri terhadap substrat yang digunakan
(405 nm). Absorbansi yang terukur kemudian dikonversikan menggunakan kurva
standar pNP sebagai aktivitas lipase (Lampiran 2). Aktivitas lipase didefinisikan
sebagai jumlah µmol p-nitrofenol yang terbentuk per menit (Becker et al. 1997).
Paranitrofenol yang terbentuk menyebabkan larutan berwarna kuning menandakan
pH larutan berubah menjadi basa (Pencreac’h dan Baratti 1996). Lipase ekstrak
kasar isolat PAR9 berikutnya akan dikarakterisasi enzim.
12

3,5

Aktivitas lipase (U/mL) 2,5

1,5

0,5

0
PAR1 PAR2 PAR9
Isolat

Gambar 4 Aktivitas lipase ekstrak kasar setiap isolat

Karakterisasi Lipase Ekstrak Kasar

Karakterisasi pengaruh suhu terhadap aktivitas lipase Acinetobacter junii
menunjukkan bahwa suhu optimum lipase adalah 50°C dan masih bertahan lebih
dari 80% dari aktivitas optimum pada suhu 40°C dan 60°C (Gambar 5a). Sedangkan,
aktivitas lipase terhadap pengaruh pH diperoleh aktivitas optimum berada pada pH
8.5 (Gambar 5b). Hasil karakter ini sesuai dengan Acinetobacter junii SY-01 yang
memiliki aktivitas optimum pada suhu 45-50°C dan pH 7-9 (Yoon et al. 2004).
Berdasarkan hasil aktivitas optimum pada suhu dan pH tersebut menunjukkan
bahwa lipase Acinetobacter junii hasil isolasi bersifat termofilik dan alkalin.
Lipase Acinetobacter junii memiliki aktivitas enzim yang stabil dalam
penyimpanan pada suhu 30°C dan tetap stabil lebih dari 80% aktivitasnya pada suhu
20-60°C (Gambar 6a). Sedangkan, kestabilan penyimpanan lipase terhadap pH
menunjukkan lipase yang stabil pada pH 4-6 dengan tingkat aktivitas enzim lebih
dari 70% dengan pengaruh penyimpanan lipase pada pH 7 menunjukkan aktivitas
tertinggi (Gambar 6b). Peningkatan suhu lingkungan menyebabkan energi kinetik
enzim meningkat. Tingginya nilai energi kinetik menunjukkan aktivitas katalitik
enzim yang tinggi (Daniel dan Danson 2013). Namun setelah titik suhu optimum
aktivitas enzim, suhu akan merusak struktur enzim sehingga enzim terdenaturasi
(Copeland 2000). Sedangkan, pH lingkungan dapat mempengaruhi ikatan ionik
pada struktur enzim terutama pada sisi aktif enzim yang mengandung residu
katalitik asam dan basa. Konsentrasi ion hidrogen dalam sistem reaksi dapat
mempengaruhi proses ionisasi ikatan antara enzim dan substrat. Hal tersebut
menunjukkan ketergantungan aktivitas enzim terhadap perubahan pH lingkungan
(Frankenberger dan Tabatabai 1982).
 13

120

100

Aktivitas relatif (%)

80

60

40

20

0
10 20 30 40 50 60 70 80
Suhu (⁰C)

(a)
120

100
Aktivitas relatif (%)

80

60

40

20

0
5 6 7 8 9 10 11 12
pH

Fosfat Tris Cl Glisin-NaOH

(b)
Gambar 5 Karakterisasi aktivitas lipase ekstrak kasar pada berbagai:
(a) suhu; (b) pH
Berdasarkan sifat termostabil dan suhu optimum aktivitas lipase
Acinetobacter junii hasil isolasi menunjukkan lipase yang berpotensi sebagai
biokatalisator dalam produksi biodiesel (Yucel et al. 2012). Kestabilan aktivitas
lipase terhadap pengaruh suhu dan pH menunjukkan potensi enzim untuk
diaplikasikan skala industri (Borrelli dan Trono 2015).
Kespesifikan substrat terhadap aktivitas lipase Acinetobacter junii diuji
menggunakan substrat pNP-ester. Hasil pengujian lipase bakteri ini menunjukkan
lipase Acinetobacter junii dapat menghidrolisis ester asam lemak rantai panjang dan
pendek. Aktivitas lipase tertinggi terdapat pada substrat pNP-heksanoat (Gambar
7a). Substrat ini akan terhidrolisis oleh lipase dengan menghasilkan produk khusus
asam lemak dengan panjang 6 rantai karbon (C6). Spesifitas Substrat dikendalikan
14

120

Aktivitas relattif (%) 100

80

60

40

20

0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Suhu (⁰C)

(a)
120

100
Aktivitas relatif (U/mL)

80

60

40

20

0
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
pH

(b)
Gambar 6 Kestabilan penyimpanan lipase ekstrak kasar pada berbagai:
(a) Suhu; (b) pH

oleh sifat-sifat molekul enzim, struktur substrat dan faktor yang mempengaruhi
pengikatan enzim ke substrat. Kemampuan lipase yang dapat memproduksi asam
lemak seperti ini berpotensi dapat digunakan sebagai penguat rasa dalam industri
makanan (Kilara 2011).
Hasil karakterisasi pengaruh pelarut organik terhadap aktivitas lipase
Acinetobacter junii menunjukkan aktivitas lipase tertinggi terdapat pada pelarut n-
heksana (Gambar 7c). Pelarut organik seperti heksana dapat meningkatkan aktivitas
lipase dengan cara membuat struktur lipase dalam keadaan ‘terbuka’ (Tejo et al.
2005). Keadaan ini menyebabkan situs aktif lipase mudah berikatan dengan substrat
 15

Aktivitas relatif (%) 250

120
200

Aktivitas relatif (%)

100
150 80
100 60
40
50
20
0 0
C4 C6 C8 C10 C12 C14 C16 C18 Kontrol CaCl₂ MgCl₂ CuCl₂ MnCl₂ ZnCl₂ FeCl₃
Substrat paranitrofenil Ion logam
(a) (b)
120

100
Aktivitas relatif (%)

80

60

40

20

0
Kontrol Metanol Etanol Isopropanol Butanol n-Heksana Asetonitril
Pelarut organik
(c)
Gambar 7 Karakterisasi aktivitas lipase ekstrak kasar terhadap: (a) Substrat spesifik;
(b) Ion logam; (c) Pelarut organik.

sehingga aktivitasnya meningkat (Khan et al. 2017) Tingginya aktivitas terhadap

n-heksana menunjukkan potensi lipase A.junii sebagai agen katalasi produksi
biodiesel (Yucel et al. 2012). Sedangkan, pengaruh ion logam terhadap aktivitas
lipase menunjukkan aktivitas tertinggi pada ion logam CaCl2 (Gambar 7b). Menurut
Wang et al. (2012), meningkatnya keberadaan Ca2+ dapat meningkatkan aktivitas
lipase karena kestabilan struktur enzim saat berikatan dengan Ca2+ dan adanya
ketergantungan reaksi pelepasan asam lemak dengan Ca2+. Hal ini dapat dilihat
pada diagram yang menunjukkan peningkatan aktivitas lipase dari aktivitas lipase
kontrol.
Kloning Gen α/β hidrolase
Koloni transforman yang didapatkan berjumlah 2 koloni berwarna putih.
Kemudian dua koloni tersebut dianalisis keberadaan sekuen insert dengan PCR
koloni dan penyekuenan menggunakan primer M13.
 16

Tabel 3 Analisis bioinformatika hasil penyejajaran protein α/β hidrolase di GeneBank

No. Deskripsi E-Value Identity No. Akses
alpha/beta hydrolase
1 0.0 99% WP_005403968.1
[Acinetobacter junii]
alpha/beta hydrolase
2 0.0 99% WP_026057430.1
[Acinetobacter junii]
alpha/beta hydrolase
3 0.0 99% WP_035336141.1
[Acinetobacter junii]
alpha/beta hydrolase
4 0.0 99% WP_039047191.1
[Acinetobacter junii]
alpha/beta hydrolase
5 0.0 99% WP_035338446.1
[Acinetobacter junii]

10 15 27 43 232 254 296

Gambar 8 Hasil analisis penyejajaran protein α/β hidrolase

Analisis Hasil Kloning

Hasil penyekuenan dengan primer M13 didapatkan sekuen dengan panjang
1160bp (Lampiran 3). Hasil BLAST-P menunjukkan kemiripan 99% dengan
protein α/β hidrolase Acinetobater junii di Genebank (Lampiran 4). Perbedaan
deduksi sekuen asam amino terdapat pada asam amino nomor 10, 15, 27, 43, 232,
254, 296 (Gambar 8). Penyejajaran dilakukan dengan menggunakan sekuen gen α/β
hidrolase di GeneBank. Hasil analisis bioinformatika menunjukkan nilai identitas
99% dengan E-value 0.0 (Tabel 3). Hal berikut menunjukkan kemiripan hasil
sekuen gen yang diligasi dengan database adalah identik.

SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Koloni Acinetobacter junii memiliki bentuk koloni bundar, berwarna putih

kecoklatan dengan elevasi cembung dan tepian koloni licin. Bakteri ini memiliki
sel dengan bentuk kokobasil dan bersifat Gram negatif. Lipase pada bakteri ini
memiliki aktivitas optimum pada suhu 50⁰ C dan pH 8.5 dengan substrat spesifik
heksanoat. Aktivias lipase meningkat dengan penambahan ion logam CaCl2 dalam
pelarut n-heksana. Gen α/β hidrolase yang merupakan kelompok lipase telah
berhasil diklon.
 17

Saran

Penelitian ini perlu dilanjutkan ke tahap ekspresi gen α/β hidrolase

menggunakan vektor ekspresi dan analisis efek perubahan asam amino pada sekuen
rekombinan gen α/β hidrolase Acinetobacter junii.

DAFTAR PUSTAKA

Almeida AF, Tauk-Tornisielo SM, Carmona EC. 2013. Acid lipase form Candida
viswanathii: production, biochemical properties, and potential application.
Biomed Res Int. 2013:1-10.
Anbu P, Noh M, Kim D, Seo J, Hur B, Min KH. 2011. Screening and optimization
of extracellular lipases by Acinetobacter species isolated from oil-
contaminated soil in South Korea. Afr J Biotechnol. 10: 4147-4156.
Andualema B, Gessesse A. 2012. Microbial lipases and their industrial applications:
review. Biotechnology. 11(3): 100–118.
Basuki W, Syahputra K, Suryani AT, Pradipta I. 2011. Biodegradation of used
engine oil by Acinetobacter junii TBC 1.2. I J Biotechnol. 16(2): 132-138.
Becker P, Abu-Reesh I, Markossian S, Antranikian G, Markl H. 1997.
Determination of the kinetic parameters during continuous cultivation of the
lipase-producing thermophile Bacillus sp. IHI-91 on olive oil. Appl Microbiol
Biotechnol. 48: 184-190.
Borrelli GM, Trono D. 2015. Recombinant lipases and phospholipases and their use
as biocatalysts for industrial applications. Int J Mol Sci. 16: 20774-20840.
Bouvet PJM, Grimont PAD. 1986. Taxonomy of the genus Acinetobacter with the
recognition of Acinetobacter baumannii sp. nov., Acinetobacter haemolyticus
sp. nov., Acinetobacter johnsonii sp. nov., and Acinetobacter junii sp. nov.
and emended descriptions of Acinetobacter calcoaceticus and Acinetobacter
lwoffii. Int. J Syst Baicteriol. 36: 228-240.
Breuil C, Shindler DB, Sijher JS, Kushner DJ. 1978. Stimulation of lipase
production during bacterial growth on alkanes. J Bacteriol. 133(2): 601-606.
Carr PD, Ollis DL. 2009. α/β hydrolase fold: an update. Protein Pept. Lett. 16: 137-
148.
Copeland RA. 2000. Enzymes: A Practical Introduction to Structure, Mechanism,
dan Data Analysis. New York (US): Wiley-VCH.
Daniel RM, Danson MJ. 2013. Review: temperature and the catalytic activity of
enzymes: A fresh understanding. FEBS Letters. 587: 2738–2743.
De Berardinis V, Durot M, Weissenbach J, Salanoubat M. 2009. Acinetobacter
baylyi ADP1 as a model for metabolic system biology. Curr Opin Microbiol.
12: 568–576.
Frankenberger WT, Tabatabai MA. 1982. Amidase and urease activities in plants.
Plant Soil. 64: 153-166.
Gokbulut AA, Arslanoglu A. 2013. Purification and biochemical characterization
of an extracellular lipase from psychrotolerant Pseudomonas fluorescens
KE38. Turk J Biol. 37: 538-546.
18

Guehi TS, Dingkuhn M, Cros E, Fourny G, Ratomahenina R, Moulin G, Vidal AC.

2007. Identification and lipase-producing abilities of moulds isolated from
Ivorian raw cocoa beans. Res J Agric Biol Sci. 3(6): 838-843.
Gupta R, Gupta N, Rathi P. 2004. Bacterial lipases: an overview of production,
purification and biochemical properties. Appl Microbiol Biotechnol. 64: 763-
781.
Hadioetomo RS. 1993. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta (ID): Gramedia
Hasan F, Shah AA, Hameed A. 2006. Industrial applications of microbial lipases.
Enzyme Microb Technol. 39(2): 235-251.
Holmquist M. 2000. Alpha/beta-hydrolase fold enzymes: structures, functions and
mechanisms. Curr. Protein Pept. Sci. 1: 209–235.
Huda JM. 2013. Physicochemical factors affected the partial purified lipase activity
of Acinetobacter baumannii local isolates. Iraqi J Pharm Sci. 22: 82–89.
Jaeger KE, Dijkstra BW, Reetz MT. 1999. Bacterial biocatalysts: molecular biology,
three-dimensional structures and biotechnological applications of lipases.
Annu Rev Microbiol. 53:315–351.
Jaeger KE, Reetz MT. 1998. Microbial lipases form versatile tools for
biotechnological. Trends Biotechnol. 16: 396-403.
Jorgensen KS, Puustinen J, Suortti A. 2000. Bioremediation of petroleum
hydrocarbon-contaminated soil by composting in biopiles. Environ Pollut.
107: 245-254.
Khan FI, Lan D, Durrani R, Huan W, Zhao Z, Wang Y. 2017. The lid domain in
lipases: structural and functional determinant of enzymatic properties. Front
Bioeng Biotechnol. 5(6): 1-13.
Kilara A. 2011. Enzymes Exogenous to Milk in Dairy Technology, Lipases. Di
dalam: Fuquay, J.W. eds. Encyclopedia of Dairy Sciences (Edisi ke-2).
London (GB): Academic Pr.
Liu IL, Tsai SW. 2003. Improvements in lipase production and recovery form
Acinetobacter radioresistens in presence of polypropylene powders filled
with carbon sources. Appl Biochem Biotechnol. 104:129–140.
Mahjoubi M, Jaouani A, Guesmi A, Ben Amor S, Jouini A, Cherif H, Najjari A,
Boudabous A, Koubaa N, Cherif A. 2013. Hydrocarbonoclastic bacteria
isolated from petroleum contaminated sites in Tunisia: isolation,
identification and characterization of the biotechnological potential. New
Biotechnol. 30:723–733.
Mantsala P, Niemi J. 2015. Enzymes: the biological catalysts of life. Physiol
Maintenan. 2:1-9.
Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, Hiom SJ, Wade WG.
1998. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that
amplify genes coding for bacterial 16s rRNA. Appl Environ Microbiol. 64(2):
795-799.
Narita V, Arum AL, Isnaeni SM, Fawzya NY. 2012. Analisis bioinformatika
berbasis web untuk eksplorasi enzim kitosanase berdasarkan kemiripan
sekuens. Al-Azhar Indonesia Seri Sains dan Teknologi. 1(4): 197-203.
Neet KE. 1998. Enzyme catalytic power minireview series. J Biol Chem. 273:
25527-25528.
 19

Ohadi M, Dehghan-Noudeh G, Shakibaie M, Banat IM, Pournamdari M,

Forootanfar H. 2017. Isolation, characterization, and optimization of
biosurfactant production by an oil-degrading Acinetobacter junii B6 isolated
from an Iranian oil excavation site. Biocatal Agric Biotechnol. 12: 1-9.
Ollis DL, Cheah E, Cygler M, Dijkstra BW, Frolow F, Franken SM, Harel M,
Remington SJ, Silman I, Schrag J. et al. 1992. The alpha/beta hydrolase fold.
Protein Eng. 5: 197-211.
Pahoja VM, Sethar MA. 2002. A review of enzymatic properties of lipase in plants,
animals, and microorganisms. Pak J Appl Sci. 2(4): 474-484.
Patel MT, Nagarajan R, Kilara A. 1996. Lipase-catalyzed biochemical reactions in
novel media: a review. Chem Eng Comm. 152: 365-404.
Patil KJ, Chopda MZ, Mahajan RT. 2011. Lipase biodiversity. Indian J Sci Technol.
4: 971-982.
Pencreac’h G, Baratti JC. 1996. Hydrolysis of p-nitrophenyl palmitate in n-heptane
by the Pseudomonas cepacia lipase: A simple test for the determination of
lipase activity in organic media. Enzyme Microb Technol. 18: 417-422.
Pouderoyen van G, Eggert T, Jaeger K-E, Dijkstra BW. 2001. The crystal structure
of Bacillus subtilis lipase: a minimal α/β hydrolase fold enzyme. J Mol Biol.
309: 215-226.
Preeti A, Hemalatha D, Rajendhran J, Mullany P, Gunasekaran P. 2014. Cloning,
expression and characterization of a lipase encoding gene from human oral
metagenome. Indian J Microbiol. 54(3): 284-92.
Sharma R, Chisti Y, Banerjee UC. 2001. Production, purification, characterization
and application of lipases. Biotech Adv. 19: 627–662.
Singh P, Singh VK, Singh R, Borthakur A, Kumar A, Tiwary D, Mishra PK. 2018.
Biological degradation of toluene by indigenous bacteria Acinetobacter junii
CH005 isolated from petroleum contaminated sites in India. Energ Ecol
Environ. 3(3): 162-170.
Tejo BA, Salleh AB, Pleiss J. 2005. Structure and dynamics of Candida rugosa
lipase: the role of organic solvent. J Mol Model. 10(5-6): 358-366.
Villeneuve P. 2003. Plant lipases and their applications in oils and fats modification.
Eur. J. Lipid Sci. Technol. 105: 308–317.
Wang HK, Shao J, Wei YJ, Zhang J, Qi W. 2011. A novel low-temperature alkaline
lipase from Acinetobacter johnsonii LP28 suitable for detergent formulation.
Food Technol Biotechnol. 49(1): 96-102.
Wang H, Zhong S, Ma H, Zhang J, Qi W. 2012. Screening and characterization of
a novel alkaline lipase from Acinetobacter calcoaceticus 1-7 Isolated from
bohai bay in China for detergent formulation. Braz J Microbiol. 43(1): 148–
156.
Wiseman A. 1995. Introduction to Principles, Handbook of Enzyme Biotechnology,
edisi ke-3. Cornwall (GB): Ellis Horwood Ltd. T.J. Press Ltd.
Yoon, Moon-Young, Shin P, Han Y, Lee S, Park J, Cheong C. 2004. Isolation of
an Acinetobacter junii SY-01 strain producing an extracellular lipase
enantioselectively hydrolyzing itraconazole precursor, and some properties of
the lipase. J Microbiol Biotechnol. 14(1): 97–10.
Yucel S, Terzioglu P, Ozcimen D. 2012. Biodiesel. Rijeka (HR): IntechOpen.
20

LAMPIRAN

Lampiran 1 Urutan basa nitrogen hasil analisis gen 16s rRNA isolat PAR1, PAR2,
dan PAR9

PAR1:
GACTTCTGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGATCGGCTT
TTTGAGATTAGCATCACATCGCTGTGTAGCAACCCTTTGTACCGACCAT
TGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGT
CGTCCCCGCCTTCCTCCAGTTTGTCACTGGCAGTATCCTTAAAGTTCCC
ATCCGAAATGCTGGCAAGTAAGGAAAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGA
CTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACC
TGTATCTAGATTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTTCTAGT
ATGTCAAGGCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACA
TGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAGTCT
TGCGACCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATCGCGTTAGCTGCGCCACT
AAAGCCTCAAAGGCCCCAACGGCTAGTAGACATCGTTTACGGCATGGA
CTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTACCTCAGC
GTCAGTATTAGGCCAGATGGCTGCCTTCGCCATCGGTATTCCTCCAGAT
CTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCATCCTCTCCCATA
CTCTAGCTTCCCAGTATCGAATGCAATTCCCAAGTTAAGCTCGGGGAT
TTCACATCCGACTTAAAAAGCCGCCTACGCACGCTTTACGCCCAGTAA
ATCCGATTAACGCTCGCACCCTCTGTATTACCGCGGCTGCTGGCACAG
AGTTAGCCGGTGCTTATTCTGCGAGTAACGTCCACTATCCAAGAGTAT
TAGTCTCAGTAGCCTCCTCCTCGCTTAAAGTGCTTTACAACCATAAGGC
CTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGGTTCCCCCCATTGTCCA
ATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCC
CAGTGTGGCGGATCATCCTCTCAGACCCGCTACAGATCGTCGCCTTGG
TAGGCCTTTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACTTAGGCTCATCTATTA
GCGCAAGGTCCGAAGATCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGT
ATTAGCATTCCTTTCGGAATGTTGTCCCCCACTAATAGGCAGATTCCTA
AGCATTACTCACCCGTCCGCCGCTAAGATA

PAR2:
TTATCTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTA
GTGGGGGACAACATTCCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTAC
GGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTA
AGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATC
TGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACG
GCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGG
GGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGT
TGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAGACTAATACTCTTG
GATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAG
CAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGC
GTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAAGTCGGATGTGAAATCCCCGAG
CTTAACTTGGGAATTGCATTCATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGAGAG
GATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAG
 21

GAATACCGATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAG
GTACGAAAGCRTGGGGAGCAAACASGATTAGATACCCTGGTAKTCCAT
GCCGTAAACGATGTCTACTAKCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGG
CGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA
CTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCAT
GTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATA
CTAGAAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACA
GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAG
TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACTTGCCAGCATTTCGGATGG
GAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACG
ACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACA
ATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACACAGCGATGTGATGCTAATCTCAA
AAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAG
TCGGAATC

PAR9:
TGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTCCGAAAGGGATG
CTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCT
TGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAA
GGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCC
ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTG
GGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGT
GTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGC
TACTGAGACTAATACTCTTGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGC
ACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAG
CGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTAA
GTCGGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACT
GGGAAGCTAGAGTATGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGG
TGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCAT
CTGGCCTAATACTGACGCTGATGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAG
GATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGT
TGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCG
CCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGG
GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTT
22

Lampiran 2 Kurva standar pNP

1,2

1 y = 14,804x - 0,0443
R² = 0,9982
Absorbansi (λ 405nm)

0,8

0,6

0,4

0,2

0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
pNP (µmol)

Lampiran 3 Urutan basa nitrogen hasil analisis kloning gen α/β hidrolase dengan
primer M13

ATGAACAGCGCGATAAAGGGGACAAACCTGACAGCATTACCTCACAA
AATTCAAACGATTTTAGATAAAGGACAAGGTACAGCTGCACGTGCATT
AGATAAACTTCCCAAAATAGTTCAAGAATCTCTCGCAAAAGTTTTAGG
TTATCCTTATCAATATCCTGACTTAGACGCCTTTACCAAGTGCTTAATG
GCGGTGCAAATTAAACAAGGGCGTATAGGGTTTATCGGGGAAGATCC
AATTGAATCACGCCGCCAGTTTGATGCACAAATGTTGGCTATCCTAAA
CAAAGCGACACAGATTGAATCGGTAGAAGACATTCGATTACCTTTACA
AAGTGGAACAGTCTTCGCTAGACATTATCATCCTGCACCCAATAAAAA
ACTACCTATGATCTTGTTCTATCATGGTGGTGGTTTTGTGGTTGGTGGA
TTGGATACTCATGATGAGGTGTGTCGACTCATTGCCAAATATGCCAAA
GTACAGGTATTAAGTATCGATTATCCACTTGCACCTGAAGCTTCTCCGC
AGCTTTTAATCAAATCATGTGAAGATGCATTAGCATGGGTCTATCAGA
ATCGTCGACAATTAAAGATTTATAAAAATAGAATTGCTGTTGCTGGTG
ATAGTGCAGGCGGAAATATCAGTACAGTCGTTGCACAACACACAGCTG
GTAAATCTTATGCTCCACAAGCTCAGTTACTTATATATCCAGTTGTAGA
CTTCAAAAGTAGACATCCATCATTTTATGCATATGGTGAAGGGTTGGT
ATTGACGAGTAAGGATGTTGATTATGTTACTCAGTATTATGCGACTCA
ACACAACATCGCTTTGGATAATCCACTGATCTCTCCAACCTATGGTAAT
TTGAGAAAGCTAGCACCTGCGTATGTTATTACAGCTGGGCATGACTTG
CTTCATGATGAAGGGGAAATTTACAGCCATAAATTGAGACAAAGTGG
AGTCAAAGTTCAATATGTAGATTATCCAGATCAAACACATGGATTTAT
CAATTTGACACCTATTTCTAGTAAGGCTAAGCGCAATACAATCGAAAT
 23

AGCCAAGAACTTTAGAAAATTTTGGGATAAGCATAGCTGATTCAAAAA
ATGCCAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATG
GGAGAGCTCCCAACGCGT

Lampiran 4 Urutan asam amino hasil analisis kloning gen α/β hidrolase dengan
primer M13

MNSAIKGTNLTALPHKIQTILDKGQGTAARALDKLPKIVQESLAKVLGYP
YQYPDLDAFTKCLMAVQIKQGRIGFIGEDPIESRRQFDAQMLAILNKATQI
ESVEDIRLPLQSGTVFARHYHPAPNKKLPMILFYHGGGFVVGGLDTHDEV
CRLIAKYAKVQVLSIDYPLAPEASPQLLIKSCEDALAWVYQNRRQLKIYK
NRIAVAGDSAGGNISTVVAQHTAGKSYAPQAQLLIYPVVDFKSRHPSFYA
YGEGLVLTSKDVDYVTQYYATQHNIALDNPLISPTYGNLRKLAPAYVITA
GHDLLHDEGEIYSHKLRQSGVKVQYVDYPDQTHGFINLTPISSKAKRNTIE
IAKNFRKFWDKHS*FKKCQITSEFAAACRSTIWESSQR
24

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 3 Desember 1996 dari ayah bernama
Wisnu Subroto dan ibu bernama Daryati. Penulis merupakan anak pertama dari tiga
bersaudara. Penulis menamatkan pendidikan SMA di SMA Negeri 1 Parung dan
melanjutkan pendidikan jenjang strata satu di IPB melalui jalur undangan
SNMPTN pada tahun 2014.
Penulis melaksanakan studi lapangan mengenai Struktur Anatomi Daun
Tumbuhan Mangrove di Pulau Handeuleum, Taman Nasional Ujung Kulon pada
tahun 2016. Penulis juga melaksanakan praktik lapangan di PT Super Unggas Jaya,
Kabupaten Purwakarta mengenai Manajemen Pakan dalam Perawatan Ayam
Broiler di PT Super Jaya Unggas pada tahun 2017.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi staf biro internal di
Badan Eksekutif Mahasiswa (BEM) FMIPA pada tahun 2016, ketua divisi
koordinasi kerohanian islam (Rotasi) FMIPA pada tahun 2017, dan menjadi
anggota kepanitiaan contohnya Masa Perkenalan Kampus Mahasiswa Baru
(MPKMB) 52 pada tahun 2015 dan Pesta Sains Nasional (PSN) sub Lomba Cepat
Tepat Biologi (LCTB) pada tahun 2016 dan 2017. Penulis juga merupakan asisten
praktikum Biologi Dasar pada tahun 2016 dan Mikrobiologi Dasar pada tahun 2016
dan 2017.