Optimasi fase gerak dan cara, serta pebedaan dari ketiga gambar

Optimasi fase gerak kromatografi kolom dengan KLT

Kromatografi lapis tipis menggunakan plat tipis yang dilapisi dengan adsorben seperti
silika gel, aluminium oksida (alumina) maupun selulosa. Adsorben tersebut berperan sebagai
fasa diam Fasa gerak yang digunakan dalam KLT sering disebut dengan eluen. Pemilihan eluen
didasarkan pada polaritas senyawa dan biasanya merupakan campuran beberapa cairan yang
berbeda polaritas, sehingga didapatkan perbandingan tertentu. Eluen KLT dipilih dengan cara
trial and error. Kepolaran eluen sangat berpengaruh terhadap Rf (faktor retensi) yang diperoleh.
Nilai Rf sangat karakterisitik untuk senyawa tertentu pada eluen tertentu. Hal tersebut dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya perbedaan senyawa dalam sampel. Senyawa yang
mempunyai Rf lebih besar berarti mempunyai kepolaran yang rendah, begitu juga sebaliknya.
Hal tersebut dikarenakan fasa diam bersifat polar. Senyawa yang lebih polar akan tertahan kuat
pada fasa diam, sehingga menghasilkan nilai Rf yang rendah. Rf KLT yang bagus berkisar antara
0,2 - 0,8. Jika Rf terlalu tinggi, yang harus dilakukan adalah mengurangi kepolaran eluen, dan
sebaliknya

Untuk menentukan fase gerak kromatografi kolom tergantung dengan polaritas sampel.
Jika senyawa dalam sampel diketahui, maka dapat menggunakan protokol pemisahan yang
sudah di publikasikan. Jika polaritas senyawa dalam sampel belum diketahui KLT dapat
digunakan untuk menentukan fase gerak yang sesuai. Cara mengelusi sampel dengan sistem
solven yang bervariasi, lalu dibandingkan profil kromatogramnya, lalu fase gerak dipilih dengan
ketentuan Rf senyawa berkisar 0,2-0.3. Fase gerak yang menghasilkan Rf senyawa paling tinggu
0,5 sebagai fase gerak awal, sedangkan fase gerak yang menghasilkan Rf senyawa paling rendah
0,2 sebagai fase gerak akhir.

Perbedaan :
 Fase yang pertama (initial mobile phase) adalah fase tetap atau stasioner dan fase yang
kedua adalah fase bergerak atau fase mobil. Fase bergerak lebih cenderung kepada
penahanan terhadap komponen sementara untuk fase mobil cenderung kepada melarutkan
campuran yang bersangkutan.
 Isocrotik mobie phase. Dengan adanya kecepatan migrasi yang berbeda, itu akan
membuat campuran yang terdiri atas beberapa komponen terpisah. Adapun komponen
yang terpisah tersebut merupakan rangkaian pita-pita di dalam fasa diam. Selanjutnya,
masing-masing pitanya akan dorong keluar dari kolom dengan ditambahkannya fasa
gerak
 Proses selanjutnya (Final mobile phase) adalah penampungan, pemisahan dan selanjutnya
ada proses identifikasi. Proses kromatografi juga mampu memisahkan campuran dalam
ukuran yang cukup besar bahkan mencapai berat 1 gram