PETUNJUK TEKNIS

PRAKTIKUM GINOGENESIS

Oleh

Ibnu Dwi Buwono

 GINOGENESIS

(1) Pengertian
Ginogenesis adalah proses pembentukan zigot tanpa kontribusi genetis
gamet ikan jantan, sehingga perkembangan embrio dikontrol oleh sifat-sifat induk
betina (maternal heridity). Agar sperma tidak menyumbangkan 1 set kromosom (1
N), maka sperma harus di inaktivasi menggunakan sinar UV (Ultra Violet) yang
berfungsi merusak kromosom sperma, namun tidak sampai mengganggu
pergerakan ekor sperma, sehingga sperma masih dapat berpenetrasi ke lubang
mikropil telur, tetapi tidak menyumbangkan kromosomnya ( sebagai triger atau
stimulan pembuahan telur).
Proses pembuahan telur di atas dapat berlangsung normal, apabila polar
bodi kedua (PB II) yang akan keluar ketika terjadi pemasukan sperma ke dalam
lubang mikropil telur dicegah agar tidak keluar dengan perlakuan kejutan
suhu panas (heat shock), sehingga PB II telur (1 N) akan masuk kembali ke dalam
inti sel telur (1 N) yang menghasilkan gamet Diploid (2 N) dan individu yang
terbentuk dari gamet tersebut adalah Betina (Gino). Pada Gambar 1 dan 2a dan 2
b disajikan mekanisme pembuahan telur secara normal dan secara induksi
ginogenesis.

Gambar 1. Mekanisme pembuahan telur dengan sperma ikan normal (gamet

diploid / 2 N)
Gambar 2a. Mekanisme Induksi pembuahan secara Ginogenesis Meiosis (Iradiasi
sperma; penahanan PB II sehingga gamet diploid 2 N)

Gambar 2b. Mekanisme Induksi pembuahan secara Ginogenesis Mitosis (iradiasi

sperma; iradiasi sperma ; kejutan suhu pada pembelahan 2 sel
pertama sehingga gamet diploid 2 N)

Ginogenesis memberikan manfaat besar dalam program breeding ikan.

Galur-galur inbred dapat dihasilkan dengan cara ginogenesis homosigot yang
hanya memerlukan dua generasi untuk memperoleh keturunan homosigot (galur
murni).
(2) Protokol Ginogenesis
Oleh karena keberhasilan ginogenesis, salah satunya terletak pada in
aktivasi sperma induk jantan agar tidak menyumbangkan kromosomnya, maka
dalam praktikum ini digunakan 2 jenis induk jantan yaitu (a) induk jantan dari ikan
komet (Cyprinus carpio auratus) dan (b) induk jantan dari ikan mas ( Cyprinus
carpio carpio).
Sebelum dilaksanakan perlakuan iradiasi dengan sinar UV, semua induk
jantan (ikan komet dan ikan mas) serta induk betina ikan komet disuntik terlebeih
dahulu dengan hormon Ovaprim. Dosis penyuntikan hormon Ovaprim berdasarkan
masing-masing berat 5 ekor induk betina komet. Sebagai pedoman untuk induk
ikan yang beratnya 1 kg, dosis pemberian Ovaprim yang digunakan sebanyak 0,5
ml. Atau dilakukan perhitungan praktisnya sebagai berikut :
~ diambil 0,5 ml hormon ovaprim ke dalam tube eppendorf 1,5 ml yang kemudian
diencerkan dengan menambahkan 1 ml Lar. NaCl physiologis lalu divorteks 1
menit agar homogen
~ volume campuran larutan tersebut (1,5 ml) di bagi menjadi 5, sehingga 1 kali
penyuntikan ke induk betina komet sebanyak 0,3 ml
~ oleh karena perlakuan ginogenesis memerlukan teknik pembuahan buatan,
maka diperlukan perlakuan stripping baik pada induk jantan dan betina, dalam
praktikum ini, penyuntikan ovaprim dilaksanakan rabu malam pk. 22-24.00 dan
hari kamisnya (pk 12.00) baru dilakukan stripping untuk perlakuan ginogenesis

a. Alat yang diperlukan :

 4 buah bak air fiber glass

 8 buah saringan plastik
 4 buah water heater
 aerator
 2 buah kotak stryrofoam
 spuit volume 1 ml dan 2,5 ml
 2 buah waterbath pemanas air
 termometer Celcius
 hand counter
 2 buah kotak radiasi
 4 buah lampu germicidal (sinar UV)
 1 buah vortex-moxer

b. Bahan yang diperlukan :

 8 buah petridish
 10 buah beaker glass
  2 buah Cawan proselen
 4 ekor induk jantan komet dan 4 ekor ikan mas jantan
 8 ekor induk betina komet
 tissue
 timbangan digital
 4 buah tube eppendorf 1,7 ml
 stop watch (timer)
 bulu ayam steril

c. Teknis pelaksanaan :

Sebelum dilakukan stripping pada induk ikan, terlebih dahulu dilakukan

persiapan penyediaan bak penetasan yang telah diisi air, disediakan saringan
untuk penetasan telur, disediakan heater untuk stabilisasi suhu air dan suplai
oksigen dari blower untuk penyediaan oksigen telur.
Demikian pula dilakukan pemeriksaan kotak radiasi beserta lampu UV
(kondisi aktiv) untuk perlakuan radiasi yangdiberikan pada sperma. Setiap
petridish dilabel untuk radiasi 0,5 menit ; 1 menit ; 1,5 menit dan 2 menit serta
digunakan perlakuan kontrol, yaitu sperma ikan yang tidak diradiasi UV.
Setelah kira-kira 12 jam penyuntikan induk betina dan jantan, dilakukan
terlebih dahulu stripping pada ikan komet jantan (dan ikan mas jantan) untuk
menampung milt (cairan berisi sperma ikan) ke dalam beaker glass. Dilakukan
pengenceran sperma sebanyak 100 x, caranya : ke dalam beaker glass diisikan
dulu 39 ml Lar. NaCl physiologis, kemudian ditambahkan 1 ml sperma ikan dan
sebelumnya telah diisi 10 ml NaCl physiologis.
Masing-masing petridish yang sudah dilabel diisikan sperma ikan dari
beaker glass sampai ketebalan sperma dalam petridish 1 mm, sambil digoyang-
goyang perlahan, kemudian diletakkan dalam permukaan kaca kotak radiasi dan
selanjutnya ditutup lalu lampu UV dinyalakan sesuai dengan lama perlakuan
radiasi pada masing-masing label.
Dengan segera dilakukan stripping pada induk komet betina, dan telur-
telurnya ditampung dalam wadah porselen, kemudian diambil telur-telur hasil
stripping diambil dengan sendok kecil untuk ditambahkan ke masing-masing
petridish untuk proses pembuahan buatan dengan waktu fertilisasi selama 1 menit
pada air bersuhu kamar Semua proses ini dilakukan secara serentak agar dapat
dilakukan kejutan suhu secara bersamaan pula.
Setelah busa styrofoam diisi air dan suhu air dipertahankan 40 0C dan
saringan-saringan plastik telah ditempatkan dalam styrofoam, maka setelah radiasi
sperma, segera telur-telur dalam petridish dipindahkan ke dalam saringan tersebut
untuk perlakuan kejutan suhu 40 0C selama 2 menit untuk memperoleh gamet
diploid 2 N yang semuanya individu betina.
Selanjutnya saringan plastik berisi telur-telur tersebut dipindahkan ke dalam
masing-masing bak fiber penetasan telur, dan dilakukan pengamatan kurang 1
jam untuk proses pembelahan sel, dan berikutnya dilakukan penghitungan derajat
pembuahan dan derajat penetasan telur.
 Induk ♂ Ikan Komet atau Mas

Stripping

beaker glass sperma 1 ml di + 39 ml NaCl

physiologyst
pengenceran 100 x
diisi dulu dengan 10 ml NaCl
physiologist

Petridish masuk
Kotak Radiasi

1 2 3 4 5 6 7 8

1 mm
ketebalan sperma
Radiasi sperma dengan sinar UV

Kelas A :
1 = radiasi 0,5 menit
2 = radiasi 1 menit
3 = radiasi 1,5 menit
4 = radiasi 2 menit
sisi
Kelas B :
5 = radiasi 0,5 menit sinar Ultra Violet
6 = radiasi 1 menit
7 = radiasi 1,5 menit
8 = radiasi 2 menit
Fertilisasi Buatan Berurutan sesuai dengan
selesainya radiasi sperma dan inkubasi 1 menit pada air 26 0C
♀ Komet
stripping
sperma radiasi 0,5 menit
sperma + telur diaduk
♀ sperma radasi 1 menit

♀ sperma radiasi 1,5 menit

♀
sperma radiasi 2 menit
 KEJUTAN SUHU 40 0C (HEAT SHOCK)
saringan telur

saringan
busa styrofoam
(diisi air suhu 40 0C)

LAMA KEJUTAN SUHU 2 MENIT

Pindahkan Saringan Telur ke Bak Fiber Penetasan Telur

saringan telur

saringan

Heater
STABILISASI SUHU AIR DLM Bak Fiber

PENGAMATAN DAN PENGHITUNGAN PEMBUAHAN DAN DERAJAT PENETASAN TELUR

Lampiran. Ringkasan Protokol Ginogenesis dan Triploidisasi

TEKNIK GINOGENESIS DAN TRIPLOIDISASI

SELEKSI INDUK MATANG GONAD (JANTAN DAN BETINA)

PENYUNTIKAN DENGAN PENGAMBILAN CAIRAN

HORMON OVAPRIM
(0,2 ML/KG) SECARA INTRA M
Dilakukan setelah ovulasi
(lubang genital terdapat telur)
dan bila dilakukan pijatan ke arah genital,
telur akan keluar dengan lancar
SPERMA
Bagian perut dipijit ke arah genital dengan
posisi di atas, akan keluar cairan
berwarna putih, kemudian disedot dengan
syringe/suntikan yang telah diisi larutan
Na-Physiol. Selanjutnya encerkan sampai
100 x dan dilakukan pengadukan

Telur Ditampung Pada Wadah Kering Isi Petridisch dengan ketebalan

sekitar 1 mm yang telah diencerkan
untuk setiap kelompok terdapat
5 petridisch. (1.unt.triploid 1 buah
2.unt.ginogenesis 2 buah dan 3.unt.
kontrol (tanpa perlak) 2 buah)

TELUR DISEBARKAN PADA SETIAP WADAH

(PETRIDISCH) SEBANYAK 1 SENDOK BER- GINOGENESIS
DASARKAN KELOMPOK Larutan Sperma pada petridisch
dipindahkan ke kotak radiasi
selama 2 menit

PROSES PEMBUAHAN
Campurkan sperma dengan telur untuk setiap petridisch dan aduk
secara merata dengan cara menggoyangkan petridisch ± 60 detik
pada air dengan suhu 26 0 C

Inkubasi telur masing-masing perlakuan pada saringan

di akuarium yang telah diisi air dan beri label

Ginogenesis dan Triploid

Kontrol Telur yang telah dibuahi didiamkan
Telur didiamkan pada wadah selama 2 menit. Telur yang ada pd
atau akuarium saringan diberi perlakuan heat shock
pada styrofoam dg suhu 39-400C
selama 2 menit
 Inkubasi Telur pada Akuarium pada Wadah Saringan

Perhitungan derajat pembuahan Pengamatan embriogenesis

Setelah 6 jam setelah inkubasi (perkembangan telur) sampai
menetas di bawah mikroskop
Telur yang dibuahi (warna bening) di dalam petridisch (3 perlakuan)
________________________________ x 100 % selama 24 jam

Telur yg tidak dibuahi (warna putih)

Usia Gambar Keterangan
Perkembangan
(jam)
1 jam Cleavage
2 jam Morula
3 jam Blastula
4 jam Gastrula
5 jam Organogenesis

PENGHITUNGAN DERAJAT PENETASAN

± 36 jam setelah Inkubasi

Telur yang menetas

___________________ x 100 %

Telur yang dibuahi

PENGHITUNGAN KELANGSUNGAN HIDUP

Setelah 2 minggu masa pemeliharaan

Total larva akhir

_________________ x 100 %

Telur yang menetas