UJI AKTIVITAS HIPERURISEMIA DAUN GATAL (Laportea

decumana(Roxb.) Wedd) DAN ANALISIS FILOGENETIK ASAL

PAPUA BARAT

PRPOSAL

OLEH
WIDYA VERONICHA SOUISA
NIM : 20160511064001

PROGRAM STUDI FARMASI

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS CENDERAWASIH
JAYAPURA
2019
 KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas
rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Proposal sebagai
Tugas Akhir I dengan judul “UJI AKTIVITAS HIPERURISEMIA DAUN
GATAL (Laportea decumana(Roxb.) Wedd) DAN ANALISIS
FILOGENETIK ASAL PAPUA BARAT”.
Dalam menyelesaikan proposal ini, penulis banyak memperoleh bantuan
dan bimbingan dari berbagai pihak untuk menyelesaikannya. Untuk itu, penulis
ingin menyampaikan ucapan terima kasih sebesar-besarnya, kepada Yth:

1. Dr. Apolo Safanpo, ST, MT., selaku Rektor Universitas Cenderawasih.

2. Dr. Dirk Y. P. Runtuboi, M.Kes., selaku Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Cenderawasih Jayapura.

3. Elsye Gunawan, M.Sc., Apt., selaku Ketua Program Studi Farmasi Jurusan
Farmasi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Cenderawasih.

4. Eva Susanty Simaremare, S.Si., M.Si., sebagai Dosen Pembimbing I yang telah
banyak memberikan arahan dan masukkan kepada penulis dalam penyusunan
proposal ini.

5. Hotma Martogi Lorensi Hutapea, M.Si, sebagai Dosen Pembimbing II yang

telah banyak memberikan arahan dan masukkan kepada penulis dalam
penyusunan proposal ini.

6. Seluruh Dosen Program Studi Farmasi Universitas Cenderawasih yang telah

banyak memberikan arahan dan masukkan kepada penulis dalam penyusunan
proposal ini.

7. Kedua orang tua dan saudara yang telah banyak memberikan doa dan dukungan
baik secara moril maupun materi kepada penulis sehingga dapat menyelesaikan
pembuatan proposal ini.

2
8. Seluruh teman-teman Farmasi Universitas Cenderawasih angkatan 2015
(Solution’s) yang telah banyak membantu dan mendukung penulis untuk
menyelesaikan pembuatan proposal tersebut.

9. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu dan telah
memberikan dorongan serta motivasi yang telah diberikan.

Penulis menyadari bahwa dalam penulisan proposal ini masih jauh dari
sempurna. Untuk itu, penulis mengharapkan kritik serta saran yang bersifat
membangun dalam pengembangan penulisan proposal ini. Penulis berharap
semoga proposal ini dapat bermanfaat bagi pembaca.

Jayapura, 2019

Penulis

3
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR.............................................................................................2
DAFTAR ISI............................................................................................................4
LEMBAR PERSETUJUAN....................................................................................8
BAB I PENDAHULUAN........................................................................................9
1.1 Latar Belakang..........................................................................................9
1.2 Rumusan Masalah...................................................................................11
1.3 Tujuan......................................................................................................12
1.4 Manfaat Penelitian...................................................................................12
BAB II TINJAUAN PUSTAKA............................................................................13
2.1.1 Klasifikasi Tanaman Laportea decumana (Roxb.) Wedd......................13
2.1.2Spesies Urtica dioica (Stinging Nettle)..................................................13
Gambar.1 penampang daun....................................................................................13
Laportea decumana................................................................................................13
2.1.3 Spesies Urtica urens...............................................................................14
2.1.4 Spesies Lain-lain....................................................................................14
Gambar 2. Gambar daun gatal spesies Urtica dioica.............................................14
Gambar 3. Gambar daun gatal spesies Urtica urens..............................................14
2.1.4 Deskripsi daun gatal (Laportea decumana (roxb.) Wedd)....................16
2.1.5 Kandungan dan manfaat........................................................................16
BAB III METODE PENELITIAN.......................................................................18
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian......................................................................18
3.2 Alat dan Bahan.............................................................................................18
3.3 Penentuan Lokasi / Titik Pengambilan Sampel............................................18
3.4 Prosedur Penelitian.......................................................................................18
3.4.1 Koleksi Sampel untuk analisis molekuler..............................................18
3.4.2 Ekstraksi DNA Daun Gatal...................................................................19
3.4.3 Analisis Kemurnian dan Konsentrasi DNA Total.................................20
3.4.4 Amplifikasi Gen (rbcl) Subunit Besar...................................................20
3.4.5 Elektroforesis.........................................................................................20
3.4.6 Pengurutan.............................................................................................20
3.4.7 Analisis Data..........................................................................................21
3.4.8 Penapisan Fitokimia...............................................................................21

4
3.4.9 Uji aktivitas penghambatan terhadap aktivitas xanthine in vitro oksidase
........................................................................................................................21
3.4.10 Identifikasi fraksi senyawa aktif..........................................................22

5
 LEMBAR PERSETUJUAN
Proposal dengan judul: ”UJI AKTIVITAS HIPERURISEMIA DAUN
GATAL (Laportea decumana(Roxb.) Wedd) DAN ANALISIS
FILOGENETIK ASAL PAPUA BARAT” oleh Widya Veronicha Souisa
telah diperiksa untuk disetujui.

Jayapura, 2019

Pembimbing I, Pembimbing II,

Eva Susanty Simaremare, S.Si., M.Si. Hotma Martogi Lorensi Hutapea, M.Si
NIP. 198309132012122001 NIP. 198411212010122002

6
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Di Indonesia banyak tanaman lokal yang dimanfaatkan sebagai obat
tradisional salah satunya yaitu tanaman daun gatal asal Papua atau dengan
sebutan nama latin Laportea decumana. (Heyne, 1987). Masyarakat Papua
terlebih khususnya lagimasyarakat pribumi yaitu Biak, Wamena, Sentani, dan
lain-lain, tanaman ini untuk mengatasi keluhan kesehatan seperti rasasakit, kaku
atau pegal, dan capek. Tumbuhan ini tumbuh di berbagai tempat baik di tepi
hutanmaupun di pekarangan atau ladang masyarakat (Yasni dan Puro, 2012).
Menurut pendapat Winduo 2013 daun gatal juga banyak tersebar luasdi hutan
primer, hutan sekunder atau disturb areas mulai dari Kalimantan, Sulawesi,
Maluku, dan Papua Nugini (Winduo, 2003)dan Maluku (Heyne, 1987).
Daun gatal dengan dengan sebutan nama latin Laportea decumana
merupakan tanaman yang bentuk daunnya bergerigi dan memiliki bulu-bulu halus
di sepanjang daun dan batang. Tanaman daun gatal memiliki spesies yang
berbeda-beda di antaranya yaitu Laportea aestuan (Okereke and Elekwa, 2014),
L. ovafolia (Nzeugeumet al., 2015), L. interrupta (Njina et al., 2006; Tchinda et
al., 2017), L. canadiensis (Reauma, 2010; Tuberville et al., 2007), biasanya juga
dimanfaatkan di negara-negara lain seperti di Nigeria, Kamerun, Filipina
(Oloyede and Oyelola, 2013; Oloyede, 2016), Bangladesh, Sri Langka, India
(Khan et al., 2007), dan beberapa negara di Eropa.
Tanaman ini kebanyakan berasal dari tanaman yang bersemak-semak,
tumbuhan daun gatal memiliki tinggi yang dapat tumbuh hingga mencapai 2
meter(Winduo, 2003).Tumbuhan daun gatal adalah sejenis tanaman perdu yang
berasal dari family Urticaceae dimana jika dioleskan ke seluruh tubuh akan
menimbulkan efek yang sangat gatal. Setelah sensasi gatal selama 5 menit, maka
efeknya akan bekerja dengan sangat mujarab.Tanaman ini sangat efektif karena
memiliki senjata berupa rambut atau bulu-bulu kaku (trikoma) yaitu asam format
yang dipercayai secara turun temurun jika dioleskan pada bagian tubuh yang sakit,
pegal, kaku, nyeri akan segera sembuh. Ketika trikoma dioleskan di bagian tubuh,

7
maka asam format akan keluar dari trikoma dengan proses enzimatis. Asam
format akan memperlebar pori-pori darah sehingga darah lancar mengalir dan
mekanisme ini lah yang mengurangi rasa nyeri dan capek pada badan atau otot
(Simaremare dkk, 2014; Simaremare dkk, 2015).
Masyarakat adat Papua memanfaatkan tanaman ini sebagai
makanan,papan dan obat-obatan. Skrining fitokimia DNA memberikan gambaran
tentang golongan senyawa yang terkandung di dalam tanaman, hasil penelitian
dari daun gatal menunjukkan bahwa laportea Decumana (Roxb) Wed
menghasilkan hasil yang positif untuk alkaloid,glikosida, steroid atau triterpenoid
dan hasil negatif dari daun gatal yaitu untuk saponis, flavonoid dantanin.
(Simaremare dkk, 2014) Beberapa masyarakat di Indonesia sangat percaya dan
mempraktekkan cara pemakaian daun gatal untuk kesembuhan. Daun gatal
memiliki tipe yaitu daun lebar yang digunakan untuk memukul mukul pada
bagian yang nyeri dengan tingkat kesakitan yang tinggi, sedangkan daun gatal tipe
daun kecil hanya untuk diusap-usapkan pada bagian yang capek (Simaremare dkk,
2017). Daun ini merupakan tanaman endemik Papua yang sudah digunakan secara
tradisional secara turun-temurun dan sangat bermanfaat sekali untuk masyarakat
di Papua.
Daun gatal dengan tipe morfologi yang daunnya kecil ternyata tidak dapat
dimanfaatkan sebagai obat atau khasiat seperti yang diharapkan. Biasanya
masyarakat Wamena menggunakan daun yang besar untuk mengobati rasa capek.
Berdasarkan hasil survei pada tahun 2014, tumbuhan daun gatal yang dari
Genyem memiliki daun putih besar dan kecil. Ada juga yang berdaun lebar dan
berdaun kecil. Ternyata daun gatal berdaun lebar memiliki bulu atau trikoma yang
lebih banyak, tingkat iritan yang tinggi, dan efektif digunakan sebagai obat
dibandingkan dengan daun kecil. Daun gatal yang berasal dari Biak justru berbeda
dengan daun gatal yang berasal dari Genyem daunnya lebih lebar dan tingkat
iritannya sangat efektif sekali.Oleh karena itu, berdasarkan informasi dari
masyarakat Papua dan tim penelitian daun gatal (Laportea decumana)
sebelumnya, ternyata daun gatal yang tersebar di hutan-hutan tropis Papua
ternyata bukan dari spesies yang sama. Daun-daun gatal yang ada di Genyem
Kabupaten Sentani, Wamena, Biak Papua Barat mempunyai morfologi daun,

8
batang, bulu, iritan bulu yang ternyata berbeda-beda sehingga kemungkinan di
berbagai tempat lain juga memiliki suku dan marga yang mungkin berbeda pula.
Asam urat merupakan produk akhir dari metabolisme purin dari senyawa 7
dalam tubuh yang kemudian diekskresikan melalui urin, tinja dan keringat.
Kelebihan asam urat dalam darah (Hiperurisemia) menyebabkan asam urat
mengendap di persendian dan menyebabkannya radang sendi (gout). Prevalensi
asam urat (gout) telah meningkat dalam beberapa tahun terakhir. Prevalensi gout
di Amerika bahkan mencapai 4% dari total populasi 8. Sementara di Indonesia,
diperkirakan mencapai 1,6-13,6 per seratus seribu orang. Prevalensi ini meningkat
dengan bertambahnya usia. Jika kondisi ini dibiarkan tidak diobati akan
menyebabkan risiko penyakit seperti radang sendi (gout), hipertensi, diabetes
mellitus dan gagal ginjal 9. Salah satu kondisi yang dapat menurunkan kadar asam
urat dalam tubuh adalah kekurangan serta penghambatan enzim xanthine oksidase
dalam pembentukan asam urat, seperti pemberian allopurinol dari obat-obatan
tertentu yang telah digunakan sebagai obat yang efektif untuk gout.
Allopurinol adalah obat yang berguna untuk mengobati asam urat, tetapi
jika digunakan dalamwaktu yang lama dengan dosis yang tinggi memiliki
beberapa efek samping yang merugikan, seperti reaksi alergi, gangguan
pencernaan, depresi sumsum tulang dan anemia aplastik. Oleh karena itu, perlu
untuk menemukan senyawa yang memiliki penghambatan aktivitas Xanthine
Oksidase dan efek samping moderat yang berasal dari produk alami. Salah
satunya adalah A. marina yang secara tradisional telah digunakan sebagai obat
oleh 8 6. 11 20 orang asam urat. Namun, dasar ilmiah pemanfaatan mangrove A.
marina sebagai obat asam urat belum dilaporkan. Dalam kesempatan ini akan
dilaporkan suatu senyawa dalam fraksi aktif eksudat A. marina. Tujuan dari
penelitian ini adalah untuk menjelaskan struktur kimia fraksi konstituen aktif
sebagai xanthine oxidase inhibitor dari A. marina exudate.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang maka rumusan masalahnya adalah :
1. Apakah uji aktivitas daun gatal (Laportea decumana) memiliki aktivitas
terhadap filogenetik?

9
 2. Apakah hubungan uji aktivitas Hiperurisemia memiliki aktivitas terhadap
daun gatal (Laportea decumana)?
1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah di atas, maka tujuan dari penelitian adalah :
1. Mengetahui uji aktivitas tumbuhan daun gatal (Laportea decumana)yang
ada di ProvinsiPapua Barat secara Filogenetik.
2. Mengetahui pengaruh Hiperurisemia terhadap daun gatal (Laportea
decumana)
1.4 Manfaat Penelitian
Adapun manfaat dari penelitian ini adalah :
1. Instansi
Sebagai kajian ilmiah dari penemuan obat Hiperurisemia dari daun
gatal (Laportea decumana) yang baru dan juga sebagai DNA
filogenetik.
2. Masyarakat
Memberikan informasi aktivitas daun gatal (Laportea decumana)
terdahap uji aktivitas Hiperurisemiasecara analisis senyawa DNA
filogenetik.
3. Peneliti

Mendapatkan wawasan ilmu pengetahuan tentang metodepengujian

aktivitas Hiperurisemia daun gatal (Laportea decumana (Roxb.)
Wedd) dan sebagai analisis senyawa DNA filogenetik sehingga dapat
menjadi dasar untuk penelitian selanjutnya

10
 BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Deskripsi Dan Tata Nama
2.1.1 Klasifikasi Tanaman Laportea decumana (Roxb.) Wedd
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Class : Magnoliopsida
Ordo : Urticales
Suku : Urticaceae
Gambar.1 penampang daun Laportea decumana
Marga : Laportea
Jeni :Tanaman Laportea decumana. (Yasni dan Puro, 2012).
Laporteadecumana(Roxb.) Wedd merupakan tumbuhansemak-semak,sub-
semak atau tanaman tinggi yang banyak ditemui di daerah Indonesia bagian
Timur. Tanaman ini memiliki batang yang banyak dan lunak, rapuh, bercabang
dengan baik (wellbranched) dan memiliki senjata berupa rambut panjang dan
kaku yang tersusun rapatdan iritan. Habitat tumbuhan ini pada tempat yang teduh
dan tumbuh dengan baik pada daerah basah tapi dengan tanah yang kering (WHO,
2009).

2.1.2Spesies Urtica dioica (Stinging Nettle)

Stingging Nettle adalah tumbuhan semak dengan tinggi 0,5-3m
(Reauma,2010) yang terdapat di bagian utara pantai San Fransisko. Tumbuhan ini
memiliki bunga berwarna ungu kecoklatan yang berbunga pada bulan april-
oktober. Jarum atau bulu tersebar di daun dan batang. Di Eropa jenis ini
digunakan sebagai obat herbal, obat diuretic, penetral asam, antiinflamantori,
penurun stress (http://plants.montara.com/ListPages/FamPages/Urtica.html).
Bubuk daun tanaman ini memiliki klrorofil yang tinggi, protein, mineral. Diklim
lebih makanan hijau yang efektif melebihi ganggang atau alga dan lebih murah
(Harrison, 2009).

11
Klasifikasi tanaman ini:
Kingdom : Plantae
Divisi : Angiospermae
Kelas : Rosids
Ordo : Rosales
Gambar 2. Gambar daun gatal spesies
Suku : Urticaceae
Urtica dioica
Marga : Urtica
Jenis : Urtica urens
2.1.3 Spesies Urtica urens
Urtica urens dikenal orang dengan sebutan jarum kecil, jarum anjing, dan jarum
pembakar. Banyak ditemukan di Eurasia, Amerika Utara, dan New Zealand. DI
New Zealand tanaman inisebagai bahan makanan untuk kupu-kupu
http://en.wikipedia.org/wiki/Urtica_urens.
Klasifikasi tanaman ini:
Kingdom : Plantae
Divisi : Angiospermae
Kelas : Rosids
Ordo : Rosales
Suku : Urticaceae
Marga : Urtica Gambar 3. gambar
Jenis : Urtica urens daun gatal spesies
Urtica urens
2.1.4 Spesies Lain-lain
Sejumlah besar spesies yang memiliki genus yang sama dengan ketiga spesies di
atas.
Beberapa spesies ini masih terus diperbaiki sebagai sub spesies, diantaranya
1. Urtica angustifolia Fisch Hornem. Cina, Jepang, Korea
2. Urtica ardens Cina
3. Urtica aspera Petrie South Island, New Zealand
4. Urtica atrichocaulis Himalaya, Asia Tenggara Ciina
5. Urtica atrovirens, Bagian Eropa Barat
6. Urtica australis Hook.f. Pulau Selatan, New Zealand dan mengelilingi pulau
subantartika

12
7. Urtica cannabina L., Asia Barat dari Siberia sampai ke Iran
8. Urtica chamaedryoides (heartleaf nettle), Amerika Selatan Utara
9. Urtica dioica L. 1753 (stinging nettle atau bull nettle), Erope, Asia, Amerika
utara
10. Urtica dioica subsp. galeopsifolia Wierzb. ex Opiz (fen nettle or stingless
nettle), Eropa.
(Terkadang diperlakukan masuk Urtica galeopsifolia.)
11. Urtica dubia (large-leaved nettle), Kanada
12. Urtica ferox G.Forst. (ongaonga or tree nettle), New Zealand
13. Urtica fissa Cina
14. Urtica gracilenta (mountain nettle), Arizona, New Meksiko, Teksas Barat,
Mexico utara
15. Urtica hyperborea Himalaya dari Pakistan ke Bhutan, Mongolia dan Tibet,
high altitudes
16. Urtica incisa Poir (scrub nettle), Australia, New Zealand
17. Urtica kioviensis Rogow. Eropa Barat
18. Urtica laetivirens Maxim. Jepang, Cina Utara
19. Urtica linearifolia' (Hook.f.) Cockayne (creeping or swamp nettle), New
Zealand
20. Urtica mairei Himalaya, Cina Tenggara, India Utara, Myanmar
21. Urtica massaica Afrika
22. Urtica membranacea Bagian Mediterranean, Azores
23. Urtica morifolia Canary Islands (endemic)
24. Urtica parviflora Himalaya (lower altitudes)
25. Urtica peruviana D.Getltman Perú
26. Urtica pseudomagellanica D.Geltman Bolivia
27. Urtica pilulifera (Roman nettle), Eropa Selatan
28. Urtica platyphylla Wedd. Cina, Jepang
29. Urtica procera Mühlenberg (tall nettle), Amerika Utara
30. Urtica pubescens Ledeb. Russia Timur Laut ke Asia Tengah
31. Urtica rupestris Sicily (endemik)

13
32. Urtica sondenii (Simmons) Avrorin ex Geltman Eropa Tenggara, Asia
Tenggara
33. Urtica taiwaniana Taiwan
34. Urtica thunbergiana Jepang, Taiwan
35. Urtica triangularisa
36. Urtica urens L. (small nettle atau annual nettle), Eropa, Amerika Utara.
2.1.4 Deskripsi daun gatal (Laportea decumana (roxb.) Wedd)
Tanaman ini memang berasal dari timur Indonesia tepatnya Papua dan
Maluku. Daun gatal sendiri termasuk dalam keluarga tanaman perdu (Urticaceae)
dan termasuk dalam spesies Laportea decumana (Roxb.) Wedd(Rudiyanto, 2015).
Daun gatal Merupakan tumbuhan herbal musiman, monoecious , berupa
semak tinggi 2 m. Batang berkayu, kayu lunak, kaku dan mudah pecah, bercabang
bagus , lengan cabang padat dan panjang, kaku tidak mudah dibengkokkan,
mengandung trikoma yang bersifat iritan, khususnya pada bagian pucuk. Stipula
dan tangkai daun kelihatan sangat jelas. Helaian daun panjang 20-25 cm lebar 6-
18 cm, bangun daun oval, jarang yang jorong; daun kasar berkerut-kerut, terdapat
trikoma iritan yang padat pada kedua permukaan, terlebih pada bagian permukaan
bawah; bagian basal membulat atau seperti jantung; ujung daun panjang
meruncing, tepi daun bergerigi-bergigi, stipula panjang 2 cm, semi jamak, warna
terang, stigma panjang 3 mm, bunga jantan antar bunga , bractea lebih panjang
dari bunga jantan.Habitat penyebarannya. Hidup subur di daerah naungan dan
tumbuh baik di tempat basah atau di daerah yang curah hujannya cukup.
Menyebar hampir di seluruh wilayah Papua dari dataran rendah sampai di dataran
tinggi[ CITATION WHO09 \l 1057 ].
2.1.5 Kandungan dan manfaat
Daun gatal (Laportea decumana (Roxb.) Wedd) dapat digunakan
untukmengobati sakit nyeri/pegal pegal karena lelah bekerja, perjalanan jauh,
salah urat, sakit pinggang, rematik, sakit kepala, sakit perut, dara tinggi, dan
demam. Cara menggunakannya dengan menggunakan daun gatal 5-10 lembar
daun, lalu dioleskan atau digosok pada bagian yang merasa sakit atau nyeri. Kalau
sakitnya lebih parah bisa digunakan sampai 10-15 lembar daun. Cara menggosok
atau mengoles harus satu arah tidak boleh bolak balik atau dari arah yang lainnya.

14
Permukaan bagian bawah daun, yang mempunyai bulu-bulu digosok atau dioles
berulang-ulang pada bagian yang pegal atau sakit sampai daun-daun tersebut
hancur. Selanjutnya akan terasa gatal sekitar 2-3 menit dan timbul bintik-bintik
kecil yang dapat bertahan sekitar 30-60 menit kemudian rasa nyeri atau pegal
akan hilang dan tubuh terasa lebih nyaman kembali. Khusus untuk sakit panas
daun ditempelkan dan diikat kemudian biarkan sampai rasa sakit hilang.
Penggunaan secara tradisional. Daun seperti jelatang digunakan secara
ekternal untuk meringankan nyeri badan, capek pegal-pegal, sakit kepala, sakit
perut, nyeri persendian tulang dan memar. Daun dengan sisi permukaan bawah
ditempelkan, ditekankan atau ditepukkan pada bagian yang nyeri atau sakit. Ada
juga daun gatal digosokkan pada area yang sakit dengan sensasi seperti sengatan
pada akhirnya menjadi mati rasa dan dapat dikembangkan sebagai anestesia. Daun
yang digosokkan pada dada dapat digunakan untuk mengatasi asma. Bagi
penderita malaria daun gatal pukul-pukulkan pada seluruh badan sehingga rasa
nyengat dan panas menyebabkan badan berkeringat dan hangat sehingga
meringankan penderita malaria. Mengandung senyawa kimia golongan alkaloid,
glikosida, triterpenoid dan asam formiat[ CITATION Chr16 \l 1057 ].
Bila salah menggosok atau menggunakan daun gatal akan menimbulkan
bengkak-bengkak, atau bintik-bintik merah, dibagian permukaan kulit manusia
seperti dipaha, bahu, punggung, pinggang, ketiak atau bagian lainnya. Khusus
untukjenis daun gatal akan menyebabkan pembengkakannya lebih parah lagi
walaupun hanya penggunaan satu daun dapat menyebabkan benjolanseperti luka
terbakar yang diikuti demam selama 1-2 hari [CITATION Mom12 \l 1057 ].
Menghilangkan rasa pegal-pegal di badan. Daun gatal dipakai dengan cara
menggosokan daun gatal secara langsung pada bagian tubuh yang terasa pegal dan
nyeri. Untuk menghilangkan rasa pusing di kepala, daun gatal dapat digunakan
dengan cara menempelkan daun di kening lalu dapat dilepaskan jika sudah merasa
ringan dan lebih baik (Rudiyanto, 2015).

15
 BAB III
METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan selama 6 bulan dari Juni sampai dengan November di
laboratorium Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Papua.
3.2 Alat dan Bahan
1. Alat
Alat yang digunakan adalah mortar steril, mikrocentrifuga, mesin thermocycler
simpliamp (appiled biosystem), gell doc (biocard) timbangan analitik, mikro
pipet, laminar air flow (LAF), biosafety cabinet (BSC), fluorometer
(qubit),waterbath, tanki, power supply, well comb, genetic analyzer 3500, septa,
optical 96 well plate, corong pemisah, beker gelas, erlenmeyer, cawan petri, oven,
penggaris dan alat tulis, pipet tetes, batang pengaduk, pinset, vortex.
2. Bahan
Bahan tumbuhan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun gatal (Laportea
decumana (Roxb.) Wedd). KIT ektraksi DNA genom tumbuhan, KIT PCR ready
mix (promega), DNA ladder 100 bp dan loading dye (qiagen),agarosa powder
(serbuk agarosa), dye (invitrogen), pewarna gel, buffer TAE1X (invitrogen),
buffer ABC (applied biosystem), buffer CBC (applied biosystem,) Applied
Biosystem (POP 7), KIT fluorometer (qubit), aquadest.
3.3 Penentuan Lokasi / Titik Pengambilan Sampel
Lokasi yang ditentukan sebagai pengambilan sampel dibuat berdasarkan kota atau
kabupaten. Terdapat di Empat tempat Provinsi Papua Barat yaitu (Manokawari,
Sorong, Maybrat, Serui ).
3.4 Prosedur Penelitian
3.4.1 Koleksi Sampel untuk analisis molekuler
Sampel daun gatal dari empat tempat Provinsi Papua Barat diambil dan di
masukkan ke dalam plastik klip untuk keperluan ekstrak DNA. DNA diekstrkasi
menggunakan KIT ekstraksi DNA genom tumbuhan sehingga di peroleh DNA
yang murni.

16
 3.4.2 Ekstraksi DNA Daun Gatal
Tahap Persiapannya yaitu Sampel daun gatal dicuci menggunakan aquadest
hingga bersih, setelah itu tambahkan etanol kemudian dibiarkan selama etanol
menguap. Potong jaringan daun gatal sebanyak 50-100 mg daun yang masih segar
Menggerus daun gatal menggunakan mortar steril sehingga menjadi serbuk
kemudian pindahkan pada tabung microcentrifuge dengan ukuran 1,5 mL. Lalu
tambahkan sebanyak 400 μl buffer GP1 atau buffer GPX1 sebanyak 5 μl. Rnase A
pada sampel dalam tabung kemudian dicampurkan dengan vortex, lalu inkubasi
pada suhu 60° C selama 10 menit. Selama inkubasi tabung digoyang atau dikocok
perlahan setiap 5 menit dalam waktu pre-heat elution buffer (200 μl per sampel)
dengan suhu 60° C. Tambahkan sebanyak 100 μl buffer GP2 dan campurkan
dengan vortex kemudian inkubasi mengunakan es (gunakan papan es yang ada di
referigrator) selama 3 menit. Letakkan filter kolom dalam collection tube
berukuran 2 ml kemudian pindahkan campuran dalam filter kolom. Setelah
disentrifuse selama 1 menit sebanyak 1000 g kemudian angkat filter kolom.
Setelah itu pindahkan dengan hati-hati supernatan dari collectiontube pada tabung
microsentrifuse dengan berukuran 1,5 ml yang baru. Tambahkan 1,5 volume
buffer GP3 kemudian divortex dengan cepat selama 5 detik (e.g. tambahkan 750
μl pada 500 μl lysate). Letakkan GD kolom pada tabung collectiontube dengan
ukuran 2 ml. Pindahkan 700 μl campuran. Pada GD Kolom. Sentrifuse pada 14-
16000 g selama 2 menit. Kemudian angkat GD kolom dan letakkan balik pada
tabung collection tube dengan ukuran 2 ml. Tambahkan sisa campuran pada GD
kolom kemudian sentrifuse pada 14-16000 g selama 2 menit. Lalu angkat GD
kolom dan letakkan balik pada tabung collection tube 2 ml. Tambahkan sebanyak
40 μl buffer W1 pada GD kolom kemudian sentrifuse pada 14-16000 g selama 30
detik. Angkat GD kolom dan letakkan balik pada tabung collection tube 2 ml.
Tambahkan 600 μl Wash buffer pada GD kolom. Sentrifuse pada 14-16000 g
selama 30 detik. Angkat GD kolom dan letakkan balik pada tabung collection
tube 2 ml. Sentrifuse selama 3 menit pada 14-16000 g untuk mendapatkan matrix
kolom yang kering. Setelah itu pindahkan GD kolom kering pada tabung
mikrosentrifuse 1,5 baru. Tambahkan 100 μl pre-heatedelution buffer (TE) pada
bagian tengah dari kolom matrix. Biarkan selama 3-5 menit untuk memastikan

17
elution buffer (TE) diserap sempurna. Sentrifuse pada 14-16000 g selama 30 detik
untuk purifikasi DNA. Kemudian ekstrak DNA di simpan di dalam freezer.
3.4.3 Analisis Kemurnian dan Konsentrasi DNA Total
Konsentrasi atau kemurnian DNA di peroleh dengan teknik spektofotometri
menggunakan alat nano-spekrofotometer. Kemurnian DNA dapat dilihat dengan
nilai rasio A260/A280 anatara 1,8-2,0 nm. Apabila >2,0 sama dengan
terkontaminasi dengan RNA.
3.4.4 Amplifikasi Gen (rbcl) Subunit Besar
Amplifikasi gen rbcL dari daun gatal dilakukan dengan teknikPolymerase Chain
Reaction(PCR) dengan kondisi yang akan dioptimasi hingga fragmen DNA yang
diperoleh spesifik dan tunggal. Primer yang digunakan adalah rbcLaF (5'-
ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC-3 ') (Levin et al. 2003) dan rbcLaR
(5'-GTAAAATC AAGTCCACCRCG-3 ’) (Kres et al. 2009). Reagen PCR adalah
kit campuran Go-Taq-Green Master,Promega. Reaksi PCR dilakukan dalam
volume total 50 μL, yang terdiri dari 18μL ddH2O, 25 μL campuran master Go-
Taq-Green, 2.5 μL primer rbcLaF, 2.5 μL dariprimer rbcLaR, dan 1 μL ekstrak
genom DNA. Profil suhuMesin PCR adalah 80˚C selama 10 detik, 94˚C selama 2
menit, kemudian diikuti oleh 35siklus dengan 3 langkah yaitu (94˚C selama 30
detik, 50˚C selama 30 detik dan 72˚C untuk1 menit), ekstensi terakhir pada 72˚C
selama 5 menit, kemudian ditutup dengan 37˚C untuk satumenit.
3.4.5 Elektroforesis
Visualisasi produk PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1%
denganpenyangga natrium borik dan tegangan 100 V selama 30 menit. Setiap
sumur terdiri dari 4 μLProduk PCR dan 1 μL pemuatan pewarna. Sebagai
penanda, tangga DNA Generuller 1 Kb(Thermoscientific) digunakan. Sekarat
DNA dilakukan dengan merendamnyagel pada larutan etidium bromida selama 20
menit dan visualisasikan dengan UV-transilluminator.Gel itu didokumentasikan
oleh kamera digital.
3.4.6 Pengurutan
Pengurutan gen rbcl dilakukan oleh dideoxy termination sanger, proses dilakukan
oleh layanan Balai Penelitian Dan Pengembangan Kesehatan Papua.

18
 3.4.7 Analisis Data
Urutan gen rbcL adalah proof read dengan electropherogram dengan MEGA10
perangkat lunak. Alat penyelarasan pencarian dasar lokal (BLAST) dari NCBI
digunakan untukbandingkan data kami dengan data GenBank (NCBI). Analisis
pohon filogenetik(tetangga bergabung dan kemungkinan maksimum) dibuat
dengan perangkat lunak MEGA 10.Dukungan bootstrap di setiap cabang dihitung
dengan metode bootstrap dengan1000 replikasi.
3.4.8 Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia dilakukan sesuai dengan metode yang dikembangkan oleh
Harborne 13 dan Farnsworth 14. Ekstraksi dan fraksinasi:Eksudat kering maserasi
A. marina dengan etanol 3 × 24 jam. Filtrat yang diperoleh dipekatkan
menggunakan rotary vacuum evaporator untuk mendapatkan ekstrak etanol kental.
Ekstrak etanol fraksinasi lebih lanjut diperoleh dengan pelarut n-heksana, etil
asetat dan metanol menggunakan Vacuum Liquid Chromatography (VLC) fase
diam gel silika fase H60. Kemudian setiap eluen yang diperoleh dikonsentrasikan
dengan rotary evaporator vakum.
3.4.9 Uji aktivitas penghambatan terhadap aktivitas xanthine in vitro
oksidase
Tahap persiapan:
Uji aktivitas penghambatan terhadap xanthine oxidase Res. J. Med. Tanaman, 11
(1): 19-24, 2017 aktivitas in vitro dilakukan dengan metode spektrofotometri
berdasarkan prosedur. Satu larutan uji mililiter ditambahkan ke 2,9 mL buffer
kalium fosfat 0,05 M (pH 7,5). Campuran ditambah 0,1 mL xanthine oksidase
(0,1 U mLG 15,16 dalam buffer fosfat pH 7,5) dan dilakukan pra-inkubasi pada
25EC selama 15 menit. Campuran kemudian ditambahkan 2 mL xanthine 0,15
mM dan diinkubasi pada 25EC selama 30 menit. Setelah inkubasi, campuran
segera ditambahkan 1 mL HCl 1 N untuk menghentikan reaksi. Absorbansi UV
mengukur campuran pada panjang gelombang 290 nm. Satu unit aktivitas
xanthine oksidase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk
menghasilkan 1 mmol asam urat per menit pada suhu 25EC. Aktivitas xanthine
oksidase dinyatakan sebagai persen penghambatan xanthine oksidase yang
dihitung dengan menggunakan persamaan: persen penghambatan: rumus dimana,

19
A adalah absorbansi aplikasi (tanpa menambahkan sampel), B adalah kontrol
aplikasi absorbansi (tanpa menambahkan sampel dan enzim), C adalah sampel
absorbansi dan D adalah kontrol sampel absorbansi (tanpa menambahkan enzim).
3.4.10 Identifikasi fraksi senyawa aktif
Fraksi paling aktif terhadap penghambatan xanthine oksidase diidentifikasi
menggunakan kromatografi lapis tipis dengan bintik-bintik yang dikembangkan
oleh Wagner dan Bladt dan kromatografi lapis tipis preparatif murni yang
dimurnikan. Karakterisasi isolat menggunakan spektrofotometer UV-vis dan
FTIR.

20