LAPORAN MANDIRI KOASISTENSI DIAGNOSA LABORATORIK

Infeksi African Swine Fever pada Babi (Sus scrofa)

Disusun oleh :
Desqi Vigia Anggis Dwimantara
20/458146/KH/10516

Dosen Pembimbing :
Dr. drh. A.E.T.H. Wahyuni, M.Si.

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN

UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2020
 Kajian Mikrobiologi
African Swine Fever
Etiologi
ASF disebabkan oleh virus DNA dengan untai ganda dari genus Asfivirus
dan famili Asfarviridae dengan morfologi icosahedral, memiliki ukuran 170 – 194
kbp, sitoplasmik dan beramplop. Virus ASF hanya memiliki satu serotipe meskipun
terdapat 23 genotipe dengan virulensi yang bervariasi. Virus ASF sangat tahan
terhadap pengaruh lingkungan, dan stabil pada pH 4-13, serta dapat tahan hidup
dalam darah (40C) selama 18 bulan, dalam daging dingin selama 15 minggu, dalam
daging beku selama beberapa tahun, dan di dalam kandang babi selama 1 bulan.
Virus ASF merupakan virus yang sangat unik, hidup dalam makrofag darah sehingga
antibody yang ditimbulkan tidak cukup untuk menetralkan virus sehingga
penggunaan vaksin masih belum efektif (Sendow et al., 2020).

Gambar 1. Struktur Virus ASF (Beltran-Alcrudo et al.,2017).

Patogenesis
Rute infeksi utama adalah melalui saluran pernapasan bagian atas, dan
replikasi virus awal terjadi dalam waktu 24 jam setelah infeksi di tonsil faring dan di
jaringan limfoid yang mengeringkan mukosa hidung. Viremia mengikuti, dan virus
mempengaruhi endotel vaskular dan menyebabkan limfopenia, diikuti
trombositopenia. Setelah beberapa hari, lesi endotel melibatkan membran basal dan
kematian biasanya menyusul karena edema paru. ASFV bereplikasi terutama di
monosit dan makrofag tetapi replikasi juga terjadi di berbagai sel lain seperti
megakariosit, sel endotel, sel epitel mesangial dan tubular glomerulus, hepatosit, sel
retikulum-epitel timus, fibroblas, sel otot polos venula dan arteriol. Gambaran
histopatologi yang paling mencolok dari ASF adalah karioreksis masif di jaringan
limfoid, sering disertai dengan perdarahan dan koagulasi intravaskular diseminata.
Babi yang terinfeksi ASF umumnya menderita limfopenia parah, yang terjadi selama
fase tengah awal penyakit. Limfopenia dikaitkan dengan apoptosis limfosit.
Perdarahan disebabkan oleh sitokin dan mediator lain yang dilepaskan oleh makrofag
yang terinfeksi, mengakibatkan aktivasi kaskade pembekuan dan koagulasi
intravaskular diseminata. Trombositopenia dikaitkan dengan konsumsi trombosit
karena koagulopati atau sebagai efek langsung virus pada megakariosit dan
umumnya diamati pada fase akhir penyakit akut. Kerusakan makrofag secara masif
juga memainkan peran utama dalam gangguan hemostasis (Ganowiak, 2012).
ASFV memasuki sel inang melalui proses kompleks yang melibatkan
endositosis dan makropinositosis yang dimediasi oleh dinamin dan clathrin. Hanya
beberapa detik kemudian, ASFV berkembang melalui jalur endositik dan mencapai
kompartemen endosom yang matang dimana terjadi dekapsidasi virus dan fusi
selubung virus bagian dalam dengan membran endosom. Virion yang baru disintesis
dirakit di pabrik virus dan akan keluar dari sel baik dengan eksositosis yang tumbuh
di membran plasma atau melalui pembentukan badan apoptosis (Galindo dan Alonso,
2017).

Gambar 2. Patogenesis Virus ASF (Galindo dan Alonso, 2017).

Gejala
Klinis
Masa
inkubasi
antara 3 –
15 hari dan
penyakit
dapat terjadi
dalam
bentuk perakut, akut, sub akut dan kronis. Pada bentuk perakut biasanya hewan
ditemukan mati tanpa gejala apapun.
Pada penyakit bentuk akut, masa inkubasi berlangsung lebih singkat (3-7
hari), ditandai dengan demam tinggi hingga 42 °C, depresi, nafsu makan menurun,
malas bergerak, mata dan hidung keluar cairan, hemoragi pada kulit dan organ
dalam, lesi nekrotik di abdomen, leher, telinga, abortus pada babi bunting, sianosis
(warna kulit kebiruan), muntah, dan diare. Kematian biasanya terjadi dalam 5-10 hari
setelah muncul gejala klinis. Angka kematian dapat mencapai 100% dan terkadang,
kematian terjadi bahkan sebelum tanda klinis dapat diamati.
Pada bentuk subakut dan kronis yang disebabkan oleh virus dengan virulensi
yang rendah, tanda klinis yang muncul lebih ringan dan berlangsung dalam periode
waktu yang lebih lama. Tingkat kematian lebih rendah, berkisar antara 30-70%.
Manifestasi penyakit bentuk kronis di antaranya penurunan berat badan, demam
berkala, gangguan pernapasan, ulser pada kulit, dan radang sendi. Bentuk ini jarang
ditemukan pada wabah penyakit (Salguero, 2020).

Gambar 3. (A) Letargi pada infeksi akut. (B) Sianosis pada telinga dan moncong
(Salguero, 2020).
Diagnosa
Deteksi antibodi terhadap ASF dapat dilakukan dengan uji serologi seperti uji
ELISA, Indirect Immunoperoxidase, Indirect Fluorescent Antibody, dan
Immunoblotting. Sedangkan uji deteksi virus ASF yang paling sering digunakan
adalah Conventional dan Real time Polymerase Chain Reaction serta Enzyme-Linked
Immunosorbent Assay.
 Sampel yang dapat dikoleksi diantaranya serum untuk pemeriksaan serologi
dan untuk uji virologik berupa organ seperti limpa, hati, tonsil, ginjal, limfoglandula,
jantung dan paru atau darah dalam EDTA. Untuk pengujian RT-PCR, dapat
menggunakan sampel seperti tanah yang telah terkontaminasi cairan tubuh babi atau
tempat pemotongan babi secara tradisional, air minum babi, sisa makanan atau
tempat pembuangan feses. Isolasi virus ASF dapat dilakukan pada Swine Pulmonary
Alveolar Macrophages (PAMs) atau sel primer dari Swine leucocyte (SL) (Sendow
et al., 2020).
Deferential Diagnosa
1. Classical Swine Fever (CSF)
Diagnosis yang paling penting dari ASF adalah demam babi klasik, juga
dikenal sebagai hog cholera, yang disebabkan oleh pestivirus dalam keluarga
Flaviviridae. Seperti ASF, ada berbagai presentasi atau bentuk klinis. CSF akut
menunjukkan tanda-tanda klinis dan lesi postmortem yang hampir identik dengan
ASF akut, dan juga ditandai dengan tingkat kematian yang tinggi. Tanda klinis
dapat berupa demam tinggi, kurang nafsu makan, depresi, perdarahan (pada kulit,
ginjal, amandel dan kandung empedu), konjungtivitis, kelemahan, bergerombol,
perubahan warna kulit menjadi ungu (sianotik), dan kematian dalam 2-10 hari.
Satu-satunya cara untuk membedakannya secara tepat adalah melalui konfirmasi
laboratorium (Beltran-Alcrudo et al.,2017).
2. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome (PRRS)
Juga dikenal sebagai penyakit telinga biru, PRRS ditandai dengan pneumonia
pada babi yang sedang tumbuh dan mati serta aborsi pada babi betina yang hamil.
Hal ini sering disertai dengan demam, kemerahan pada kulit dan khususnya
dengan perubahan warna kebiruan pada telinga. Meskipun kematian akibat PRRS
umumnya tidak tinggi, virus PRRS yang sangat patogen telah menghancurkan
kawanan babi di Cina, Vietnam, dan Eropa Timur selama beberapa tahun
terakhir, terkait dengan tingginya mortalitas, demam tinggi, lesu, anoreksia,
batuk, sesak, pincang, dan sianosis / kebiruan (di telinga, tungkai dan perineum).
Temuan nekropsi terdapat lesi di paru-paru (pneumonia interstitial) dan organ
 limfoid (atrofi timus dan pembengkakan, perdarahan di kelenjar getah bening)
dan perdarahan petekie di ginjal (Beltran-Alcrudo et al.,2017).
3. Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome (PDNS)
PDNS biasanya menyerang petani. Meskipun tanda klinis sangat sugestif,
tidak ada tes diagnostik khusus. Sindrom ini ditandai dengan adanya lesi kulit
berwarna merah tua hingga keunguan yang seringkali paling menonjol di bagian
belakang dan daerah perineum, meskipun pada kasus yang parah panggul juga
dapat terpengaruh. Lesi pada dinding pembuluh darah disebabkan oleh
necrotizing vasculitis (peradangan pembuluh darah), dan secara mikroskopis
mudah dibedakan dengan ASF. Penyakit ini juga disertai anoreksia, depresi, dan
nefrosis berat (radang ginjal) yang biasanya menjadi penyebab kematian.
Kelenjar getah bening juga bisa membesar. Morbiditas umumnya rendah tetapi
babi yang terkena sangat sering mati (Beltran-Alcrudo et al.,2017).
4. Erysipelas
Penyakit bakteri yang disebabkan oleh Erysipelothrix rhusiopathiae ini
mempengaruhi babi dari segala usia dan kemungkinan besar juga mempengaruhi
babi di peternakan skala kecil dan ekstensif seperti di unit intensif komersial.
Manifestasi klinis dalam bentuk akut atau subakut. Bentuk akut, biasanya terlihat
pada babi yang lebih muda, ditandai dengan kematian mendadak, meskipun
mortalitas biasanya jauh lebih rendah dibandingkan pada ASF. Dua atau tiga hari
setelah infeksi, babi yang terkena mungkin menunjukkan lesi kulit berbentuk
berlian yang sangat khas yang berhubungan dengan necrotizing vasculitis
(peradangan pembuluh darah). Pada babi dewasa ini biasanya satu-satunya
manifestasi klinis dari penyakit ini. Seperti pada ASF akut, limpa mengalami
kongesti dan sangat membesar. Temuan nekropsi lainnya termasuk hemoragidi
paru-paru dan kelenjar getah bening perifer, serta perdarahan di korteks ginjal,
jantung dan serosa lambung (Beltran-Alcrudo et al.,2017).
5. Aujeszky’s Disease
Penyakit Aujeszky, juga dikenal sebagai pseudorabies, menyebabkan masalah
reproduksi dan neurologis yang parah pada hewan yang terkena, seringkali
menyebabkan kematian. Hewan yang lebih muda terkena dampak paling parah,
 dengan tingkat kematian mencapai 100 persen selama dua minggu pertama usia.
Anak babi biasanya mengalami demam, berhenti makan, dan menunjukkan tanda
neurologis (gemetar, kejang, kelumpuhan), dan sering mati dalam waktu 24-36
jam. Babi yang lebih tua (lebih dari dua bulan) mungkin menunjukkan gejala
yang sama, tetapi biasanya mengalami gejala pernapasan dan muntah, dan kecil
kemungkinannya untuk mati. Lesi nekrotik dan ensefalomielitis fokal terjadi di
otak besar, otak kecil, adrenal dan organ dalam lainnya seperti paru-paru, hati
atau limpa. Pada janin atau anak babi yang masih sangat muda, bintik putih pada
hati merupakan ciri khas infeksi virus (Beltran-Alcrudo et al.,2017).
6. Salmonellosis
Babi muda biasanya lebih rentan. Hewan yang dirawat tepat waktu dapat
merespons terapi antimikroba. Konfirmasi diagnosis adalah dengan kultur
bakteri. Gambaran umum dengan ASF termasuk demam, kehilangan nafsu
makan, gangguan pernapasan atau gastrointestinal. Hewan bisa mati 3-4 hari
setelah terinfeksi. Babi yang mati karena salmonelosis septikemia menunjukkan
sianosis pada telinga, kaki, ekor, dan perut. Temuan nekropsi dapat berupa
perdarahan petekie di ginjal dan permukaan jantung, pembesaran limpa (tetapi
dengan warna normal), pembengkakan kelenjar getah bening mesenterika,
pembesaran hati, dan kongesti paru-paru (Beltran-Alcrudo et al.,2017).
Gambar 4. Differensial Diagnosa Virus ASF (Beltran-Alcrudo et al.,2017)
Isolasi dan Identifikasi

Gambar 5. Isolasi dan Identifikasi Virus ASF(OIE, 2019)

Jika dicurigai ASF, sampel berikut harus dikirim ke laboratorium: darah dalam
antikoagulan (EDTA untuk PCR, heparin atau EDTA untuk isolasi virus), serum dan
jaringan, terutama limpa, limfoglandula, sumsum tulang, paru, tonsil dan ginjal.
a. Isolasi Virus dengan Haemadsorption Test
Uji haemadsorpsi (HAD) didasarkan pada fakta bahwa eritrosit babi akan
menempel pada permukaan monosit babi atau sel makrofag yang terinfeksi
ASFV dan sebagian besar isolat virus memiliki fenotipe HAD. Hasil positif pada
tes HAD pasti untuk diagnosis ASF. Sejumlah kecil virus 'non-haemadsorbing'
telah diisolasi, kebanyakan di antaranya dilemahkan atau avirulen, tetapi
beberapa memang menghasilkan ASF akut yang khas. Tes dilakukan dengan
menginokulasi darah atau suspensi jaringan dari babi yang dicurigai ke dalam
kultur leukosit primer dari darah babi atau ke dalam kultur sel makrofag alveolar
(OIE, 2019).
Adapaun tahapan kultur leukosit primer yaitu :
1. Darah babi segar yang didefibrinasi dikumpulkan dalam jumlah yang
dibutuhkan.
2. Sentrifugasi pada 700 g selama 30 menit dan kumpulkan sel buffy coat.
Tambahkan tiga volume 0,83% amonium klorida ke leukosit yang diperoleh.
Campur dan inkubasi pada suhu kamar selama 15 menit. Sentrifugasi 650 g
selama 15 menit dan angkat supernatan dengan hati-hati. Cuci pelet dalam
medium atau phosphate buffered saline (PBS).
3. Resuspend sel pada konsentrasi 10 sel / ml dalam media kultur jaringan yang
mengandung 10-30% serum babi dan antibiotik. Untuk mencegah
haemadsorpsi nonspesifik, media harus mengandung serum atau plasma dari
babi yang sama dari mana leukosit diperoleh. Jika volume sampel yang besar
akan diuji, serum homolog dapat diganti dengan serum yang telah
diidentifikasi dengan pra-skrining yang mampu mencegah pembentukan auto
rosette nonspesifik.
4. Keluarkan suspensi sel dalam 96-piring sumur dengan 200 µl per sumur
(300.000 sel / sumur) dan inkubasi pada 37 ° C dalam inkubator 5% CO2
yang dilembabkan. Prosedur ini juga dapat dilakukan dalam alikuot 1,5 ml
dalam tabung 160 × 16 mm dan diinkubasi dalam posisi miring (5–10 ° dari
horizontal) pada 37 ° C.
5. Setelah 3 hari, inokulasi tiga tabung atau pelat sumur dengan menambahkan
0,2 ml / tabung atau 0,02 ml (pengenceran 1/10 akhir) / sampel sumur yang
telah disiapkan. Dianjurkan untuk menginokulasi pengenceran sepuluh kali
lipat dan seratus kali lipat ke dalam biakan, dan ini penting terutama bila
bahan lapangan yang dikirimkan dalam kondisi yang buruk.
6. Inokulasi kultur kontrol positif dengan virus yang menyerap darah. Kontrol
negatif noninokulasi yang tidak diinokulasi sangat penting untuk memantau
kemungkinan hemadsorpsi nonspesifik.
 7. Tambahkan 0,2 ml preparasi segar dari 1% eritrosit babi dalam buffer saline
ke setiap tabung. Untuk pelat 96 lubang, tambahkan 0,02 ml 1% eritrosit babi
per sumur.
8. Periksa biakan setiap hari selama 7-10 hari di bawah mikroskop untuk
mengetahui efek sitopatik (CPE) dan hemadsorpsi.
9. Pembacaan hasil. Haemadsorpsi terdiri dari penempelan sejumlah besar
eritrosit babi ke permukaan sel yang terinfeksi. CPE yang terdiri dari
pengurangan jumlah sel yang melekat dengan tidak adanya haemadsorpsi
mungkin disebabkan oleh sitotoksisitas inokulum, virus penyakit Aujeszky
atau ASFV non-haemadsorbing, yang dapat dideteksi oleh FAT pada sedimen
sel atau dengan menggunakan dari PCR. Jika tidak ada perubahan yang
diamati, atau jika hasil imunofluoresensi dan tes PCR negatif, supernatan
subkultur hingga tiga kali ke dalam kultur leukosit segar. Semua isolasi harus
dikonfirmasi oleh PCR dan sekuensing (OIE, 2019).

Gambar 6. Isolasi ASFV dengan uji HAD (Beltran-Alcrudo et.al.,2017)

b. Deteksi Antigen dengan Direct Fluorescent Antibody (FAT)
FAT merupakan tehnik pewarnaan untuk mengetahui keberadaan protein
spesifik (antigen, hormon, antibodi) dengan mengandalkan ikatan spesifik dengan
antibodi yang memiliki kemampuan berpendar atau fluorescent antibody.
Kemampuan fluorescent antibodi untuk berpendar dipengaruhi oleh agen yang
terikat pada antibodi tersebut yang disebut fluorochrome yang akan berpendar
akibat tereksitasi oleh gelombang cahaya tertentu. FAT terbagi menjadi dua jenis
yaitu Direct Fluorescent Antibody (DFA) dan Indirect Fluoescent Antibody
(IFA). Pembacaan hasil dari FAT memerlukan mikroskop khusus yaitu
immunoflurescent microscope yang dilengkapi dengan sinar UV dan akan
menunjukan tampak berpendar pada bagian yang terdapat ikatan antigen dan
antibodi (Leboff dan Pierce, 2012).

Gambar 7.Prinsip kerja

DFA dan IFA (Leboff dan Pierce, 2012).

Pada DAF, antigen akan berikatan langsung dengan fluorescent antibody

sehingga menimbulkan hasil diagnosa yag cepat untuk mengetahui keberadaan
antigen dalam sebuah sampel. Antigen intraseluler dideteksi menggunakan
antibodi spesifik terkonjugasi Fluorescein Isothiocyanate (FITC). Sampel yang
digunakan dalam uji ini adalah inokulasi leukosit atau jaringan sumsum tulang
yang sudah dibekukan dalam cryostat.Kontrol positif dan negatif digunakan
untuk memastikan bahwa slide diinterpretasikan dengan benar. FAT adalah tes
yang sangat sensitif untuk kasus ASF akut dan dapat dilakukan dengan cukup
cepat.
Adapaun tahapan uji ini yaitu :
1. Disiapkan bagian cryostat atau apusan cetakan jaringan uji, atau penyebaran
endapan sel dari kultur leukosit yang diinokulasi pada slide, dikeringkan dan
fiksasi dengan aseton selama 10 menit pada suhu kamar.
 2. Pewarnaan dengan fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated anti-ASFV
immunoglobulin pada pengenceran yang direkomendasikan selama 1 jam
pada suhu 37 ° C dalam ruangan yang lembab.
3. Fiksasi dan warnai preparat kontrol positif dan negatif dengan cara yang
sama.
4. Cuci dengan merendam empat kali dalam PBS bersih segar, letakkan jaringan
di dalam PBS / gliserol, dan periksa di bawah mikroskop sinar ultraviolet
dengan filter penghalang dan exciter yang sesuai.
5. Hasil positif akan terlihat fluoresensi sitoplasma granular spesifik pada
jaringan parakortikal organ limfoid atau makrofag di organ lain, dan atau
dalam kultur leukosit yang diinokulasi (Beltran-Alcrudo et al.,2017).

Gambar 8. Inklusi Bodi berwarna Fluorescent (Beltran-Alcrudo et al., 2017).

c. Deteksi Genom dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR merupakan metode enzimatis untuk melipat gandakan suatu sekuen dari
nukleotida tertentu secara in vitro. Terdapat empat komponen utama dalam PCR
yang pertama adalah template DNA yang meruapakan sekuen DNA yang ingin
digandakan, kedua adalah Primer , yang merupakan sekuen nukleotida pendek
(18-24 basa nukleotida) yang digunakan untuk mengawali prose sintesis rantai
DNA. Ketiga, deoksiribonukleotida trifosfat yang merupakan asam nukleotida
bebas yang akan dipakai untuk menggandakan DNA. dan yang terakhir adalah
enzim DNA polymerase, yang akan mengkatalisi reaksi sintesis rantai DNA.
Semua komponen tersebut dilarutkan dalam larutan buffer.
 Proses dari PCR secara garis besar terdiri dari 3 tahapan utama. Tahapan
pertama merupakan denaturasi dengan meningkatkan suhu di thermalcycler ke
96o C, agar memecah ikatan hidrogen pada DNA sehingga DNA dapat di
replikasi nantinya. Tahapan ke dua adalah Annealing, Pada tahapn ini suhu
diturunkan kembali menjadi 55o C, sehingga memungkinkan menempelnya
primer pada DNA template dan berikatan pada masing – masing basa nukelotida
komplemennya. Tahapan terakhir meruapakn ekstensi, dimana suhu dinaikan
kembali pada 72oC dan pada kondisi ini DNA polymerase akan bekerja dengan
menempel pada rantai DNA dan memulai sintesis dengan mengambil dan
mencocokan basa nukleotida bebas yang terdapat dalam buffer dan
mencocokanya dengan DNA template sehingga terbentuk sekuen DNA baru yang
sama dengan sekuen DNA template. Langkah ini dapat diulang berkali-kali
sesuai kebutuhan banyaknya DNA yang dibutuhkan, karena PCR dapat
menggandakan DNA secara eksponensial dalam sekali siklus sehingga langkah
ini sangat efektif untuk mendapatkan DNA spesifik dalam jumlah yang banyak
dan waktu yang relatif singkat.
Hasil pembacaan pada PCR dapat dilakukan dengan metode elektroforesis
agar menggunakan agarose atau SDS PAGE agar. Prinsip dari pembacaan PCR
meliputi pembacaan ukuran dari materi genetik yang telah digandakan dengan
bantuan arus listik yang mengalir dari anoda ke katoda sehingga memisahkan
DNA berdasarkan ukuranya. Semakin kecil ukuran dari sebuah DNA maka akan
semakin jauh terbawa arus listrik menjauhi sumur. Dengan bantuan Marker dan
kontrol positif yang sudah tersedia maka dapat diketahui keberaddan DNA dari
sampel yang telah di multiplikasi oleh PCR (Leboffe dan Pierce, 2012).
 Gambar 9. Skema tahapan pemeriksaan PCR (Sudaryatma, 2014).
Polymerase chain reaction (PCR) digunakan untuk mendeteksi genom ASFV
dalam sampel babi (darah, organ, dll.). Semua tes PCR yang divalidasi
memungkinkan deteksi DNA virus bahkan sebelum munculnya tanda klinis. PCR
memungkinkan diagnosis ASF dibuat dalam beberapa jam setelah sampel tiba di
laboratorium. PCR menyediakan alternatif yang sensitif, spesifik, dan cepat untuk
isolasi virus guna mendeteksi ASFV (OIE, 2019).
DNA diekstraksi dari sampel yang dipilih yaitu tonsil, limfoglandula, hati,
limpa, dan ginjal menggunakan QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) sesuai dengan
instruksi pabrik. DNA yang diekstraksi digunakan dalam PCR untuk mendeteksi
genom ASFV. PCR dilakukan menggunakan TaKaRa Ex Taq HS (Takara Bio
Inc.) sesuai dengan protocol pabrikan. Set primer diagnostik ASF yaitu
PPA1/PPA2 (PPA1, 5′AGTTATGGGAAACCCGACCC-3′; PPA2,5′
CCCTGAATCGGAGCATCCT-3′), yang menghasilkan amplicon 257-bp.
Langkah PCR terdiri dari denaturasi awal pada 98 0C selama 30 detik, diikuti oleh
35 siklus denaturasi pada 980C pada 30 detik, annealing pada 62oC selama 30
detik, ekstensi pada 720C pada 30 detik, dan ekstensi akhir pada 72o C. Untuk
identifikasi pasti amplikon, produk PCR dimurnikan dan kemudian dilakukan
pengurutan langsung menggunakan BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kit and a 3130 Genetic Analyze. Urutan ini menunjukkan kemiripan yang tinggi
dengan genom ASFV (Yabe et al., 2015).

Gambar 10. Hasil Deteksi Genom dengan PCR (Yabe et al., 2015).
d. Deteksi Antibodi dengan Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Prinsip metode immunoassay adalah reaksi antara antigen dan antibodi
spesifik dimana hasil reaksi dapat diamati dengan menggunakan suatu label atau
marker. ELISA merupakan salah satu metode immuno assay yang paling banyak
digunakan. Pada uji ini reaksi terjadi dengan mengabsorbsikan antigen atau
antibodi pada suatu solid phase serta dengan memberi label suatu enzim. Enzim
yang paling banyak digunakan adalah Horseradish peroxidase dan Alkaline
phosphatase. Enzim ini dapat dilabel baik pada antibodi maupun antigen yang
akan membentuk warna dengan penambahan suatu substrat. Pengujian secara
kuantitatif dapat dilakukan dengan mengamati intensitas warna yang terbentuk
(Gallardo, 2018).
Prosedur ELISA yang dilakukan adalah sebagai berikut: serum uji dan
kontrol diencerkan 1/10 dalam buffer pemblokiran (PBS yang mengandung
0,05% Tween 20,2% susu skim dan serum babi normal 2%), dan satu lubang
pelat ELISA dibiarkan kosong sebagai sumur kontrol (100 µl buffer
pemblokiran). Serum diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37 ± 2 ° C pada plate
shaker. Konjugat pra-titrasi pada working dilution (kisaran yang disarankan 1:
5000–1: 20000 protein A, 1 mg / ml) dipertahankan selama 45 menit pada 37 ± 2
° C pada plate shaker. Substrat baru yang terbentuk ditambahkan 100 µl / per
sumur dengan larutan substrat (ABTS [2,2'-azino-di (3-ethyl-benzothiazoline) -6-
sulfonic acid] diammonium salt) dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu
ruangan dalam keadaan gelap. Reaksi dihentikan dengan penambahan 100 µl /
sumur dengan stopping solution (1% natrium dodesil sulfat). Hasil yang
diperoleh dibaca pada ELISA reader atau spektrofotometer pada panjang
gelombang 405 nm. Setiap batch ASF-Ag pada pengecekan dengan
menggunakan indirect ELISA, harus disesuaikan terhadap referensi serum ASF
positif, batas dan negatif (PC, LC dan NC) untuk menentukan pengenceran
antigen yang optimal untuk digunakan dalam pelapisan pelat ELISA. Batch baru
ASF-Ag dianggap optimal ketika pada pengenceran 1: 1600 (0,5-0,9 g / per
sumur) dan menggunakan pengenceran tunggal serum pada 1/30. Semua sampel
serum hasil pengenceran diukur rasio hasil pengukuran level absorbennya (OD)
 dan dibandingan dengan level background (OD PC/OD NC). Sampel dinyatakan
“positif” apabila OD dari PC (Kontrol Positif), setidaknya 4 kali lebih tinggi dari
OD dari NC (Kontrol Negatif).

Nilai OD PC harus ≥ 1.0

Nilai OD NC harus ≤ 0.250
Nilai OD LC harus dalam rentang Cut off, dengan nilai OD maksimal 0.7
Perhitungan Cut Off

(OIE, 2019)

Gambar 11. Hasil Deteksi Antibodi dengan ELISA (OIE, 2019).

e. Deteksi Antibodi dengan Indirect Fluorescent Antibody (IFA)
 IFA adalah teknik cepat dengan sensitivitas dan spesifisitas tinggi untuk
mendeteksi antibodi ASF dari eksudat serum, plasma atau jaringan. Uji IFA
dilakukan untuk mengetahui antibodi pada sampel. Dalam IFA, hubungan antara
antigen dengan fluorescent antibodi akan didahului oleh antibodi dari sampel,
kemudian fluorescent antibodi akan menempel pada antibodi yang berada dalam
sampel tersebut (Gallardo, 2018).
Adapun tahapan dalam uji yaitu:
1. Antigen ASDV disiapkan dalam piring kultur sel atau lempeng mikrotiter 96-
well.
2. Sel yang digunakan itu dipersiapkan dengan dicampurkan dengan acetone-
alkohol selama 10 menit yang kemudian dikeringkan. Pelat dapat disimpan
dalam lemari es hingga siap untuk diwarnai atau dibekukan untuk jangka
waktu yang lebih lama.
3. Permukaan piring selanjutnya dibasahi dengan PBS, lalu ditambahkan serum
pada beberapa pengenceran (1:5, 1:10, 1:20, 1:40). Selanjutnya dilakukan
inkubasi dalam bak air atau inkubator pada suhu 37oC selama 30-60 menit.
4. Serum selanjutnya dibuang, dan piring dicuci dengan air mengalir sebanyak
tiga kali dan diikuti dengan pencucian menggunakan PBS sebanyak tiga kali.
5. Ditambahkan pengenceran yang telah ditentukan atau direkomendasikan dari
anti-pig immunoglobulin / FITC atau konjugat proteinA / FITC k semua
slide, dan inkubasi selama 1 jam pada suhu 37 ° C dalam ruang yang lembab.
6. Kemudian piring dicuci kembali seperti tahapan sebelumnya dan dilakukan
pembacaan preparat dengan segera menggunakan mikroskop fluorescent.
(OIE, 2019).
 Gambar 12. Hasil Deteksi Antibodi dengan IFA (Gallardo, 2018)
Laporan Pemeriksaan Mikrobiologi
Pemilik : Bapak Wadikin
Alamat : Deli Serdang, Sumatera Utara
Jenis hewan : Babi betina (Sus scrofa), umur 6 bulan
Anamnesa : Populasi total 200 ekor, morbiditas 10% dan mortalitas 50%
per 1 bulan. Pakan ampas tahu, bekatul, konsentrat, dan sisa
restoran. Minum air sumur. Babi belum pernah diberi obat
cacing dan vaksin. Demam tinggi hingga 42 °C, depresi, nafsu
makan menurun, malas bergerak, mata dan hidung keluar
cairan.
Sampel Pemeriksaan : Serum, darah, limpa , limfoglandula, jantung, sumsum
tulang, tonsil, hati.
Jenis Pemeriksaan : Isolasi dan Identifikasi African Swine Fever Virus
Hasil Pemeriksaan :
Tabel 1. Hasil pemeriksaan kasus African Swine Fever pada babi
No. Jenis Hasil Pemeriksaan Keterangan
Pemeriksaan
1. Isolasi Virus : Terdapat Cytopathic effect
Haemadsorption (CPE) pada biakan dan
Test (HAD) adanya haemadsorpsi yang
ditandai dengan penempelan
eritrosit babi ke permukaan
sel yang terinfeksi (Beltran-
Alcrudo et al.,2017).

(Beltran-Alcrudo et al.,2017)
2 Deteksi Antigen : (Beltran-Alcrudo et al.,2017) Hasil pewarnaan dengan
Direct Fluorescent fluorescein isothiocyanate
Antibody (FAT) (FITC) pada jaringan
sumsum tulang menghasilkan
fluorensi sitoplasma granular
spesifik dengan mikroskop
flouresen (Beltran-Alcrudo et
al.,2017).
 3 Deteksi Genom : Berdasarkan hasil
Polymerase Chain elektroforesis pada sampel
Reaction (PCR) tonsil, limfoglandula, hati,
ginjal, dan ginjal pada
amplicon 257-bp didapatkan
semua sampel dinyatakan
positif virus ASF sehubungan
dengan adanya band pada
(Yabe et al., 2015) hasil eletroforesis (Yabe et
al., 2015).
4 Deteksi Antibodi : Pemeriksaan sampel serum
Indirect Enzyme- dengan menggunakan
Linked indirect ELISA dinyatakan
Immunosorbent positif karena didapatkan
Assay (ELISA) hasil OD PC ≥4 OD NC yaitu
sebesar 9,29 (OIE, 2019).

(OIE, 2019)
5 Deteksi Antibodi : Pemeriksaan sampel serum
Indirect menggunakan metode
Fluorescent Indirect Fluorescent
Antibody (IFA) Antibody (IFA) dengan
antigen anti-pig
immunoglobulin (FITC)
(Gallardo, 2018) didapatkan warna fluorensi
antibodi (Gallardo, 2018).
Kesimpulan

Berdasarkan hasil pemeriksaan mikrobiologi, maka dapat disimpulkan bahwa

babi (Sus scrofa) terisolasi dan teridentifikasi virus African Swine Fever.

Yogyakarta, 13 November 2020

Mengetahui,
Dosen Pembimbing Mikrobiologi Mahasiswa Kodil
Prof. Dr. drh. A.E.T.H. Wahyuni, M.Si. Desqi Vigia Anggis Dwimantara, S.K.H.
Daftar Pustaka

Beltran-Alcrudo, D., Arias, M., Gallardo, C., Kramer, S. & Penrith, M.L. 2017.
African Swine Fever : Detection And Diagnosis – A Manual For
Veterinarians. USA : FAO Animal Production and Health Manual.
Gallardo, C. 2018. Centro De Investigacion En Sanidad Animal (CISA-INIA).
Animal Health Research Centre (CISA), INIA Ctra Algete-El Casar s/n
28130, Valdeolmos, Spain.
Galindo, I., dan Alonso, C. 2017. African Swine Fever Virus: A Review. Viruses.
2017, 9, 103.
Ganowiak, J. 2012. Patho-Anatomical Studies On African Swine Fever In Uganda.
Examensarbete Inom Veterinärprogrammet.
Leboffe, M. dan Pierce, B. 2012. Microbiology. Englewood: Morton Publishing
Company.
Office International des Epizooties. 2019. African Swine Fever (Infection With
African Swine Fever Virus). OIE Terrestrial Manual 2019, Chapter 3.8.1.
Paris (France) : Office International des Epizooties.
Salguero, F.J. 2020. Comparative Pathology and Pathogenesis of African Swine
Fever Infection in Swine. Frontiers in Veterinary Science. May 2020.
Volume 7. Article 282.
Sendow,I., Ratnawati, A., Dharmayanti, M Saepulloh, M. 2020. African Swine
Fever: Penyakit Emerging yang Mengancam Peternakan Babi di Dunia.
WARTAZOA Vol. 30 No. 1 Th. 2020 Hlm. 15-24.
Sudaryatma, P.E. and Lestari, A.T. 2014. Imunohistokimia Patogenitas Viral
Nervous Necrosis Isolat Lapang Bali yang Diinfeksikan pada Kerapu Macan
Budidaya. Acta Veterinaria Indonesia. 2(2): 54-61.
Yabe, J., Hamambulu, P., Simulundu, E., Ogawa, H. 2015. Pathological and
Molecular Diagnosis of the 2013 African Swine Fever Outbreak in Lusaka,
Zambia. Trop Anim Health Prod. (2015), 47:459–463.