HIGH PERFORMANCE LIQUID

CHROMATOGRAPHY (HPLC)
KA II - Senny
Pendahuluan
 HPLC adalah bentuk kromatografi cair yang
digunakan untuk memisahkan senyawa yang larut
dalam larutan. Instrumen HPLC terdiri dari reservoir
fase gerak, pompa, injektor, kolom pemisahan, dan
detektor.
 Senyawa dipisahkan dengan menyuntikkan
campuran sampel ke kolom. Komponen yang
berbeda dalam campuran melewati kolom denga
laju yang berbeda karena perbedaan dalam
partisi mereka antara fase gerak dan fase diam.
Skema Umum HPLC
High Performance Liquid Chromatography
(HPLC)
Peralatan HPLC secara prinsip terdiri dari :
 Tempat pelarut
 Pompa
 Tempat injeksi sampel
 Kolom
 Detektor
 Rekorder
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
1. Fasa mobile (pelarut)
pelarut yang digunakan harus dilakukan degassing untuk
mengeluarkan gas terlarut yang tidak diinginkan.
2. Sistem pompa
ada dua jenis pompa, yang mendasari pemakaiannya yaitu : tekanan
tetap dan volume tetap.
3. Flow controller (pengendali aliran)
untuk menstabilkan aliran fasa mobile akibat adanya perubahan
tekanan gas, temperatur dan viskositas.
4. Kolom
Tidak memerlukan temperatur yang tinggi, karena sifat ikatan kimia
terhadap fasa stasioner sangat sensitif terhadap temperatur yang tinggi.
High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) [lanjutan]
5. Detektor
karakteristik detektor untuk HPLC
- sensivitasnya tinggi
- respon yang menyeluruh terhadap sampel
- tidak meruska sampel
- tidak sensitif terhadap perubahan temperatur dan kecepatan aliran
fasa mobile
- dapat beroperasi secara terus menerus.

6. Rekaorder
Mengeluarkan output berupa kromatogram.
 Keuntungan HPLC
7

 Kapasitas pemisahan (resolusi) tinggi,

 memungkinkan analisis batch dari beberapa komponen
 kuantitatif dan reprodusibel
 Kondisi analitik moderat
 Tidak seperti GC, sampel tidak perlu diuapkan.
 Sensitivitas umumnya tinggi
 Konsumsi sampel rendah
 Pemisahan preparatif yang mudah dan pemurnian sampel
 Kegunaan HPLC
8
 Zat-zat Biogenik
 Sugars, lipids, nucleic acids,
amino acids, proteins, peptides,
steroids, amines, etc.
 Produk obat-obatan
 Drugs, antibiotics, etc.
 Produk Makanan
 Vitamins, food additives,
sugars, organic acids, amino
acids, etc.
 Sampel lingkungan
 Inorganic ions
 Hazardous organic substances,
etc.
 Produk organik Industri
 Synthetic polymers, additives,
surfactants, etc.
 9

HPLC HARDWARE: PART 1

Solvent Delivery System, Degasser, Sample

Injection Unit, Column Oven
 Flow Channel Diagram for HPLC
10

Detector

Column

Pump Column Oven

(thermostatic column
chamber)
Eluent Sample injection unit Drain
(mobile phase) (injector)
Data processor
Degasser
 Solvent Delivery Pump
11

 Persyaratan Kinerja
 Kapasitas untuk menahan tekanan beban tinggi.
 Pulsasi yang menyertai fluktuasi tekanan kecil.

 Laju aliran tidak berfluktuasi.

 Penggantian pelarut itu mudah.

 Rentang pengaturan laju aliran lebar dan laju aliran

akurat.
 Solvent Delivery Pump:
12
Representative Pumping Methods
 Syringe pump
 Plunger pump
 Diaphragm pump
 Solvent Delivery Pump:
Schematic Diagram of Plunger Pump
13

Pump head
Motor and cam

Check
valves

Plunger
Plunger seal 10 -100µL
 Solvent Delivery Pump:
14
Single Plunger Type

Check valves

Plunger head
 Solvent Delivery Pump:
15
Dual Plunger Type

Check valves

Plunger heads

Type Type
 Gradient System
16

 Sistem Isokratik
 Komposisi eluen konstan
 Sistem Gradien
 Komposisi eluen bervariasi
 HPGE (High Pressure Gradient)
 LPGE (Low Pressure Gradient)
 Sistem Gradien (1)
17

 In isocratic mode

CH3OH / H2O = 6 / 4
Long analysis time!!

Poor CH3OH / H2O = 8 / 2

separation!!

(Column: ODS type)

 Sistem Gradien (2)
18

 If the eluent composition is changed gradually during analysis...

95%
Concentration of methanol in eluent

30%
 High- / Low-Pressure Gradient System
19

Low-pressure
gradient unit

Mixer
Mixer

High-pressure gradient Low-pressure gradient

 Sistem Gradien Tekanan Tinggi / Rendah
20

 Sistem gradien tekanan tinggi

 Akurasi gradien tinggi
 Konfigurasi sistem yang rumit (diperlukan beberapa
pompa)
 Sistem gradien tekanan rendah
 Konfigurasisistem yang sederhana
 Diperlukan Degasser
 Degasser
21

 Masalah yang disebabkan oleh udara terlarut di eluen

 Pengiriman tidak stabil dengan pompa Lebih banyak
 kebisingan dan penyimpangan dasar yang besar dalam sel
detektor

Jadi Eluen harus dibebaskan dari gas

 Online Degasser
22

Regulator Vacuum chamber

Helium Polymeric film tube
cylinder

To pump
To pump
To draft

Drain valve

Eluent container Eluent container

Helium purge method Gas-liquid separation membrane method

 Unit Penginjekan sampel (Injektor)
23

 Persyaratan
 Tidak ada sampel yang tersisa di unit
 Pelebaran pita sampel minimal

 Penyesuaian volume injeksi

 Kehilangan minimal

 Daya tahan dan ketahanan tekanan yang baik

 Manual Injektor
24

From pump

To column
LOAD position
From pump

To column
INJECT position
 Manual Injector:
Operating Principle of Sample Injection
25

From pump From pump

Loop

Loop
To column
To column

LOAD INJECT
 Manual Injector:
26
Injection Method
 Syringe measurement method
 Tidak lebih dari setengah volume loop yang
diinjeksikan
 Loop measurement method
 Minimal 3 kali volume loop yang diinjeksikan
 Autosampler
27
(Pressure Injection Method)

From pump To column From pump To column

Sample Loop

LOAD INJECT
 Autosampler
28
(Total-Volume Injection Method)

From pump To column From pump To column

Needle

Sample vial
LOAD INJECT
Measuring pump
 Column Oven
29

 Tipe Pemanasan sirkulasi

 Tipe Pemanasan Blok
 Aluminum block heater
 Tipe Kolom terisolasi dengan Jaket
 Water bath
 Fase Gerak
30

 Air  Pelarut Organik

 “Ultrapure water”
 “distilled water for HPLC”
 Mempunyai kemurnian
(grade) untuk Kromatografi
 Perlu teknik dan perhatian
khusus untuk pelarut organik
tertentu (mis; tetrahidrofuran
dan kloroform)
 Penggantian Eluen
31

 Larutan berbasis air yang

 Pelarut yang tidak saling campur mengandung garam dan pelarut
tidak boleh langsung digantikan organik tidak boleh langsung
digantikan

Water Buffer solution

2-Propanol Water

Hexane Water-soluble
organic solvent
 Pencampuran, Filtrasi dan Degassing
32
(offline)

Decompression by Membrane filter with pore

aspirator size of approx. 0.45 µm

Decompression by
aspirator

Ultrasonic
cleaning unit
 33

REVERSED PHASE
CHROMATOGRAPHY PART 1
Basic Principles
 Polaritas Senyawa
34

 Polaritas  Pencampuran Pelarut

 Posisi elekton menimbulkan  Pelarut dengan polaritas yang
kutub positif dan negatif hampir sama mudah
 Air: Polar dicampurkan.
Metana: Nonpolar  Molekul Polar dan nonpolar
seperti halnya air dan minyak.

H –
H
O O
C H C C
H H O
–
H + H
H
H
Metana Air Asam asetat
 Gugus Fungsi Polar dan non polar
35

 Gugus Fungsi Non  Gugus Fungsi Polar

Polar  -COOH
 -(CH2)nCH3  Grup karboksil
 Grup alkil  -NH2
 -C6H5  Grup amino
 Grup fenil  -OH
 Grup hidroksil
 Normal Phase / Reversed Phase
36

Stationary
Mobile phase
phase
Normal High polarity Low polarity
phase (hydrophilic) (hydrophobic)

Reversed Low polarity High polarity

phase (hydrophobic) (hydrophilic)
 Kromatografi Fase Terbalik
37

 Fase Diam : polaritas rendah

 Grup Oktadesil-bonded silical gel (ODS)
 Fase Gerak : Polaritas tinggi
 Air,
metanol, asetonitril
 Kadang ditambahkan garam (buffer).
 Kolom Fase terbalik
38

 C18 (ODS) type  Phenyl type

 C8 (octyl) type  TMS type
 C4 (butyl) type  Cyano type

CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2

Si -O-Si
CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3

C18 (ODS)
 Interaksi hidrofobik
39

H2O H2O H2O

H2O
H2O
H2O Nonpolar solute H2O
H2O
H2O Jika senyawa H2O
H2O H2O nonpolar ditambahkan H2O H2O
Ikatan hidrogen Ikatan akan putus

H2O H2O
H2O
H2O H2O
H2O H2O substansi nonpolar didorong
ke lokasi nonpolar.
Nonpolar solute

Nonpolar stationary phase

 waktu retensi vs polaritas
40

C18 (ODS) OH

Weak
Strong
CH3
 Fase gerak Fase terbalik
41

 Air (larutan dapar) + pelarut organik campur air

 Pelarut organik campur air: Metanol
Acetonitril
Tetrahidrofuran dll.
 Rasio pencampuran air (larutan buffer) dan pelarut organik
memiliki pengaruh terbesar pada pemisahan.
 Jika larutan buffer digunakan, nilai pH adalah parameter
yang penting.
 Relationship between Polarity of Eluent and
Retention Time in Reversed Phase Mode
42

Eluent: Methanol / Water

60/40

70/30

80/20
 43

PENGGUNAAN LARUTAN
DAPAR SEBAGAI ELUEN
Pemilihan dan Penyiapan larutan dapar
 Kesetimbangan Disosiasi Asam
44

H+ Jika asam ditambahkan...

Kesetimbangan reaksi akan

bergerer ke kiri untuk
mengimbangi peningkatan H+.

HA A- + H+
Jika basa yang
ditambahkan...
Kesetimbangan selalu bergeser
… Kesetimbangan reaksi seiring dengan adanya perubahan.
akan bergerer ke kiri OH-
untuk mengimbangi
pengurangan H+.
 Preparasi Larutan Dapar
45

 Gunakan asam lemah dengan pKa yang dekat dengan

pH yang diinginkan.
 Contoh: Jika diinginkan larutan dapar dengan pH 4,8 maka,
 gunakan asam asetat, dengan pKa 4.8.
 Buat konsentrasi HA dan A-kurang lebih sama.
 Campur asam dengan garamnya.
 Contoh: campur asam asetat dan garam asetat sehingga mereka
mempunya konsentrasi (molar) yang sama.
 Larutan Buffer yang digunakan untuk Eluen HPLC
46

 Persyaratan  Asam yang biasa

 Daya buffering tinggi digunakan
pada pH yang ditentukan.  Asam fosfat
 pKa 2.1, 7.2, 12.3
 Tidak mempengaruhi
pendeteksian.  Asam asetat
 pKa 4.8
 Tidak merusak kolom atau
 Asam sitrat
peralatan.
 pKa 3.1, 4.8, 6.4
 Murah.
 Konsentrasi
 Jika hanya untuk adjust pH,
cukup10 mmol/L.
 Karakteristik Larutan Dapar Fosfat
47

 Keuntungan  Kerugian
 Mempunya 3 nilai pKa  Tidak mudah menguap
(pKa 2.1, 7.2, 12.3)  Sulit
digunakan pada
 Memungkinkanuntuk LCMS atau detektor
pH yang bervariasi. hambatan cahaya
evaporatif.
 Tidak mengabsorpsi
UV
 Murah
 48

REVERSED PHASE
CHROMATOGRAPHY PART 2
Consideration of Analytical Conditions
 Pedoman untuk Menetapkan Kondisi Fase Gerak (1)
Senyawa Neutral (Nonionik)
49

 Komposisi Eluen
 Air / Acetonitril
 Air / metanol

 Penyesuaian
 Mengubah rasio pencampuran air dan pelarut organik
 Mengubah jenis pelarut organik
 pH dari Eluent vs Retensi dari solut ionik
50

COOH
Asam
Peningkatan sifat
hidrofobik
pH dari eluen

COO
Basa
Peningkatan sifat
hidrofilik
+
H
 Pedoman untuk Menetapkan Kondisi Fase Gerak (2)
Senyawa Asam (Anionik)
51

 Komposisi Eluen
 Larutan dapar asam/ acetonitril
 Larutan dapar asam/ metanol

Meningkatkan kekuatan retensi dengan

eluen asam dan menekan ionisasi
 Analisis Zat Dasar (1)
Masalah-masalah yang ditemukan dengan Eluen Alkaline
52

eluen alkalin, ionisasi senyawa ditekan,

N+ N dan kekuatan retensi meningkat..
H

OH Si
O

OH Si OH
… silika gel larut dalam alkali,
sehingga material pengepakan
OH memburuk dengan cepat
OH
OH
 Analisis Zat Dasar (2)
Pengaruh residu silanol
53

Senyawa berinteraksi dengan residu

silanol, menyebabkan elusi dan tailing

Si
O

Si -O-Si-O
Residual silanol group N+
O H
Si
 Analisis Zat Dasar (3)
54
Penambahan Sodium Perklorat

ClO4 Ion pair

N+
H

Si
O

Si Senyawa membentuk pasangan ion dengan ion

perklorat, sehingga menyeimbangkan muatan dan
meningkatkan kekuatan retensi.
 Pedoman untuk Menetapkan Kondisi Fase Gerak (3)
Bahan Dasar (Bahan Kationik)
55

 Komposisi Eluen
 Larutan dapar asam mengadung anion dengan densitas
rendah (cth., ion perklorat) / acetonitril
 Sama seperti diatas/ methanol

Dengan eluen asam

 menekan disosiasi dari residu silanol
 mencegah tailing

Penambahan ion perklorat

 membentuk pasangan ion meningkatkan
kekuatan retensi menekan tailing
 Kromatografi Fase Terbalik Pasangan ion
56

 Kekuatan retensi meningkat dengan adanya penambahan

pereaksi dengan pasangan ion dengan muatan yang
berlawanan dengan substansi target ke dalam eluen.
Ion pair formation Ion pair formation

Ion exchange-like effect Ion exchange-like effect

Basic Substance Acidic Substance

 Pereaksi Pasangan Ion
57

 Senyawa Aionik
 Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)
 Senyawa Kationik
 Pentanesulfonicacid sodium salt (C5)
 Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)

 Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)

 Octanesulfonic acid sodium salt (C8)

 Hal-hal yang perlu diperhatiakan
58
dalam penggunaan pasangan ion
 Pemilihan Reagen Pasangan Ion
Secara umum, kekuatan retensi meningkat dengan panjang rantai alkil.

 pH Eluent
Kekuatan retensi berubah sesuai dengan apakah atau tidak terjadi ionisasi.

 Konsentrasi Reagen Pasangan Ion

Secara umum, kekuatan retensi meningkat dengan konsentrasi pasangan ion,
tetapi ada batas atas.

 Proporsi Pelarut Organik dalam Eluen

Optimalkan kondisi pemisahan dengan mempertimbangkan jenis dan
konsentrasi reagen pasangan ion.
 Fase Diam dan Fase Gerak untuk Sistem Normal
59

 Fase Diam
 Silica gel: -Si-OH
 Cyano type: -Si-CH2CH2CH2CN

 Amino type: -Si-CH2CH2CH2NH2

 Diol type: -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2OH

 Fase Gerak
 Solven dasar: hidrokarbon alifatik, aromatik
hidrokarbon, dll.
 Pelarut tambahan: alkohol, eter, dll.
 Hubungan antara ikatan hidrogen dan waktu retensi
pada fase normal
60

SiOH HO
Strong
SiOH
Weak
Very weak
OH

Steric hindrance
 Hubungan polaritas eluen dengan waktu retensi pada
fase normal
61

Eluen: Heksan/metanol

100/0

98/2

95/5
 Perbandingan Fase terbalik dan normal
62

 Fase Normal  Fase Terbalik

 Efektif untuk pemisahan
isomer struktural
 Menawarkan selektivitas
pemisahan tidak tersedia
dengan fase terbalik
 Menstabilkan secara
perlahan dan rentan
terhadap fluktuasi dalam
waktu retensi
 Eluents itu mahal
 Berbagai aplikasi Efektif
untuk pemisahan homolog
 Fase diam memiliki umur
pemakaian yang panjang
 Menstabilkan dengan cepat
 Eluents murah dan mudah
digunakanWide range of
applications
 63

HPLC HARDWARE: PART 2

Detektor
 Persyaratan Detektor
64

 Sensitif
 Detektor harus memiliki tingkat kepekaan yang sesuai.
 Selektivitas
 Detektor harus dapat mendeteksi substansi target
tanpa, jika mungkin, mendeteksi zat lain.
 Dapat beradaptasi terhadap pemisahan
 Mudah dioperasikan.
 Macam-macam Detektor HPLC
65

 UV-VIS absorbance detector

 Photodiode array-type UV-VIS absorbance
detector
 Fluorescence detector
 Refractive index detector
 Evaporative light scattering detector
 Electrical conductivity detector
 Electrochemical detector
 Mass spectrometer
 UV-VIS Absorbance Detector
66

C: Concentration
Detection cell

Ein Eout

A
l

A = e·C·l = –log (Eout / Ein) C

(A: absorbance, E: absorption coefficient)
 Optical System of UV-VIS Absorbance
67
Detector
Grating
Sample cell
l Ein Eout Photodiode

Ein Ein Photodiode

Reference cell

D2 / W lamp
 Spectrum and Selection of Detection
68
Wavelength

The longer wavelength is

more selective.

200 250 300 350

Wavelength [nm]
 Optical System of Photodiode Array
69
Detector

Sample cell
Grating

A single photodiode
D2 / W lamp measures the absorbance for
the corresponding wavelength
at a resolution of approx. 1 nm.

Photodiode array
 Data Obtained with a Photodiode
70
Array Detector

Spectrum

Chromatogram
Absorbance

Retention time
 Keuntungan dari Detektor Photodiode Array
71

 Dapat mengidentifikasi Puncak dengan spektra

 Identifikasi
berdasarkan waktu retensi
 Pencarian berdasarkan pustaka

 Dapat mengevaluasi kemurnian puncak

 Evaluasikemurnian berdasarkan bentuk spektra dari
awal puncak/ kromatogram sampai akhir
 Fluorescence Detector
72

Excitation wavelength

+ hv1 *

* hv2 +
Fluorescence wavelength
Excited state
Quasi-excited state
hv1
hv2
Fluorescence
Ground state
 Optical System of Fluorescence Detector
73

Xenon lamp
Fluorescence
grating
Photomultiplier tube

Fluorescence

Excitation
Excitation grating Sample cell
light
 Pereaksi untuk derivatisasi
74

 OPA (Bereaksi dengan amin primer)

S-R’
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO R’-SH
o-phthalaldhyde
(OPA)

 ADAM (Bereaksi dengan asam-asam lemak)

+ R-COOH

CHN2 CH2OCOR
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
 Differential Refractive Index Detector
75
(Deflection-Type)

Light-receiving unit
Reference cell

Light

Sample cell
 Optical System of Differential Refractive Index Detector
(Deflection-Type)
76

Slit W lamp

Reference cell
Sample cell
The slit image moves if the
refractive index inside the
flow cell changes.

Photodiode
 Evaporative Light Scattering Detector
77

Light-receiving unit
Drift tube

Nebulizer

Column eluate

Nebulizer gas
Drain Assist gas

Light source

The column eluate is evaporated and the light scattered by the

particles of nonvolatile substances is detected.
 Electrical Conductivity Detector
78

Pure water NaCl aqueous

solution

Cl- Na+

The bulb does not light with water. The bulb lights if there are ions.
 Principle of Electrical Conductivity Detector
79

I A
V K   k
I
E L
L
k  K
A
A A K: Electrical conductivity [S]
I: Electric current [A]
E: Voltage [V]
A: Electrode surface area [cm2]
L Electrode L: Distance between electrodes [cm]
k: Specific electrical conductivity [S•cm-1]
 Limiting Equivalent Ion Conductance, l
[S•cm2/mol], in Aqueous Solution (25ºC)
80

Cation l Anion l
H+ 349.8 OH– 198.3
Li+ 38.6 F– 55.4
Na+ 50.1 Cl– 76.3
K+ 73.5 Br– 78.1
NH4+ 73.5 NO3– 71.4
(CH3)3NH+ 47.2 CH3COO– 40.9
Mg2+ 53.0 C6H5COO– 32.3
Ca2+ 59.5 SO42– 80.0
 Electrochemical Detector
81

Electrode
HO R

HO
2e-
O R
+ 2H+
O
 Cell Structure of Electrochemical
82
Detector (Amperometric Type)

Reference electrode Working electrode

(Ag/AgCl) (glassy carbon)

Eluent

Electrode couple
 Mass Spectrometer (LCMS)
83

Atmospheric
pressure High vacuum

Quadrupole MS analyzer
API probe

Electron
multiplier tube

RP TMP1 TMP2
(high vacuum pumps)
 Atmospheric Pressure Ionization
84

Electrospray Ionization (ESI)

+
-+ + +
++- + -- +
+- -+- +
+-+-+-
+ +- + - ++ +
- + +
+

3) n E
LiquidSamples
Liquid Sample

1)
+

2) of S

Io
Co va
C
Neburaizing
Nebulizing Gas High
HighVoltage

Ev o l
ha
Voltage

ul po
ap ve

on ra
rg
Gas

ed

ol nt

E tio
at

xc n
D

io

lu
ro

si
p

on
le
t
Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI)

Molecular ion reaction

Liquid Sample
Liquid Samples Heater
Heater
Nebulizing Gas
Neburaizing Gas Corona Discharge
Colona Discharge
Needle
Nnndle
 Keuntungan LCMS (1)
85

 Analisis Kuantitatif dengan selektivitas tinggi

m/z=100
A
TIC A:100 B
B:100
C:150 D:150

m/z=150
C D
 Keuntungan LCMS (2)
86

 Puncak dapat diidentifikasi dengan spektra MS.

M/Z

M/Z

M/Z
 Perbandingan Detektor
87

Possibility of
Selectivity Sensitivity
Gradient System
Light-absorbing
Absorbance ng Possible
substances

Fluorescence Fluorescent substances pg Possible

Differential
None µg Impossible
refractive index
Evaporative light
Nonvolatile substances µg Possible
scattering
Electrical
Ionic substances ng Partially possible
conductivity
Oxidizing / reducing
Electrochemical pg Partially possible
substances
Note: The above table indicates general characteristics. There are exceptions.
 Post-Column Derivatization
88

Reaction
chamber

Pump
Reaction
solution
 Application Examples of Post-Column
89
Methods
 Amino Acids
 Orthophthalic acid, OPA
(fluorescence)
 Ninhydrin (visible absorption)
 Reducing Sugars
 Arginine (fluorescence)
 Carbamate Pesticides
 Alkaline hydrolysis - OPA
(fluorescence)
 Bromate Ions
 Tribromide ionization
(ultraviolet absorption)
 o-Dianisidine
(visible absorption)
 Cyanide Ions
 Chlorination - pyrazolone
(visible absorption)
 Transition Metal Ions
 4-(2-Pyridylazo) resorcinol,
PAR (visible absorption)
 90

ANALISIS KUANTITATIF
Metode Kurva Kalibrasi dan Metode Standar
Internal
 Analisis Kuantitatif
91

 Identifikasi berdasarkan waktu retensi

 Pengamatan spektrum dengan detektor
 UV

 MS

 Transfer ke instrumen analitik lainnya setelah

pemisahan preparatif
 Analisis Kuantitatif
92

 Kuantitasi berdasarkan luas area atau tinggi

puncak.
 Kurva kalibrasi dibuat terlebih dahulu
menggunakan standar.
 Metode kurva kalibrasi
 Metode internal standar

 Metode standar adisi

 Metode Kurva Kalibrasi
93

Area
Concentration
A1 Calibration curve
C1
A4

A2 A3

Peak area
C2

A2
A3
C3
A1

A4
C4 C1 C2 C3 C4
Concentration
 Metode Standar Internal
94

Concentration Area

Area for target substance / Area for internal standard

Target Internal
substance standard A1 AIS Calibration curve
C1 CIS A4 /AIS

A2 AIS A3 /AIS
C2 CIS

A2 /AIS
A3 AIS
C3 CIS
A1/AIS

A4 AIS
C4 CIS C1/CIS C2 /CIS C3 /CIS C4 /CIS
Concentration of target substance /
Concentration of internal standard
 Keuntungan Metode Standar Internal (1)
95

 Tidak terpengaruh oleh inkonsistensi dalam volume injeksi.

IS
X AX / AIS
10 µL
injected

Same area
ratio
IS
X
9 µL
injected
CX / CIS
 Keuntungan Metode Standar Internal (2)
96

 Tidak terpengaruh oleh pretreatmen

IS
X

AX / AIS
100%
recovery
rate

Same area
ratio
IS
90% X
recovery
rate
CX / CIS
 Kriteria untuk Standar Internal
97

 Itu harus memiliki sifat kimia yang mirip dengan

substansi target.
 Puncaknya harus tampak relatif dekat dengan substansi
target.
 Tidak terkandung dalam sampel yang sebenarnya.
 Puncaknya harus benar-benar terpisah dari komponen
sampel lainnya.
 Stabil secara kimia.
 98

PRETREATMEN SAMPEL
Tahapan sebelum Injeksi
 Tujuan Pretreatmen
99

 Untuk meningkatkan akurasi nilai-nilai

kuantitatif
 Untuk meningkatkan sensitivitas dan selektivitas

 Untuk melindungi dan mencegah kerusakan

kolom dan instrumen analitis

 Untuk menyederhanakan operasi dan prosedur

pengukuran
 Untuk menstabilkan zat target
 Zat-zat yang tidak diinjeksikan ke kolom
100

 Zat yang tidak larut (misalnya, partikel

mikroskopis dan pengendapan)
 Zat yang diendapkan dalam eluen

 Zat yang secara ireversibel terserap ke bahan

pengepakan
 Zat yang larut, atau bereaksi secara kimia,

dengan bahan pengepakan

 Filtrasi dan Pemisahan Sentrifugal
101

 Secara umum, saring

setiap sampel sebelum
injeksi!
 Lebih mudah untuk
menggunakan filter sekali
pakai dengan diameter
pori sekitar. 0,45 µm.
 Pemisahan sentrifugal
berlaku untuk sampel Filter Syringe
yang sulit untuk disaring.
 Pengendapan Protein
102

 Pengendapan
 Penambahan pelarut organik (misalnya, asetonitril)
 Penambahan asam (misalnya, asam trikloroasetat,
asam perkhlorat)
 Penambahan garam logam berat atau netral
Ultrafiltrasi
 Ultrafiltrasi
 Ekstraksi Padat Cair
103

(1) (2) (3) (4)

Conditioning Sample addition Rinsing Elution
Solvent with low
elution strength

Solvent with
high elution
strength

Target
component
Unwanted
components
 Derivatizasi Prekolom
104

 OPA Reagent (Reacts with Primary Amines)

S-R’
CHO
+ R-NH2 N-R
CHO R’-SH
o-phthalaldhyde
(OPA)

 2,4-DNPH (Reacts with Aldehydes and Ketones)

R
NHNH2 NHN=C
R
+ C=O R’
R’ H+
O2N NO2 O2N NO2
2,4-dinitrophenylhydrazine
(2,4-DNPH)
 105

EVALUASI KEANDALAN
ANALISIS
Validasi Metode Analisis
 Apa itu Validasi Metode Analisis ?
106

 Secara ilmiah  Karakteristik Validasi

menunjukkan bahwa  Accuracy / trueness
metode analisis sesuai  Precision
dengan tujuan yang  Specificity
dimaksudkan (yaitu,  Detection limit
bahwa kesalahan  Quantitation limit
berada dalam rentang  Linearity
yang diizinkan)  Range
 Mengevaluasi item  (Robustness)
yang diperlukan dari
karakteristik validasi
 107

PEMELIHARAAN KOLOM
Memperpanjang umur kolom
 Kolom berbasis Silika dan Resin
108

Silica-Based Resin-Based

pH range 2 - 7.5 bervariasi

Pelarut
Tanpa batasan terbatas
Organik
Resistensi Resistensi tekanan
25 MPa max.
tekanan rendah
Tergantung bahan
Temperatur 60ºC max.
pengepakan
 Penanganan Kolom Secara Umum
109

 Patuhi batasan yang  Gunakan tekanan serendah

terkait dengan pelarut mungkin
dan rentang pH.  Jangan melebihi batas atas
 Jangan biarkan bahan tekanan.
kemasan mengering.  Jangan merubah tekanan
 Jangan biarkan kolom secara mendadak.
partikel padat atau  Jangan membuat kolom
mikroskopis masuk ke terguncang kuat
kolom.
 Saring sampel.
 Masalah yang sering terjadi (1)
110
Penyumbatan Kolom
 Tindakan Pencegahan
 Saring sampel.
 Sampel harus terlarut
dalam pelarut.
 Selalu mengamati tekanan
kolom.
 Tindakan Perbaikan
 Periksa penyumbatan di
bagian selain kolom.
 Bilas dengan pelarut yang
sesuai.
 Hubungkan kolom secara
terbalik dan flush zat yang
tidak larut dengan laju alir
rendah.
 Buka ujung kolom dan
lakukan pembersihan filter
dengan ultrasonik.
 Masalah yang sering terjadi (2)
111
Perubahan Bentuk Puncak
Penyebab Perbaikan
Sampel terlalu banyak Kurangi konsentrasi sampel
Pelarut yang tidak tepat Ganti pelarut sampel dengan salah satu
kapasitas elusi rendah.

Kotoran Cuci kolom

Gap di saluran kolom Perbaiki kolom dengan
menambahkannya dengan bahan
pengepakan.
Pengaruh efek retensi Bilas kolom. Ganti kolom.
sekunder
 Masalah yang sering terjadi (3)
112
Penurunan Waktu Retensi
 Periksa Penyebab selain  Jika Kolom
kolom Penyebabnya
 Komposisi eluen  Cuci

 Laju alir eluen  Ganti

 Temperatur kolom
 Masalah yang sering terjadi (4)
113
Garis baseline
 Penyebab bukan kolom.  Penyebab Kolom
 Eluen  cuci

 Degasser  Kontrol suhu

 detektor  ganti
 Guard Column and Pre-column
114

Guard column

Pre-column
 Pencucian Kolom
115

 Gunakan eluen dengan kapasitas elusi yang

tinggi
 Fase terbalik: Solusi dengan proporsi pelarut organik yang tinggi
 Mode pertukaran ion: Solusi dengan konsentrasi garam tinggi
 Pertimbangan efek retensi sekunder
 Untuk menghilangkan substansi dasar dari kolom fase terbalik
 Gunakan larutan asam dan tambahkan reagen pasangan ion.
 Untuk menghilangkan zat hidrofobik dari kolom penukar ion
 Tambahkan pelarut organik.
 Checking Column Performance
116

2
tR
N  16
W
2
tR
 5.54
H W1/ 2
W1/2
tR  H
2
H1/2
 2
W Area
 Penyimpanan Kolom
117
 Larutan Penyimpanan
 Umumnya aman untuk
menggunakan solusi
penyimpanan yang sama
seperti yang digunakan saat
pengiriman.
 Untuk mencegah pembusukan,
alkohol atau bahan pengawet
lainnya dapat ditambahkan.
 Kondisi Penyimpanan
 Masukkan sumbat kedap udara
di ujung kolom. Jangan biarkan
bahan kemasan mengering.
 Buat catatan solusi penyimpanan
dan kondisi penggunaan terakhir
dan simpan bersama dengan
kolom.
 Simpan kolom di lokasi yang
tidak mengalami guncangan atau
perubahan suhu mendadak.