LAPORAN PRAKTIKUM METODE ANALISIS INSTRUMEN

PERCOBAAN 3.1

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF BAHAN BAKU DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

Disusun oleh :
KELOMPOK 3B

YENI SARI (10060312046)

MARSHA BETARI A (10060312047)
IMAS ZAKIAH (10060312048)
WIDYA (10060312090)
FAJRI ZAKIYYATU S (10060312091)
ACEP SOMANTRI (10060312092)

Tanggal Praktikum : 25 Februari 2015

Tanggal Laporan : 4 Maret 2015

Asisten : Shanti Wilandari, S.Farm

LABORATORIUM FARMASI INSTRUMEN

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG

2015
 PERCOBAAN 3.1

ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF BAHAN BAKU DENGAN

METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI

I. Tujuan
a. Melakukan analisis kualitatif bahan baku dengan metode kromatografi cair
kinerja tinggi
b. Melakukan analisis kuantitatif bahan baku dengan metode kromatografi
cair kinerja tinggi
c. Menyimpulkan mutu bahan baku dengan data kromatogram dan hasil
penetapan kadar

II. Teori Dasar

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau yang sering
disebut kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah jenis kromatografi
yang penggunaannya paling luas. Kegunaan umum HPLC adalah untuk
pemisahan dan oemurnian senyawa obat serta untuk analisis kuantitatif
senyawa obat dalam sediaan farmasetika. Disamping itu, HPLC juga
digunakan untuk identifikasi kualitatif senyawa obat berdasarkan pada
parameter waktu retensi senyawa obat standar serta senyawa obat dalam
sampel (Gandjar dan Rohman, 2012). Menurut Gandjar dan Rohman, 2007,
Kegunaan HPLC antara lain :
1. Untuk pemisahan sejumlah senyawa organik, anorganik, maupun senyawa
biologis
2. Analisis ketidakmurnian
3. Analisis senyawa – senyawa tidak mudah menguap
4. Penentuan molekul – molekul netral, ionik, maupun zwitter ion
5. Isolasi dan pemurnian senyawa
6. Pemisahan senyawa – senyawa yang strukturnya hampir sama
7. Pemisahan senyawa – senyawa dalam jumlah yang sekelumit dalam
jumlah banyak dan dalam skala proses industri
Jenis – jenis kromatografi, yaitu :
1. Kromatografi padatan cair (LSC)
Teknik ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben
yang polar seperti silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis
(TLC) adalah salah satu bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati
atau dipak dengan partikel-partikel micro or macro particulate or pellicular
(berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian besar dari KCKT sekarang ini dibuat
untuk mencapai partikel-partikel microparticulate lebih kecil dari 20μ .
Teknik ini biasanya digunakan untuk zat padat yang mudah larut dalam
pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini terutama sangat kuat untuk
pemisahan isomer-isomer.
2. Kromatografi partisi
Teknik ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang
tidak dapat bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam
dan yang lainnya sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi
cair (LSC), rasa diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung
pada kromatografi gas (GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada
suatu pendukung inert dan dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa
gerak dilewatkan melalui kolom. Bentuk kromatografi partisi ini disebut
kromatografi cair cair (LLC).
Untuk memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan
lama, telah dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara
kimia dengan pendukung inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut
kromatografi fase terikat (BPC = Bonded Phase Chromatography). BPC
dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang paling populer dari KCKT.
Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut "fase normal" bila fase diam
lebih polar dari fase gerak dan "fase terbalik" bila fase gerak lebih polar
dari pada fase diam.
3. Kromatografi penukar ion (IEC)
Teknik ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase
gerak dan tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin
berasal dari kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya
telah ditambah. Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin
pilihan paling baik untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah
digunakan. Teknik ini digunakan secara luas dalam life sciences dan
dikenal untuk pemisahan asam-asam amino. Teknik ini dapat dipakai
untuk keduanya kation dan anion.
4. Kromatografi eksklusi
Teknik ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran
molekul dari zat padat. Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan
berlubang-lubang sangat kecil (porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil
dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan dalam fase gerak yang
menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang lebih besar,
tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa
ditahan.
Kromatografi eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum
disebut permeasi gel (GPC) dan filtrasi gel. Apapun namanya,
mekanismenya tetap sama. Dalam bidang biologi, Sephadex, suatu Cross-
linked dextran gel, telah digunakan secara luas, hanya pengepak keras dan
semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan dalam KCKT. Dextran
gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2 atmosfer. Tenik ini
dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan biologi,
terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.
5. Kromatografi pasangan ion (IPC)
Kromatogtafi pasangan ion sebagai penyesuaian terhadap KCKT
termasuk baru, pemakaian pertama sekali pada pertengahan tahun 1970.
Diterimanya IPC sebagai metode baru KCKT merupakan hasil kerja Schill
dan kawan-kawan dan dari beberapa keuntungan yang unik. Kadang-
kadang IPC disebut juga kromatografi ekstraksi, kromatografi dengan
suatu cairan penukar ion dan paired ion chromatography (PIC). Setiap
teknik-teknik ini mempunyai dasar yang sama.
Popularitas IPC muncul terutama sekali dari keterbatasan IEC dan dari
sukanya menangani sampel-sampel tertentu dengan metode-metode LC
lainnya (seperti senyawa yang sangat polar, senyawa yang terionisasi
secara kompleks dan senyawa basa kuat).
IPC dapat dilaksanakan dalam dua tipe yaitu fase normal dan fase
balik. Fase diam dari rase balik IPC dapat terdiri dari suatu pengepak
silika yang disilanisasi (misalnya C8 atau C18 Bonded Phase) atau dari
suatu pengepak yang diperoleh secara mekanik, fase organik yang tidak
dapat bercampur dengan air seperti 1 pentanol. Fase diam yang dipakai
adalah Cs atau CIS BPC Packing. Fase gerak terdiri dari suatu larutan
bufer (ditambah suatu kosolven organik seperti metanol atau asetonitril
untuk pemisahan fase terikat) dan suatu penambahan ion tanding,yang
muatannya berlawanan dengan molekul sampel.
 Menurut Crawford pada tahun 2011, Parameter yang dapat digunakan
untuk mengetahui kualitas suatu kromatogram adalah resolusi (R s), faktor

retensi (k), faktor selektifitas ( ), efisiensi dan jumlah teoritis (N)

- Resolusi (Rs)
Hal yang terpenting dari HPLC adalah mengoptimasi resolusi dalam
waktu yang minimum. Nilai resolusi yang melebihi 1,5 diantara dua
puncak akan memberikan pemisahan yang baik. Resolusi dipengaruhi
oleh beberapa parameter.
- Faktor retensi (k)
Faktor retensi adalah waktu yang diperlukan untuk membawa keluar
suatu komponen dari dalam kolom kromatografi. Nilai k yang tinggi
mengindikasikan sampel memerlukan waktu dalam berinteraksi
dengan fase diam terlebih dahulu hingga keluar dari kolom saat tepat
dalam konsentrasi maksimum.
- Faktor selektifitas ( )
Selektifitas merupakan kemampuan instrumen dalam mengenali
senyawa-senyawa dalam campuran untuk mendapat selektifitas yang
maksimum diperlukan interaksi yang sesuai (partisi, adsorpsi, size
exclusion atau ion exchange). Apabila kedua senyawa memiliki k atau
nilai α = 1 kedua senyawa tidak dapat dipisahkan. Akibat waktu
retensinya identik. Agar terjadi pemisahan yang baik maka nilai
selektivitas (α) harus lebih besar daripada 1, semakin besar nilai
α maka pemisahannya akan semakin baik. Nilai α dapat diubah-ubah
dengan cara, mengubah fasa gerak (misalnya dengan memperbesar
polaritas), mengubah fasa diam, mengubah temperatur karena pada
umumnya kenaikan temperatur akan memperkecil waktu retensi,
dan mengubah bentuk komponen.
- Efisiensi
Efisiensi kolom merupakan kemampuan kolom mengeluarkan hasil
yang diinginkan dengan memuaskan dan dalam waktu yang singkat.
Hasil yang ideal kolom yang efisien akan menghasilkan puncak yang
tajam. Efisiensi sangat dipengaruhi oleh kapasitas dari kolom.
- jumlah teoritis (N)
Merupakan parameter yang menghitung efisiensi kromatografi.
Menyatakan jumlah peristiwa partisi yang dialami oleh analit pada
 setiap saat yang dibawa oleh fase gerak selama elusi. Dimana semakin
besar harga N akan memberikan puncak yang lebih efisien.
Instrumen HPLC

a. Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui
kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan
(constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement).
Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua,
yaitu : pompa reciprocating dan pompa syringe.
Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut
teratur (pulsating), oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau
peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor
yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya
ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran
yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas (Putra, 2004).
b. Injektor (Injector )
Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :
1. Stop-Flow : Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja
atmosfir,sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa
digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan resolusi tidak
dipengaruhi.
2. Septum : Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan
yangdigunakan pada Kromatografi Gas. Injektor ini dapat
digunakan padakinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini
tidak tahan dengan semua pelarut – pelarut kromatografi cair.
Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum
injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
3. Loop Valve : Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk
menginjeksi volume lebih besar dari 10 μL dan dilakukan dengan
 cara otomatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume
yang lebih kecildapat diinjeksikan secara manual). Pada posisi
load, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfer, bila valve
difungsikan, maka sampel akan masuk ke dalam kolom (Putra,
2004).
c. Kolom (Column)
Kolom dapat diklasifikasikan menjadi dua kelompok, yaitu :
1. Kolom analitik : Diameter dalam 2 - 6 mm.
Panjang kolom tergantung pada jenis material pengisi kolom.
Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 - 100
cm. Untuk kemasan porosmikro partikulat, 10 - 30 cm. Dewasa ini
ada yang 5 cm.
2. Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih
besar dan panjang kolom 25 -100 cm (Putra, 2004).
d. Detektor
Detektor dapat dibagi menjadi beberapa macam, yaitu sebagai berikut :
1. Detektor spektrofotometri UV – Vis.
Detektor jenis ini merupakan detektor yang paling banyak
digunakan dan sangat berguna untuk analisis di bidang farmasi
karena kebanyakan senyawa obat mempunyai struktur yang dapat
menyerap sinar UV – Vis. Detektor ini didasarkan pada adanya
penyerapan radiasi UV dan sinar tampak pada kisaran panjang
gelombang 190 – 800 nm oleh spesies solut yang mempunyai
struktur atau gugus kromoforik. Seldetektor umumnya berupa
tabung dengan diameter 1 mm dan panjang celah optiknya 10
mm, serta diatur sedemikian rupa sehingga mampu menghilangkan
pengaruh indeks bias yang dapat mengubah absorbansi yang
terukur.
2. Detektor Indeks Bias
Detektor indeks bias atau refraktometer diferensial adalah suatu
detektor universal yang memberi tanggap pada setiap zat terlarut,
asalkan indeks biasnya jauh berbeda dengan indeks bias fase gerak.
Kelemahanutamanya adalah bahwa indeks bias ini peka terhadap
suhu. Karena itu suhu fase gerak, kolom, dan detektor harus
dikendalikan dengan seksama, bila pengukuran yang cermat
dilakukan pada kepekaan tinggi.
3. Detektor Elektrokimia
 Banyak molekul organik, termasuk obat, dapat dioksidasi atau
direduksi secara elektrokimia pada elektrode yang cocok. Arus
yang dihasilkan pada proses ini dapat diperkuat untuk
menghasilkan tenaga yang sesuai. Meskipun detektor elektrokimia
cukup peka, namun ada pula kelemahannya. Adanya timbrungan
listrik dan goncangan arus juga harus diperhatikan.
4. Detektor Photodiode – Array (PDA)
Detektor PDA merupakan detektor UV – Vis dengan berbagai
keistimewaan. Detektor ini mampu memberikan kumpulan
kromatogram secara simultan pada panjang gelombang yang
berbeda dalam sekali proses (single run). Selama proses berjalan,
suatu kromatogram
pada panjang gelombang yang diinginkan (biasanya antara 190 –
400) dapat ditampilkan. Dengan demikian, PDA memberikan
banyak lebih banyak informasi komposisi sampel dibanding
dengan detector UV – Vis.Dengan detektor ini, juga diperoleh
spectrum UV tiap puncak yang terpisah sehingga dapat dijadikan
sebagai alat yang penting untuk memilih panjang gelombang
maksimal untuk sistem KCKT yang digunakan. Dan akhirnya
dengan detektor ini pula, dapat dilakukan uji kemurnian puncak
dengan membandingkan antara spectra analit dengan spectra
senyawa yang sudah diketahui.
Keuntungan KCKT
KCKT dapat dipandang sebagai pelengkap Kromatografi Gas (KG).
Dalam banyak hal kedua teknik ini dapat digunakan untuk memperoleh
efek pemisahan yang sama membaiknya. Bila derivatisasi diperlukan pada
KG, namun pada KCKT zat-zat yang tidak diderivatisasi dapat dianalisis.
Untuk zat-zat yang labil pada pemanasan atau tidak menguap, KCKT
adalah pilihan utama. Namun demikian bukan berarti KCKT
menggantikan KG, tetapi akan memainkan peranan yang lebih besar bagi
para analis laboratorium. Derivatisasi juga menjadi populer pada KCKT
karena teknik ini dapat digunakan untuk menambah sensitivitas detektor
UV Visibel yang umumnya digunakan.
KCKT menawarkan beberapa keuntungan dibanding dengan
kromatografi cair klasik, antara lain :
 a. Cepat : Waktu analisis umumnya kurang dari 1 jam. Banyak analisis
yang dapat diselesaikari sekitar 15-30 menit. Untuk analisis yang tidak
rumit (uncomplicated), waktu analisi kurang dari 5 menit bisa dicapai
b. Resolusi : Berbeda dengan KG, Kromatografi Cair mempunyai dua
rasa dimana interaksi selektif dapat terjadi. Pada KG, gas yang
mengalir sedikit berinteraksi dengan zat padat; pemisahan terutama
dicapai hanya dengan rasa diam. Kemampuan zat padat berinteraksi
secara selektif dengan rasa diam dan rasa gerak pada KCKT
memberikan parameter tambahan untuk mencapai pemisahan yang
diinginkan.
c. Sensitivitas detektor : Detektor absorbsi UV yang biasa digunakan
dalam KCKT dapat mendeteksi kadar dalam jumlah nanogram (10 – 9
gram) dari bermacam - macam zat. Detektor – detektor Fluoresensi
dan Elektrokimia dapat mendeteksi jumlah sampai picogram (10 – 12
gram). Detektor – detektor seperti Spektrofotometer Massa, Indeks
Refraksi, Radiometri, dll dapat juga digunakan dalam KCKT
d. Kolom yang dapat digunakan kembali : Berbeda dengan kolom
kromatografi klasik, kolom KCKT dapat digunakan kembali
(reusable). Banyak analisis yang bisa dilakukan dengan kolom yang
sma sebelum dari jenis sampel yang diinjeksi, kebersihan dari solven
dan jenis solven yang digunakan
e. Ideal untuk zat bermolekul besar dan berionik : zat – zat yang tidak
bisa dianalisis dengan KG karena volatilitas rendah , biasanya
diderivatisasi untuk menganalisis psesies ionik. KCKT dengan tipe
eksklusi dan penukar ion ideal sekali untuk mengalissis zat – zat
tersebut.
f. Mudah rekoveri sampel : Umumnya setektor yang digunakan dalam
KCKT tidak menyebabkan destruktif (kerusakan) pada komponen
sampel yang diperiksa, oleh karena itu komponen sampel tersebut
dapat dengan mudah dikumpulkan setelah melewati detector.
Solvennya dapat dihilangkan dengan menguapkan kecuali untuk
kromatografi penukar ion memerlukan prosedur khusus.

III. Alat dan Bahan

a. Alat
 - HPLC Agillent
- Vial
- Pipet
- Labu takar
- Injekasi filter
- Gelas ukur
- Pipet ukur
- Spatel
b. Bahan dan MSDS
- Baku pembanding paracetamol
Parcetamol mengandung tidak kurang dari 98,0% dan tidak lebih dari
101,0 %
Pemerian : hablur atau serbuk hablur putih ; tidak berbau ;
rasa pahit.
Kelarutan : larut dalam 70 bagian air, dalam 7 bagian etanol,
dalam 13 bagian aseton dan 40 bagian griserol dan
dalam 9 bagian propilengkliol.
Suhu lebur : 169 – 172 ◦C
Timbal : tidak lebih dari 10 bpj.
Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik dan terlindungi dari
cahaya.
Khasiat : analgetik, antipiretik
- Methanol pro HPLC
Pemerian : cairan tidak berwarna, jernih bau khas.
Kelarutan : dapat bercampur dengan air, membentuk cairan
jernih tidak berwarna.
Bobot jenis : 0,796- 0.798.
Titik didih : 64,5oC – 65oC
Indeks bias : 1,328 samapai 1,329.
- Air bidestilasi
Pemerian : cairan jernih , tidak berwarna , tidak berbau, tidak
mempunyai rasa.
Sisa penguapan : tidak lebih dari 0.001 %b/v , penguapan dilakukan
diatas tangas air hingga kering.
Penyimpanan : dalam wadah tertutup baik.
- Kolom HPLC C18
Octadecyl silica (C18) berupa padatan berwarna putih, tidak larut
dalam air.

IV. Prosedur
 System Kromatografi
Fase diam : ODS, packing L1
Fase gerak : air : methanol = 3:1
Laju alir : 1.5 ml/menit
Lempeng teoritis : 1000
Tailing factor : maksimal 2
Detector : UV 243 nm
1. Uji Kesesuaian Sistem
Untuk melihat apakah system kroatografi yang diset sudah memenuhi
syarat atau tidak, maka dilakukan uji kesesuaian system. Uji dilakukan dengan
menginjeksikan berturut-turut sebanyak 7 kali larutan standar ke dalam instrument
KCKT. Selanjutnya luas area standar, waktu retensi, factor ilutan dihitung nilai
simpangan baku relative (SBR) . uji kesesuaian system dinyatakan memenuhi
syrat apabila nilai SBR <2.0%.
2. Uji Kualitatif
a. Larutan Standar
Ditimbang 25 mg baku pembanding paracetamol dimasukan ke dalam labu
takar 50 mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dikocok larutan
hingga homogen. Dipipet 1,0 mL dilarutan ke dalam labu takar 10 mL. diencerkan
dengan fase gerak hingga batas. Disaring larutan dengan membrane filter PTFE
ukuran 0,45 µm. larutan siap untuk diinjeksikan ke dalam alat KCKT.
b. Larutan Uji
Ditimbang 25 mg bahan baku paracetamol dimasukan ke dalam labu takar
50 mL, diencerkan dengan fase gerak hingga sampai batas. Dipipet 1.0 mL larutan
ke dalam labu takar 10 mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.
Disaring larutan dengan membrane filter PTFE ukuran 0.45 µm. larutan siap
untuk diinjeksikan ke dalam alat KCKT. Diinjeksikan masing-masing larutan
standard an larutan uji ke dalam alat KCKT. Rekam kromatogram yang terbentuk.
Dibandingkan kromatogram larutan uji dan larutan standar. Waktu retensi puncak
larutan uji harus sama dengan waktu retensi puncak larutan standar.
3. Analisis Kuantitatif
a. Larutan Standar
 Ditimbang 25 mg baku paracetamol ke dimasukan kedalam labu takar 50
mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dikocok larutan hingga
homogeny (larutan stok baku pembanding parasetmol). Buat serngkaian
pengenceran larutan standar untuk pembuatan kurva kalibrasi. Di Pipet masing-
masing 0,2; 0,4; 0.6;0.8;1.0; dan 1,5 mL larutan stok pembanding ke dalam labu
takar 10 mL. diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Disaring larutan
dengan membrane filter PTFE ukuran 0.45 µm. larutan siap diinjeksikan ke dalam
alat KCKT. Dihitung konsentrasi masing-masing larutan kurva kalibrasi.
b. Larutan Uji
Ditimbang 25 ng bahan baku parasetamol kedalam labu takar 50 mL.
diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Dikocok larutan hingga
homogeny . dipipet 1,0 mL larutan kedalam labu takar 10 mL. diencerkan dengan
menggunakan fase gerak hingga tanda batas. Disaring larutan dengan membrane
filter nilon ukuran 0,45 µm . larutan siap untuk diinjeksikan kedalam alat KCKT.
4. Cara Kurva Kalibrasi
Diinjeksikan masing masing konsentrasi larutan standard an larutan uji. Di
catat luas area kromatogram masing-masing larutan standard an larutan uji.
Dengan menggunakan kurva kalibrasi atau persaman garis. Dihitung kadar larutan
sampel.
5. Cara one point
Diambil luas area kromatogram salah satu larutan pembandingan
kemudian digunakan untuk menghitung kadar larutan sampel dengan
menggunakan metode “one point”

V. Hasil Pengamatan dan Perhitungan

- Air : ¾ x 100 = 75ml

- Metanol : 100 – 75 = 25ml

- Bahan baku Paracetamol : 25,5 mg dalam 50 ml

50 ml = 0,05 L

ppm = = 510 ppm

 Pengenceran bahan baku paracetamol

V1. N1 = V2. N2

1 ml . 510 ppm = 10 ml . N2

N2 = 51 ppm

- Larutan Standar paracetamol 25,38 mg dalam 50 mL

50 ml = 0,05 L

ppm = = 507,6 ppm

Pengenceran larutan standar paracetamol

V1. N1 = V2. N2

1 ml . 507,6 ppm = 10 ml . N2

N2 = 50,76 ppm

Tabel Uji Kesesuaian Sistem

Penyuntikan TR Luas Area
1 3,743 39969151
2 3,683 39479879
3 3,567 38873839
4 3,647 38731850
5 3.67 39079502
6 3,653 39041732
7 3,637 39247650
Rata-rata 3.67 39204237.57
SD 0.035529331 415770.5416
SBR 0.968101651 106,054,768

Pengenceran Kurva larutan Standart Paracetamol

 V1. N1 = V2. N2
0,2 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2
N2 = 10,125 ppm
 V1. N1 = V2. N2
0,4 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2
 N2 = 20,304 ppm
 V1. N1 = V2. N2
0,6 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2
N2 = 30,456 ppm
 V1. N1 = V2. N2
0,8 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2
N2 = 40,608 ppm
 V1. N1 = V2. N2
1,0 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2
N2 = 50,76 ppm
 V1. N1 = V2. N2
1,2 mL . 507,6 ppm = 10 mL . N2
N2 = 60,912 ppm

Tabel Kurva Kalibrasi

Konsentrasi Luas Area
(x) (y)
10,152 8735425
20,304 14526645
30,456 21527997
40,608 29153395
50.76 37106445
60,912 446122556

y = bx + a

44612256 = 716956,4139x + 468798,5333

716956,4139x = 44612256 - 468798,5333

 x = 61,57 ppm

Kadar Paracetamol dengan Metode Kurva Kalibrasi

Larutan Uji

RT = 3,613

Luas Area = 66021219

% kadar paracetamol = x 100 % = 120,72 %

Kadar Paracetamol dengan Metode ‘One Point’

Cu = x Cs

= x 51

=75,474 ppm

% kadar = x 100 % = 147,98 %

VI. Pembahasan
Prinsip kerja dari KCKT adalah pemisahan komponen analit berdasarkan
kepolarannya, artinya komponen pada suatu analit (sampel) akan terpisah
berdasarkan sifat kepolaran masing-masing komponen dalam sampel, apakah
kepolarannya lebih mirip dengan fasa diam, maka dia akan tertinggal di fasa
diam atau bergerak lebih lambat, ataukah kepolarannya lebih mirip dengan
fasa gerak sehingga dia akan bergerak terdistribusi lebih jauh dan lebih cepat.
Sedangkan untuk prinsip kerja dari alat KCT tersebut adalah ketika suatu
sampel yang akan diuji diinjeksikan ke dalam kolom maka sampel tersebut
kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-senyawa kimia ( analit )
sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Cairan yang akan dipisahkan merupakan
fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner).

Fasa gerak dalam KCKT adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen
atau pelarut. Fasa gerak yang digunakan adalah air dan metanol dengan
perbandingan 3:1 yang bersifat lebih polar, sedangkan fase diamnya berupa
kolom C18 besifat lebih nonpolar. Hal ini disebabkan karena senyawa yang
dianalisis yaitu paracetamol bersifat lebih polar. Molekul polar dalam
campuran itu akan menghabiskan sebagian besar waktu mereka bergerak
dengan pelarut. Senyawa non-polar dalam campuran akan cenderung
membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena gaya dispersi van der
Waals. Mereka juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan
pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya di antara molekul-molekul air
atau metanol. Maka jenis teknik kromatografi yang digunakan adalah
kromatografi fase balik.

Pada KCKT fasa gerak selain berfungsi membawa komponen-komponen

campuran menuju detector, fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut.
Oleh karena itu, fasa gerak dalam KCKT merupakan salah satu faktor penentu
keberhasilan proses pemisahan. Fase gerak sebelum digunakan harus disaring
terlebih dahulu untuk menghindari adanya partikel-partikel kecil . Selain itu,
adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan
berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga
akan mengacaukan analisis.

Sebelum melakukan analisis setiap hari, seorang analis harus memastikan

bahwa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu memberikan data
yang dapat diterima. Hal ini dilakukan dengan percobaan kesesuaian sistem
yang didefinisikan sebagai serangkaian uji untuk menjamin bahwa metode
tersebut dapat menghasilkan akurasi dan presisi yang dapat diterima. Uji
kesesuaian system ditujukan utk memastikan efektivitas sistem operasional
dari sistem kromatografi sebelum digunakan utk analisis (terutama analisis
kuantitatif).
 Farmakope Amerika (United States Pharmacopeia, USP) menentukan
parameter-parameter yang dapat digunakan untuk menetapkan kesesuaian
sistem sebelum dianalisis. Parameter-parameter yang dapat digunakan
meliputi: bilangan lempeng teori (N), factor tailing, kapasitas (k’ atau α) dan
nilai standar deviasi relative (RSD) tinggi puncak dan luas puncak dari
serangkaian injeksi. Uji kesesuaian system dinyatakan memenuhi syarat
apabila nilai Simpangan Baku Relatif (SBR) < 2,0%. Dalam pengujian yang
kami lakukan diperoleh nilai SBR 0,968% dan 1,06% menunjukan bahwa
system yang digunakan telah memenuhi syarat.

Analisis yang dilakukan dalam percobaan ini adalah analisis kualitatif dan
analisis kuantitatif. Analisis kualitatif dilakukan dengan membandingkan
waktu retensi larutan uji dengan waktu retensi larutan standar. Waktu retensi
adalah waktu yang diperlukan sampel untuk keluar kolom. Sedangkan,
analisis kuantitatif dilakukan dengan menghitung konsentrasi sampel
berdasarkan luas area puncak kromatogram dengan menggunakan metode
kurva yang menghitungan konsentrasi dengan menggunakan persamaan garis
y = bx + a serta metode one point.
Pengujian kualitatif parasetamol menggunakan teknik HPLC, dalam
proses analisisnya HPLC memiliki beberapa tahapan. Diawali dengan
menginjeksikan sampel uji dan standar yaitu larutan yang sebelumnya telah
disaring dengan membran PTFE ke dalam kolom HPLC dengan injektor
khusus yang bervolume 20 µL, penyaringan sebelum penginjeksian ini
dilakukan agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom dan menghilangkan
gas dari pelarutnya. Larutan didorong cepat saat melalui kolom dengan
bantuan pompa bertekanan tinggi. Komponen akan keluar dari kolom dengan
kecepatan yang berbeda dan terdeteksi oleh detektor. Detektor yang digunakan
adalah detektor UV karena parasetamol merupakan senyawa organik yang
dapat menyerap sinar UV karena memiliki gugus kromofor pada strukturnya.
Pengujian ini menggunakan panjang gelombang 243 nm dengan
mempertimbangkan panjang gelombang methanol yaitu 205 nm dan air yaitu
190 nm. Selanjutnya hasil analisis dengan HPLC ini menghasilkan suatu citra
berupa kromatogram. Kromatogram merupakan grafik antara intensitas
 komponen yang dibawa oleh fasa gerak terhadap waktu retensi . Tampilan
kromatogram yang baik berupa grafik lurus, lancip, dan simetris.
Sampel melewati kolom HPLC tentunya memiliki jangka waktu yang
terukur dan juga menjadi parameter, waktu yang dibutuhkan sampel untuk
melewati kolom ini disebut waktu retensi. Kromatogram yang dihasilkan dari
setiap konsentrasi larutan standar diperoleh waktu retensi dan luas area
kromatogram. Analisis kualitatif dilakukan dengan menentukan waktu retensi
dan luas area kromatogram larutan sampel/uji. Waktu retensi larutan uji adalah
3.613 dengan luas area 66021219. Kemudian dibaningkan dengan waktu
retensi pada larutan standar. Adanya kesamaan waktu retensi yaitu pada 3,613
menunjukan larutan uji benar mengandung paracetamol.
Setelah analisis kualitatif, selanjutnya dilakukan analisis kuantitatif yang
bertujuan untuk menentukan kadar dari paracetamol dengan cara kurva
kalibrasi dan cara one point. Untuk cara kurva kalibrasi perhitungan kadar
dilakukan dengan persamaan garis y = bx + a.
y : luas area yang didapat setelah sampel diinjeksikan ke alat KCKT, y
yang dipilih adalah y pada konsentrasi 60.912 ppm yaitu 44612256
b : didapat dari persamaan regresi yaitu 716956.4139
x : konsentrasi dari larutan standar yaitu 60.912
a : didapat dari persamaan regresi yaitu 468798.5333
dari data diatas didapat x adalah 61.57 ppm. Setelah data x didapat maka
dapat dihitung kadar dari paracetamol adalah 120.72%. Untuk penentuan
kadar paracetamol dengan cara one point kadar yang didapat adalah 147.98%.
Berdasarkan literature dari farmakope, Parcetamol mengandung tidak kurang
dari 98,0% dan tidak lebih dari 101,0 %. Dari kedua cara diatas, metode kurva
kalibrasi lebih baik daripada metode one point. Dapat dilihat dari hasil
perhitungan kadar, dimana cara kurva kalibrasi hasilnya lebih mendekati
konsentrasi sesuai literatur dibandingkan dengan cara one point.

VII. Kesimpulan
- Analisis kualitatif bahan baku dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
dilakukan berdasarkan nilai TR (waktu retensi) dan luas area kromatogram
yang dibandingkan dengan larutan standar.
 - Analisis kuantitatif bahan baku dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
dilakukan dengan Metode Kurva Kalibrasi dan Metode One Point
- Kadar paracetamol yang terkandung dalam sampel dengan metode kurva
kalibrasi yaitu 120,72% sedangkan dengan menggunakan metode One
Point yaitu 147,98%

VIII. Daftar Pustaka

Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1979. Farmakope
Indonesia Edisi III. Departemen Kesehatan R.I Jakarta
Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan. 1995. Farmakope
Indonesia Edisi IV. Departemen Kesehatan R.I Jakarta
Gandjar, Gholib., dan Rohman, 2009. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka
Pelajar: Yogyakarta.
Johnson, E. L. and Steven son, R. 1978. Basic liquid chromatography. Varian,
California
Lindsay, S. 1992. High performance liquid chrotomagraphy second edition,
John Wiley &Sons, Chischer, New York, Brisbane, Toronto, Singapore
Rucker, G .1988. Instrumentelle pharmazeutische Analytik : lehbuch zu
spektroskop, chrotograph.u. elektrochem.Analysemethoden/von G.
Rucker. M. Neugebauer ; G.G. Wilems . Stuttgart : Wiss. Verl – Ges.,
Germany
Snyder, L. R and Kirkland J.J. 1979. Introduktion to modern liquid
chromatography. second edition. John Wiley & Sons.Inc NewYork,
Chihester, Briebane, Toronto, Singapore