Blok Imunologi

Laporan Hasil Praktikum Biokimia

PEMISAHAN (FRAKSINASI) PROTEIN BERDASARKAN KELARUTAN DAN

PROSES AGLUTINASI

Kelompok 7:
Achmad Arifin 2019730001
Hollyvia Clorinda 2019730047
Ihsanuddin Irsyad 2019730048
Khansa Alqurratuaini P. S. 2019730053
Lika Ameylia Tanjung 2019730057
Mohammad Rifqi R. 2019730066
Nadia Rachmawati 2019730082
Nur Wahyu Eka Saputri 2019730090
Sheina Zahra Supriyadi 2019730099

Tutor :
dr. Nur Asikin, PhD

Fakultas Kedokteran dan Kesehatan

Universitas Muhammadiyah Jakarta
2020
 KATA PENGANTAR

Assalammu’alaikum warrahmatullahi wabarakatuh

Puja dan puji syukur kami ucapkan atas ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa
yang telah memberikan rahmat dan karunia-Nya sehingga kami dapat
menyusun laporan praktikum ini yang mengenai “PEMISAHAN (FRAKSINASI)
PROTEIN BERDASARKAN KELARUTAN DAN PROSES AGLUTINASI”.
Laporan tutorial ini disusun dalam rangka memenuhi tugas Semester
dari Blok Imunologi. Terima kasih kami ucapkan kepada dosen Bapak dr. Nur
Asikin, PhD yang terlibat dalam pembuatan laporan praktikum ini atas segala
pengarahannya sehingga laporan ini dapat kami susun dengan cukup baik dan juga
kepada semua teman yang ikut membantu dalam melancarkan proses penyusunan
laporan praktikum kami.
Kami menyadari banyak kekurangan dalam penulisan laporan ini
yang masih kami harus perbaiki dan tingkatkan, baik d a r i s e g i i s i ,
bahasa, analisis, dan sebagainya. Oleh karena itu,kami ingin
meminta maaf atas segala kekurangan tersebut, hal ini disebabkan karena
masih terbatasnya pengetahuan, wawasan, dan keterampilan yang kami ketahui.
Selain itu, kritik dan saran dari pembaca sangat kami harapkan, guna untuk
kesempurnaan laporan ini dan perbaikan untuk kita semua.
S e mo g a l ap or an in i d ap a t b er m an f aa t d an me m be r ik a n
w aw a s an berupa ilmu pengetahuan untuk kita semua.

Wassalammu’alaikum warrahmatullahi wabarakatuh

Jakarta, 27 Juli 2020

 PETUNJUK PRAKTIKUM SISTEM IMUNOLOGI

1. PEMISAHAN (FRAKSINASI) PROTEIN BERDASARKAN KELARUTAN

Pemisahan Imunoglobulin Serum

Daya larut relatif berbagai protein dalam air, etanol dan larutan garam digunakan
sebagai dasar pemisahan protein-protein tersebut. Dalam praktikum ini akan dilakukan
pemisahan protein serum dengan larutan garam amonium sulfat (NH 4)2SO4.
Darah mengandung ratusan protein, dan yang terbanyak adalah albumin, globulin dan
fibrinogen. Bila darah dibiarkan menggumpal (clotting) dalam suatu wadah atau tabung reaksi,
cairan serum yang kuning jernih dapat dipisahkan (didiamkan saja atau disentrifugasi) dan
menjadi sumber globulin dalam percobaan ini. Umumnya disebut bahwa globulin adalah
protein yang mengendap dalam larutan amonium sulfat (AS) setengah jenuh (half-saturated,
50%), dan albumin mengendap dalam AS jenuh (saturated, 100%). Imunoglobulin G (IgG)
yang relatif murni diperoleh dengan pengendapan memakai AS 33%.

Alat dan Bahan

✓ Darah / serum
✓ Amonium sulfat
✓ Larutan amonia encer (NH4OH 10%)
✓ garam faal (NaCl 0.9%)
✓ pH meter
✓ alat sentrifus

Prosedur
1. Larutkan 100g AS dalam 100 mL air (aquades) dan diamkan semalam pada suhu
kamar. Tambahkan larutan amonia encer sehingga pH 7.2. Ini larutan AS jenuh.
2. Emcerkan 1 bagian serum dengan 2 bagian garam faal, lalu tambahkan sejumlah
(volum) sama larutan AS jenuh.
3. Aduk selama 30 menit pada suhu kamar.
4. Sentrifus endapan (1000xg, 15 menit, 4o C)
5. Endapan globulin dapat dilarutkan dalam garam faal untuk karakterisasi selanjutnya
(pemurnian lebih lanjut, kandungan protein, dll).
2. PERCOBAAN REAKSI AGLUTINASI

Reaksi aglutinasi pasif terbalik/ Reaksi aglutinasi lateks langsung (Direct Latex
Agglutination)

Tujuan
Memperlihatkan bahwa suatu reaksi presipitasi dapat dibuat menjadi reaksi aglutinasi
dengan cara mengikatkan salah satu reaktan ke suatu partikel. Reaksi aglutinasi pasif terbalik
ini digunakan antara lain dalam cara menentukan kehamilan.

Dasar
hCG (human Chorionic Gonadotropin) adalah hormon yang dikeluarkan oleh plasenta
sejak usia kehamilan yang sangat dini. Hormon ini dieksresikan dalam urin dan keberadaannya
dapat digunakan untuk mendiagnosis kehamilan.
Hormon hCG adalah suatu glikoprotein yang mudah larut. hCG sebagai antigen, bila
direaksikan dengan antibodi spesifik anti-hCG, akan membentuk endapan dari komplek
antigen-antibodi, Ag-Ab). Reaksi presipitasi ini dapat terlihat dengan menggunakan hCG dan
antibodi dalam jumlah yang cukup banyak. Dengan demikian pelacakan hCG dengan reaksi
presipitasi menjadi tidak praktis untuk digunakan dalam diagnosis dini kehamilan.
Bila salah satu reaktan diikatkan pada suatu partikel, reaksi imun yang terjadi adalah
reaksi aglutinasi dan disebut reaksi aglutinasi pasif atau tidak langsung. Dikatakan demikian,
sebab partikel ikut teraglutinasi karena ia terikat pada antigen atau antibodi, yang pada mulanya
bukan bagian integral dari partikel tersebut. hCG atau anti-hCG dapat diikatkan pada suatu
partikel seperti lateks polistiren. Bila anti-hCG yang diikatkan pada partikel, reaksi yang akan
terjadi disebut reaksi aglutinasi pasif terbalik. Ini dikarenakan pada reaksi aglutinasi alamiah
antibodi berada dalam serum dalam keadaan terlarut yang akan mengenali serta mengikat
molekul antigen yang ada di permukaan sel (misalnya antigen pada sel bakteri).
Perubahan ini sangat meningkatkan kepekaan dan kecepatan reaksi. Reaksi
berlangsung dalam waktu singkat dan hanya memerlukan jumlah sedikit contoh uji dengan
konsentrasi hCG dan antibodi yang rendah. Dengan demikian diagnosis dini kehamilan dapat
dilakukan dengan mudah dan cepat. Reaksi aglutinasi pasif terbalik dapat dilihat pada reaksi
ini.
 +
hCG

aglutinasi partikel lateks

Gambar : Skematis reaksi aglutinasi pasif terbaik (lateks)

Keterangan :

: Partikel lateks

: hCG
: antibody anti-hCG

Alat dan Bahan

✓ Pereaksi Lateks berupa suspensi yang mengandung antibodi monoklonal anti-hCG
dengan Na-azida sebagai pengawet.
✓ Kontrol urin positif
✓ Kontrol urin negatif
✓ Plat kaca
✓ Pipet plastik, dengan tangkainya sebagai tanduk

Prosedur
1. Dengan pipet plastik, teteskan 1 tetes urin di tengah lingkaran di atas plat kaca;
2. Pipetkan pula 1 tetes kontrol urin positif dan 1 tetes kontrol urin negatif di tengah dua
lingkaran lain;
3. Kocok botol pereaksi lateks dan segera teteskan dari botol 1 tetes pereaksi ini
langsung pada urin uji, kontrol urin positif dan kontrol urin negatif, dalam lingkaran.
4. Aduk dengan tangkai pipet plastik, sehingga memenuhi lingkaran;
5. Goyangkan plat kaca perlahan-lahan dengan hati-hati selama 2 menit, segera catat
hasil yang didapat.
 Catatan :
• Pada uji positif, aglutinasi terjadi dalam 2 menit
• Pada uji negatif, tidak terjadi aglutinasi dalam 2 menit

Hasil Praktikum
Sampel urin Aglutinasi Keterangan
A - -
B - -
Kontrol positif - -

Kontrol negatif - -

Kesimpulan

Tidak dilakukan percobaan

Pertanyaan:
1. Berapa kadar albumin, globulin dan fibrinogen dalam serum seorang dewasa
normal?
Serum adalah bagian darah yang tersisa setelah darah membeku. Pembekuan
mengubah semua fibrinogen menjadi fibrin dengan menghabiskan faktor VIII, V dan
protrombin. Faktor pembekuan lain dan protein yang tidak ada hubungannya dengan
hemostasis tetap ada dalam serum dengan kadar yang sama dalam plasma. Serum normal
tidak terdapat fibrinogen, protrombin, faktor VIII, V dan XIII, yang ada ialah faktor XII, XI,
IX, X, dan VII.

• Fibrinogen
Fibrinogen atau faktor I adalah protein yang diproduksi secara alami di plasma darah dan
berperan penting dalam proses pembekuan darah. Pada kondisi perdarahan yang disebabkan
oleh kondisi kekurangan fibrinogen, tambahan fibrinogen dari luar akan diberikan. Fibrinogen
yang akan diberikan ini tersedia dalam bentuk komponen darah dari Palang Merah Indonesia
(PMI) atau yang dikenal dengan cryoprecipitate. Selain itu, darah manusia yang telah
diproses untuk diambil fibrinogennya (fibrinogen konsentrat), juga dapat diberikan dengan
cara disuntikkan untuk mengatasi perdarahan pada defisiensi atau kekurangan fibrinogen,
namun fibrinogen konsentrat belum tersedia di Indonesia. Defisiensi fibrinogen merupakan
kelainan darah yang diturunkan dan sangat jarang terjadi. Fibrinogen pada orang dewasa
normal berkisar antara 200-400 mg/dl.

• Albumin
Albumin merupakan substansi terbesar protein yang di produksi oleh hati dari asam amino
yang diambil dari makanan. Albumin merupakan fraksi protein terbanyak (kira-kira 2/3 dari
protein total). Albumin memiliki rentang nilai normal yang besar yaitu 3,5-5,3 g/dl
sehingga penurunan ringan tidak terlalu. Fungsi albumin adalah mengatur tekanan onkotik,
yaitu tekanan yang menjaga air agar tetap berada dalam plasma. Kemudian fungsi lainnya
adalah mengangkut nutrisi, hormon, asam lemak, dan zat metabolit dari tubu. Apabila terdapat
gangguan fungsi sintesis sel hari maka kadar albumin serum akan menurun (hipoalbumin)
terutama apabila terjadi lesi sel hati yang luas dan kronik. Penyebab lain hipoalbumin
diantaranya terdapat kebocoran protein total di tempat lain seperti ginjal, pada kasus gagal
ginjal, usus akibat malabsorbsi protein, dan kebocoran melalui kulit pada kasus luka bakar
yang luas. Hipoalbumin juga 20 dapat disebabkan intake kurang, peradangan atau infeksi).

• Globulin

Globulin adalah kelompok protein yang tidak larut dalam larutan garam encer. Globulin
terdiri atas beberapa kelompok protein lagi. Globulin berfungsi sebagai pengangkut lemak,
vitamin, hormon, dan mineral. Selain itu globulin juga berguna untuk membentuk fibrinogen,
musculin, crystallin dan antibody.
Nilai rujukan untuk globulin normal adalah 2,8-3,2 g/dl. Peningkatan konsentrasi
protein total dan globulin diikuti dengan penurunan konsentrasi albumin. Kadar globulin
meningkat pada infeksi kronis, penyakit hati (sirosis bilier, ikterus obstruktif), rheumatoid
arthritis, leukemia, lupis, dan disfungsi ginjal. Kadar globulin dapat menurun pada kasus
anemia hemolitik akut (Healthoracle, 2014).

2. Bagaimana cara menyatakan kadar sesuatu zat dalam larutan?

a) Persentase Massa
Persen massa menyatakan jumlah gram komponen dalam 100 gram campuran. Misalnya
larutan gula 10% mengandung 10 gram gula dalam setiap 100 gram larutan.
b) Persentase Volume
Persentase volume adalah konsentrasi yang dinyatakan sebagai perbandingan volume zat
terlarut dan volume larutan dikalaikan 100%

c) Persentase Massa per Volume

Persentase massa per volume menyatakan banyaknya massa zat yang terlarut dalam
sejumlah tertentu larutan untuk memperoleh volume larutan yang diinginkan

d) Part Per Million (ppm) atau bagian per juta (bpj)

Kadar zat yang jumlahnya sangat kecil dapat dinyatakan dalam bagian per juta, yaitu bagian
zat dalam setiap satu juta bagian campuran

1% = 10.000 bpj

e) Molalitas

Hampir sama dengan molaritas, molalitas merupakan banyaknya mol zat terlarut dalam satu
kilogram pelarut. Secara matematis, molalitas dirumuskan sebagai berikut.
 f) Molaritas (M)

Membahas masalah molaritas tidak akan lepas dari besaran bernama mol. Hal itu karena
molaritas merupakan satuan konsentrasi yang menunjukkan banyaknya mol zat terlarut
dalam satu liter larutan. Secara matematis, molaritas dirumuskan sebagai berikut.

g) Fraksi mol

Fraksi mol merupakan satuan konsentrasi yang menunjukkan perbandingan antara

konsentrasi mol zat terlarut atau pelarut terhadap larutannya. Adapun persamaan fraksi
mol adalah sebagai berikut.

Keterangan:

Xt = fraksi mol zat terlarut;

Xp = fraksi mol pelarut;

nt = mol zat terlarut; dan

np = mol zat pelarut.

3. Sebutkan satu cara mendeteksi adanya protein, dan mengukur kadarnya dalam
larutan.

Uji biuret merupakan pendeteksian ada tidaknya ikatan peptide yang membentuk suatu
protein. Uji positif ditadai dengan munculnya warna merah muda hingga ungu. Prinsip dari
reagen ini menggunakan prinsip reaksi antara reagen dengan senyawa CuSO4 pada suasana
basa sehingga menghasilkan larutan berwarna ungu.
Larutan xantroproteat terdiiri dari campuran larutan HNO3 pekat atau campuran asam
cuka pekat dengan asam sulfat pekat. Hasil yang terjadi pada uji Xantroproteat menghasilkan
turunan nitro benzene berwarna kuning tua. Penambahan alkali atau ammonia pekat
mengubah warna zat menjadi jingga. Fungsi dari uji ini adalah untuk mendeteksi keberadaan
asam amino yang mengandung inti benzene pada gugus sampingnya.
Penetapan kadar asam amino secara kromatografi cair kinerja tinggi = hidrolisis protein
dalam suasana asam Sampel yang telah diliofilisasi sampai kering, ditimbang tepat 5,00 mg,
dihidrolisis dengan HCl 6N dengan penambahan 1 ml larutan merkaptoetanol 5 ppm v/v
dalam HCl pekat selama 24 jam pada t= 110 C. Sisa HCl dihilangkan dengan penghampaan
(dengan Rotary evaporator), pada t= 60 C. Setelah kering dilarutkan dalam dapar sitrat (pH
2,2) sebanyak 5,0 mL dan disaring dengan penyaring Millipore 5 m hingga didapat filtrat
dan hasil pencucian 7 mL, kemudian diencerkan sampai 10,0 mL. Filtrat ini dianalisis
kandungan asam aminonya dengan cara kromatografi cair kinerja tinggi.

4. Jelaskan apa yang dimaksud dengan reaksi presipitasi dan aglutinasi?

• Prespiltasi
Reaksi presipitasi dapat terjadi antara antigen yang terlarut dengan antibodi yang
terlarut juga . Ketika sejumlah antibodi terlarut dicampurkan dengan antigen terlarut maka
akan terjadi interaksi antibodiantigen yang menyebabkan pengendapan. Reaksi presipitat
dipengaruhi oleh jumlah epitop yang dimiliki antigen dan jumlah antibodi yang dapat
terikat pada antigen tersebut.
• Aglutinasi
Aglutinasi Reaksi aglutinasi dapat terjadi antara antigen yang terlarut dengan
antibodi yang tidak terlarut atau sebaliknya. Antigen atau antibodi dapat dibuat menjadi
tidak terlarut dengan cara mengikatkannya pada permukaan carier seperti partikel latex .
Penggumpalan terjadi jika molekul antigen memiliki berbagai macam epitop yang
menyebabkan ikatan silang.

Reaksi presipitasi merupakan pengujian serologis untuk mendeteksi kadar imunoglobulin

dari serum pasien yang terinfeksi. Di sisi lain, aglutinasi adalah pencampuran antibodi dengan
antigen yang cocok pada permukaan seperti sel hewan, eritrosit, atau bakteri, yang
menghasilkan antibodi yang menghubungkan partikel yang membentuk rumpun yang
terlihat. Dalam hal presipitasi, antigen adalah molekul yang larut sementara dalam kasus
aglutinasi; antigen adalah molekul besar dan tidak larut.
5. Bagaimana cara membuat zat antibodi hCG manusia?

hCG merupakan hormon glikoprotein yang memiliki kandungan karbohidrat tinggi

dengan berat molekul 36-40 kDa. hCG tersusun dari 2 sub-unit berbeda yang berikatan secara
non-kovalen yaitu sub-unit α (α-hCG) yang terdiri dari 92 asam amino dengan berat molekul
14,5 kDa dan sub-unit β (β-hCG) yang terdiri dari 145 asam amino dengan berat molekul 22,2
kDa.
Prinsip deteksi hCG baik pada urine ataupun serum yaitu melalui antibodi yang sengaja
diciptakan dengan spesifitas yang tinggu terhadap hCG. Suspensi lateks mengandung
antibody monoclonal anti HCG dengan natrium azida sebagai pengawet sebagai anti HCG
dan hormon HCG yang terkandung dalam urin sebagai antigen. Ketika anti HCG (antibodi)
bertemu dengan antigen (hormon HCG) maka terbentuklah kompleks imun.
Salah satu immunoassay yang digunakan untuk mengukur hCG yaitu dengan teknik lapis
(sandwich type immonoassay). Pada tipe tes ini, dibuat 2 macam antibodi. Antibodi jenis
monoklonal yang berguna untuk mengikat β-hCG. Kemudian antibodi yang kedua berguna
untuk melapisi hCG yang telah terikat. Pada beberapa metode, antibodi yang kedua ini
diikatkan pada suatu enzim yang akan menghasilkan suatu warna sebagai detektor keberadaan
hCG.

6. Berapa lama setelah pembuahan hCG dalam urin wanita hamil dapat dideteksi?

Hormon ini yang pertama kali dapat dideteksi sekitar 11 hari setelah terjadinya
pembuahan, tetapi hanya melalui test darah. Setelah itu antara hari ke-12 sampai 14, hormon
ini dapat dideteksi dengan test urin. Kadar HCG akan berlipat ganda kurang lebih 8 setiap 72
jam, mulai dari minggu pertama sampai ke-12 kehamilan, lalu akan cenderung menurun
setelah itu.