NAMA : Jihan Nadhira Salsabila

NIM : 20184323033
PRODI : DIV Analis Kesehatan
TINGKAT/SEMS : III/V

Identifikasi Mycobacterium tuberculosis

Hari/Tanggal : Senin, 5 September 2020
Tujuan :
 Untuk mengetahui jenis sampel yang digunakan untuk identifikasi Mycobacterium
tuberculosis
 Untuk mengetahui cara pengambilan sampel pada penderita Mycobacterium
tuberculosis
 Untuk mengetahui persiapan peralatan dan bahan/ media dan reagensia yang
diperlukan untuk identifikasi Mycobacterium tuberculosis
 Untuk mengetahui prosedur kerja idntifikasi Mycobacterium tuberculosis
 Untuk mengetahui pembacaan hasil pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis
pada media
Prinsip :
Bakteri atau sampel ditanam pada media kemudian dilakukan pewarnaan dan dilakukan
identifikasi terhadap sampel untuk mendapatkan ciri spesifik dari bakteri Mycobacterium
tuberculosis.
Dasar Teori :
Mycobacterium tuberculosis (MTB) adalah bakteri dari famili Mycobacteriaceae,
ordo Actinomycetes, dan kelas Actinobacteria. Salah satu ciri khas dari MTB adalah
kandungan asam mikolat pada dinding bakteri tersebut. Adanya zat ini menyebabkan MTB
sulit diwarnai dengan pewarnaan bakteri standar karena tidak bisa tembus oleh pemberian zat
asam sehingga dikenal sebagai bakteri tahan asam. Oleh sebab itu, untuk deteksi MTB
dilakukan dengan metode khusus yaitu pewarnaan Ziehl-Neelsen atau auramine.
Mycobacteria sendiri terdiri dari banyak spesies. Saat ini dikenal sampai 130 spesies
dari genus ini. M. tuberculosis merupakan spesies yang dominan menyebabkan penyakit pada
manusia. Contoh spesies lain adalah Mycobacterium bovis yang menyebabkan tuberkulosis
pada sapi dan dapat pula menginfeksi manusia (2-5% kasus) dan M. africannum yang juga
bisa menginfeksi manusia walaupun kasusnya sangat jarang.
Kurang lebih terdapat 60 spesies penyebab mycobacteriosis yang menimbulkan
infeksi oportunistik (terutama pada AIDS). Diantaranya adalah Mycobacterium avium-
intracellulare, M. kansasii, M. ulcerans, M. canetti, dan lain sebagainya.
 Adapun penyakit lain yang disebabkan oleh genus ini adalah penyakit lepra yang
disebabkan oleh Mycobacterium leprae. Namun, penyakit ini tidak akan dibahas lebih jauh
dan pada kesempatan kali ini akan lebih fokus pada penyakit tuberkulosis.
Sebenarnya MTB bersifat pleomorfik dengan bentuk kebanyakan berupa batang lurus
tanpa kapsul, spora, atau flagela. Selain itu dapat pula tampak granular, kokoid, seperti
benang, bercabang, dan membentuk sepertt jaring.
M.tuberculosis berbentuk batang berwarna merah pada pemeriksaan mikroskopis
dengan pewarnaan Ziehl-Neelsen
Sebenarnya MTB masuk ke dalam kelompok bakteri gram positif walaupun sulit diwarnai
dengan pewarnaan aniline.
Seperti disebutkan di atas, MTB tahan terhadap zat asam maupun basa sehingga
dikenal dengan istilah “bakteri tahan asam’ atau BTA. Sifat ini disebabkan dinding MTB
yang membentuk kompleks dinding mukopeptida dengan zat asam mikolat.
BTA ini memberi pewarnaan merah dengan zat basa fenol fuchsin dengan metode
pewarnaan Ziehl-Neelsen. Adapun bakteri lain yang sensitif terhadap asam akan memberi
gambaran biru karena tewarnai dengan methylene blue.
Mycobacteria merupakan mikroorganisme yang bersifat aerob, yang artinya
membutuhkan oksigen untuk hidup. M. tuberculosis memproduksi beberapa enzim oksidasi-
reduksi seperti katalase-peroksidase termolabil dan superoksida dismutase. Selain itu bakteri
ini juga mengekspresikan lechitinase, fosfatase, dan urease. Dalam metabolisme, MTB dapat
memanfaatkan karbohidrat maupun protein sebagai sumber energi.
Persiapan Alat :
 Kapas steril (swab)
 Object glass
 Lidi
 Lampu spirtus
 Spatula
 Ose
 Mikroskop
 Plate
 Tabung reaksi
 Rak tabung
 Erlenmeyer
 Batang pengaduk
 Hotplate
Persiapan Bahan :
1. Media Lowenstein Jensen
 KH2PO4 2,4 gr
 Tri-magnesium sitrat 0,6 gr
 L-asparagin 3,6 gr
 Sodium glutamate 1 g
 Sodium piruvat 6,5 gr
 Aquadest 600 ml
  Whole egg 1 L
 Malachite green 2% 20 ml
2. Media Ogawa
 KH2PO4 3 gr
 Sodium glutamate 2 gr
 Sodium piruvat 1,2 gr
 Agar Noble 14 gr
 Aquadest 540 ml
 Kuning telur 40 ml
 Whole egg 400 ml
 Malachite green 2% 12 ml
3. Pewarna
 Karbol fuchsin
- Basic fuchsin 1 gr
- Fenol kristal 5 gr
- Alcohol 90% 10 ml
- Aquadest 100 ml
 Asam alcohol
- HCl pekat 3 ml
- Alcohol 96% add 100 ml
 Methylene Blue
- Methylene blue 0,5 gr
- Aquadest add 100 ml
 Kinyoun
- Basic fuchsin 4 gr
- Alcohol 96% 20 ml
- Fenol kristal 8 gr
- Aquadest add 100 ml
 Gabbet
- Methylene blue 2 gr
- H2SO4 40 ml
- Alcohol 96% 60 ml
- Aquadest add 100 ml
Persiapan Sampel
 Sputum/ dahak
 Cairan lambung
 Urine
 Cairan pleura
 Cairan otak dan sendi
 Nanah pus
 Bahan biopsy
Pembuatan Media & Reagensia :
 Pembuatan Reagensia
 1) Karbol Fuchsin
Larutkan 1 gr karbol fuchsin, 5 gr fenol kristal, dan 10 ml alcohol 96%. Tambah
aquadest, add kan sampai 100 ml
2) Asam Alkohol
Larutkan 3ml HCl pekat ke dalam alcohol 96% (add kan sampai 100 ml)
3) Methylene blue
Larutkan 0,5 gr methylene blue ke dalam aquadest, add kan sampai 100 ml
4) Kinyoun
Larutkan 4 gr basic fuchsin, alcohol 96% 20 ml, 8 gr fenol kristal ke dalam aquadest,
add kan sampai 100 ml
5) Gabbet
Larutkan 2 gr methylene blue, 40 ml H2SO4, 60 ml alcohol ke dalam 100 ml
aquadest, add kan sampai 100 ml

 Pembuatan Media
a. Media Lowenstein Jensen
1) Timbang 2,4 gr KH2PO, 0,6 gr Tri-magnesium sitrat, 3,6 gr L-asparagin, 1 gr
sodium glutamat, 6,5 gr sodium piruvat
2) Larutan tersebut dilarutkan dalam aquadest hingga 600 ml
3) Dihomogenkan dengan hot plate,
4) Kemudian diautoklaf pada suhu 121°C selama15 menit.
5) Larutan tersebut ditambah 1 L whole egg, dihomogenkan, dan diberi 20 ml
malachite green 2%
b. Media Ogawa
1) Timbang 3 gr KH2PO4, 2 g sodium glutamat, 1,2 g sodiumpiruvat.
2) Larutan tersebut ditambah 14 g agar Noble, ditambah aquades hingga 540 mL,
3) Dihomogenkan dengan hot plate
4) kemudian diautoklaf pada suhu 121°C selama 20 menit
5) Larutan didinginkan hingga suhu 50°C,
6) Dtambahkan 140 mL kuning telur dan 12 mL malachite green 2%, dihomogenkan,
7) Dibagi kedalam lima tabung steril, masing-masing sebanyak 10 mL.
8) Tabung diposisikan dengan kemiringan 45° sampai media menjadi padat.
9) Untuk menguji sterilitasnya, media diinkuba-sikan pada suhu 37°C selama 48 jam
 10) Media kemudian disimpan pada suhu 4°C sebelum digunakan

 Homogenisasi Sputum dengan NaOH

1) Sputum sebanyak 2 ml dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi,
2) Kemudian ditambah 2 ml larutan NaOH 4%,
3) Dikocok-kocok selama 15 menit
4) Kemudian disentrifugasi pada kecepatan 3000 rpm. selama 15 menit
5) Supernatant dibuang kemudian filtrate dibuat smear dan siap untuk dilakukan
pengecatan dengan metode Ziehl Nelseen
 Proses Dekontaminasi Sputuh pada NaOH
1) Siapkan sputum yang akan didekontaminasi
2) Tambahkan Larutan dekontaminan (NaOH 4%, +2,9 % Na Sitrat) sebanyak 500 µL
ke dalam tabung sentrifuge yang telah berisi sputum sebanyak 500 µL.
3) Campurkan / homogenisasikan tabung yang berisi cairan sputum dan NaOH 4 %
diatas mesin pengguncang (vortex shaker) dengan kecepatan 2500 rpm 20 detik.
4) Sentrifuge larutan homogenisasi selama 15 menit pada kecepatan 3000 rpm. Buang
supernatan
5) Tambahkan sedimen dengan larutan HCl sebanyak 100µL kemudian
dihomoginesasikan dengan menggunakan vortex shaker.
6) Ambil dan pilih bagian dari dahak yang purulen yang telah didekontaminasi dengan
menggunakan ose atau lidi

Prosedur Kerja :
1. Pemeriksaan Mikroskopis
a. Metode Ziehl Neelsen
1) Sediaan di genangi dengan cat Ziehl Neelsen A Karbol fuchein selama 5 menit
sambil di panaskan jangan mendidih.
2) Cuci dengan air mengalir
3) Tambahkan cat Ziehl Neelsen B (asam alcohol) selama 30 detik, buang
4) Cuci dengan air mengalir
5) Genangi dengan cat Ziehl Neelsen C (methylene blue) biarkan selama 1 menit
6) Cuci dengan air mengalir.
7) Keringkan sediaan pada rak pengering
 8) Preparat siap utk diperiksa.
9) Pemeriksaan dgn mikroskop pembesaran 1000x
b. Metode Kinyoun Gabbet
1) Preparat difiksasi terlebih dahulu
2) Genangi preparat dengan cat Kinyoun, biarkan 3-5 menit
3) Sisa cat dibuang, lalu cuci dengan air mengalur
4) Genangi dengan cat Gabbet, biarkan selama 1-3 menit
5) Sisa cat dibuang, cuci, kemudian dikeringkan
6) Periksa dibawah mikroskop perbesaran 1000x
2. Pembiakan Pada Media
a. Media Lowenstein Jensen
1) Sputum / dahak yang telah dilakukan dekontaminasi dengan NaOH 4 %.
2) Kemudian Inokulasi pada media L. Jensen mengunakan ose.
3) Kemudian Inkubasi pada alat inkubator pada 37⁰C selama 4-6 minggu.
4) Amati pertumbuhan koloni bakteri pada media L. Jensen.
5) Ciri-ciri pertumbuhan koloni, seperti bungan kol, koloni bewarna kuning keputih-
putihan.
b. Media Ogawa
1) Sputum / dahak yang telah dilakukan dekontaminasi dengan NaOH 4 %.
2) Kemudian Inokulasi pada media Ogawamengunakan ose.
3) Kemudian Inkubasi pada alat inkubator pada 37⁰C selama 4-6 minggu.
4) Amati pertumbuhan koloni bakteri pada media Ogawa
5) Koloni tumbuh di atas permukaan cairan biakan berwarna kuning pucat, warna
media disekitar koloni menjadi hijau tua
3. Tes Biokimia
Uji Niacin
1) Memasukkan 2 mL akuades mendidih ke dalam media yang berisi koloni kuman
(minimal 100 koloni)
2) biarkan 10 menit agar niasin terekstraksi,
3) Selanjutnya cairan ekstrak dipipet 0,2 mL dan dimasukkan ke dalam tabung lain.
4) Kemudian ditambahkan 0,1 mL anilin 4% 31 dalam alkohol dan 0,1 mL cyanogen
bromide 10% dalam akuades dan dicampur,
5) Setelah 5 menit dibaca hasilnya
4. Tes Tuberkulin
 Tes mantoux dilakukan dengan cara menyuntikkan sejumlah zat kecil cairan yang
disebut dengan PPD tuberculin, pada kulit lengan. Pasca penyuntikan, biasanya akan
terbentuk benjolan kecil di permukaan kulit. Jika tidak muncul pembesaran pada
benjolan, dapat disimpulkan bahwa hasil tes Mantoux negatif atau pasien tidak
terpapar kuman TB. Sementara, pada hasil tes yang menunjukkan penambahan ukuran
benjolan, biasanya sebanyak 5-9 mm dan terlihat adanya peradangan, ini berarti tes
Mantoux dikatakan positif, yakni pasien sedang atau sudah pernah terpapar kuman
TB. Hasil tes ini memerlukan pemeriksaan lebih lanjut untuk memastikan apakah
terdapat infeksi TB.
5. Tes PCR
Pada metode ini bahan pemeriksaan lebih dahulu didekontaminasi, lalu dinetralisasi,
kemudian dicuci dengan bufer dan disentrifus. Setelah supernatan dibuang,
sedimennya dibuat suspensi, lalu dilakukan ekstraksi DNA. Dari penelitian Buck et al.
mendapatkan cara ekstraksi DNA yang terbaik adalah dengan Sonication. Dengan
cara ini DNA dapat ditemukan jika dalam bahan terdapat 10 - 1000 basil; sedang
dengan cara lain misal dengan Proteinase K, harus terdapat > 1000 basil supaya DNA
dapat ditemukan. Hasil ekstraksi kemudian dipresipitasi dengan alkohol dan presipitat
yang mengandung DNA disuspensikan dalam akuades untuk selanjutnya diperbanyak
dengan PCR.

Hasil :
 Pemeriksaan Mikroskopis
 Pewarnaan Ziehl
Neelsen

- Bentuk: batang lurus agak bengkok

- Warna: merah
- Tidak berspora dan tidak berkapsul
- Ukuran: lebar 0,3-0,6 mm. Panjang 1-4 mm

 Pewarnaan Kinyoun Gabbet

 Media Lowen
Jensens

- Bentuk: bulat
- Warna: kuning
gading
- Permukaan: cembung kering

 Media Ogawa
 - Bentuk: bulat
- Warna: kuning gading
- Permukaan: cembung kering

 Uji Niasin

- Warna: kuning

 Uji Tuberculin

- (+) positif = bentol meradang semakin besar

Pembahasan :
Pemeriksaan dengan cara kultur lebih sensitif dan spesifik dibandingkan dengan
pemeriksaan sputum secara mikroskopis. Melalui pemeriksaan kultur, diferensiasi antara
bakteri mati dan hidup serta diferensiasi antara M tuberculosis. dan NTM dapat dilakukan.
Selain itu pada isolat yang ditemukan, dapat dilakukan uji kepekaan sehingga akan mampu
memandu pengobatan lebih baik. Untuk mendapatkan 50% kesempatan BTA positif
diperlukan kuman BTA pada sputum 1000 kuman per ml, sementara dengan tehnik kultur
yang baik hasil positif dapat terjadi walau kuman hidup berkisar antara 10-100 kuman per ml.
Pada pemeriksaan mikroskopis langsung, hasil positif pada mayoritas kasus baru
terjadi jika jumlah kuman per ml sputum minimal 5000 kuman, sementara untuk kultur
diperlukan 1000 kuman. Pada umumnya biakan sputum akan meningkatkan penemuan kasus
sekitar 20 – 30% dari jumlah keseluruhan TB paru BTA positif. Oleh sebab itu, pemeriksaan
kultur sangat sangat bermanfaat untuk kasus paucibasile seperti pada kasus TB ekstra paru,
TB anak, dan TB sistemik (Sjahrurachman, 2008). Biakan sputum merupakan suatu metode
pemeriksaan yang kompleks, membutuhkan sarana, prasarana, dan peralatan yang lebih
mahal dan pemeriksaan mikroskopis langsung. Indikasi utama melakukan pemeriksaan kultur
apabila tiga kali BTA negatif, sedang yang bersangkutan dicurigai TB karena mempunyai
gejala saluran pernafasan, tersangka TB pada anak, spesimen berasal dari ekstra paru, dari
seorang tersangka TB, semua yang berkaitan dengan TB-HIV.
Mycobacteria merupakan mikroba tahan asam, serupa dengan rhodococcus dan
Nocardia. Tingkat ketahanan Mycobacteria terhadap asam bervariasi. Mycobacteria ada yang
bersifat pathogen dan ada juga yang tidak pathogen. Mycobacteria tidak pathogen mudah
ditemukan di lingkungan manusia, khususnya dalam air. Mycobacteria lingkungan ini
merupakan cemaran yang harus diantisipasi agar tidak mengacaukan hasil pemeriksaan kultur
dan uji kepekaan. Koloni M tuberculosis yang tumbuh pada media perbenihan mempunyai
sifat tidak terjadi perubahan warna koloni setelah terpapar cahaya, uji akumulasi niasin
positif, uji reduksi nitrat positif, uji katalase tahan panas 680C negatif, dan uji PNB negatif.
Jika fasilitas laboratorium tidak memadai, identifikasi M tuberculosis minimal didasarkan
pada hasil pewarnaan, kecepatan tumbuh, morfologi koloni, uji PNB , dan salah satu uji dari
niasin, reduksi nitrat, katalase tahan panas.
Adapun ciri-ciri M tuberculosa merupakan sel berbentuk batang lurus, berukuran 0,4
x 3 um. Kuman tidak berspora dan tidak berkapsul. Pada pewarnaan ZN tampak kuman
berwarna merah dengan latar belakang biru. Pada pewarnaan fluorokrom berfluoresensi
dengan warna kuning jingga. Kuman sulit diwarnai dengan cat Gram, tapi bila berhasil maka
hasilnya adalah Gram positif.
Deteksi kuman TBC dengan teknik PCR mempunyai sensitivitas yang amat tinggi.
PCR merupakan cara amplifikasi DNA, dalam hal ini DNA Mycobacterium tuberculosis,
secara in vitro. Proses ini memerlukan DNA cetakan (template) untai ganda yang
mengandung DNA target, enzim DNA polymerase, nukleotida trifosfat, dan sepasang primer.
deteksi Mycobacterium tuberculosis dilakukan dengan teknik PCR, mengingat akurasinya
yang baik dan membutuhkan waktu pemeriksaan lebih singkat. Hasil negatif pemeriksaan
BTA secara mikroskopik sebaiknya dilanjutkan dengan teknik PCR guna menghindari salah
diagnosis. Deteksi Mycobacterium tuberculosis, baik dengan teknik PCR maupun dengan
kultur bakteri secara statistik berbeda bermakna dari deteksi BTA secara mikroskopik.
Dengan demikian, Mycobacterium tuberculosis dalam sputum sering tidak terdeteksi sebagai
BTA secara mikroskopik. Pemeriksaan secara PCR menunjukkan hasil yang berbeda yaitu
penderita yang baru menjalani pengobatan ≥ 2 bulan hasilnya masih positif dan masih ada
juga penderita TB yang hampir selesai menjalani pengobatan juga masih ditemukan positif
TB paru. Oleh karena itu, PCR sangat spesifik dalam mendeteksi Mycobacterium
tuberculosis. Banyak Mycobacterium tuberculosis yang tidak terdeteksi dengan pemeriksaan
mikroskopis (BTA) dapat dideteksi dengan teknik PCR.

Daftar Pustaka :
 https://caiherang.com/mycobacterium-tuberculosis/
 https://translate.google.com/translate?
u=https://en.wikipedia.org/wiki/Mycobacterium_tuberculosis&hl=id&sl=en&tl=id&cl
ient=srp&prev=search
 https://www.alodokter.com/tuberkulosis