BioTrends Vol.7 No.

2 Tahun 2016

BIOTEKNOLOGI CRISPR/CAS9: CARATERBARUUNTUK

“MEMUKUL JATUH GEN"
SUPATMI
Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI
Jl Raya Bogor Km 46 Cibinong 16911
Telp.0218754587; Fax. 0218754588
Email:patmi_bio@yahoo.com

P ada satu abad terakhir,

kemajuan teknologi di
bidang bioteknologi dan
biologi molekuler mengalami
peningkatan yang luar biasa.
Kemajuan tersebut dimulai sejak
ditemukannya teknologi PCR
(polymerase chain reaction) untuk
amplifikasi gen hingga teknologi
transgenesisyang mengantarkan
berbagai keberhasilan penelitian
di bidang biomedik dan pertanian.
Namun demikian, transgenesis
memiliki keterbatasan. Teknologi
transgenesisadalah teknologi
rekayasa genetika dengan
menyisipkan/mengintroduksi gen
asing untuk menciptakan sifat-
sifat baru yang memiliki nilai
agronomis/biomedis tinggi
(Hefferon, 2012) atau
memodifikasi sifat-sifat yang tidak
diinginkan. Penyisipan gen asing
tersebut menimbulkan
kekhawatiran publik atas produk-
produk hasil rekayasa genetika
khususnya apabila gen yang
diintroduksi memiliki hubungan
kekerabatan yangjauh seperti
misalnya kita menyisipkan gen
tertentu hewan pada tanaman
atau manusia. Hal ini tentu saja
menghambat transgenesis untuk
digunakan secara luas. Selain itu
untuk melepaskan produk
transgenesis diperlukan beberapa
regulasi terkait tentang produk-
produk rekayasa genetika
(transgenik) seperti uji keamanan
pangan dan hayati serta
lingkungan dalam rangka untuk
mengatasi keselamatan publik dan
ini menambah beban biaya
produksi yang besar (Todaka et
al., 2015). Untuk itu para ahli
berusaha mencari inovasi baru
untuk mengatasi keterbatasan-
keterbatasan teknologi
transgenesis tersebut. Berbagai
penelitian dilakukan untuk
mendapatkan metode manipulasi
fungsi gen yang lebih effisien,
aplikatif dan tepat sasaran.
Beberapa usaha tersebut
diantaranya adalah homologous
recombination dan RNA
interference (RNAi). RNAi menjadi

Gambar 1. Ilustrasi kartun genome editing , http://www.ecologise.in/2016/03/13/crispr-is-coming-with-

big-implications-for-food-farmers-consumers-and-nature/

31
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016

metode yang memungkinkan Genome editing adalah metode Activator-Like

Like Effector Nucleases
untuk mengetahuifungsi dari gen perakitan genetik dimana sebuah (TALENs) (Ledford, 2016). Teknik
yang akurat dan murah, namun sekuens DNA bisa disisipkan, ini berbeda dengan teknik
demikian, beberapa penelitian diganti dihapus, dan atau transgenesis klasik sebab tidak
menunjukkan bahwa dipindahkan dari genom suatu melibatkan pengambilan gen dari
penghambatan fungsi gen ini organisme ke organisme spesies lain melainkan
bersifat sementara dan laindengan bantuan suatu enzim mempercepat terjadinya prosproses
dimungkinkan menyebabkan nuklease yang berfungsi seperti mutasi genetik yang secara alami
penghambatan fungsi gen lain gunting molekuler (Schinkel & terjadi saat proses perkawinan
yang bukan merupakan gen target Schillberg, 2016). Tujuan dari /pemuliaan (Sprink et al., 2015).
(off-target effects) (Baulcombe, metode ini tak lain adalah Teknologi ini memungkinkan para
2004). mengedit susunan basa DNA pada peneliti untuk menciptakan
genom sehingga ketika mutasi secara permanen, namun
Saat ini, telah muncul teknologi diterjemahkan dalam bahasa demikian, teknik ini sangat mahal
genome editing yang asam amino bisa merubah sifat dan membutuhkan waktu yang
pendekatannya disinyalir lebih dari organisme tersebut. lamaa serta terbatas untuk
baik dari teknologi manipulasi gen Teknologi genome editing digunakan dalam skala luas
secara transgenesis klasikseperti tergolong baru karena baru resmi (Lusser et al., 2012). Untuk itu,
mengintroduksi sifat baru pada dipublikasikan pada tahun 2005. para peneliti berusaha untuk
tanaman atau hewan dengan Beberapa modul teknik genome menciptakan modul terbaru
rekombinasi genetik alami dengan editing yang telah digunakan genome editing yang lebih murah
cara mengawinkan dengan induk diantaranya Zinc Finger Nucleases dan memiliki presisi tinggi. Belum
yang lebih baik atau unggul. (ZFNs) dan Transcription lama ini, teknologi tersebut sudah

Gambar 2. Prinsip kerja dari CRISPR-Cas9

CRISPR Cas9 untuk pengeditan gen. 1) sgRNA yang terdiri dari sekuen
crRNA yang spesifik menyasar DNA target dan tracrRNA yang berinteraksi dengan Cas9
protein. 2) Terbentuk ikatan komplek antara sgRNA dengan pro protein Cas9 yang
mengandung aktivitas DNA endonuclease. 3) Ikatan komplek tersebut akan menyebabkan
dsDNA target terputus. 4) Situs yang terputus tersebut akan diperbaiki oleh lewat jalur
perbaikan DNA non--homologous
homologous end joining (NHEJ), proses ini bisa menye
menyebabkan insersi
atau penghapusan dari nukleotida yang menyebabkan rusaknya fungsi gen. Diambil dari
http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=100247
http://www.clontech.com/xxclt_ibcGetAttachment.jsp?cItemId=100247.

32
 BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016

ditemukan dan diberi namaCluster
Regularly Interspaced Short
Palindromic Repeats-associated
protein-9 nuclease (CRISPR-Cas 9).
Modul teknologi genome editing
ini disebut-disebut sebagai era
penemuan baru dan terbesar
dalam dunia biologi molekuler
(Gambar 1). Lalu, sebenarnya apa
pemberi jarak DNA(DNAspacer)
dan pengulangan frasa sekuen
yang sama (palindromic
sequence).Karena proses
pengulangan singkat sekuen basa
DNA tersebut maka disebut
dengan istilah CRISPR.
Ternyata,pola yang sama hampir
dimiliki di 40% bakteria dan 90%
serangan beberapa virus
Bakteriofage yang berdampak
pada kerusakan dari produk
makanan yang dihasilkan sehingga
menurunkan baik kuantitas dan
kualitas produk makanan yang
dihasilkan. Karena itulah para ahli
berusaha mengatasi hal tersebut.
Mereka akhirnya menemukan

Gambar 3. Organisme hasil genome editing dengan menggunakan teknik CRISPR.Kanan: Embrio zebrafish
yang memiliki kelebihan jaringan ventral berlebih; kiri: lalat buah yang memiliki mata berwarna
hitam dengan mengedit gen yang bertanggung jawab terhadap pigmen warna mata pada lalat
buah. Diambil dari Pennisi (2013).

itu CRISPR-Cas9, bagaimana cara di mikroba dengan lokasi yang cara bagaimana mendorong agar
kerjanya dan mengapa teknik ini berbeda.Pada mulanya para ahlibakteri ini melawan serangan dari
menjadi buah bibir? Jawabannya menduga bahwa sekuen yang virus Fage tersebut. Mirip dengan
dimulai dari penelitian pada tahun aneh itu hanyalah sampah, tetapi
prinsip vaksinasi, jadi bakteri
2007 mengenai kekebalan pada tahun 2005,tiga grupahli tersebut diekspose dengan virus
imunitas yang terjadi pada bioinformatika melaporkan tersebut agar melawan serangan
bakteri. adanya kesesuaian DNAbakteri virus. Menariknya bakteri tersebut
dengan DNA pada sekuens virus mampu menciptakan kekebalan
Asal Penemuan CRISPR Fage yang mengindikasikan imun sistem yang
adanya kemungkinan cara kerja memungkinkannya untuk resisten
Sebenarnya ide pertama dari CRISPR dalam mekanisme pada serangan virus yang kedua
teknik CRISPR ini bermula pada imunitas mikroba (Pennisi, 2013).
dan seterusnya. Sistem
tahun 1987, ketika sebuah tim Dan ini menjadi petunjuk yang pertahanan yang ditunjukkan oleh
peneliti mengamati fenomena menarik dalam perkembangan bakteri S. thermophilus tersebut
proses pengulangan sekuens yang CRISPR selanjutnya. menjadi sangat penting tidak
aneh pada salah satu ujung dari hanya bagi para ahli makanan dan
gen bakteri. Satu dekade Pada tahun 2007, para peneliti mikrobiologi tapi para ahli biologi
kemudian para ahli mikroba dari Danisco, yang bergerak dalam molekuler lainnya untuk meneliti
menemukan pola yang sama di industri komposisi makanan yang lebih lanjut. Akhirnya, Danisco dan
genom mikroba dimana sekuen dimiliki oleh DuPont, melakukan timberhasil merubah S.
dari DNA ternyata diikuti oleh penelitian mengenai bakteri thermophilus yang resisten
sekuen yang polanya hampir mirip Streptococcus thermophilusyang terhadap serangan Fage dengan
seperti pelengkapdari sekuen sangat penting dalam industri menambah atau menghapus
sebelumnya. Pola sekuen tersebut pembuatan yoghurt dan keju. spacer DNA yang bersesuaian
adalah 30 basa nukleotida yang Bakteri ini ternyata menjadi dengan Fage. Pada saat itu para
acak yang disebut sebagai bersifat lemah karena adanya ahli tersebut masih belum

33
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
memikirkan bahwa teknologi
tersebut adalah cara kerja CRISPR
dan potensi CRISPR sebagai
teknologi genom editingdalam
skala yang lebih besar.
Kemudian ahli dari Jerman,
Doudna dan Emmanuelle
Charpentier (2007)meneliti lebih
jauh dari sistem CRISPR ini dengan
mengaitkannya dengan protein-
protein lain untuk mengetahui
bagaimanaS. thermophilus ini
menggunakan DNA spacers dalam
sistem pertahanan imun mereka.
Kedua ahli ini fokus menggunakan
sistem CRISPR ini dengan protein
yang disebut Cas9 untuk
menyederhanakan sistem CRISPR
dibandingkan dengan yang lain
(Pennisi, 2013). Lalu bagaimana,
cara kerja dari CRISPR-Cas9 ini
hingga mampu mengedit DNA dari
genom organisme?.
Cara kerja CRISPR/Cas9
Ada dua komponen utama dalam
sistem CRISPR-Cas9 yaitu protein
Cas dan single guide RNA (sgRNA).
Dalam sistem CRISPR-Cas tipe II,
Cas 9 ini merupakan protein
penting yang menjadi karakteristik
utama dan sistem ini yang paling
banyak digunakan dalam
penelitian. Hal ini karena CRISPR-
Cas tipe II ini memiliki komponen
yang lebih sederhana yaitu 3
komponen (Cas9, crRNA dan
trRNA) yang lebih mudah
diadaptasi dibandingkan CRISPR-
Cas tipe I, III dan IV. Cas 9
berfungsi sebagai enzim yang
memotong DNA target di sekuen
yang posisinya dekat dengan situs
protospacer adjacent motif (PAM).
Sekuen di situs PAM ini biasanya
ditandai dengan 3 basa nukleotida
(NGG, dengan N adalah basa
nukleotida yang bisa berupa A:
Adenin; T: Timin; C: Cytocine; G:
Guanin). Protein cas9 ini memiliki
Streptococcus
thermophilusyang sangat
penting dalam industri
pembuatan yoghurt dan keju.
Bakteri ini ternyata menjadi
bersifat lemah karena adanya
serangan beberapa virus
Bakteriofage yang berdampak
pada kerusakan dari produk
makanan yang dihasilkan
sehingga menurunkan baik
kuantitas dan kualitas produk
makanan yang dihasilkan.
bakteri ini melawan serangan
dari virus Fage tersebut
2 situs homolog yaitu RuvC dan mengkombinasikan dengan jenis
HNH, yang masing-masing promotor dan sekuen dari enzim
memotong satu dari untai ganda restriksi lainnya tergantung dari
DNA, yang menghasilkan karakter genom yang ditargetkan.
potongan tumpul (blunt cut) pada Metode pengeditan dari CRISPR
sekuen DNA target. Selanjutnya, ini, sama dengan dua teknologi
sgRNA yang merupakan RNA sebelumnya yaitu adanya
buatan gabungan dari dua non- mekanisme reparasi akibat
coding RNA yaitu crRNA yang terpotongnya sekuen DNA target.
berfungsi sebagai guide yang bisa Mekanisme reparasi tersebut bisa
menyesuaikan dengan sekuen dari terjadi secara alami yang
DNA target dan tracrRNAyang bergabung dengan Non-
berfungsi sebagai scaffold. Sekuen homologous end joining (NHEJ)
sgRNA ini digunakan untuk men- maupun dengan menggunakan
target lokus genom cetakan eksternal yang diinginkan
tanaman/hewan yang secara seperti homology directed repair
34ector34us panjangnya 19-22bp, (HDR). Dari mekanisme perbaikan
dengan penambahan 3 bp sekuen ini maka akan terjadi insersi basa
PAM (NGG). Cas9 dan sgRNA atau penghapusan nukleotida
dapat dikonstruk dalam satu baru yang menyebabkan
vektor atau bisa menggunakan terjadinya disfungsi gen (Gambar
dua vektor yang terpisah dengan 2).(Sprink et al., 2015).
34
 BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016

Aplikasi CRISPR-Cas 9 jaringan daun. Sebagai contoh dengan teknologi CRISPR ini masih
pada tahun 2014, Shan dan tergolong sebagai GMO. Mereka
Sejak awal kemunculannya, koleganya menemukan metode menilai bahwa teknologi genome
teknologi CRISPR ini telah untuk menciptakan mutasi pada editing bukan termasuk dalam
membawa angina segar dalam padi dan gandum dengan kategori produk GMO, karena
dunia genome editing. Aplikasinya menggunakan teknik CRISPR ini tidak adanya DNA asing yang
yang sederhana dan relatif murah dengan menggunakan dimasukkan dan tidak melibatkan
telah banyak diterapkan di sel transformasi dari protoplas penggunaan bakteri
eukariotik, tikus, nematode dan dengan masa regenerasi mutan Agrobacterium yang bersifat
tanaman. Sebagai contoh nyata yang relatif cepat selama 13-17 pathogen dalam perakitannya
Pennisi (2013) melaporkan bahwa minggu. Menariknya, pada bulan (Puchta & Fauser , 2013; Araki &
8 bulan sejak kemunculannya di April 2015, para peneliti Ishii, 2015). Dengan kata lain
tahun 2007, teknologi CRISPR ini melaporkan bahwa mereka teknik ini meniru proses alami dari
mampu menciptakan varietas berhasil mengedit embrio sel dan tidak menyebabkan
baru dari lalat buah yang memiliki manusia dengan menggunakan transformasi gen secara
mata berwarna hitam dengan teknik CRISPR ini. Meskipun hal ini keseluruhan yang merupakan isu
mengedit gen yang bertanggung memunculkan perdebatan di sensitif dari produk GMO. Karena
jawab terhadap pigmen warna kalangan masyarakat dunia itulah, para peneliti-peneliti
mata pada lalat buah (Gambar 3). mengenai etis atau tidak etisnya internasional berdebat mengenai
Dalam dunia industri dan teknologi CRISPR ini digunakan terminologi GMO yang dirasa
therapeutik, penggunaan CRISPR untuk penelitian pada manusia regulasinya tidak lagi valid untuk
sangat gencar dilakukan, terbukti (Jiang et al., 2013; Ledford et al., produk-produk hasil dari teknik
dengan dana penelitian yang 2015). Dari beberapa contoh genome editing karena organisme
dikeluarkan mencapai hamper 89 aplikasi dan trend dari yang dihasilkan lebih disebut
juta dollar pada tahun penggunaan teknologi CRISPR sebagai Genetically edited
2013.Menariknya, publikasi- yang cenderung meningkat dalam organism (GEO) (Qaim&
publikasi ilmiah yang membahas dunia penelitian baik biomedis Zilberman, 2003). Menariknya,
tentang aplikasi teknik CRISPR ini dan pertanian merupakan bukti baru baru ini US Department of
dalam dunia medis meningkat nyata bahwa teknik ini merupakan Agriculture (USDA) meloloskan
tajamsepertipenggunaan CRISPR- gebrakan baru dalam dunia jamur hasil dari teknologi CRISPR
Cas 9 untuk terapi gen secara in genome editing dan biologi ini dari regulasi sebagai produk
vivo(Ledford, 2015). Menariknya, molekuler yang tentu saja GMO yang merupakan lampu
publikasi-publikasi tersebut menimbulkan status pro dan hijau dari produk hasil genome
tercatat sebagai terbesar kedua kontra mengenai status produk editing(Waltz, 2016). Meskipun
setelah teknologi induced yang dihasilkannya di masa depan. begitu, kekhawatiran-
pluripotent stem sel (iPS) dan kekhawatiran mengenai
diikuti oleh Zinc fingers dan Talens Status dan Masa Depan CRISPR- modifikasi genom hasil dari teknik
(Ledford, 2015). Cas 9 genome editing ini, yang
dimungkinkan tidak bisa
Penerapan teknologi CRISPR ini Mudah dan efisiennya dibedakan dengan mutasi alami
juga menjadi buah bibir dalam penggunaan teknologi CRISPR ini yang terjadi di alam dan hasil
dunia pertanian. Setidaknya pada bukan berarti tanpa hambatan. pemuliaan konvensional seperti
tahun 2013, ada delapan publikasi Sejak kemunculannya, banyak pada tanaman atau mutagenesis
ilmiah yang menerapkan teknik ini para peneliti yang kimia atau fisik yang terjadi. Hal
pada genom tanaman yaitu di memperdebatkan tentang siapa ini menimbulkan kekhawatiran
Arabidopsis, tembakau, padi, yang berhak mendapatkan paten adanya pencemaran plasma
gandum dan sorgum (Belhaj et al., dari teknologi ini karena nutfah dari alam dan
2013). Teknik CRISPR ini diuji banyaknya pengajuan klaim atas kekhawatiran akan kestabilan dari
dengan assay ekspresi sementara teknologi ini.Selain itu para gen yang diturunkan ke generasi
dengan menggunakan peneliti internasional juga mulai selanjutnya. Karena itulah regulasi
transformasi dari protoplas memperdebatkan mengenai mengenai GEO ini menjadi topik
tanaman serta agroinfiltrasi di apakah produk yang dihasilkan yang panas di kalangan pakar

35
BioTrends Vol.7 No.2 Tahun 2016
peneliti internasional sampai saat
ini. Evaluasi mengenai produk-
produk baru dan akhir yang
dihasilkan dari teknik genome
editing ini mungkin perlu menjadi
perhatian yang serius kedepannya
oleh para ahli, agar masyarakat
ter-edukasi dan mampu
menentukan pilihan dan sikap
yang benar terhadap produk-
produk dari GMO/GEO ini. Namun
demikian, terlepas dari adanya
kontroversi terkait regulasi GMO
maupun GEO, teknologi CRISPR-
Cas9 ini memberikan angin segar
bagi para peneliti, industri dan
masyarakat pada umumnya.
Karena pada akhirnya, inovasi dan
perkembangan bioteknologi
hewan dan tanaman yang dulu
sukar diprediksi akan tercerahkan
kedepannya, terutama dengan
maraknya isu-isu mengenai
pemanasan global dan climate
change yang sekarang banyak
diperbincangkan.
Daftar Pustaka
Araki M & Ishii T. (2015): Towards Lusser M, Parisi C, Plan D,
social acceptance of plant
breeding by genome editing.
Trends in plant science, 20(3),
145-149.
Baulcombe D. (2004) : RNA
silencing in plants.
Nature431, 356-363.
Belhaj K, Chaparro-Garcia A,
Kamoun S, Nekrasov V.
(2013): Plant genome editing
made easy: targeted
mutagenesis in model and
crop plants using the
CRISPR/Cas system. Plant
Methods 9, 39.
Hartung F, Schiemann J. (2014):
Precise plant breeding using
new genome editing
techniques: opportunities,
safety and regulation in the
EU. The Plant Journal 78, 742-
752.
Hefferon KL. (2012): Plant virus
expression vectors set the
stage as production
platforms for
biopharmaceutical proteins. Shan Q, Wang Y, Li J, Gao C.
Virology, 433(1), 1-6.
http://www.clontech.com/xxclt_i
bcGetAttachment.jsp?cItemI
d=100247.Mei 2013.
http://www.ecologise.in/2016/03
/13/crispr-is-coming-with-
big-implications-for-food-
farmers-consumers-and-
nature/. 13 Maret 2016
Ledford, H. (2015): CRISPR, the
disruptor. Nature, 522(7554),
20-24.
Ledford, H. (2016): Riding the
CRISPR Wave. Nature,
531(7593), 156-159.
Rodriguez-Cerezo E. (2012):
Deployment of new
biotechnologies in plant
breeding. Nat Biotech 30,
231-239.
Pennisi, E. (2013): The CRISPR
craze. Science, 341(6148),
833-836.
Puchta H, Fauser F. (2013): Gene
targeting in plants: 25 years
later. The International
Journal of Developmental
Biology 57, 629-637.
Qaim, M, & Zilberman, D. (2003):
Yield effects of genetically
modified crops in developing
countries. Science, 299(5608),
900-902.
36
Jiang, W, Bikard, D, Cox, D, Zhang,
F, & Marraffini, LA. (2013):
RNA-guided editing of
bacterial genomes using
CRISPR-Cas systems. Nature
biotechnology, 31(3), 233-
239.
(2014): Genome editing in
rice and wheat using the
CRISPR/Cas system. Nat
Protocols 9, 2395-2410.
Sprink T, Metje J, Hartung F.
(2015): Plant genome editing
by novel tools: TALEN and
other sequence specific
nucleases. Current Opinion in
Biotechnology 32, 47-53.
Todaka D, Shinozaki K, &
Yamaguchi-Shinozaki K.
(2015): Recent advances in
the dissection of drought-
stress regulatory networks
and strategies for
development of drought-
tolerant transgenic rice
plants. Frontiers in plant
science, 6, 84.
Schinkel H & Schillberg S. (2016):
Genome editing: intellectual
property and product
development in plant
biotechnology. Plant cell
reports, 1-5.
Waltz E. (2016): Gene-edited
CRISPR mushroom escapes
US regulation. Nature News,
532, 293.