PRAKTIKUM KE 4

PENGECATAN GRAM

I. Prinsip
Prinsip pengecatan Gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna
dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%.

II. Tujuan
1.Melalui praktikum pengecatan Gram mahasiswa dapat Melakukan
pengecatan Gram
2. Mahasiswa mampu membedakan hasil Gram (+) dan Gram (-)
3. Menuliskan hasil pengecatan Gram
4. Membuat kesimpulan dari hasil pengecatan Gram

III. Dasar Teori

Permaebilitas dinding sel
Teori ini berdasarkan tebal tipisnya lapisan peptidoglikan dalam dinding
sel. Kuman Gram (+) mempunyai susunan dinding sel yang kompak dengan
lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permaebilitas kurang dan
komplek kristal violet jodium tidak dapat keluar.Kuman Gram (-) mempunyai
mempunyai lapisan peptidoglikan yang tipis hanya 1-2 lapisan dan susunan
dinding sel tidak kompak, permaebilitas dinding sel lebih besar, sehingga
masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristas violet-jodium.
- Pada pengecatan dengan Gram A semua bakteri berwarna violet
- Pada pengecatan dengan Gram B terjadi perubahan, yang tadinya berwarna
violet berubah menjadi violet tua – hitam
- Pada pelunturan dengan Gram C, bakteri Gram (+) tetap berwarna violet
sedangkan bakteri yang Gram (-) menjadi tidak berwarna/pucat.
Pada pengecatan dengan Gram D, bakteri Gram (+) tetap berwarna violet
sedangkan bakteri Gram (-) akan berwarna merah oleh safranir. O di dalam
Gram D
 Tugas mahasiswa sebelum praktikum :
1. Menyiapkan alat dan bahan
Alat : rak pengecatan, pipet tetes
Bahan : Gram A, B, C dan D.

IV. Alat dan Bahan

Alat : rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes, kran air mengalir
Bahan :
Cat yang digunakan :
1. Gram A : 3. Gram C (bahan pelarut)
- 2 gram crystal violet - 50 ml aceton
- 20 ml alcohol 95% - 50 ml alcohol 95%
- 0,8 gram ammonium oksalat
- 80 ml aquadest

2. Gram B (lugol) 4. Gram D

- 1 gram iodium - 0,25 gram safranin O
- 2 gram kalium iodide - 10 ml alcohol 95%
- 300 ml aquadest - 90 ml aquadest

V. Prosedur Kerja
1. Sediaan yang sudah di fixer, digenangi dengan cat Gram A, sampai
menutupi seluruh sediaan, diamkan 1 menit.
2. Cuci dengan air sebentar
3. Genangi dengan Gram B selama 1 menit
4. Cuci dengan air sebentar
5. Larutkan warnanya dengan menggenangi sediaan dengan Gram C selama
± 30 detik, sampai tidak kelihatan adanya merah yang luntur
6. Cuci dengan air sebentar
7. Genangi dengan gram D selama 30 detk
8. Cuci dengan air sampai bersih keringkan, siap dilihat di mikroskop
Gambar

1. Ungu Kristal 2. Buanglah kelebihan 3. Bilas dengan air

1 menit zat warna

4. Iodium 2 menit 5. Buanglah kelebihan 6. Bilas dengan air

zat warna

7. lakukanlah pemucatan 8. Bilas dengan air 9. Safranin

Dengan alkohol 95% 30 detik

10. Buanglah kelebihan 11. Bilas dengan air 12. Seraplah sisa-sisa air
zat warna dengan kertas serap
Hasil Pengecatan :
Gram (+) : berwarna violet
Gram (-) : berwarna merah

Gambar 4. Gambar 5
Hasil pengecatan Gram : Hasil Pengecatan Gram:
Cocus Gram (+) Basil Gram (-)

Gambar 6
Hasil Pengecatan Gram:
Cocus Gram (-)

Sifat pengecatan :
Warna pengecatan :
Susunan bakteri :
Bentuk bakteri :
Tugas mahasiswa setelah praktikum :
1. Membereskan/mencuci alat yg telah digunakan
2. Melakukan desinfeksi meja kerja
3. Mengisi lembar kerja mahasiswa
4. Membuat laporan praktikum
 PRAKTIKUM KE
PENGECATAN BTA
METHODEZIEHL NEELSEN

I. Prinsip
Dinding bakteri yang tahan asam mempunyai lapisan lilin dan lemak yang
sukar ditembus cat. Oleh karena pengaruh fenol dan pemanasan maka lapisan
lilin dan lemak itu dapat ditembus cat basic fuchsin. Pada waktu pencucian
lapisan lilin dan lemak yang terbuka akan merapat kembali. Pada pencucian
dengan asam alkohol warna fuchsin tidak dilepas. Sedangkan pada bakteri
tidak tahan asam akan luntur dan mengambil warna biru dari methylen blue.

II. Tujuan
Mahasiswa terampil :
Melakukan pengecatan BTA metode Ziehl-Neelsen dan mampu membedakan
hasil pengecatan BTA (+) dan BTA (-)

III. Dasar Teori

Bakteri tahan asam adalah bakteri yang mempertahankan zat
warna karbol-fuchsin (fuchsin basa yang dilarutkan dalam suatu campuran
phenol-alkohol-air) meskipun dicuci dengan asam klorida dalam alkohol.
Sediaan sel bakteri pada gelas alas disiram dengan cairan karbol fuchsin
kemudian dipanaskan sampai keluar uap. Setelah itu, zat warna dicuci dengan
asam alkohol dan akhirnya diberi warna kontras (biru atau hijau)..
Mycrobakteria adalah bakteri aerob berbentuk batang, yang tidak
membentuk spora. Walaupun tidak mudah diwarnai bakteri ini tahan terhadap
penghilangan warna (deklorisasi) oleh asam atau alkohol dan karena itu
dinamakan basil tahan asam. Ciri –ciri khas Mycobakterium tuberculosis
dalam jaringan, basil tuberkel merupakan batang ramping lurus berukuran
kira-kira 0,4 x 3 µm. Pada perbenihan buatan terlihat bentuk coccus dan
filamen. 
 Mycobakteria tidak dapat diklasifikasikan sebagai gram positif atau gram
negatif. Sekali diwarnai dengan zat warna basa, warna tersebut tidak dapat
dihilangkan dengan alkohol, meski dibubuhi dengan iodium. Basil
tuberkel yang sebenarnya ditandai oleh sifat tahan asam misalnya 95 % etil
alkohol yang mengandung 3 % asam hidroklorida (asam alkohol) dengan
cepat akan menghilangkan warna semua bakteri kecuali Mycobakteria. Sifat
tahan asam ini bergantung pada integritas struktur selubung berlilin. Pada
dahak atau irisan jaringan, Mycobakteria dapat diperlihatkan karena memberi
fluoresensi kuning jingga setelah diwarnai dengan zat warna fluorokrom
(misalnya auramin, rodamin).

Proses pengecatan:
- Pada pengecatan dengan karbol fuchsin dan dipanaskan, selubung lemak pada
BTA terbuka, cat masuk ke dalam badan bakteri. Bakteri yang tidak tahan
asam dengan mudah menyerap cat, dengan pemanasan atau tidak. Semua
bakteri (BTA dan BTTA) berwarna merah.
- Pada waktu dicuci dengan air, selubung lemak pada BTA tertutup kembali,
sehingga waktu dilarutkan dengan asam alkohol BTA berwarna merah dan
BTTA berwarna pucat/jernih.
- Pada pengecatan dengan metylen biru, BTA tetap berwarna sedangkan BTTA
berwarna biru.

Tugas mahasiswa sebelum praktikum :

1. Menyiapkan alat dan bahan
Alat : Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes, bunsen,
Bahan : Cat Ziehl-Neelsen A, Ziehl-Neelsen B, Ziehl-Neelsen C

IV. Alat dan bahan

Alat :Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes, bunsen, kran air mengalir.
Bahan :
a. Ziehl-Neelsen A :
- 10 ml 3% alkohol fuchsin
- 90 ml 5% phenol
b. Ziehl-Neelsen B :
- 3 ml asam klorida pekat (37%)
 - 97 ml alkohol 95%
c. Ziehl neelsen C :
- 0,1 gram methylen biru
- 100 ml aquadest

V. Prosedur Kerja
1. Sediaan yang sudah diviksasi, diletakkan pada jembatan pengecatan,
digenangi dengan ZN A. Lewatkan nyala api spritus di bawah sediaan,
sampai selalu keluar uapnya, tetapi jangan sampai mendidih/kering selama 5
menit
2. Cat dibuang dicuci dengan air mengalir
3. Larutkan warna merah pada sediaan sampai bersih, dengan ZN. B (asam
alkohol)
4. Cuci dengan air mengalir
5. Genangi sediaan dengan ZN. C (metylen biru), selama 20-30 detik
6. Cuci dengan air mengalir, keringkan

Hasil Pengecatan:
BTA (+) : bakteri tahan asam positif : berwarna merah
BTA (-) : bakteri tahan asam negatif : berwarna biru

Gambar 7
Hasil pengecatan BTA (+) metode Ziehl-Neelsen

Tugas:
1. Gambarkan hasil pengecatan BTA yang saudara lakukan
2. Berilah keterangan tentang sifat pengecatan, warna pengecatan, susunan
bakteri, bentuk bakteri

Sifat pengecatan :
Warna pengecatan :
Susunan bakteri :
Bentuk bakteri :

Tugas mahasiswa setelah praktikum :

1. Membereskan/mencuci alat yg telah digunakan
2. Melakukan desinfeksi meja kerja
3. Mengisi lembar kerja mahasiswa
4. Membuat laporan praktikum
 PERTEMUAN IV
PENGECATAN GRANULA METHACHROMATIS MENURUT NEISSER
I. Tujuan
Mahasiswa terampil :
Melakukan pengecatan Granula Methachromatis metode Neisser dan
mampu membedakan bakteri bergranula dan tidak bergranula

III. Dasar Teori

Granula metakromatik disebut juga granula volutin. Granula metakromatik
tidak hanya ditemukan pada Corynebacterium diphtheria tetapi juga di
beberapa bakteri selain Corynebacterium diphtheria fungi, algae, dan
protozoa. Granula metakromatik mengandung polifosfat, asam ribonukleat,dan
protein. Granula metakromatik sangat mungkin mempunyai fungsi sebagai
sumber cadangan energi. 
Semua bakteri gram negative tidak tahan asam, sedangkan bakteri Gram
positif ada yang tahan asam dan ada yang tidak tahan asam. Di dalam
sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik yang terdiri atas volutin,
granula glikogen serta granula lemak. Granula metakhromatik sering
ditemukan pada jenis-jenis kuman pathogen tertentu dan berbentuk khas untuk
kuman tersebut. Didalam sitoplasma dapat ditemukan granula metakhromatik
yang didalam sediaan mikroskop.
Prinsip
pengecatan dengan Neisser A menyebabkan granula Babes Ernst
(poolkarrel) berwarna violet hitam, cat tadi oleh granula bakteri dipegang kuat
terhadap air. Sehingga dengan cat Neisser B tidak berubah (luntur), badan
bakteri akan terlunturkan oleh air yang terdapat pada Neisser B sehingga
mengambil warna kuning atau coklat dari Neisser B.
1. Pada pengecatan dengan Neisser A, granula berwarna biru tua, badan bakteri
berwarna biru muda.
2. Dicuci dengan aquadest, granula berwarna biru, badan bakteri tidak berwarna
3. pengecatan dengan Neisser B, memberikan warna coklat/kuning kepada badan
bakteri.
Tugas mahasiswa sebelum praktikum :
menyiapkan alat dan bahan
Alat : Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes.
Bahan : Cat Neisser A dan Neisser B

III Alat dan bahan :

Alat :Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes, kran air mengalir.
Bahan :
 Neisser A:
- 0,1 gram methylen biru
- 2 ml alkohol absolute
- 5 ml asam asetat pekat
- 95 ml aquadest
Neisser B:
- 0,2 gram Bismarck brown/visuluin
- 100 ml aquadest
IV. Prosedur Kerja :
1. Sediaan digenangi dengan Neisser A selama 60 detik
2. Cuci dengan absolute
3. Genangi dengan Neisser B selama 10 detik
4. Cuci dengan aquadest
5. Keringkan di udara. Periksa dengan mikroskop
Hasil Pengecatan
Granula di ujung badan bakteri akan berwarna biru oleh methylen biru dan
badan bakteri berwarna kuning atau coklat.
 Gambar 8. Hasil pengecatan Granulla metode Neisser
Tugas:
1. Gambarkan hasil pengecatan Granula yang saudara lakukan
2. Berilah keterangan tentang sifat pengecatan, warna pengecatan, susunan
bakteri, bentuk bakteri

Sifat pengecatan :
Warna pengecatan :
Susunan bakteri :
Bentuk bakteri :

Tugas mahasiswa setelah praktikum :

1. Membereskan/mencuci alat yg telah digunakan
2. Melakukan desinfeksi meja kerja
3. Mengisi lembar kerja mahasiswa
4. Membuat laporan praktikum
 PRAKTIKUM KE
PENGECATAN KAPSUL BAKTERI MENURUT BURRY GINS

I. Tujuan
Mahasiswa terampil :
Melakukan pengecatan Kapsul bakteri metode Burry Gins dan mampu
membedakan hasil pengecatan berupa kapsul dan badan bakteri

II. Dasar Teori

Beberapa jenis bakteri dan amoeba hijau-biru mengeluarkan bahan-bahan
yang amat berlendir dan lengket pada permukaan selnya, melengkungi dinding
sel. Bila bahan berlendir tersebut kompak dan tampak sebagai suatu bentuk
yang pasti ( bundar/lonjong) maka disebut kapsul, tetapi bila tidak teratur
bentuknya dan menempelnya pada sel kurang erat maka disebut selaput lendir.
Kapsul dan lendir tidaklah esensial bagi kehidupan sel, tapi dapat
berfungsi sebagai makanan cadangan, perlindungan terhadap fagositosis ( baik
dalam tubuh inang maupun dialam bebas )atau perlindungan terhadap
dehidrasi. Kemampuan menghasilkan kapsul merupakan sifat genetis, tetapi
produksinya sangat dipengaruhi oleh komposisi medium tempat
ditumbuhkannya sel-sel yang bersangkutan.
Ukuran kapsul berbeda-beda menurut jenis bakterinya dan juga dapat
berbeda diantara jalur-jalur yang berlainan dalam satu spesies.Pada beberapa
jenis bakteri adanya kapsul sebagai petunjuk virulensi. Semua kapsul   dapat
larut dalam air. Komposisi kimiawi kapsul ada yang berupa glukosa( misalnya
 dektrosa pada leokonostok mesendteroides), polimer gula amino (misalnya
asamhialuronat pada Staphylococcus piogenik), polipeptida (misalnya polimer
asam D-glutamat pada Bacillus antraksis) atau kompleks polisakarida protein
( misalnya B disentri). Kapsula bakteri tidak berwarna sehingga untuk
mengetahui ada tidaknya kapsula bakteri perlu dilakukan pewarnaan khusus.
Pewarnaan ini bisa dilakukan dengan menggunakan nigrosin, merah kongo
atau tinta cina. Setelah ditambahkan pewarna yang tidak menembus kapsul,
maka kapsul dapat tampak dengan menggunakan mikroskop cahaya.

1. Penambahan tinta Cina pada suspensi bakteri tidak akan memberi warna ke
badan bakteri dan kapsulnya, tetapi memberi warna pada object glassnya.
2. Pengecatan dengan solotio fuchsin, memberi warna merah pada badan bakteri
sedangkan kapsulnya tidak, begitu pula latar belakangnya.
Prinsip
Kapsul pada kuman tidak dapat mengikat zat warna, sehingga pada pemberian cat
tinta cina dan carbol fuchsin terlihat bulatan terang atau transparan dengan latar
belakang gelap dan badan kuman berwarna merah dari fuchsin.
Kapsul tidak dapat diwarnai , Badan bakteri yang latar belakangnya diwarnai

Tugas mahasiswa sebelum praktikum :

1. menyiapkan alat dan bahan
Alat : Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes.
Bahan : tinta cina, solotio fuchsin/safranin, aquadest

III. Alat dan bahan

Alat: Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes, kran air mengalir.
Bahan :
1. Tinta Cina/tinta India
2. Solotio fuchsin/safranin
- 0,25 gram basic fuchsin/safranin
- 100 ml aquadest
IV. Prosedur Kerja
1. Pada ujung sebelah kanan dari objek glass yang bersih dan bebas lemak,
dibuat suspensi bakteri dengan 1 ose air garam
2. Pada suspensi itu ditambahkan 1 ose tinta Cina, campur sampai homogen.
3. Dengan objek glass yang lain campuran itu dibuat sediaan apus = malit = tipis
4. Dibiarkan kering di udara
5. Digenangi dengan cat solotio fuchsin selama 1 menit
6. Cat dibuang, sediaan dikeringkan di udara dengan posisi miring, atau diserap
dengan kertas saring/tissue

Gambar

1.Taruhlah dua lup 2. Tambahkan 1 ose tinta 3. Lakukan fiksasi

penuh biakan susu K. cina Sebarkan organisme terhadap olesan untuk
Pneumonise tersebut dan biarkan melekatkan organisme
kering pada kaca obyek

4. Genangi olesan 5. Bilaslah kelebihan zat 6. Seraplah sisa-sisa

dengan ungu kristal warna dengan larutan larutan tembaga pada
selama 1 menit tembaga kaca obyek dengan
kertas serap

Hasil Pengecatan:
 Kapsul bakteri tidak berwarna, badan bakteri berwarna merah, latar belakang
sedikit hitam

Gambar 10. Hasil pengecatan Kapsul

Tugas:
1. Gambarkan hasil pengecatan Kapsul yang saudara lakukan
2. Berilah keterangan tentang sifat pengecatan, susunan bakteri, bentuk bakteri

Tugas mahasiswa setelah praktikum :

1. Membereskan/mencuci alat yg telah digunakan
2. Melakukan desinfeksi meja kerja
3. Mengisi lembar kerja mahasiswa
4. Membuat laporan praktikum
 PRAKTIKUM KE
PENGECATAN SPORA BAKTERI MENURUT KLEIN

I. Tujuan
Mahasiswa terampil :
Melakukan pengecatan Spora bakteri metode Klein dan mampu membedakan
hasil pengecatan berupa spora

III. Dasar Teori

Pewarnaan merupakan salah satu cara yang paling sering digunakan untuk
membedakan mikroorganisme, khususnya bakteri yaitu bakteri gram positif
dan gram negative. Kedua jenis bakteri dibedakan berdasarkan komponen
penyusun dinding sel. Selain itu, pewarnaan spora dapat membedakan ada atau
tidaknya spora dan letak dari spora tersebut di dalam sel. 
Zat warna dapat mengabsorbsi dan membiaskan cahaya, sehingga kontras
sel bakteri dengan sekelilingnya ditingkatkan. Zat warna yang digunakan
bersifat asam atau basa. Pada zat warna basa, bagian yang berperan dalam
memberikan warna disebut kromofor dan mempunyai muatan positif.
Sebaliknya pada zat warna asam bagian yang berperan memberikan zat warna
memiliki muatan negatif. Zat warna basa lebih banyak digunakan karena
muatan negatif banyak ditemukan pada permukaan sel. Contoh zat warna asam
antara lain cristal violet, methylen blue, safranin, Base Fuchsin, Malachite
Green, dll. Sedangkan zat warna basa antara lain Eosin, Congo Red dll.
Spora pada bakteri adalah endospora, suatu badan yang refraktil terdapat
dalam induk sel dan merupakan suatu stadium dari sel tersebut. Salah satu ciri
endospora bakteri adalah susunan kimiawinya. Semua endospora bakteri
mengandung sejumlah besar asam dipikolinat yaitu suatu substansi yang tidak
terdeteksi pada sel vegetatif. Sesungguhnya, asam tersebut merupakan 5-10 %
berat kering endospora. Letak endospora di dalam sel serta ukurannya selama
pembentukannya tidaklah sama bagi semua spesies sebagai contoh, beberapa
 spora adalah sentral yaitu dibentuk ditengah-tengah sel yang lain terminal yaitu
dibentuk di ujung dan yang lain lagi lateral yaitu dibentuk di tepi sel, Diameter
spora dapat lebih besar atau lebih kecil dari diameter sel
vegetatifnya.Dibandingkan dengan sel vegetatif, spora sangat resinten terhadap
kondisi-kondisi fisik yang kurang menguntungkan seperti suhu tinggi dan
kekeringan serta bahan-bahan kimia seperti desinfektan.Ketahanan tersebut
disebabkan oleh adanya selubung spora yang tebal dan keras.
- Pada pengecatan dengan ZN. A semua bagian bakteri berwarna merah.
- Pencucian dengan asam sulfat melarutkan warna merah pada badan bakteri,
sedangkan spora bakterinya tetap berwarna merah (spora tahan asam).
- Pengecatan dengan ZN. C memberi warna biru kepada badan bakteri, spora
tetap merah.

Tugas mahasiswa sebelum praktikum :

1. Menyiapkan alat dan bahan
Alat : Rak pengecatan, botol reagen, pipet tetes, bunsen
Bahan : Cat Ziehl-Neelsen A, Asam sulfat 1%, Ziehl-Neelsen C

III. Alat dan bahan

Alat :Rak pengecattan, botol reagen, pipet tetes, kran air mengalir, Bunsen.
Bahan :
- Ziehl Neelsen A (carbol fuchsin)
- Asam sulfat 1%
- Ziehl Neelsen C (solotio methylen biru)

IV. Prosedur Kerja

1. Sediaan ditempatkan pada jembatan pengecatan.
2. Genangi dengan ZN. A sampai semua permukaan sediaan yang ada sampelnya
tertutup dengan cat
3. Di bawah sediaan dilewatkan nyala api spiritus sampai selalu keluar uapnya,
jangan sampai mendidih, selama 5 menit.
4. Cuci dengan air mengalir
5. Cuci dengan asam sulfat 1% sampai sediaan kelihatan sedikit rose.
6. Cuci dengan air mengalir
7. Genangi dengan ZN. C selama 2 menit.
8. Cuci dengan air mengalir sampai bersih, keringkan, periksa dengan mikroskop.

Hasil Pengecatan:
Spora bakteri : berwarna merah, badan bakteri : berwarna biru.

Gambar 11. Hasil Pengecatan Spora

Tugas mahasiswa setelah praktikum :
1. Membereskan/mencuci alat yg telah digunakan
2. Melakukan desinfeksi meja kerja
3. Mengisi lembar kerja mahasiswa
4. Membuat laporan praktikum