PRAKTIKUM V

PEWARNAAN GRAM

Tujuan : Mempelajari prosedur pewarnaan Gram, memahami pentingnya setiap

langkah Dalam prosedur tersebut, dan secara umum memahami reaksi-reaksi
kimiawi yang terlibat di dalam prosedur tersebut.

Pendahuluan
Prosedur pewarnaan sederhana memungkinkan kita untuk melihat bakteri dengan
jelas, tetapi tidak dapat membedakan jenis-jenis bakteri yang berbeda dengan
morfologi yang sama. Pada tahun 1884, seorang ahli bakteriologi Denmark yaitu Dr.
Christian gram secara kebetulan menemukan prosedur pewarnaan Gram.Pewarnaan
ini mungkin merupakan salah satu prosedur yang amat penting dan paling banyak
digunakan dalam klasifikasi bakteri. Dengan metode ini, bakteri dapat dipisahkan
secara umum menjadi dua kelompok besar yaitu :

1. Organisme yang dapat menahan kompleks pewarna primer ungu kristal

iodium sampai akhir prosedur (sel-sel tampak ungu atau biru gelap), disebut
Gram positif.
2. Organisme yang kehilangan kompleks warna unhgu kristal pada waktu
pembilasan dengan alkohol namun kemudian terwarnai oleh pewarna
tandingan, safranin (sel-sel tampak merah muda) disebut Gram negatif. Karena
kemampuannya, untuk membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dari
kelompok lainnya, pewarnaan Gram disebut juga pewarnaan ‘differensial’.

Prinsip
Bakteri dengan pewarna utama (primary stain) yaitu dengan kristal violet atau
gentian violet akan berwarna ungu, melalui fiksasi warna dengan lugol (mordant)
akan menguatkan pelekatan warna utama, penambahan alkohol akan melunturkan
atau memucatkan (decolorizing agent) zat warna utama, sehingga pada sel gram
negatif sel menjadi tidak berwarna, tetapi pada sel gram positif tidak mengalami
pelunturan sehingga tetap berwarna ungu. Pada pemberian pewarna tandingan
(counterstain) yang berbeda dengan pewarna utama yaitu safranin, menyebabkan
bakteri gram negatif akan menyerap warna tersebut menjadi merah

1
Alat dan Bahan
Biakan
 kultur bakteri E.coli, S.aureus dan B.cereus (umur 24 jam) pada Agar nutrient
miring
Reagen
 kristal Violet
 Gram’s iodine (lugol)
 Alkohol (Etil alkohol)
 Safranin
Peralatan
 Kaca obyek bersh
 Pensil gelas atau spidol permanen
 Ose (loop) atau jarum tusuk (needle)
 Pembakar bunsen / spirtus
 Kertas serap
 Kertas lensa
 Mikroskop
 Bak pewarnaan

Prosedur Pewarnaan Gram

1. Sediakan empat kaca obyek yang bersih
2. Dengan teknik steril yang baik, buat olesan pada tiga kaca obyek untuk tiap-
tiap bakteri dan satu buah kaca obyek untuk campuran E.coli dan S.aureus
(sebagai kontrol)
3. Tandai setiap olesan
4. Biarkan olesan kering di udara, kemudian fiksasi
5. Teteskan kristal violet pada olesan dan biarkan selama 1 menit
6. Bilas dengan air menggunakan pipet tetes (tap water)
7. Genangi dengan Gram’s iodine (Lugol) selama 1 menit
8. Bilas dengan air menggunankan pipet tetes
9. Cuci olesan dengan alkohol 95% dengan cara tetes demi tetes sampai kristal
violet terlihat meluntur dari olesan
10. Bilas dengan air menggunakan pipet tetes
11. Genangi dengan pewarna tandingan (counterstain) yaitu safranin selam 30-45
detik.
12. Bilas dengan air menggunakan pipet tetes
13. Tiriskan kaca obyek dan seraplah kelebihan air pada olesan dengan
menekankan kertas serap secara hati-hati
14. Periksa dengan menggunakan minyak imersi

2
 Gambar 1. Prosedur Pewarnaan Gram

Gram (+) kokus Gram (+) basil

Gram (-) kokus Gram (-) basil

Gambar 2. Mikroskopis Pewarnaan Gram

3
Hasil Pengamatan

E. Coli B. cereus S. aureus Dari Sampel

Gambarlah
lapang yang ada
dibawah
mikroskop

Morgologi sel:
- Bentuk
- Susunan

Warna
Reaksi / sifat