MODUL PRAKTIKUM

BAKTERIOLOGI SEMESTER III

TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

OLEH :
NYOMAN MASTRA, S.KM., S.Pd., M.Si
I NYOMAN JIRNA, S.KM., M.Si
BURHANNUDDIN, S.Si., M.Biomed

POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR

JURUSAN TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIS

1
 DAFTAR ISI

Halama
n
JUDUL MODUL PRAKTIKUM
KATA PENGANTAR i
…………………………………………………
DAFTAR ISI ………………………………………………………… ii
BAB I. KEAMANAN KERJA DI LABORATORIUM 1
BAKTERIOLOGI............................................................................
...
PENDAHULUAN 1
………………………………………………….
TUJUAN PEMBELAJARAN 2
……………………………………...
PEDOMAN UMUM 2
……………………………………………….
BAB II. MEDIA PEMBIAKAN KUMAN 4
…………………………….
PENDAHULUAN 4
………………………………………………….
TUJUAN PEMBELAJARAN 4
……………………………………...
PRINSIP 5
……………………………………………………………
MEDIA UMUM 5
……………………………………………………
MEDIA TRANSPORT 5
…………………………………………….
MEDIA SELEKTIF 5
………………………………………………..
MEDIA DIFERENSIAL ………………………………………… 6
MEDIA DIPERKAYA 6
……………………………………………..
BAB III. IDENTIFIKASI BAKTERI ENTEROBACTERIACEAE 9

2
…..
TUJUAN PRAKTIKUM 9
…………………………………………..
PRINSIP 9
……………………………………………………………
BAHAN PEMERIKSAAN 10
………………………………………...
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 10
……………………………………
PROSEDUR KERJA 10
………………………………………………
BAB IV. UJI BIOKIMIA 12
……………………………………………...
PENDAHULUAN 12
………………………………………………….
TUJUAN PRAKTIKUM 12
…………………………………………..
BAHAN PEMERIKSAAN ……………………………………… 12
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 13
……………………………………
PROSEDUR KERJA 13
………………………………………………
BAB V. IDENTIFIKASI BAKTERI VIBRIO 21
………………………...
PENDAHULUAN 21
…………………………………………………
TUJUAN PRAKTIKUM 21
…………………………………………..
PRINSIP 21
……………………………………………………………
BAHAN PEMERIKSAAN ……………………………………… 22
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 22
……………………………………
BAB VI. IDENTIFIKASI BAKTERI STAPHYLOCOCCUS 23

3
………...
PENDAHULUAN 23
………………………………………………….
TUJUAN PRAKTIKUM 23
…………………………………………..
PRINSIP 23
……………………………………………………………
BAHAN PEMERIKSAAN ……………………………………… 24
PROSEDUR KERJA 24
………………………………………………
BAB VII. IDENTIFIKASI BAKTERI STREPTOCOCCUS 26
………….
PENDAHULUAN 26
………………………………………………….
TUJUAN PRAKTIKUM 26
…………………………………………..
PRINSIP 26
……………………………………………………………
BAHAN PEMERIKSAAN ……………………………………… 27
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 27
……………………………………
PROSEDUR KERJA 27
………………………………………………
BAB VIII. UJI KEPEKAAN BAKTERITERHADAP ANTIBIOTIK 29
PENDAHULUAN 29
………………………………………………….
TUJUAN PRAKTIKUM 29
…………………………………………..
PRINSIP 29
……………………………………………………………
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 30
……………………………………
PROSEDUR KERJA 30

4
 ………………………………………………
BAB IX. IDENTIFIKASI BAKTERI NEISSERIA 32
GONORRHOEAE
TJUAN PRAKTIKUM 32
…………………………………………….
PRINSIP 32
…………………………………………………………....
BAHAN PEMERIKSAAN 33
………………………………………...
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 33
……………………………………
BABA X. IDENTIFIKASI BAKTERI NEISSERIA 34
MENINGITIDIS..
PENDAHULUAN 34
………………………………………………….
TUJUAN PRAKTIKUM 35
…………………………………………..
PRINSIP 35
……………………………………………………………
BAHAN PEMERIKSAAN 35
………………………………………...
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 35
……………………………………
PROSEDUR PEMERIKSAAN 35
……………………………………
BAB XI. UJI DAYA HAMBAT ZAT ANTIMIKROBA 37
……………..
PENDAHULUAN 37
………………………………………………….
TUJUAN PRAKTIKUM 37
…………………………………………..
PRINSIP 37
……………………………………………………………

5
 BAHAN PEMERIKSAAN ……………………………………… 38
ALAT, BAHAN DAN MEDIA 38
……………………………………
PROSEDUR KERJA 38
………………………………………………
DAFTAR PUSTAKA

KATA PENGANTAR

Dengan mengucapkan Puji Syukur Kehadirat Tuhan Yang Maha Esa,

maka penyusunan Modul Praktikum Bakteriologi Untuk Mahasiswa Program
Studi D. III Teknologi Laboratorium Medis / Jurusan Analis Kesehatan Semester

6
Gasal ( III ) dapat diselesaikan dengan baik. Adanya modul praktikum ini, semoga
mahasiswa serta tim pembimbing praktikum khususnya Mata Kuliah Bakteriologi
dapat memanfaatkannya
Bakteriologi ini merupakan mata kuliah berdasarkan Kurikulum Teknologi
Laboratorium Medis ( TLM ) Tahun 2014 diberikan pada Semester Genap ( II )
dan Semester Gasal ( III ) setiap Tahun Akademik dengan jumlah SKS adalah 2
SKS Teori dengan waktu 100 menit dan 4 SKS Praktikum dengan waktu 340
menit, disamping itu Bakteriologi merupakan mata kuliah yang diujikan dalam
Try Out Uji Kompetensi yang dilaksanakan setiap akhir Semester Genap dan Uji
Kompetensi, untuk itu dengan adanya modul praktikum ini menjadi pedoman bagi
mahasiswa dalam menyiapkan diri sebelum ujian akhir semester dan Try Out Uji
Kompetensi ( TO. UKomp )
Akhir kata saya ucapkan terimakasih kepada tim penyusun Modul
Praktikum Bakteriologi, semoga apa yang dihasilkan akan bermanfaat bagi civitas
akademika

Denpasar, Agustus 2021

Ketua Jurusan

Ttd

Cok. Dewi Widhya HS, S.KM., M.Si

NIP. 19690621 199203 2 004

BAB I
KEAMANAN KERJA DI LABORATORIUM BAKTERIOLOGI

PENDAHULUAN

7
 Laboratorium bakteriologi adalah tempat untuk melakukan kegiatan
praktikum atau penelitian dengan mikroba sebagai objek kajian. Bekerja di
laboratorium bakteriologi memiliki potensi bahaya, baik dari bahan biologis
(biakan kuman, specimen klinis), kimia (zat warna, bahan asam), ataupun fisika
(api, arus listrik, benda tajam). Oleh karena itu semua pengguna laboratorium
bakteriologi, hendakya memahami dan menyadari hal-hal yang dapat
membahayakan keselamatan dirinya atau orang-orang disekitarnya.
Saat ini laboratorium Bakteriologi Jurusan Analis Kesehatan telah dilengkapi
fasilitas keamanan dan keselamatan kerja, yaitu Biological Safety Cabinet (BSC).
BSC merupakan peralatan yang dapat melindungi pekerja dari transmisi
organisme lewat udara (aerosol). Berbagai prosedur yang dapat menimbulkan
aerosol dan penanganan spesimen sampel mikrobiologi sebaiknya ditangani dalam
BSC.
BSC yang ada dilaboratorium bakteriologi jurusan Analis Kesehatan termasuk
BSC Kelas II. BSC kelas II merupakan Biological Safety Cabinets yang
melindungi personil, produk, dan lingkungan. BSC ini memiliki aliran udara
masuk untuk melindungi personil, aliran udara ke bawah dari HEPA filter menuju
area kerja untuk melindungi produk, dan kemudian aliran udara keluar melalui
HEPA filter untuk melindungi lingkungan dari partikel atau aerosol berbahaya.
Perlindungan terhadap personil karena adanya aliran udara tekanan negatif ke
dalam kabinet. Untuk melindungi produk, area kerja secara kontinyu dialiri udara
bersih yang berasal dari HEPA filter.
Sebelum bekerja di laboratorium bakteriologi diharapkan seluruh pengguna
laboratorium memahami cara pengoperasian BSC dan prosedur bekerja di dalam
BSC. Pengguna laboratorium juga diharapkan memahami cara perawatan BSC
agar alat ini dapat terus berfungsi dengan baik. Praktikan sebelum bekerja di
dalam BSC akan dijelaskan dan didampingi cara penggunaan BSC oleh instruktur
di laboratorium.

TUJUAN PEMBELAJARAN
Setelah membaca materi pada bab ini, mahasiswa diharapkan mampu :
1. Memahami berbagai potensi bahaya di laboratorium bakteriologi
2. Memahami prosedur keamanan kerja di laboratorium bakteriologi

8
3. Memahami dan dapat melakukan tindakan yang harus dilakukan jika
terjadi kecelakaan di dalam laboratorium

PEDOMAN UMUM
Berikut adalah peraturan keselamatan dasar yang harus selalu diperhatikan
selama praktik di laboratorium bakteriologi :
1. Saat memasuki laboratorium, letakkan jaket, buku-buku, dan perlengkepan
lainnya pada tempat yang telah ditentukan, jangan diletakkan di atas meja
kerja.
2. Tutup pintu dan jendela selama sesi laboratorium berlangsung untuk
mencegah kontaminasi dari aliran udara.
3. Pada setiap permulaan dan akhir sesi laboratorium, bersihkan permukaan
meja kerja dengan larutan disinfektan yang disediakan oleh instruktur.
4. Jangan meletakkan alat-alat yang telah terkontaminasi seperti ose, jarum,
dan pipet inokulasi di atas meja kerja. Ose dan jarum harus disterilkan
dengan dibakar.
5. Pada akhir sesi laboratorium, tempatkan seluruh biakan dan bahan-bahan
pada tempat pembuangan yang telah ditentukan oleh instruktut
6. Percobaan dengan biakan jamur harus dilakukan dengan cepat dan efisien
untuk mencegah diseminasi (penyebaran spora) reproduktif jamur-jamur
itu dalam lingkungan laboratorium
7. Cuci tangan anda dengan deterjen cair dan keringkan dengan kertas tissue
saat akan memasuki dan sebelum meninggalkan laboratorium
8. Gunakan penutup kepala kertas atau ikat rambut yang panjang ke belakang
untuk meminimalkan risiko terbakar atau terkena panas api.
9. Gunakan jas laboratorium selama bekerja di laboratorium
10. Gunakan sepatu tertutup selama bekerja di laboratorium
11. Jangan menggunakan kosmetik atau memasang lensa kontak di dalam
laboratorium
12. Jangan merokok, makan, atau minum di dalam laboratorium
13. Bawalah biakan dengan menggunakan rak tabung uji saat berpindah
tempat di lingkungan laboratrium.
14. Jangan memindahkan media, peralatan, perlengkapan atau terutama biakan
bakteri ke luar laboratorium.

9
15. Segera tutup biakan yang tumpah atau tabung biakan yang pecah dengan
menggunakan kertas tisu, kemudian jenuhkan kertas dengan larutan
disinfektan. Setelah 15 menit angkat kertas tisu tersebut dan buang pada
tempat dan dengna cara yang telah ditetapkan oleh instruktur.
16. Segera laporkan kecelakaan tersayat atau terbakar kepada instruktur.
17. Jangan memipet biakan kaldu atau pereaksi kimia dengan mulut.
Pemipetan hanya boleh dilakukan dengan bantuan alat pemipet mekanis.
18. Jangan menjilat label. Gunakan label yang dapat menempel sendiri untuk
mengidentifikasi biakan percobaan
19. Bicaralah dengan suara pelan dan hindari aktivitas yang tidak perlu di
lingkungan laboratorium untuk menghindari gangguan yang dapat
mengakibatkan kecelakaan.
20. Sarung tangan sekali pakai harus selalu digunakan selama bekerja dengan
bahan-bahan uji.
21. Segera cuci tangan jika terjadi kontak dengan bahan cair dan juga setelah
melepas sarung tangan.
22. Masker, kaca mata pengaman, dan jas laboratorium harus digunakan jika
ada kemungkinan terbentuk aerosol atau dapat terjadi percikan cairan.
23. Cairan tubuh yang tumpah/terpercik harus didekontaminasi dengan larutan
pemutih 1 : 10, tutup dengan kertas tisu, dan biarkan selama 10 menit
untuk bereaksi sebelum dibuang.
24. Specimen uji dan bahan yang berkontak dengan cairan tubuh tersebut
harus ditempatkan dalam wadah berisi desinfektan sebelum dimasukkan
ke dalam autoklaf dan disterilkan.

10
 BAB II
MEDIA PEMBIAKAN KUMAN

PENDAHULUAN
Berbagai jenis media pertumbuhan bakteri lazim digunakan untuk tujuan
isolasi, transportasi, persemaian, dan diferensiasi. Untuk menunjang pertumbuhan
yang optimal, bakteri membutuhkan nutrisi yang amat beragam. Sebagian bakteri
dapat tumbuh dalam medium yang hanya mengandung zat anorganik, sedangkan
bakteri tertentu memerlukan tambahan asam amino, vitamin, dan zat organik lain
untuk pertumbuhannya. Media pembiakan bakteri umumnya terdiri dari ekstrak
daging, ekstrak ragi, pepton, dan agar.
Berdasarkan konsistensinya, media pembiakan dapat dibedakan menjadi
media cair, media padat, dan semisolid. Kaldu nutrisi (pepton dan ekstrak daging)
dan agar nutrisi (pepton, ekstrak daging, dan agar) merupakan contoh media cair
dan padat yang sering digunakan. Berbagai komponen dapat ditambahkan ke
dalam medium untuk menghasilkan medium dengan sifat tertentu. Sebagai
contoh, penambahan zat warna dapat digunakan untuk indikator aktivitas
metabolisme bakteri.
Berdasarkan fungsinya media pembiakan bakteri dapat diklasifikasikan
menjadi media umum, media pengaya, media transport, media selektif, dan media
selektif/diferensial.

TUJUAN PEMBELAJARAN
1. Mengenal berbagai media untuk pembiakan bakteri.
2. Memahami penggunaan dan fungsi media terspesialisasi untuk seleksi dan
diferensiasi mikroorganisme.
3. Mengerti bagaimana suatu media yang diperkaya seperti agar darah juga dapat
berfungsi baik sebagai media selektif maupun diferensial.

11
PRINSIP
Beberapa media yang bertujuan khusus tersedia untuk fungsi seperti berikut :
1. Isolasi jenis-jenis bakteri dari populasi mikrooganisme campuran
2. Diferensiasi kelompok-kelompok bakteri yang berkaitan erat berdasarkan
tampilan koloni-koloni secara makroskopik dan reaksi-reaksi biokimia di
dalam media
3. Penghitungan bakteri pada mikrobiologi sanitari, seperti di air dan sampah, dan
juga pada makanan, dan produk susu lainnya
4. Pengujian senyawa-senyawa yang terdapat di alam, seperti antibiotik, vitamin,
dan produk fermentasi industry
5. Karakterisasi dan identifikasi bakteri berdasarkan kemampuannya
menghasilkan perubahan kimia dalam media yang berbeda-beda.

MEDIA UMUM
Media ini digunakan untuk menumbuhkan mikroba secara umum. Kandungan
yang terdapat pada media memungkinan berbagai mikrooganisme untuk tumbuh,
seperti Nutrien Agar (NA) atau Nutrien Broth (NB)

MEDIA TRANSPORT
Media transport merupakan media yang digunakan untuk transport specimen
dari pengambilan ke laboratorium. Media ini digunakan untuk menunda
pertumbuhan mikroorganisme dalam batas tertentu, yang tidak mematikan dan
mengembangbiakkan. Contoh : Media Carry and Blair

MEDIA SELEKTIF
Media ini digunakan untuk mengisolasi kelompok-kelompok bakteri tertentu
karena dapat menghambat pertumbuhan bakteri lain secara selektif. Media-media
tersebut mengandung zat-zat kimia yang menghambat pertumbuhan satu jenis
bakteri dan memungkinkan pertumbuhan bakteri lainnya sehingga memudahkan
isolasi bakteri. Contoh media selektif antara lain :
a. Salmonella-Shigella Agar, untuk mengisolasi bakteri Salmonella-Shigella
b. Agar feniletil alcohol, untuk mengisolasi sebagian besar organisme gram
positif. Feniletil alcohol dapat menghambat sebagian pertumbuhan bakteri
gram negative.

12
c. Agar kristal violet, untuk mengisolasi sebagian besar bakteri gram negative.
Pewarna Kristal violet memberikan efek penghambatan pada sebagian besar
organism gram positif
d. Agar NaCl 7.5 %. Media ini menghambat kebanyakan organism, kecuali
mikroorganisme halofilik. Media ini paling bermanfaat dalam pendeteksian
anggota-anggota genus Staphylococcus.

MEDIA SELEKTIF/DIFERENSIAL
Media ini dapat membedakan kelompok-kelompok organisme yang berkaitan
erat secara morfologis dan biokimia. Media-media tersebut mengandung zat-zat
kimia yang setelah inokulasi dan inkubasi, menghasilkan suatu perubahan
karakteristik pada tampilan pertumbuhan bakteri dan/atau media di sekeliling
koloni, yang memungkinan diferensiasi. Contoh media selektif diferensial antara
lain : Mac Conkey Agar (MCA), Manitol Salt Agar (MSA), dan Eosin Metilen
Blue (EMB)

MEDIA YANG DIPERKAYA

Media yang diperkaya merupakan media yang telah ditambahkan dengan
bahan-bahan bernutrisi tinggi, seperti darah, serum, atau ekstrak khamir, untuk
tujuan kultivasi organism-organisme sekektif, misalnya Agar Darah. Darah yang
dimasukkan ke dalam media ini merupakan bahan pengayaan untuk kultivasi
organism-organisme selektif, seperti Streptococcus sp. Darah juga memungkinkan
terjadinya sifat hemolitik dari berbagai mikroorganisme, terutama Streptococcus,
yang aktivitas hemolisisnya diklasifikasikan sebagai berikut :
a. Hemolisis gamma, tidak terjadi lisis sel-sel darah sehingga tidak ada perubahan
yang signifikan pada tampilan media di sekeliling koloni
b. Hemolisis alfa, terjadi lisis sel-sel darah secara tidak sempurna, dengan reduksi
hemoglobin menjadi metemoglobin, menghasilkan suatu halo berwarna
kehijauan di sekelling pertumbuhan bakteri.
c. Hemolisis beta, terjadi lisis sel-sel darah merah dengan penghancuran yang
sempurna dan penggunaan hemoglobin oleh organism yang menghasilkan zona
jernih di sekeling koloni.

13
 Tabel 2. Kegunaan Berbagai Medium Untuk Pembiakan Bakteri
MEDIA AGAR PADAT (1,5 – 2 % AGAR)
No Media Kegunaan
1 Agar Nutrien Mengasingkan/mempelajari koloni bakteri
2 Agar Darah Membiakkan bakteri yang memerlukan nutrisi
tinggi dan melihat adanya reaksi hemolisis
3 Agar Cokelat Thayer Medium selektif untuk membiakkan Neisseria sp
Martin
4 Agar Endo Medium selektif untuk membiakkan bakteri
enterik
5 Agar Eosin Medium selektif dan diferensial untuk
Methylene Blue membiakkan bakteri enteric
(EMB)
6 Agar Salmonella- Medium selektif dan diferensial untuk untuk
Shigella membiakkan Salmonella dan Shigella
7 Serum Loeffler Membiakkan Corynebacterium diptheriae
8 Agar Thiosulphate Medium selektif dan diferensial untuk
Citrate Bile Sucrose membiakkan Vibrio cholerae dan Vibrio sp.
(TCBS) lainnya.
9 Triple Sugar Iron Melihat kemampuan bakteri dalam meragi gula-
Agar (TSIA) gula dan membentuk H2S
10 Agar darah telurit Medium selektif untuk membiakkan
Corynebacterium sp
11 Lowenstein jensen Membiakkan Mycobacterium sp

MEDIA AGAR SEMISOLID (0,5 % AGAR)

1 Media Kegunaan
1 Semisolid/SIM Melihat gerak bakteri dan dapat juga digunakan
untuk melihat reaksi indol

MEDIA CAIR
1 Media Kegunaan
1 Nutrien Broth Membiakkan, meremajakan bakteri

14
2 Kaldu Membiakkan atau membuat suspense bakteri
3 Air Pepton Membiakkan atau membuat suspense bakteri
4 Perbenihan Tarozzi Membiakkan bakteri anaerob
5 Perbenihan Perbenihan transport dan persemaian untuk
thioglikolat bakteri aerob dan anaerob
6 Selenit Cystein Broth Membiakkan bakteri enteric terutama untuk
(SCB) Salmonella sp.
7 Gula-gula Mengetahui kemampuan bakteri dalam
memfermentasi gula.
Gula yang digunakan :
a. Glukosa (tutup tabung kapas berwarna kuning)
b. Laktosa (tutup tabung kapas berwarna ungu)
c. Manitol (tutup tabung kapas berwarna hijau)
d. Maltosa (tutup tabung kapas berwarna merah)

15
 BAB III
IDENTIFIKASI BAKTERI ENTEROBACTERIACEAE

PENDAHULUAN
Enterobacteriaceae adalah suatu family kuman yang terdiri dari sejumlah besar
spesies bakteri yang sangat erat hubungannya satu dengan dengan lainnya. Hidup
di usus besar manusia dan hewan, tanah, air, dan dapat pula ditemukan pada
dekomposisi material. Karena hidupnya yang pada keadaan normal di dalam usus
besar manusia, kuman ini sering disebut kuman enteric atau basel enteric.
Sebagian besar kuman enteric tidak menimbulkan penyakit pada host bila
kuman tetap berada di dalam usus besar, tetapi pada keadaan-keadaan dimana
terjadi perubahan pada host atau bila ada kesempatan memasuki bagian tubuh
yang lain, banyak diantara kuman enteric ini mampu menimbulkan penyakit pada
tiap jariangan di tubuh manusia. Salmonella dan Shigella adalah genus yang
bersifat patogen. Anggota-anggota genus yang lain, khususnya Escherichia dan
Enterobacter, dan dalam jumlah yang lebih kecil, Klebsiella dan Proteus
merupakan flora normal pada saluran cerna dan umumnya dianggap avirulen.
Bahan pemeriksaan kuman enteric dapat dari berbagai sumber seperti : feses,
usap dubur (rectal swab), urine, darah, usap tenggorokan, dan sebagainya.
Berbagai media dapat digunakan untuk membiakkan kuman enteric. Specimen
yang dapat ditumbuhkan pada media pengaya, yaitu Selenit Cystein Broth (SCB)
sebelum dikultur pada media selektif dan diferensial seperti MCA, EMB, atau
SSA. Pemeriksaan biokimia dapat dilakukan selanjutnya untuk mengidentifikasi
jenis bakteri yang ditemuka.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Enterobacteriaceae
2. Mampu mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri-bakteri kelompok
Bakteriaceae

PRINSIP
Kuman enteric pada specimen dapat ditingkatkan jumlahnya pada media
pengaya, kemudian dibiakkan pada media selektif dan diferensial yang dapat
menumbuhkan dan membedakan berbagai kelompok bakteri Enterobactericeae.

16
Pada media tersebut kuman enteric akan menampilkan kharakteristik koloni yang
khas. Koloni yang dipilih dapat diisolasi kemudian diuji reaksi biokimia untuk
menentukan jenis kuman enteric yang didapatkan.

BAHAN PEMERIKSAAN
Feses/Rectal Swab/Urine

ALAT, BAHAN, DAN MEDIA

ALAT BAHAN MEDIA
1. Tabung reaksi 1. Aquades 1. SCB
2. Ose 2. Alkohol 2. MCA
3. Bunsen 3. Kapas 3. EMB
4. Incubator 4. Tissue 4. SS
5. BSC 5. TSIA
6. NA miring

PROSEDUR KERJA
1. Spesimen berupa feses diambil 1-2 ose, dimasukkan ke dalam media SCB.
Media diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam ; specimen berupa rectal
swab dapat langsung ditanam pada media selektif dan diferensial seperti MCA
dan EMB.
2. Biakan pada media SCB diambil 1-2 ose, disubkultur dengan teknik goresan
empat kuadran pada media MCA, EMB, dan/atau SSA. Selanjutnya diinkubasi
pada suhu 37 o C selama 24 jam.
3. Koloni yang tumbuh pada media-media tersebut diidentifikasi ukuran, bentuk,
tekstur, dan warna (parameter penting) untuk menentukan kemampuannya
dalam fermentasi laktosa.
4. Dipilih salah satu koloni tunggal, diambil 1 ose, ditanam pada media TSIA.
Dari koloni yang sama diambil 1 ose, ditanam pada media NA miring sebagai
stok kuman. Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam
5. Diamati perubahan warna media TSIA pada bagian dasar dan lereng.
6. Kultur pada media NA disimpan pada suhu 4 oC sebagai stok kuman untuk
pemeriksaan lanjutan, yaitu uji biokimia

17
 7. Dilakukan uji biokimia, antara lain uji IMVIC (Indol, Metil Red, Voges-
Proskauer, Sitrat), fermentasi karbohidrat, motilitas, dan urease.
Kuning/Kuning Kuning/Kuning Merah/Kuning Merah/Merah
H2s (-) H2S (+) H2S (+) Tidak
E. coli Citrobacter Salmonella Alcaligenes
Klebsiellla Arizona Arizona Pseudomonas
Enterobacter Proteus sp Citrobacter Acitenobacter

Spesimen feses

Media SCB Ditanam langsung ke media

MCA, EMB, SSA

Subkultur ke media MCA,

EMB, SSA

Koloni-koloni terisolasi Koloni-koloni terisolasi

Laktosa + Laktosa +
Laktosa - Laktosa -

Triple Sugar Iron Agar (TSIA)

UJI BIOKIMIA
(IMViC, gula-gula,
motilitas, urease)

18
 BAB IV
UJI BIOKIMIA

PENDAHULUAN
Mikroorganisme harus dipisahkan dan diidentifikasi untuk berbagai tujuan
seperti penentuan patogen yang menimbulkan penyakit infeksi atau
pembandingan aktivitas biokimia untuk tujuan taksonomi. Untuk memenuhi
tujuan-tujuan tersebut, berbagai metode dapat dilakukan misalnya dengan
melakukan serangkaian uji biokimia. Seperti halnya sidik jari manusia yang khas
dan spesifik, semua mikroorganisme memiliki karakteristik biokimia yang
menjadi ciri khasnya. Sifat-sifat tersebut dikendalikan oleh aktivitas enzimatik sel.
Keseluruhan reaksi kimia tersebut didefinisikan sebagai metabolisme seluler.
Uji biokimia sangat membantu identifikasi bakteri, melengkapi identifikasi
makroskopis dan mikroskopis yang tidak dapat membedakan bakteri sampai
tingkat spesies. Pada uji biokimia reaksi bersifat spesifik karena melibatkan
enzim-enzim yang dihasilkan oleh bakteri. Bakteri yang menghasilkan enzim
tertentu akan bereaksi positif ketika diberi substrat yang sesuai. Dengan
memberikan indikator tertentu hasil reaksi dapat dilihat secara kasat mata,
misalnya melalui perubahan warna yang terjadi pada media.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur berbagai uji biokimia untuk mengidentifikasi
mikroorganisme
2. Mengidentifikasi kuman sampai tingkat spesies
3. Memahami sifat dan aktivitas enzim yang dihasilkan oleh bakteri

BAHAN PEMERIKSAAN
Biakan kuman usia 24 jam

19
ALAT, BAHAN, DAN MEDIA
ALAT BAHAN/REAGEN MEDIA
1. Tabung reaksi 1. Aquades 1. Media gula-gula
2. Ose 2. Alkohol 2. TSIA
3. Bunsen 3. Kapas 3. Kaldu MR-VP
4. Incubator 4. Tissue 4. SIM
5. BSC 5. Pereaksi kovac 5. Agar Urea
6. Indikator metal
merah
7. Pereaksi Voges-
Proskauer
8. Pereaksi Katalase
9. Pereaksi Oksidase
10. Plasma
darah/Pereaksi
Koagulase

PROSEDUR KERJA
A. UJI GULA-GULA
Tujuan :
Menentukan kemampuan bakteri menguraikan dan memfermentasi karbohidrat
yang disertai dengan produksi asam dan gas
Prinsip :
Bakteri menggunakan karbohidrat secara berbeda-beda, tergantung pada
komplemen enzim yang dihasilkan. Fermentasi tersebut akan menghasilkan
asam-asam organic (asam laktat, asam format, atau asa, asetat) yang
kemungkinan disertai dengan pembentukan gas seperti hydrogen atau
karbondioksida
Cara kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke masing-masing media gula-gula.
- Inkubasi pada suhu 37 oC, selama 24 jam.
- Diamati reaksi yang terjadi.

20
B. UJI TSIA ( Triple Sugar Iron Agar )
Tujuan:
- Memahami prosedur skrining cepat untuk membedakan antara
Enterobacteriaceae dan basilus intestinal lainnya
- Menginterpretasi hasil reaksi pada uji TSIA
Prinsip :
TSIA mengandung laktosa dan sukrosa berkonsentrasi 1 % serta glukosa
berkonsentrasi 0,1 %. Pada media terdapat indikator fenol merah untuk
mendeteksi fermentasi karbohidrat yang ditandai perubahan warna dari merah
jingga menjadi kuning (asam). TSIA juga mengandung natrium thiosulfat,
substrat untuk pembentukan H2S (hydrogen sulfida), dan fero sulfat untuk
mendeteksi hasil akhir. Hanya bakteri yang menghasilkan H2S yang akan
menunjukkan penghitaman yang pekat di dasar media karena terjadi
pengendapan ferosulfat yang tidak larut.
Cara kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke TSIA dengan cara penusukan
dengan ose lurus mulai dari pangkal kemiringan sampai ke dasar tabung,
saat menarik ose kembali, permukaan miring media digores.
- Kultur dinkubasi pada suhu 37 oC, selama 24-48 jam.
- Diamati perubahan warna yang terjadi.
- Interpretasi hasil :
1. Hanya meragi glukosa (Basa/Asam)
Lereng bersifat basa (merah) sedangkan tusukan/dasar bersifat asam
(kuning)
2. Meragi glukosa dan laktosa (asam/asam)
Konsentrasi laktosa dalam medium TSIA 10 kali lebih besar
dibandingkan glukosa. Dengan demikian setelah inkubasi 24 jam,
laktosa akan tetap terdapat dalam konsentrasi yang cukup sehingga
suasana asam dapat dipertahankan.
3. Tidak meragi glukosa atau laktosa (basa/basa) ; (basa/tidak ada
perubahan)
Tidak terjadi fermentasi karbohidrat, bakteri menggunakan pepton
menyebabkan kondisi basa karena pembentukan ammonia.

21
C. UJI IMVIC
1. Uji produksi indol
Tujuan :
Menentukan kemampuan mikroorganisme menguraikan asam amino tritofan
Prinsip :
Triptofan merupakan asam amino esensial, pengubahannya menjadi produk-
produk metabolic dimediasi oleh triptofanase. Indol dihasilkan melalui
hidrolisis triptofan dapat dideteksi dengan menambahkan reaksi kovac, yang
akan menghasilkan suatu lapisan pereaksi berwarna merah ceri. Reaksi
tersebut menunjukkan uji indol positif.
Cara kerja :
- Koloni dari biakan kuman diinokulasikan ke media SIM, inkubasi pada
suhu 37 oC, selama 24 – 48 jam.
- Reagen kovac ditambahkan di atas permukaan media SIM, diamati reaksi
yang terjadi.

2. Uji Metil Merah/MR

Tujuan :
- Menentukan kemampuan mikroorganisme memfermentasi glukosa
dengan disertai pembentukan dan stabilisasi produk akhir asam
berkonsentrasi tinggi
- Membedakan semua organism enteric fermenter glukosa, terutama E.coli
dan E. aerogens

Prinsip Kerja :
Produk-produk akhir dari metabolisme Glukosa akan beragam
tergantung pada jalur enzimatik spesifik yang ada dalam bakteri. Pada uji
ini, indikator pH metil merah akan mendeteksi terbentuknya produk akhir
asam berkonsentrasi tinggi. Pada E.coli produk akhir asam stabil sampai
akhir reaksi (indikator merah, reaksi positif), sedangkan pada E. aerogenes
produk akhir asam diubah secara enzimatis menjadi produk non-asam
(indikator menjadi kuning, reaksi negatif)

22
 Cara Kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke media MR-VP, inkubasi pada
suhu 37 oC, selama 24-48 jam.
- Ditambakan indikator metil merah pada biakan.
- Diamati reaksi yang terjadi.

3. Uji Voges – Proskauer / VP

Tujuan :
Membedakan organisme-organisme enterik, seperti E.coli, E. aerogenes,
dan K. pneumonia

Prinsip :
Uji VP untuk menentukan kemampuan bakteri membentuk produk
akhir non-asam atau netral, seperti asetilmetilkarbinol dari asam-asam
organik yang dihasilkan dari metabolisme karbohidrat. Pereaksi yang
digunakan adalah pereaksi barrit (alcohol α-naftol dan kalium hidroksida 40
%). Uji VP positif ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna merah
muda, setelah penambahan pereaksi Barrit pada biakan. Warna merah muda
terbentuk karena dihasilkan asetilmetilkarbinol yang dioksidasi menjadi
senyawa asetil. Reaksi ini dikatalis oleh adanya α-naftol dan gugus
guanidine pepton dalam media MR-VP.

Cara kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke media MR-VP, inkubasi pada
suhu 37 oC, selama 24-48 jam.
- Ditambakan pereaksi Barrit A dan B pada biakan.
- Diamati reaksi yang terjadi.

4. Uji Sitrat ( Citrat )

Tujuan :
Membedakan organisme-organisme enteric berdasarkan kemampuan
organisme itu memfermentasi sitrat sebagai satu-satunya sumber karbon.

23
 Prinsip :
Dalam media tidak ada glukosa atau laktosa. Enzim sitrat permease yang
dihasilkan bakteri akan mentransport sitrat ke dalam sel. Sitrat selanjutnya
diaktifkan oleh enzim sitrase menjadi asam oksaloasetat dan asetat.
Selanjutnya produk-produk tersebut diubah menjadi asam piruvat dan
karbondioksida. Reaksi selanjutnya yang terjadi adalah sebagai berikut :
CO2 + 2Na+ H2O  Na2CO3  PH Basa.
Kondisi basa menyebabkan indikator bromtimol biru bekerja, warna media
akan berubah dari hijau menjadi biru.

Cara Kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke simon sitrat
- Inkubasi pada suhu 37 oC, selama 24-48 jam.
- Diamati perubahan warna media.

D. UJI HIDROGEN SULFIDA

Tujuan :
- Menentukan kemampuan bakteri membentuk hydrogen sulfide dari senyawa
asam-asam amino yang mengandung sulfur atau senyawa-senyawa sulfur
anorganik
- Menentukan motilitas bakteri dalam agar SIM

Prinsip :
Media SIM yang digunakan mengandung pepton dan natrium tiosulfat sebagai
substrat sulfur ; fero sulfat (FeSO4) sebagai indikator H2S ; dan agar
secukupnya untuk menghasilkan media semisolid. Fero ammonium sulfat
dalam media berfungsi sebagai indikator, bereaksi dengan gas H2S
membentuk endapan fero sulfida yang berwarna hitam di sepanjang garis
imokulasi, menunjukkan reaksi positif.
Agar SIM juga dapat digunakan untuk mendeteksi motolitas yang dikenali
apabila pertumbuhan biakan (kekeruhan) tidak hanya tampak pada garis
inokulasi.

24
 Cara Kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke media SIM dengan metode tusuk
menggunakan jarum/ose lurus
- Dinkubasi pada suhu 37 oC, selama 24 jam.
- Diamati reaksi yang terjadi.

E. UJI UREASE
Tujuan :
Menentukan kemampuan bakteri menguraikan urea oleh enzim urease

Prinsip :
Urease merupakan enzim hidrolitik yang memecah senyawa amida seperti urea
menghasilkan amonia yang bersifat basa. Suasana basa menyebabkan indikator
fenol merah berubah warna menjadi merah muda yang nyata, yang
menunjukkan reaksi urease positif.

Cara kerja :
- Inokulasikan koloni dari biakan kuman ke agar urea.
- Inkubasi pada suhu 37 oC, selama 24-48 jam.
- Diamati reaksi yang terjadi.

F. UJI KATALASE
Tujuan :
Menentukan kemampuan beberapa bakteri menguraikan hydrogen peroksida
dengan menghasilkan enzim katalase.

Prinsip :
Organisme yang berespirasi secara aerob menghasilkan hydrogen peroksida
yang toksik. Untuk menguraikan zat tersebut bakteri manghasilkan enzim
katalase, yang mengubah hydrogen peroksida menjadi air dan oksigen bebas.
Produk katalase dapat dideteksi dengan menambahkan substrat H 202 ke dalam
biakan miring atau dicampur pada slide. Terbentuknya gelembug gas
menunjukkan katalase positif

25
 Cara kerja :
- Diteteskan H202 secukupnya pada permukaan slide
- Diambil koloni dari biakan, dicampur dengan H202
- Diamati reaksi yang terjadi.

G. UJI OKSIDASE
Tujuan :
Membedakan kelompok-kelompok bakteri berdasarkan aktivitas sitokrom
oksidase

Prinsip :
Enzim sitokrom oksidase berperan dalam pelaksanaan sistem transport electron
selama respirasi aerob. Deteksi terhadap keberadaan enzim ini dapat ditentukan
dengan penambahan pereaksi oksidase (p-aminodimetilanilin oksalat) pada
koloni-koloni yang ditumbuhkan pada lempeng agar. Setelah penambahan
pereaksi uji, terbentuknya warna merah muda, kemudian merah marun, dan
akhirnya warna kehitaman pada permukaan koloni menunjukkan adanya
pembentukan sitokrom oksidase positif.

Cara kerja :
- Disiapkan biakan kuman yang berusia 24 jam
- Diteteskan pereaksi oksidase pada koloni
- Diamati perubahan warna yang terjadi.

H. UJI KOAGULASE
Tujuan :
Mengetahui kemampuan bakteri mengkoagulasi plasma darah dengan enzim
koagulase

Prinsip :
Enzim koagulase yang dihasilkan oleh bakteri dapat dideteksi dengan
mencampurkan koloni bakteri dengan plasma darah, bisa ke dalam tabung atau
di permukaan slide. Uji dalam tabung diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24

26
jam. Adanya penggumpalan pada plasma menunjukkan koagulase positif.
Sedangkan uji koagulase positif pada permukaan slide ditandai dengan
terbentuknya bekuan darah dalam 1-2 menit.

Cara kerja :
1. Uji koagulase dalam tabung
- Disiapkan biakan bakteri usia 24 jam
- Diambil satu ose koloni, dicampurkan dengan 1 ml plasma darah dalam
tabung reaksi
- Diinkubasi 37 oC, 24 jam
- Diamati ada tidaknya penggumpalan plasma
2. Uji Koagulase pada slide
- Disiapkan biakan bakteri usia 24 jam
- Diteteskan secukupnya plasma pada permukaan slide
- Diambil satu ose koloni, dicampurkan dengan plasma pada permukaan
slide
- Diamati ada tidaknya bekuan darah yang dihasilkan.

27
 BAB V
IDENTIFIKASI BAKTERI VIBRIO

PENDAHULUAN
Vibrio merupakan kelompok bakteri gram negative berbentuk batang bengkok
seperti koma. Vibrio memiliki flagel monotrik yang dapat bergerak sangat aktif.
Tidak membentuk spora, pada biakan lama dapat berbentuk batang lurus. Vibrio
tidak tahan pada suasana asam dan tumbuh optimum pada pH 8.5-9.5. Bakteri
Vibrio akan tumbuh baik pada medium yang mengandung garam mineral dan
asparagin sebagai sumber karbon dan nitrogen seperti media Agar Thiosulfate
Citrate Biltsalt Sucrose (TCBS)
Beberapa spesies merupakan patogen penting yang dapat menyebabkan
gangguan gastroenteritis. Vibrio cholerae merupakan patogen utama yang
menyebabkan kolera. Spesies lain seperti Vibrio parahaemolitycus juga dapat
menimbulkan kolera yang self limitting atau sampai kolera yang berat. Bahan
pemeriksaan untuk mendiagnosis infeksi Vibrio dapat berupa feses/usap dubur.
Diagnosa dapat dilakukan untuk mengetahui adanya infeksi aktif atau carier.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Vibrio
2. Mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Vibrio dari bahan pemeriksaan

PRINSIP
Pada media TCBS bakteri Vibrio akan tumbuh dan menunjukkan
kharakteristik yang khas. Vibrio cholerae memfermentasi sukrosa yang terdapat
pada media, menyebabkan terbentuknya koloni yang berwarna kuning. Spesies
lain seperti V. parahaemolyticus membentuk koloni besar yang berwarna hijau.

28
BAHAN PEMERIKSAAN
Feses/usap dubur
ALAT, BAHAN, DAN MEDIA
ALAT BAHAN MEDIA
1. Tabung reaksi 1. Aquades 1. Alkali Pepton Water
2. Ose 2. Alkohol (APW)
3. Bunsen 3. Kapas 2. Media SIM
4. Incubator 4. Tissue 3. NA miring
5. BSC 5. Reagen oksidase
6. Mikroskop 6. Cat gram

PROSEDUR PEMERIKSAAN

1. Bahan pemeriksaan berupa feses diambil secukupnya dengan ose, kemudian

dimasukkan ke dalam media Alkali Pepton Water/APW
2. Media APW diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam
3. Kekeruhan pada media APW menunjukkan adanya pertumbuhan kuman
4. Kuman pada media APW diambil 1-2 ose, disubkultur ke media TCBS dengan
teknik goresan empat kuadran
5. Media TCBS diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam
6. Diamati koloni yang tumbuh pada media TCBS (bentuk, ukuran, tekstur,
warna)
7. Koloni tersangka diuji biokimia dengan menumbuhkan pada media gula-gula
dan SIM, diinkubasi 37 o C selama 24 jam.
8. Dari koloni yang sama diuji oksidase
9. Dibuat stok kuman dengan mensubkultur ke media NA miring
10.

29
 BAB VI
IDENTIFIKASI BAKTERI STAPHYLOCOCCUS

PENDAHULUAN
Genus Staphylococcus terdiri dari organism-organisme patogen dan
nonpatogen. Staphylococcus meliputi kokus gram positif dan terutama terbentuk
kluster-kluster yang tidak beraturan dari sel-sel yang berbentuk sferis/bulat. Tiga
spesies utama Staphylococcus adalah S. aureus, S. saprophyticus, dan S.
Epidermidis. Galur-galur dua spesies terakhir umumnya avirulen, namun pada
kondisi lingkungan khusus ketika tersedia pintu gerbang masuk yang sesuai, S.
epidermidis dapat menjadi agen penyebab lesi kulit dan endokarditis, dan S.
saprophyticus diketahui menyebabkan beberapa infeksi saluran kencing. Infeksi
yang paling sering terutama dari kelompok patogen S. aureus dapat menimbulan
abses, impetigo (bintul-bintul bernanah), pneumonia, osteomielitis, endokarditis
dan sebagainya.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Staphylococcus
2. Mengisolasi dan mengidentifikasi kelompok bakteri Staphylococcus

PRINSIP
Bakteri Staphylococcus dari specimen (swab tangan) dapat dibiakkan pada
media agar darah. Uji katalase positif pada koloni yang tumbuh dilakukan untuk
membedakan Staphylococcus dengan Streptococcus yang negative katalase. S.
aureus menghasilkan beragam produk-produk akhir metabolic diantaranya adalah
koagulase yang dapat menyebabkan pembentukan pembekuan darah. Koagulase
positif pada Staphylococcus digunakan untuk membedakan S. aureus dengan
spesies Staphylococcus lainnya.

BAHAN PEMERIKSAAN
Swab tangan

30
ALAT, BAHAN, DAN MEDIA
ALAT BAHAN MEDIA
1. Tabung reaksi 1. Aquades 1. Media Transport
2. Ose 2. Alkohol 2. Media Blood Agar
3. Bunsen 3. Kapas Plate
4. Incubator 4. Tissue 3. Manitol Salt Agar
5. BSC 5. Lidi kapas steril (MSA)
6. Reagen Katalase
7. Reagen Koagulase
8. Larutan NaCl 0,85 %
9. Objek Glass

PROSEDUR KERJA
1. Pengambilan sampel swab tangan
- Disiapkan alat, bahan, dan media yang diperlukan
- Lidi kapas steril dicelupkan ke larutan NaCl 0,85 %
- Diswab secara merata permukaan tangan dan sela-sela jari dengan lidi kapas
steril
- Lidi kapas steril dimasukkan ke media transport atau langsung dihapuskan
ke media agar darah.
2. Pembiakkan ke media agar darah
- Lidi kapas steril dari sampel swab tangan dihapuskan dengan penipisan
empat kuadran ke media agar darah
- Inkubasi 37 oC, selama 24 jam
- Identifikasi koloni yang tumbuh (ukuran, bentuk, warna, tipe hemolisis)
- Dipilih salah satu koloni tunggal untuk diuji katalase
3. Uji Katalase
- Disiapkan objek glas
- Reagen katalase (hydrogen peroksida 3 %) diteteskan pada objek glas
- Diambil 1-2 ose dari koloni tunggal yang dipilih, dicampurkan merata
dengan reagen katalase
- Diamati reaksi yang terjadi : katalase positif ditandai dengan adanya
gelembung-gelembung gas

31
 - Koloni yang menunjukkan katalase positif dilanjutkan dengan uji
koagulase
4. Uji Koagulase (slide koagulase test)
- Disiapkan objek glas
- Plasma darah/reagen koagulase diteteskan secukupnya ke permukaan objek
glas
- Koloni yang sebelumnya menunjukkan katalase positif diambil 1-2 ose,
dicampur merata dengan plasma darah
- Diamati reaksi yang terjadi ; koagulase positif ditandai dengan terbentuknya
reaksi koagulasi, yang ditunjukkan oleh adanya pembentukan bekuan darah
atau clumping factor dalam 1-2 menit.
5. Pembiakan ke media Mannitol Salt Agar/MSA
- Koloni dari agar darah yang menunjukkan uji katalase dan koagulase positif
disubkultur dengan metode gores empat kuadran ke media MSA.
- Dibuat stok kuman dengan mengsubkultur koloni tersebut ke NA miring.
- Media dinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
- Diamati koloni yang tumbuh, fermentasi mannitol ditandai dengan
perubahan warna media dari merah menjadi kuning
- Dibuat stok kuman pada media NA miring, diinkubasi 37 oC, selama 24 jam,
kemudian disimpan pada suhu 4 oC.

32
 BAB VII
IDENTIFIKASI BAKTERI STREPTOCOCCUS

PENDAHULUAN
Jika hasil pewarnaan gram dari suatu specimen atau dari kultur biakan
menunjukkan bakteri berbentuk bulat gram positif maka diduga pada specimen
atau kultur tersebut terdapat kelompok bakteri Streptococcus. Bakteri ini
menyebabkan berbagai penyakit infeksi sehingga diferensiasi dan identifikasinya
merupakan tahap yang penting dalam diagnosis. Bakteri ini dapat ditemukan
dalam nanah pada luka yang terkena infeksi. Bakteri Streptococcus dapat hidup
dalam lingkungan nutrisi tertentu, yaitu membutuhkan media yang diperkaya,
seperti darah untuk pertumbuhannya.
Streptococcus diklasifikasikan dengan dua metode utama : (1) aktivitas
hemolisis dan (2) klasifikasi serologi Lancefield. Reaksi-reaksi hemolisis yang
diamati pada agar darah mencakup tiga tipe, yaitu hemolisis alfa, hemolisis beta,
dan hemolisis gamma. Klasifikasi serologi lancefield didasarkan atas keberadaan
karbohidrat C yang menjadi antigen spesifik pada kelompok bakteri
Streptococcus.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Streptococcus
2. Mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Streptococcus berdasarkan tipe
hemolisis yang dihasilkan

PRINSIP
Hemolisin yang dihasilkan oleh bakteri Streptococcus dapat melisiskan sel-sel
darah merah. Jika bakteri ditanam pada media agar darah, maka akan dihasilkan
tiga tipe hemolisis yang dapat menjadi dasar klasifikasi Streptococcus.

33
BAHAN PEMERIKSAAN
Swab tenggorokan

ALAT, BAHAN, DAN MEDIA

ALAT BAHAN MEDIA
1. Tabung reaksi 1. Aquades 1. Media Transport
2. Ose 2. Alkohol 2. Media Blood Agar
3. Bunsen 3. Kapas Plate
4. Incubator 4. Tissue
5. BSC 5. Lidi kapas steril
6. Rak pewarnaan 6. Reagen Katalase
7. Botol Semprot 7. Larutan NaCl 0,85 %
8. Spatel steril 8. Objek Glass
9. Mikroskop 9. Cat gram

PROSEDUR PEMERIKSAAN
1. Pengambilan Sampel Swab Tenggorokan
- Lidah dijulurkan dan ditekan dengan spatel
- Lidi kapas steril diusapkan pada tonsil dan bagian belakang faring
- Bahan yang diambil dimasukkan ke dalam media transport
- Dilakukan dua kali pengambilan, satu sampel untuk identifikasi awal
dengan pewarnaan gram, satu sampel untuk pembiakan ke agar darah.
2. Pewarnaan gram
- Sampel swab tenggorokan dihapuskan pada slide
- Dibuat preparat gram
- Diamati dibawah mikrokop
3. Pembiakan ke agar darah
- Bahan pemeriksaan ditanam pada lempeng agar darah dengan penipisan
empat kuadran
- Inkubasi pada suhu 37 oC, selama 24 jam
- Diidentifikasi koloni yang tumbuh (ukuran, bentuk, tekstur, warna, dan tipe
hemolisis)
- Koloni tersangka di uji katalase dan diwarnai gram untuk mengkinfirmasi
sifat gram

34
- Dibuatkan stok kuman pada media NA miring, diinkubasi pada suhu 37 o C
selama 24 jam

35
 BAB VIII
UJI KEPEKAAN BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIK

PENDAHULUAN
Uji kepekaan bakteri terhadap antibiotik dilakukan pada isolate yang mungkin
merupakan penyebab infeksi. Bila suatu isolate telah diketahui sifat kepekaannya
terhadap antibiotik tertentu, maka uji kepekaan tidak perlu dilakukan. Metode uji
kepekaan antibiotik dan pemilihan jenis antibiotik yang diuji maupun cara
interpretasinya diatur dalam standar yang disusun oleh berbagai negara. Pada
umumnya laboratorium mikrobiologi di Indonesia menggunakan standar CLSI
(Clinical and Laboratory Standards Institute) yang disusun di Amerika Serikat dan
selalu direvisi setiap tahunnya.
Uji dapat dilakukan dengan metode difusi cakram atau dilusi tabung. Metode
dilusi dapat memberikan hasil Konsentrasi Hambat Minimal (KHM=Minimum
Inhibitory Concentration/MIC), sedangkan metode difusi cakram akan
memberikan hasil sensitive, intermediate, atau resisten berdasarkan zona hambat.
Faktor-faktor yang mempengaruhi hasil uji kepekaan, antara lain ketebalan
media, kekeruhan suspense bakteri yang digunakan, konsentrasi antibiotik yang
digunakan, suhu dan lama inkubasi. Hasil dibaca dengan dengan mengukur
diameter zona inhibisi yang terjadi setelah masa inkubasi (dalam mm). hasil
pengukuran dicocokkan dengan tabel CLSI untuk menentukan isolate sensitive,
intermediate, atau resisten terhadap antibiotik yang diuji.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami berbagai metode untuk uji kepekaan bakteri terhadap antibiotik
2. Melakukan interpretasi hasil uji kepekaan bakteri terhadap antibiotik

PRINSIP
1. Metode Difusi Cakram
Menggunakan cakram kertas saring yang telah mengandung antibiotik
dengan kadar tertentu dan diletakkan di atas lempeng agar Muller-Hinton yang
telah diinokulasi bakteri. diameter zona hambat yang tampak menunjukkan
adanya kepekaan bakteri tersebut terhadap antibiotik bersangkutan. Penilaian
terhadap zona hambat dilakukan dengan membandingkan besarnya diameter

36
 zona hambat dengan tabel standar interpretasi diameter zona hambat dan MIC
(CLSI terbaru). Hasil penilaian berupa : sensitive (apabila diameter zona
hambat ≥ diameter zona hambat standar), intermediet (apabila diameter zona
hambat diantara resisten dan sensitive), resisten (apabila diameter zona hambat
≤ diameter zona hambat standar)
2. Metode Dilusi Tabung
Pada metode ini dilakukan pengenceran antibiotik dalam tabung-tabung
reaksi untuk menentukan konsentrasi antibiotik terendah yang masih
menghambat pertumbuhan bakteri atau yang disebut sebagai konsentrasi
hambat minimal (KHM) atau MIC (minimum inhibitory concentration)

ALAT, BAHAN, DAN MEDIA

ALAT BAHAN MEDIA
1. Pinset 1. Usap kapas steril 1. Muller-Hinton Agar
2. Ose 2. Biakan bakteri 2. Muller-Hinton Broth
3. Bunsen 3. Cakram antibiotik
4. Inkubator 4. Bubuk antibiotik
5. BSC 5. Tabel standar
6. Densitomer/Standar interpretasi zona
Mc Farland 0.5 hambat dan MIC
7. Penggaris 6. NaCL 0.85 %
8. Pipet
9. Tabung steril

PROSEDUR KERJA
1. METODE DIFUSI CAKRAM
- Disiapkan biakan bakteri yang berusia 24 jam
- Dibuat suspensi bakteri dengan cara mengambil koloni dari biakan
menggunakan ose kemudian dicamprkan dalam tabung reaksi yang berisi
garam fisiologis (NaCl 0,85%)
- Dibuat sampai kepadatan sel bakteri pada suspensi mencapai 0.5
McFarland, diukur dengan Densitometer
- Usap kapas steril dicelupkan ke suspensi bakteri tersebut dengan cara
menekan dan memutar usap kapas pada dinding tabung sebanyak dua kali

37
 - Usap kapas steril lalu diusapkan secara merata pada media Muller-Hinton
- Biakan bakteri dibiarkan mongering selama 4-5 menit
- Cakram antibiotik diletakkan pada lempeng agar dengan menggunakan
pinset
- Diinkubasi 37 oC, selama 24 jam
- Diperhatikan ada tidaknya zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram
antibiotik. Bila ada zona hambat diukur zona hambatnya.

2. METODE DILUSI TABUNG

- Disiapkan satu deret pengenceran antibiotik dengan perbandingan 1:2,
volume 1ml
- Ditambahkan 1 ml inokulum bakteri dengan kekeruhan 0.5 Mc Farland
ditambahkan
- Inkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam
- Interpretasi hasil
a. Tabung dengan pertumbuhan bakteri akan akan terlihat keruh, bila terjadi
hambatan, medium di dalam tabung akan terlihat jernih
b. MIC adalah konsetrasi terkecil antibiotik yang masih dapat menghambat
pertumbuhan bakteri.

38
 BAB IX

IDENTIFIKASI BAKTERI Neisseria gonorrhoeae

PENDAHULUAN
Neisseria gonorrhoeae atau gonokokus merupakan kuman berbentuk ginjal
dengan garis tengah 0,8 μm. Selalu berpasangan, sehingga disebut diplokokus.
Penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri ini dinamakan gonore/GO (kencing
tanah), dapat menginfeksi baik pada pria maupun wanita. Bahan pemeriksaan
untuk diagnosis dapat berasal dari secret urethra, secret vagina, konjungtiva atau
serviks. Untuk kasus-kasus tertentu dapat diambil dari cairan synovial, darah atau
bilasan lambung.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Neisseria gonorrhoeae
2. Mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Neisseria gonorrhoeae dari bahan
pemeriksaan klinis

PRINSIP
Diagnosa presumtif dilakukan dengan pewarnaan gram langsung dari bahan
pemeriksaan. Presumtif N. gonorrhoeae ditandai dengan adanya diplokokus gram
negative. Kultur bakteri dapat dilakukan dari bahan pemeriksaan pada media yang
diperkaya seperti agar chocolate atau media selektif Thayer Martin (media agar
chocolate yang telah dimodifikasi). Uji oksidase dan fermentasi karbohidrat dapat
dilakukan untuk menegakkan diagnosa N. gonorrhoeae

39
BAHAN PEMERIKSAAN
Swab/Sekret vagina

ALAT, BAHAN, DAN MEDIA

ALAT BAHAN MEDIA
1. Pinset 1. Alcohol 1. Media transport
2. Ose 2. Akuades (Stuart/carry and
3. Bunsen 3. Kapas blair)
4. Inkubator Co2 4. Tissue 2. Media Agar
5. Rak Pewarnaan 5. Oksidase reagen Chocolate/Thayer
6. Mikroskop 6. Cat gram Martin
3. Media NA miring

PROSEDUR PEMERIKSAAN
1. Dilakukan uji presumtif dengan pembuatan preparat gram langsung dari bahan
pemeriksaan
2. Diamati dibawah mikroskop, sel diplokokus gram negative menunjukkan
adanya N. gonorrhoeae
3. Kultur bakteri dilakukan dengan menghapuskan usap/secret vagina pada
lempeng agar chocolate/agar Thayer martin dengan metode penipisan empat
kuadran.
4. Kultur diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 % CO2, selama 24 jam.
5. Diamati koloni yang tumbuh (bentuk, ukuran, warna, tekstur, tipe hemolisis)
6. Koloni tersangka diwarnai dengan cat gram, yang menunjukkan diplokokus
diuji oksidase dan fermentasi karbohidrat. N. gonorrhoae menunjukkan
oksidase dan glukosa positif. Sedangkan maltosa dan sakarosa negatif.
7. Dibuat stok kuman dengan mensubkultur koloni tersangka pada media NA
miring.

40
 BAB X
IDENTIFIKASI BAKTERI Neisseria meningitidis

PENDAHULUAN
N. meningitidis merupakan bakteri diplokokus gram negative yang memiliki
bentuk seperti biji kopi. Bakteri ini bersifat aerobik. N. meningitidis tumbuh
dengan baik pada suhu 35-37°C dengan 5% CO2. N. meningitidis memiliki kapsul
yang berupa polisakarida. Kapsul tersebut dipergunakan untuk mengidentifikasi
serogrup. Bakteri ini memiliki ciri koloni yang berwarna abu-abu dan tidak
berpigmen pada Blood Agar Plate. Selain itu koloni yang tumbuh memiliki
tampilan bulat, halus, lembab, mengkilat, dan konveks. N. meningitidis akan
memiliki tampilan koloni yang besar, tidak berwarna sampai abu-abu hingga
opak.
Manusia adalah satu-satunya inang alami, di dalam inang ini meningokokus
bersifat pathogen. Nasofaring merupakan pintu masuknya. Di sana, organisme ini
melekat pada sel-sel epitel dengan bantuan pili, bakteri ini dapat mencapai aliran
darah dan mengakibatkan bakterimia, gejalanya seperti infeksi saluran pernapasan
bagian atas. Gejala meningokoksemia fulminan lebih hebat, dengan demam tinggi
dan ruam hemoragik, mungkin terdapat koagulasi intravaskuler tersebar dan
kolaps sirkulasi (sindroma Waterhouse-Friderichsen).
Meningitis adalah komplikasi meningokoksemia yang tersering. Serangan
biasanya tiba-tiba dengan sakit kepala hebat, muntah-muntah, dan kaku leher,
serta terjadi koma dalam beberapa jam. Selama meningokoksemia, terjadi
thrombosis pada banyak pembuluh darah kecil dalam berbagai organ, dengan
infiltrasi perivaskuler dan petekie hemoragik. Mungkin terdapat miokarditis
interstisial, artritis, dan lesi kulit. Pada meningitis, selaput otak meradang secara
akut, dengan thrombosis pembuluh-pembuluh darah dan eksudasi leukosit
polimorfonuklir,sehingga permukaan otak diliputi oleh eksudat purulent yang
tebal.

41
TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur pemeriksaan bakteri Neisseria meningitidis
2. Mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri Neisseria meningtidis dari bahan
pemeriksaan klinis

PRINSIP
Diagnosa presumtif dilakukan dengan pewarnaan gram langsung dari bahan
pemeriksaan. Presumtif N. meningetidis ditandai dengan adanya diplokokus gram
negative. Kultur bakteri dapat dilakukan dari bahan pemeriksaan pada media yang
diperkaya seperti agar chocolate atau media selektif Thayer Martin (media agar
chocolate yang telah dimodifikasi). Uji oksidase dan fermentasi karbohidrat dapat
dilakukan untuk menegakkan diagnose N. meningitidis

BAHAN PEMERIKSAAN
Cairan serebrospinal, usap nasofaring

ALAT, BAHAN, DAN MEDIA

ALAT BAHAN MEDIA
1. Pinset 1. Alcohol 1. Media transport
2. Ose 2. Akuades (Stuart/carry and
3. Bunsen 3. Kapas blair)
4. Inkubator Co2 4. Tissue 2. Media Agar
5. Rak Pewarnaan 5. Oksidase reagen Chocolate/Thayer
6. Mikroskop 6. Cat gram Martin
3. Media NA miring

PROSEDUR PEMERIKSAAN
1. Dilakukan uji presumtif dengan pembuatan preparat gram langsung dari bahan
pemeriksaan
2. Diamati dibawah mikroskop, sel diplokokus gram negative menunjukkan
adanya N. meningitidis
3. Kultur bakteri dilakukan dengan menghapuskan usap/secret vagina pada
lempeng agar chocolate/agar Thayer martin dengan metode penipisan empat
kuadran

42
4. Kultur diinkubasi pada suhu 37 oC, 5 % CO2, selama 24 jam
5. Diamati koloni yang tumbuh (bentuk, ukuran, warna, tekstur, tipe hemolisis)
6. Koloni tersangka diwarnai dengan cat gram, yang menunjukkan diplokokus
diuji oksidase dan fermentasi karbohidrat. N. meningitidis menunjukkan
oksidase, glukosa, dan maltosa positif. Sedangkan lactosa dan sakarosa negatif.

Tabel 10. Hasil Fermentasi Karbohidrat Kelompok Bakteri Neisseria

43
 BAB XI
UJI DAYA HAMBAT ZAT ANTIMIKROBA

PENDAHULUAN
Penggunaan antibiotik yang meluas dan tidak tepat menyebabkan munculnya
berbagai strain bakteri yang resisten. Resistensi tersebut menyebabkan
berkurangnya sensitivitas bakteri terhadap antibiotik yang selama ini efektif untuk
pengobatan penyakit infeksi. Resistensi muncul karena bakteri mendapatkan
tekanan dari penggunaan antibiotik yang tidak tepat dan terjadinya mutasi secara
acak yang menghasilkan gen resisten pada genom bakteri. Gen resisten tersebut
dapat berpindah dari satu strain bakteri ke strain yang lain dan dapat menimbulkan
masalah yang serius dalam tata laksana penyakit infeksi.
Oleh karena itu, pengembangan zat antimikroba dari bahan alam terus
dilakukan sebagai alternatif pengobatan selain antibiotik. Potensi zat antimikroba
dari suatu bahan alam dapat dilihat dengan menguji daya hambatnya terhadap
pertumbuhan bakteri-bakteri patogen. Uji daya hambat tersebut dapat dilakukan
dengan dua cara, yaitu metode difusi dan dilusi.

TUJUAN PRAKTIKUM
1. Memahami prosedur uji daya hambat zat antimikroba terhadap pertumbuhan
bakteri-bakteri patogen.
2. Mendapatkan zona hambat minimum/ZHM dan konsentrasi hambat
minimum/KHM dari zat antimikroba bahan alam.

PRINSIP
Pada metode difusi menggunakan kertas cakram yang berfungsi untuk
menyerap zat antimikroba pada bahan uji. Kertas cakram selanjutnya ditempelkan
pada permukaan media yang telah ditanami bakteri uji. Zat antimikroba pada
kertas cakram akan berdifusi ke dalam media. Zona hambat yang dihasilkan di
sekitar cakram menunjukkan kemampuan zat antimikroba dalam menghambat
pertumbuhan bakteri. Pada metode dilusi, zat antimikroba didilusi (diencerkan)
menjadi beberapa konsentrasi, kemudian ditambahkan ke kultur bakteri uji, baik
pada media agar (dilusi agar) atau pada media cair (dilusi cair). Metode dilusi
digunakan untuk mengetahui konsentrasi hambat minimum (KHM) dari zat

44
antimikroba, yaitu konsentrasi terendah yang masih dapat menghambat
pertumbuhan bakteri.

BAHAN PEMERIKSAAN
Bahan Uji : VCO, ekstrak daun piduh, dll
Bakteri Uji : Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus,
Streptococcus sp.

ALAT, BAHAN, DAN MEDIA

ALAT BAHAN MEDIA
1. Pinset 1. Usap kapas steril Muller-Hinton Agar
2. Ose 2. Kertas Cakram
3. Bunsen 3. Tabel standar
4. Inkubator interpretasi zona
5. BSC hambat dan MIC
6. Densitomer/Standar 4. NaCL 0.85 %
Mc Farland 0.5 5. Alcohol
7. Penggaris 6. Tissue
8. Pipet
9. Tabung steril

PROSEDUR KERJA
1. METODE DIFUSI CAKRAM
- Dibuat larutan bahan uji dalam berbagai konsentrasi (100, 75, 50, 25, 10 %,
kontrol positif/antibiotik, kontrol negative/pelarut).
- Bahan uji dari masing-masing konsentrasi diambil sebanyak 20 μl,
diteteskan pada kertas cakram, dibiarkan mengering 30-60 menit.
- Dibuat suspensi bakteri uji dengan cara mengambil koloni dari biakan
bakteri, dimasukkan ke tabung reaksi yang berisi NaCl 0,85 %,
dihomogenkan.
- Konsentrasi sel bakteri pada suspensi dibaca pada Densitometer, disesuikan
hingga mencapai 0,5 Mc Farland.
- Usap kapas steril dicelupkan ke suspensi bakteri tersebut dengan cara
menekan dan memutar usap kapas pada dinding tabung sebanyak dua kali.

45
 - Usap kapas steril lalu diusapkan secara merata pada media Muller-Hinton
Agar/MHA.
- Biakan bakteri dibiarkan mengering selama 5-10 menit.
- Cakram kertas yang telah mengering diletakkan pada lempeng agar MHA
dengan menggunakan pinset.
- Diinkubasi 37 oC, selama 24 jam.
- Diperhatikan ada tidaknya zona hambat yang terbentuk di sekitar cakram
antibiotik. Bila ada zona hambat diukur zona hambatnya.

2. METODE DILUSI AGAR

- Dibuatkan seri pengenceran bahan uji (berdasarkan konsentrasi terendah
yang menghambat pertumbuhan bakteri pada metode difusi cakram).
- Dibuat suspensi bakteri uji 0,5 Mc Farland, dibaca pada Densitometer.
- Diambil 0,5 ml bahan uji tiap konsentrasi dicampur dengan 0,5 ml suspensi
bakteri, dimasukkan ke dalam petridish steril.
- Dituangkan sebanyak 20 ml media MHA ke dalam petri dish tersebut,
dihomogenkan, dibiarkan memadat 15-30 menit.
- Media MHA diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam.
- Diamati pertumbuhan koloni bakteri pada media MHA.
- Interpretasi hasil : Petri dish yang tidak ada pertumbuhan bakteri
menunjukkan adanya penghambatan oleh zat antimikroba. Konsentrasi
hambat minimum didapatkan pada konsentrasi terendah bahan uji yang
masih dapat menghambat pertumbuhan bakteri.

46
 DAFTAR PUSTAKA

Brook, G.F, et al. 2010. Mikrobiologi Kedokteran Jawetz, Melnick & Adelberg,
ed.25. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Cappucino, J.G dan Sherman, N. 2013. Manual Laboratorium Mikrobiologi, Ed

8. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta

College of Physicians & Surgeons of Saskatchewan Laboratory Quality

Assurance Program. 2010. Procedures/Guidelines for the Microbiology
Laboratory.

Dep.Kes RI. 1990. Petunjuk Pemeriksaan Mikrobiologi Makanan dan Minuman,

Puslabkes, Jakarta

Kavanaugh, S.C. 2009. Laboratory Exercises To Accompany Microbiology

Laboratory. Bluegrass Community & Technical College

Morello, J.A, et al. 2002. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology

Applications to Patient Care, 7th Edition.

Priya, et al. 2006. Basic Microbiology Skills Part 2. Carolina. USA

Soemarno, 1987. Penuntun Praktikum Bakteriologi, VC. Karyono, Yogyakarta

Staf Pengajar Departemen Mikrobiologi Klinik FK UI-RSCM. 2012. Penuntun

Praktikum Mikrobiologi Kedokteran. Badan Penerbit FK UI. Jakarta

Staf Pengajar FK UI. 1994. Mikrobiologi Kedokteran. Binarupa Aksara. Jakarta

47