Machine Translated by Google

Sejak Januari 2020 Elsevier telah membuat pusat informasi COVID-19 dengan

informasi gratis dalam bahasa Inggris dan Mandarin tentang novel coronavirus COVID

19. Pusat informasi COVID-19 diselenggarakan di Elsevier Connect, the

situs web berita dan informasi publik perusahaan.

Elsevier dengan ini memberikan izin untuk membuat semua yang terkait dengan COVID-19

penelitian yang tersedia di pusat sumber daya COVID-19 - termasuk ini

konten penelitian - segera tersedia di PubMed Central dan lainnya

repositori yang didanai publik, seperti database WHO COVID dengan hak

untuk penggunaan kembali dan analisis penelitian yang tidak terbatas dalam bentuk apa pun atau dengan cara apa pun

dengan pengakuan sumber aslinya. Izin ini adalah

diberikan secara gratis oleh Elsevier selama pusat sumber daya COVID-19
tetap aktif.
Machine Translated by Google

Bab 9

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai

Model Sistem In Vitro

Charis-P. Segeritz1 dan Ludovic Vallier1,2

1 2
Universitas Cambridge, Cambridge, Inggris Raya; Wellcome Trust Sanger Institute,
Hinxton, Inggris Raya

Garis besar bab

Perkenalan 152 Pengembangan Obat dan Obat
Pada prinsipnya 152 Pengujian 167
Laboratorium Kultur Sel 152 Virologi dan Produksi Vaksin 167
Praktik Kultur Sel Aseptik 155 Regenerasi Jaringan dan
Kontaminasi 157 Transplantasi 167
Garis Sel 160 Rekayasa Genetika dan Gen
Kultur Sel Terapi 168
Lingkungan mikro 160 Skenario 168
Dalam praktek 162 Keterbatasan Kunci 169
Memisahkan Sel Adheren dari Perbedaan antara Seluler
Kapal Budaya untuk Subkultur 162 Lingkungan in vitro dan in vivo 169
Subkultur Suspensi Perbedaan antara Gen
Budaya 164 Ekspresi dalam Sel Primer dan
Sel Pelet 164 Garis Sel Abadi 169
Kuantifikasi Sel dan Penyelesaian masalah 169
Menentukan Viabilitas Sel 164 Kesimpulan 171
Sel Pembekuan 166 Referensi 171
Mencairkan Sel Cryopreserved 166 Glosarium 172
Aplikasi 167 Daftar Akronim dan Singkatan 172
Model Sistem Kesehatan dan
Penyakit 167

Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis. DOI: http:// dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-803077-6.00009-6

© 2017 Diterbitkan oleh Elsevier Inc. Semua hak dilindungi undang-undang. 151
Machine Translated by Google

152 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

Tujuan
Tujuan dari bab ini adalah untuk membiasakan peneliti dengan pengaturan laboratorium
kultur sel dan teknik yang diperlukan untuk berhasil memperbanyak sel secara in vitro. •
Bagaimana memastikan keamanan peneliti di lingkungan laboratorium kultur sel. • Bagaimana
melakukan teknik aseptik yang menjaga biakan sel bebas dari kontaminasi. • Cara mendeteksi
dan merawat sel biakan yang terinfeksi oleh bakteri, jamur, dan virus. • Bagaimana memilih
garis sel dan kondisi kultur untuk berbagai pertanyaan penelitian. • Bagaimana memperoleh
keterampilan dan teknik untuk memelihara sel dalam kultur. • Bagaimana kultur sel digunakan
dalam berbagai aplikasi penelitian.

PERKENALAN
Kultur sel mengacu pada metode laboratorium yang memungkinkan pertumbuhan
sel eukariotik atau prokariotik dalam kondisi fisiologis. Asalnya dapat ditemukan
pada awal abad ke-20 ketika diperkenalkan untuk mempelajari pertumbuhan dan
pematangan jaringan, biologi virus dan pengembangan vaksin, peran gen dalam
penyakit dan kesehatan, dan penggunaan garis sel hibrida skala besar untuk
menghasilkan biofarmasi. Aplikasi eksperimental dari sel kultur sangat beragam
seperti jenis sel yang dapat ditumbuhkan secara in vitro. Namun, dalam konteks
klinis, kultur sel paling sering dikaitkan dengan pembuatan sistem model yang
mempelajari biologi sel dasar, mereplikasi mekanisme penyakit, atau menyelidiki
toksisitas senyawa obat baru. Salah satu keuntungan menggunakan kultur sel untuk
aplikasi ini adalah kelayakan untuk memanipulasi gen dan jalur molekuler. Selain itu,
homogenitas populasi sel klon atau tipe sel spesifik dan sistem kultur yang terdefinisi
dengan baik menghilangkan variabel genetik atau lingkungan yang mengganggu,
dan oleh karena itu memungkinkan pembuatan data dengan reproduktifitas dan
konsistensi tinggi yang tidak dapat dibantah ketika mempelajari seluruh sistem organ.

PADA PRINSIPNYA

Laboratorium Kultur Sel

Keselamatan Laboratorium Kultur Sel

Penerapan teknik kultur sel yang menarik dalam penelitian biomedis memerlukan
pengelolaan potensi bahaya yang terkait dengan agen infeksi yang dirusak oleh sel
kultur (misalnya, HBV atau HIV), tetapi juga kontrol reagen yang dapat bersifat
toksik, korosif, atau mutagenik. Potensi bahaya ini dapat membahayakan kesehatan
pekerja laboratorium jika masuk ke dalam tubuh (misalnya, melalui kontak kulit dan
selaput lendir dengan padatan, cairan, atau aerosol) dan mengancam lingkungan
jika ditangani dengan tidak tepat (Gbr. 9.1) .
Sebelum memulai pekerjaan kultur sel, paparan yang dikurangi atau dihilangkan
terhadap agen yang berpotensi berbahaya perlu dipastikan untuk meminimalkan
infeksi, patogenisitas, reaksi alergi, dan kontak dengan racun yang dilepaskan.
Hal ini dapat dicapai dengan pelatihan personel lab yang ketat dan penerapan
praktik kultur sel standar (Tabel 9.1), yang harus ditinjau ulang.
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 153

GAMBAR 9.1 Rute paparan biohazards. Biohazard di laboratorium dapat masuk ke dalam
tubuh melalui jarum yang terkontaminasi (inokulasi parenteral), konsumsi makanan atau
penggunaan make-up di laboratorium (pencernaan), paparan aerosol biohazardous (inhalasi),
dan kontak kulit dan selaput lendir dengan kontaminasi. Alat pelindung diri dan lemari biosafety
dipasang untuk memblokir paparan peneliti terhadap agen biohazardous.

dan direvisi secara berkala oleh anggota laboratorium dan komite keselamatan institut.
Selain itu, ketika bekerja dengan sel primer yang diisolasi langsung dari jaringan manusia,
penting untuk menyaring donor dari mana sel berasal dari patogen penyebab penyakit.
Imunisasi terkini terhadap penyakit menular seperti Hepatitis B juga sangat dianjurkan
untuk staf laboratorium yang bekerja dengan sel primer.

Penanganan Sel Sel yang

Aman Komite Penasihat Patogen Berbahaya (ACDP) adalah badan nasional yang
dikelola oleh Eksekutif Kesehatan dan Keselamatan (HSE). Ini memberi nasihat tentang
bahaya dan risiko bagi pekerja dan orang lain dari paparan patogen dan telah menerbitkan
rekomendasi ini [1]. Karena beberapa jenis sel bersifat patogenik atau membawa agen
penyebab penyakit, penting untuk terlebih dahulu menentukan Kelompok Bahayanya
dan menerapkan langkah-langkah keamanan yang sesuai. Ini termasuk penilaian risiko
tertulis dan tinjauan fasilitas laboratorium. Mikroorganisme diklasifikasikan sebagai Kelompok Bahaya 1
Machine Translated by Google

154 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

TABEL 9.1 Pedoman Keselamatan Lab Seluler

• Setiap pekerja laboratorium bertanggung jawab atas kesehatan dan keselamatan mereka sendiri dan
orang lain yang mungkin terpengaruh oleh pekerjaan yang dilakukan di laboratorium kultur sel.

• Alat pelindung diri harus dipakai saat memasuki lab kultur sel
dan dilepas saat meninggalkan atau mengotori alat pelindung diri apa pun.
Setelah menangani bahan berbahaya, sarung tangan yang berpotensi terkontaminasi harus
segera dilepas dan dibuang ke dalam limbah biohazard. Cuci tangan.

• Paparan kulit pada sepatu berujung terbuka, celana pendek, dan rok tidak disarankan.

• Mengonsumsi makanan, minuman, menyimpan bahan makanan, merokok, memakai

kosmetik, atau memegang lensa kontak tidak diizinkan di laboratorium kultur sel.

• Ponsel tidak boleh digunakan saat bekerja di lab kultur sel.

• Pakaian yang longgar (misalnya syal, kalung yang menjuntai) harus dilepas sebelumnya
mulai bekerja dan rambut harus diikat ke belakang.

• Laboratorium kultur sel harus tetap rapi dan dibersihkan secara rutin dengan disinfektan (misalnya,
inkubator, tudung aliran laminar, dan permukaan kerja).

• Semua alat laboratorium yang bersentuhan dengan bahan yang berpotensi menular atau
berbahaya harus didekontaminasi sebelum dan sesudah bekerja dengannya. Bahan yang
berpotensi menular dan berbahaya harus didekontaminasi dan dibuang sesuai rekomendasi mereka
rute.

• Benda tajam (misalnya ujung pipet) harus segera dibuang melalui tempat yang ditentukan
kotak tajam.

• Tangan harus dicuci sebelum meninggalkan lab kultur sel.

• Petugas keamanan laboratorium harus diberi tahu saat terpapar atau tumpahan
agen menular atau berbahaya untuk menyarankan strategi yang sesuai untuk penahanan
dan dekontaminasi.

(misalnya, Escherichia coli K-12) atau 2 (misalnya, Staphylococcus aureus) menunjukkan

risiko kesehatan yang rendah atau sedang bagi pekerja laboratorium dan masyarakat, dan
bergantung pada profilaksis atau pilihan pengobatan yang efektif. Kultur sel bekerja dengan
agen biologis dari Hazard Group 3 (misalnya, coronavirus terkait sindrom pernafasan akut
yang parah (SARS-CoV)), dan 4 (misalnya, virus Ebola) melibatkan agen biologis yang
membawa risiko kesehatan tinggi dan mungkin tidak memiliki pilihan pengobatan setelah
infeksi. tion. Dengan demikian, ruang laboratorium perlu menyediakan tingkat penahanan
yang sesuai dengan Kelompok Bahaya dari jenis sel yang dikultur. Ini disebut sebagai
tingkat keamanan hayati (BSL) dan membawa nomor yang sesuai (BSL1–4). Dengan
demikian, laboratorium yang ditunjuk sebagai BSL1 akan mengikuti praktik mikrobiologi
standar, sementara laboratorium BSL2 perlu dibatasi untuk personel terlatih, yang diajari
untuk mengambil tindakan pencegahan ekstrem saat menangani benda tajam dan membatasi aerosol menul
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 155

dengan memanfaatkan peralatan penahanan fisik serta lemari biosafety Kelas II.

Prosedur Eksperimental yang Aman di Laboratorium Kultur Sel

Untuk memastikan lingkungan kerja yang aman dengan lini sel dan bahan
biohazardous, alat pelindung diri (APD) harus dipakai di lab kultur sel. Jas lab,
sarung tangan, dan kacamata menciptakan penghalang antara pekerja laboratorium
dan sumber yang berpotensi berbahaya. Selain itu, lemari biosafety mengandalkan
aliran udara yang disaring HEPA yang stabil dan searah dan menciptakan ruang
kerja yang tertutup dan berventilasi. Ini meminimalkan paparan peneliti dan
lingkungan terhadap bahan berbahaya yang terkait dengan sel yang dikultur,
sekaligus melindungi kultur sel dari kontaminasi. Saat menangani media kultur sel
dan melakukan percobaan di lab kultur sel, disarankan juga untuk meninjau Lembar
Data Keselamatan Bahan (MSDS) yang terkait dengan reagen laboratorium. Ini
merinci sifat kimia dan fisik produk, menguraikan rute penyimpanan dan pembuangan
yang sesuai, menginformasikan tentang potensi bahaya kesehatan dan toksisitas,
dan menyarankan APD yang harus ada saat menangani produk ini.

Peralatan untuk laboratorium kultur sel Meskipun

berbagai teknik dan pengujian dilakukan di laboratorium kultur sel yang berbeda,
tema umum pekerjaan kultur sel adalah asepsis—penciptaan lingkungan mikro
yang bebas dari mikroorganisme patogen yang tidak diinginkan, termasuk bakteri,
virus, jamur, dan parasit. Karena asepsis adalah komponen penting dari pekerjaan
kultur sel yang berhasil, ruang terpisah atau area khusus harus didedikasikan untuk
pekerjaan ini dan tidak digunakan untuk tujuan lain. Beberapa peralatan dapat
membantu mencapai ruang kerja yang steril dan umumnya mengarah pada efisiensi,
akurasi, dan konsistensi kinerja kultur sel yang lebih tinggi (Tabel 9.2).

Praktik Kultur Sel Aseptik

Sementara bagian sebelumnya telah mengeksplorasi metode yang ditujukan untuk
mengurangi paparan zat berbahaya kepada pekerja laboratorium, bagian ini akan
membahas praktik yang harus diterapkan oleh pekerja laboratorium untuk melindungi
sel yang dikultur. Memang, infeksi mikrobiologi merupakan masalah utama untuk
pemeliharaan sel in vitro. Agen infeksi seperti bakteri bersifat toksik bagi sel
eukariotik dan akhirnya menyebabkan kematian sel. Selain itu, tingkat kontaminasi
yang rendah sekalipun dapat menghasilkan hasil yang tidak normal dan
menyebabkan interpretasi ilmiah yang salah. Dengan mengikuti beberapa teknik
yang memastikan asepsis di lab kultur sel, peneliti dapat mengurangi frekuensi dan
luasnya kontaminasi serta mengurangi kehilangan sel, sumber daya, dan waktu.
Hal ini dapat dicapai dengan mengeliminasi masuknya mikroorganisme ke dalam
kultur sel melalui peralatan yang terkontaminasi, media, komponen kultur sel,
inkubator, permukaan kerja, dan bejana kultur sel yang cacat atau terbuka.
Machine Translated by Google

156 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

TABEL 9.2 Peralatan yang Direkomendasikan untuk Laboratorium Kultur Sel

Peralatan Tujuan
Kabinet keamanan hayati – Untuk menciptakan permukaan kerja yang steril; kelas II dan
direkomendasikan

Inkubator CO2 lembab - Untuk menyediakan lingkungan fisiologis untuk pertumbuhan

sel

Mikroskop cahaya terbalik - Untuk menilai morfologi sel dan menghitung sel

Kulkas, freezer (ÿ20°C, ÿ80°C), - Untuk menyimpan sel, materi sel, dan kultur
penyimpanan nitrogen cair komponen

Sentrifugal - Untuk memadatkan sel

pengukur pH – Untuk menentukan pH komponen media yang benar

Pipet dan pipettor – Untuk alikuot volume yang berbeda

Media sel dan komponen tambahan - Untuk membiakkan sel dalam komponen yang diinginkan

Hemasitometer – Untuk menghitung sel, tentukan kinetika pertumbuhan

dan siapkan kepadatan pelapisan yang sesuai

Autoklaf – Untuk mensterilkan pipet dan peralatan lain yang bersentuhan

dengan sel

Pompa vakum - Untuk mengaspirasi media kultur sel

Mandi air (dengan suhu yang dapat – Untuk menghangatkan media kultur sel
disesuaikan)

Hidangan kultur sel – Untuk membiakkan sel dalam format yang berbeda
(misalnya labu, cawan Petri, cawan 96 lubang)

Wadah untuk limbah (biohazardous) - Membuang limbah dengan benar

Menciptakan Lingkungan Kerja Aseptik

Mengingat bahwa udara atmosfer sarat dengan partikel mikro yang berpotensi
menularkan penyakit, kabinet biosafety adalah bagian paling penting dari
peralatan untuk membatasi aerosol nonsteril dan komponen udara dari mencemari
sel kultur. Kabinet biosafety harus ditempatkan di ruang laboratorium yang tidak
mengganggu aliran udaranya melalui sumber angin eksternal (misalnya angin
dari jendela atau pintu). Sebagian besar lemari biosafety membutuhkan waktu
pemanasan setelah permukaan kerja harus didekontaminasi dengan deterjen
antijamur (misalnya, Trigen 5%) diikuti dengan etanol 70%. Semua peralatan
yang masuk ke dalam biosafety cabinet juga perlu disemprot dan dilap dengan
etanol 70%. Namun, jumlah item yang digunakan dalam kabinet biosafety harus dijaga seminima
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 157

menghindari hambatan aliran udara. Kabinet biosafety hanya boleh dimatikan setelah
penggunaan sehari-hari selesai dan lampu ultraviolet dapat dinyalakan untuk
mensterilkan area permukaan yang terbuka pada malam hari. Perawatan rutin juga
mencakup pembersihan area di bawah permukaan tempat media dapat tumpah melalui
panggangan. Selain itu, servis rutin melalui teknisi kabinet biosafety dapat memastikan
aliran udara yang benar dan kapasitas filter penuh dari peralatan kultur sel yang penting
ini.
Sangat penting untuk menjaga agar semua permukaan lain yang bersentuhan
dengan bejana kultur sel atau komponen media tetap bersih. Ini termasuk inkubator,
centrifuge, mikroskop, penangas air, kulkas, dan freezer. Inkubator stainless steel
memudahkan pembersihan dan melindungi permukaan dari korosi lingkungan yang
lembab. Larutan perawatan dapat ditambahkan ke bak air untuk mencegah pertumbuhan
mikroba. Pada skala yang lebih besar, peralatan yang disimpan di ruang kultur sel harus
bebas dari debu dan disarankan untuk membersihkan lantai kultur sel secara teratur.
Staf laboratorium dapat berkontribusi pada kebersihan permukaan kerja dengan
mencuci tangan dengan sabun sebelum dan sesudah bekerja dengan kultur sel. Sarung
tangan sekali pakai yang disemprot dengan etanol 70% dan jas lab selanjutnya dapat
mengurangi masuknya kontaminan yang dibawa oleh rambut, sel kulit, atau debu.
Namun, sarung tangan harus dilepas saat meninggalkan ruang kultur sel dan jas lab
juga harus dipakai hanya di dalam ruang laboratorium kultur sel. Selanjutnya, jas lab
perlu dicuci pada suhu panas secara rutin.

Menggunakan Reagen dan Media Aseptik untuk Kultur Sel Sumber

utama kontaminasi adalah petugas laboratorium, lingkungan, dan media kultur. Media
yang bersumber secara komersial dan produk kultur sel tambahan umumnya dipasok
dalam kondisi steril. Selain itu, sterilisasi filter memungkinkan pembuatan media kultur
sel yang didasarkan pada reagen kultur nonsteril, sedangkan autoklaf secara
konvensional digunakan untuk mensterilkan peralatan yang bersentuhan dengan sel
kultur. Filter-sterilisasi cairan dapat dicapai dengan memaksa cairan melalui sistem filter
pengikat rendah polietersulfon 0,22ÿM menggunakan pompa vakum. Penambahan
antibiotik (misalnya Penicillin/Streptomycin) selanjutnya membatasi risiko pertumbuhan
bakteri dalam botol media setelah dibuka dan dalam wadah kultur sel. Namun, beberapa
laboratorium menahan diri dari penggunaan antibiotik secara rutin karena dapat
memfasilitasi munculnya strain bakteri yang resisten, memungkinkan kontaminasi latar
belakang tingkat rendah, dan dapat menyebabkan gangguan pada metabolisme sel
dan hasil eksperimen.

Kontaminasi
Karena kontaminasi umumnya tidak dapat dihindari sama sekali, penting untuk melatih
staf laboratorium kultur sel untuk mengenali tanda-tanda awal guna mencegah
penyebaran kontaminan ke sel lain atau produk kultur sel. Kontaminan paling sering
bersifat biologis dan dapat mencakup bakteri, jamur, virus, dan parasit (Gbr. 9.2).
Penting untuk membatasi kontaminan biologis sejak itu
Machine Translated by Google

158 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

GAMBAR 9.2 Kontaminan mikroba dalam kultur sel. (A) Bergantung pada strain bakteri yang
diperkenalkan, morfologi kontaminasi bakteri di bawah mikroskop dapat bervariasi dari bentuk seperti
batang, cocci, flagellated hingga hampir tidak terlihat. (B) Ragi membentuk struktur seperti benang
multiseluler yang tampak berbentuk bulat telur. (C) Pertumbuhan jamur ditandai dengan produksi
filamen tipis (hifa) multiseluler, sangat terhubung.

mereka dapat mengubah fenotipe dan genotipe dari garis sel yang dibiakkan melalui
persaingan untuk nutrisi, sintesis produk sampingan yang basa, asam atau beracun, dan
potensi interferensi komponen virus dengan genom kultur sel. Kontaminan lain mungkin
termasuk masuknya kotoran kimia yang tidak diinginkan (misalnya, peliat dalam bejana
kultur sel) atau jenis sel lain yang dikultur bersama di laboratorium.

Kontaminasi Bakteri
Kerajaan bakteri mencakup mikroorganisme prokariotik yang sangat banyak ditemukan
di mana-mana yang ditandai dengan ukuran diameter beberapa mikrometer,
keanekaragaman morfologi yang luas, dan waktu penggandaan yang cepat melalui reproduksi aseksual.
Sementara sifat yang terakhir memungkinkan deteksi siap dalam supernatan kultur sel
segera setelah infeksi, itu juga memfasilitasi penyebaran cepat. Kultur sel yang dipengaruhi
oleh kontaminasi bakteri umumnya tampak keruh. Selain itu, laju metabolisme bakteri
yang tinggi dapat mengubah pH media kultur dan dengan demikian mengubah warna
fenol merah menjadi kuning. Sementara bakteri dapat dideteksi sebagai partikel kecil pada
perbesaran mikroskop rendah, bentuknya yang berbeda biasanya terdeteksi pada
perbesaran yang lebih tinggi. Sementara strain bakteri seperti E. coli karenanya dapat
ditemukan dengan cukup mudah karena ukurannya (~ 2ÿM) dan mobilitas yang diinduksi
flagela, strain lain seperti Mycoplasma berukuran lebih kecil (<1ÿM), tidak bergerak, dan
karenanya tidak mudah dideteksi. Akibatnya, infeksi Mycoplasma dapat tidak diketahui
untuk waktu yang lebih lama dan biasanya hanya terlihat melalui penurunan kualitas sel
yang dikultur. Ini dapat bermanifestasi sebagai berkurangnya proliferasi sel dan kematian
sel. Untuk memantau kultur sel untuk kemungkinan infeksi dengan Mycoplasma,
disarankan untuk secara rutin menguji kultur untuk keberadaannya menggunakan
polymerase chain reaction (PCR), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), atau
immunostaining [2].
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 159

Kontaminasi Jamur Ragi

adalah eukariota uniseluler yang membentuk struktur seperti tali multiseluler
selama reproduksi aseksual. Sel-sel tunas ini tampak berbentuk bulat telur,
dapat tumbuh hingga berukuran sekitar 4ÿM dan oleh karena itu mudah dideteksi
pada perbesaran mikroskop rendah.
Jamur adalah anggota tambahan dari kerajaan jamur yang dapat ditemukan dalam
kultur sel. Pertumbuhan mereka ditandai dengan produksi filamen tipis (hifa) multiseluler,
sangat terhubung.
Supernatan kultur sel yang terkontaminasi oleh ragi atau kapang tampak keruh dan
meskipun pH tetap stabil selama tahap awal infeksi, pH meningkat dalam konsentrasi
kontaminan yang tinggi. Kontaminasi ragi juga dapat disertai dengan bau yang khas.
Karena spesies jamur dapat menyebar melalui spora udara, sangat penting untuk
mengidentifikasi dan mengatasi kontaminasi tersebut dengan cepat.

Kontaminasi Virus
Virus adalah agen menular yang bergantung pada sel inang untuk replikasi mereka sendiri.
Karena ukurannya yang terbatas hingga 300 nm dan siklus hidup intraselulernya, mereka
tidak terlihat dalam mikroskop cahaya umum dan sangat sulit dideteksi. Sementara
beberapa virus dapat menginduksi perubahan morfologis pada sel yang dikultur (efek
sitopatik), spesies lain dapat berintegrasi ke dalam genom seluler dan mengubah fenotip
dari garis sel yang diselidiki. Virus dapat memasuki kultur sel, misalnya, melalui penggunaan
produk kultur sel yang berasal dari hewan seperti tripsin atau serum janin sapi dan
merupakan masalah kesehatan yang serius bagi pekerja laboratorium.
Kehadiran kontaminan virus dapat menjadi tantangan untuk dikonfirmasi tetapi umumnya
bergantung pada PCR, ELISA, imunositokimia, atau mikroskop elektron [3].

Menghilangkan kontaminasi
Terlepas dari jenis kontaminasi yang teridentifikasi, kultur sel yang terkena harus
dikeluarkan dari ruang kultur sel dan dibuang untuk mencegah penyebaran agen
infeksius ke kultur lain. Selain itu, penting untuk menentukan sumber kontaminasi.
Dianjurkan untuk membuang media kultur dan komponen kultur sel lainnya yang
telah bersentuhan dengan sel yang terkontaminasi dan membersihkan
permukaan yang telah menyentuh bejana yang terkontaminasi (misalnya,
inkubator, lemari biosafety, mikroskop, aspirator).
Tidak dianjurkan untuk merawat atau melanjutkan pembiakan sel yang terinfeksi,
karena setiap penanganan biakan yang terkontaminasi akan meningkatkan potensi
penyebaran kontaminan—terutama spora jamur di udara. Selanjutnya, penggunaan
senyawa antijamur mengandung infeksi mapan dapat mengganggu metabolisme sel kultur.
Konsekuensi serupa diharapkan jika memutuskan untuk memperpanjang kultur
menggunakan antibiotik seperti Ciprofloxacin 1% untuk mengurangi pertumbuhan bakteri:
pelepasan endotoksin yang berkelanjutan dari bakteri akan berdampak pada metabolisme
sel dan kemungkinan memalsukan pembacaan sel.
Machine Translated by Google

160 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

Penghapusan kontaminan dari laboratorium kultur sel adalah tugas yang sangat
membosankan dan memperkuat pentingnya tindakan aseptik profilaksis untuk
mencegah kontaminan berakar sejak awal.

Garis Sel

Pemilihan cell line untuk kultur sel sangat bergantung pada sifat fungsional dan
pembacaan spesifik yang diperlukan dari model sel [4]. Garis sel yang dipilih juga perlu
diselaraskan dengan peralatan yang tersedia dan persyaratan kelompok bahaya
khusus mereka. Sel yang dibiakkan di laboratorium dapat diklasifikasikan menjadi tiga
jenis berbeda: sel primer, sel yang diubah, dan sel yang memperbaharui diri. Sel
primer, seperti fibroblas yang diperoleh dari biopsi kulit dan hepatosit yang diisolasi
dari eksplan hati, diisolasi langsung dari jaringan manusia. Penelitian biomedis dan
translasi seringkali bergantung pada penggunaan jenis sel ini karena mereka adalah
perwakilan yang baik dari jaringan asalnya. Namun, ada batasan biosafety yang ketat
terkait dengan penanganan jenis sel ini. Selain itu, sel-sel primer umumnya dicirikan
sebagai "terbatas" dan oleh karena itu bergantung pada pasokan stok yang
berkelanjutan karena proliferasinya berhenti setelah pembelahan sel dalam jumlah
terbatas dan ekspansi sel seringkali tidak mungkin. Sel yang diubah dapat dihasilkan
baik secara alami atau dengan manipulasi genetik. Sementara penggunaan garis sel
yang diabadikan seperti itu mengarah ke platform seluler yang menghasilkan tingkat
pertumbuhan cepat dan kondisi stabil untuk pemeliharaan dan kloning, genotipe yang
dimanipulasi dapat menyebabkan kelainan karyotipik dan fenotipe nonfisiologis. Di sisi
lain, garis sel standar yang berasal dari spesies manusia atau bukan manusia atau
(misalnya, Chinese hamster ovary (CHO), HeLa, human umbil ical vein endothelial
cells (HUVEC)) seringkali dicirikan secara menyeluruh dan karena itu mungkin lebih
mudah untuk diatur. . Sel yang memperbaharui diri termasuk, misalnya, sel punca
embrionik, sel punca berpotensi majemuk terinduksi, sel punca saraf dan usus. Sel-sel
ini membawa kapasitas untuk berdiferensiasi menjadi beragam jenis sel lain, sementara
sifat pembaharuan diri mereka memungkinkan pemeliharaan jangka panjang secara in
vitro. Jenis sel yang memperbaharui diri seringkali bertindak sebagai perwakilan yang
relevan secara fisiologis dari mekanisme in vivo.
Garis sel dapat diperoleh secara komersial, di mana langkah-langkah kontrol
kualitas tertentu dilakukan yang menjamin stabilitas genomik dan tidak adanya kontaminan.
Tempat lain untuk mendapatkan garis sel dapat berupa bank sel atau laboratorium
kultur sel lainnya. Pengenalan garis sel baru di laboratorium harus selalu disertai
dengan tes Mycoplasma PCR untuk memastikan kultur bersih.

Lingkungan Mikro Kultur Sel

Terlepas dari garis sel yang dipilih, persyaratan umum adalah pemilihan kondisi
pertumbuhan yang sesuai. Ini juga termasuk format pertumbuhan sel.
Ada beberapa kelebihan dan kekurangan yang terkait dengan kultur sel baik dalam
suspensi atau dalam bentuk berlapis. Sedangkan sel yang tumbuh cepat dalam suspensi
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 161

lebih cocok untuk percobaan yang bertujuan untuk mengisolasi protein rekombinan,
sel yang melekat lebih cocok untuk studi di mana polaritas sel merupakan komponen
penting dari fungsi sel (misalnya, sel epitel). Sel yang tumbuh dalam suspensi umumnya
mengadopsi bentuk bulat, sedangkan sel yang melekat menampilkan morfologi berduri
atau poligonal.

Media Kultur Sel

Tujuan untuk menciptakan lingkungan yang memungkinkan perbanyakan sel
maksimum dicapai terutama melalui inkubator (yaitu, suhu, kelembapan, tekanan O2,
dan CO2 ) dan media biakan sel basal dan suplemennya.
Ini termasuk tidak hanya pasokan nutrisi seperti karbohidrat, vitamin, asam amino,
mineral, faktor pertumbuhan, hormon, tetapi juga komponen yang mengontrol sifat
fisikokimia seperti pH kultur dan tekanan osmotik seluler. Selain itu, substrat
pertumbuhan padat atau semipadat dan kepadatan sel masing-masing memungkinkan
penahan sel-matriks dan interaksi sel-sel, yang selanjutnya mengatur peniruan
lingkungan mikro yang relevan secara fisiologis.

Berbagai macam komposisi media kultur sel telah dibuat untuk kebutuhan jenis sel
tertentu dan dapat diklasifikasikan menurut tingkat serum tambahannya. Serum dalam
bentuk Fetal Bovine Serum (FBS) paling sering ditambahkan pada media basal yang
telah mengandung standar untuk formulasi berdasarkan asam amino, vitamin, sumber
karbon (misalnya glukosa), dan garam anorganik. Serum menyediakan sel dengan
faktor pertumbuhan dan hormon dan bertindak sebagai pembawa lipid dan enzim, dan
transportasi mikronutrien dan elemen jejak. Beberapa laboratorium, bagaimanapun,
bertujuan untuk mengurangi suplementasi media basal dengan faktor yang berasal dari
hewan seperti serum karena merupakan komponen yang tidak ditentukan yang dapat
sangat bervariasi antar batch. Ini juga merupakan produk kultur sel yang mahal,
membawa risiko menyebabkan efek stimulasi atau penghambatan yang tidak diinginkan
pada pertumbuhan dan fungsi sel, dan dapat menyebabkan kontaminasi jika tidak
bersumber dari pemasok yang dapat diandalkan. Media serum rendah atau media
bebas serum bergantung pada formulasi yang mengurangi atau mengganti serum
dengan komponen yang lebih jelas. Ini umumnya menghasilkan kultur sel yang ditandai
dengan konsistensi yang lebih besar dalam pertumbuhan dan dalam aplikasi
eksperimental hilir. Konsentrasi suplemen juga dapat disesuaikan dengan kebutuhan spesifik dari jenis

Suhu, pH, CO2, dan Tingkat O2 Suhu yang

diinginkan untuk biakan sel tergantung pada suhu tubuh spesies dan lingkungan
mikro tempat jenis sel biakan diisolasi. Sementara sebagian besar garis sel
manusia dan mamalia diinkubasi pada suhu 36–37°C, garis sel yang berasal dari
hewan berdarah dingin dapat dipertahankan pada rentang suhu yang lebih luas
antara 15°C dan 26°C. Tingkat pH untuk sebagian besar garis sel manusia dan
mamalia yang dibiakkan di laboratorium harus dikontrol dengan ketat dan dijaga
pada tingkat pH fisiologis 7,2–7,4. Sebaliknya, beberapa garis sel fibroblast mendukung
Machine Translated by Google

162 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

kondisi yang sedikit lebih basa antara pH 7,4 dan 7,7, sedangkan garis sel yang berubah lebih
menyukai lingkungan yang lebih asam antara pH 7,0 dan 7,4 [5].
Suhu yang stabil untuk kultur sel dapat dicapai melalui inkubator yang secara ketat mengatur
dan memantau suhu lingkungan kultur sel.
Saat sel berkembang biak, pertumbuhannya membutuhkan energi yang disuplai dalam medium,
misalnya dalam bentuk glukosa. Saat dimetabolisme, produk sampingannya meliputi asam piruvat,
asam laktat, dan CO2. Karena tingkat pH tergantung pada keseimbangan CO2 dan HCO3 -
(bikarbonat), penambahan buffer berbasis bikarbonat ke media kultur sel dapat menyeimbangkan
konsentrasi CO2. Buffer pH lainnya dapat bersifat organik dan mencakup 4-(2-hidroksietil)-1-
piperazineethane sulfonic acid (HEPES) (10–25mM) atau 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
(MOPS) (20mM). Banyak media kultur sel mengandung indikator pH (misalnya, fenol merah), yang
menampilkan rentang warna antara kondisi asam (kuning) dan basa (merah muda). Selain itu,
fluktuasi konsentrasi CO2 atmosfer juga dapat mengubah tingkat pH. Oleh karena itu, sel harus
dikultur dalam inkubator yang juga memungkinkan tekanan CO2 disesuaikan menjadi 5–7%. Untuk
menunda pergeseran pH, glukosa dapat diganti dengan sumber karbon lain seperti galaktosa atau
fruktosa.

Meskipun ini akan memperlambat laju pertumbuhan sel, ini juga akan mengurangi akumulasi
produk sampingan seperti asam laktat.
Untuk kultur sel tertentu yang meniru kondisi patologis atau fisiologis di bawah tekanan oksigen
rendah (hipoksia), disarankan untuk menggunakan inkubator hipoksia dengan konsentrasi oksigen
1–21% yang dapat disesuaikan dan seimbang dengan nitrogen.

Subkultur Ketika
ruang yang tersedia di bejana kultur sel mencapai ~80% pertemuan (cakupan), sel perlu
dipindahkan ke bejana baru untuk melanjutkan pertumbuhannya.
Proses ini, disebut sebagai “passaging,” menghasilkan subkultur atau subklon, dan membutuhkan
pencernaan enzimatik atau gangguan mekanis dari monolayer sel yang melekat untuk melepaskan
sel dari substrat yang dirawat dengan kultur jaringan (Gbr. 9.3).
Sementara pertumbuhan sel yang melekat dibatasi atau dimungkinkan oleh luas permukaan yang
tersedia, konsentrasi sel dalam medialah yang menciptakan langkah pembatas laju dalam kultur
suspensi. Oleh karena itu penting untuk memantau tingkat pertumbuhan dalam kultur suspensi
dari waktu ke waktu.

DALAM PRAKTEK

Bagian ini menjelaskan protokol dasar yang diperlukan untuk pemeliharaan kultur sel. Karena
beberapa dari protokol ini mungkin perlu diamandemen untuk mengakomodasi persyaratan spesifik
dari berbagai jenis sel, akan sangat membantu untuk meninjau rekomendasi dari pemasok cell line.

Memisahkan Sel Adheren dari Wadah Kultur untuk Subkultur

Sel yang dikultur secara in vitro dari waktu ke waktu akan menghabiskan nutrisi yang disediakan
dalam medium, melepaskan metabolit toksik dan bertambah jumlahnya. Untuk memperluas dan/atau
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 163

GAMBAR 9.3 Pemeliharaan sel. Garis sel yang melekat dipertahankan dalam labu atau piring dan
perubahan media secara teratur memastikan perbanyakan sel yang sehat. Setelah ~ 80% pertemuan telah
tercapai, sel-sel dipisahkan secara enzimatik atau mekanis dari substrat pelapisnya. Sel-sel yang terlepas
dapat dikumpulkan dalam tabung Falcon dan dibuat pelet. Dengan subset dari sel-sel ini, bejana kultur sel
baru dapat diunggulkan, sementara sel yang tersisa dapat dibekukan atau digunakan untuk percobaan hilir.

mempertahankan kultur sel yang sehat, oleh karena itu penting untuk menghasilkan
kultur baru dengan subset sel dari kultur asal, menghilangkan produk sampingan yang
beracun, dan mengisi kembali nutrisi dengan media segar. Waktu yang cocok untuk
pasase dicapai ketika pertumbuhan sel yang melekat mencapai ~80% pertemuan.
Mereka kemudian dapat dicerna secara enzimatik atau dipisahkan secara mekanis untuk
mengangkat substratnya. Dalam lemari biosafety, sel dicuci dengan phosphate-buffered
saline (PBS) yang bebas dari Mg2+ dan Ca2+ untuk menghilangkan sel mati dan
diinkubasi pada suhu 37°C dengan enzim pencernaan yang cukup atau zat pengkhelat
untuk menutupi lapisan tunggal (misal trypsin, dispase, kolagenase, asam etilendiamintetraasetat (EDTA
Waktu yang diperlukan untuk melepaskan sel jangkar dari substratnya dan interaksi sel-
sel dapat memakan waktu 1–60 menit dan bergantung pada jenis sel dan enzim
pencernaan yang digunakan. Tingkat disosiasi dapat dipantau di bawah mikroskop
cahaya dan setelah selesai, ketukan bejana kultur harus dikeluarkan
Machine Translated by Google

164 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

sel-sel yang tersisa. Sel-sel yang dipisahkan dikumpulkan dalam tabung Falcon steril dan
bejana biakan juga harus dicuci dengan media yang mengandung penghambat untuk
pencernaan enzimatik dan disosiasi sel. Sel-sel yang dikumpulkan kemudian dapat
dipekatkan dan dihitung menurut protokol 4.3 dan 4.4 dan diunggulkan dalam bejana kultur
baru pada konsentrasi yang diinginkan. Konsentrasi sel yang lebih rendah (~104 sel/mL)
cocok untuk lini sel dengan laju proliferasi cepat, sedangkan konsentrasi sel yang lebih
tinggi (~105 sel/mL) lebih sesuai untuk sel dengan laju pertumbuhan yang lebih lambat.

Catatan: Merupakan praktik laboratorium yang baik untuk mencatat jumlah pasase
yang telah terjadi sejak kultur dimulai. Beberapa garis sel tidak cocok untuk pekerjaan
eksperimental di luar nomor bagian yang diberikan karena kelainan kromosom
cenderung meningkat pada garis mamalia dengan pembelahan sel dari waktu ke waktu.

Subkultur Budaya Suspensi

Subkultur kultur suspensi dapat dicapai dengan membuang sepertiga larutan suspensi
sel secara aseptik dan mengganti volumenya dengan media lengkap yang telah
dipanaskan sebelumnya.

Sel Pelet
Untuk mengonsentrasikan sel untuk dipindahkan ke bejana kultur sel baru, pembekuan,
atau pengujian eksperimental lainnya, suspensi sel disentrifugasi pada 300 × g selama 10
menit. Setelah mengeluarkan supernatan, pelet sel disuspensikan kembali dalam media
yang diinginkan melalui pemipetan sel secara perlahan ke atas dan ke bawah tiga kali.

Catatan: Sel tunggal bisa sangat rapuh dan oleh karena itu disarankan untuk tidak melakukan sentrifugal
pada kecepatan yang lebih tinggi atau memipetnya dengan kuat.

Kuantifikasi Sel dan Menentukan Viabilitas Sel

Sel bisa mati dalam proses kultur atau selama penanganan dan pengiriman.
Saat mengandalkan konsentrasi sel hidup tertentu untuk memulai kultur atau membutuhkan
sejumlah sel hidup tertentu untuk pengujian, penting untuk membedakan antara sel hidup
dan sel mati. Penghitungan sel juga membantu saat menilai tingkat pertumbuhan. Karena
sel biasanya dibiakkan dalam jutaan, jumlah sel pertama dihitung dalam volume kecil dan
kemudian diekstrapolasi ke volume sel penuh.
Untuk mencapai hal ini, semua sel dipisahkan, dipelet, dan disuspensikan kembali secara
merata dalam volume media yang sesuai. Dalam pengenceran 1:1 dengan 0,4% trypan
Blue, sejumlah kecil suspensi sel dicampur dalam tabung Eppendorf. Pewarna Trypan
Blue menembus hanya sel-sel nonviable yang karenanya dapat dikeluarkan dari kuantifikasi
selanjutnya [6]. Hal ini terjadi dengan memuat 10µL campuran sel dalam Trypan Blue ke
hemasitometer (Gbr. 9.4). Dengan menggunakan mikroskop terbalik, kontras fase, dan
perbesaran minimal 10X, semua sel yang terletak di empat kotak terluar dihitung. Sel yang
layak mengandung "halo" yang lebih gelap, sementara tidak dapat hidup
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 165

GAMBAR 9.4 Kuantifikasi sel menggunakan Trypan Blue. Hemasitometer disiapkan dengan
menutup kedua ruang hitung dengan kaca penutup. Selanjutnya, 10ÿL suspensi sel 1:1 dengan
0,4% Trypan Blue dimuat ke takik pengisian salah satu ruang hitung. Melalui aksi kapiler, volume
ini akan menutupi kisi-kisi yang dapat diamati dalam mikroskop terbalik dengan perbesaran
minimal 10X. Rata-rata sel yang menutupi kotak A–D menentukan jumlah sel per mm2 . Sel-sel
yang layak dalam kotak ini
tampak dihitung
hitam dengan
karena mengecualikan
penyerapan sel-sel
Trypan Blue yangmembran
melalui tidak dapat
selhidup yang
permeabelnya. Hanya sel yang tumpang tindih dengan salah satu batas horizontal dan vertikal
luar yang harus disertakan.

sel berwarna biru/hitam. Untuk menentukan jumlah sel yang hidup, jumlah sel
yang ditemukan di keempat kotak dibagi dengan 4 (untuk menentukan jumlah sel
rata-rata dalam 1mm2 ), dikalikan dengan 104 (untuk mendapatkan jumlah sel
per mL), dikalikan dengan 2 (untuk memperhitungkan faktor pengenceran Trypan
Blue) dan dikalikan dengan volume media awal dari seluruh suspensi sel.
Persentase sel yang hidup dapat ditentukan dengan membagi jumlah sel yang
tidak diwarnai dengan jumlah total sel, dan mengalikan rasionya dengan 100.
Kultur sel yang sehat ditandai dengan viabilitas sel 80–95%.
Machine Translated by Google

166 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

Sel Pembekuan
Ketika kelebihan sel menjadi tersedia selama subkultur, mereka dapat dipertahankan
pada bagian itu melalui pembekuan dengan agen krioprotektif (misalnya, gliserol
atau dimetil sulfoksida (DMSO)) yang mencegah pembentukan kristal ekstra atau
intraseluler yang berbahaya [7] . Untuk itu, sel dipisahkan dari bejana kultur dan
dipadatkan seperti yang dijelaskan dalam protokol 4.3. Pelet sel disuspensikan
kembali dalam 1mL media pembekuan (misalnya, media pengganti serum knockout
yang dilengkapi dengan 10% DMSO) dan ~1 × 106 sel dipindahkan ke setiap
cryovial. Setelah 20-30 menit, krioprotektan akan menembus sel. Didinginkan
semalaman pada suhu ÿ80°C dengan laju pembekuan terkontrol 1–2°C/menit, vial
kemudian dipindahkan ke nitrogen cair untuk penyimpanan jangka panjang.

Catatan: Meskipun gliserol dan DMSO keduanya merupakan agen siroprotektif yang sesuai,
penanganan DMSO perlu dipantau secara hati-hati. Dalam konsentrasi (stok) yang tinggi,
DMSO beracun bagi personel dan sel yang dikultur dan karenanya tidak dapat ditambahkan ke
sel tanpa pengenceran sebelumnya. Toksisitas ini juga mempengaruhi sel dalam media
pembekuan yang mengandung 10% DMSO ketika dibiarkan selama beberapa jam pada suhu
kamar, menyoroti kebutuhan untuk mentransfer sel ke suhu -80°C untuk penyimpanan dalam
waktu 30 menit. Secara umum, sarung tangan pelindung bahan kimia harus dipakai untuk
melindungi personel dari bahaya DMSO dan zat terlarutnya agar mudah menembus membran, termasuk kulit.

Mencairkan Sel Cryopreserved

Sebagian besar sel mamalia dapat diawetkan dalam nitrogen cair (<130°C) selama
bertahun-tahun karena semua proses biologis terhenti pada suhu ini. Untuk
memulihkan sel, 10 mL media lengkap dihangatkan terlebih dahulu dalam bak air.
Setelah mengeluarkan vial beku dari nitrogen cair, ia segera dimasukkan ke dalam
penangas air 37°C dan diaduk perlahan hingga dua pertiga isinya benar-benar
mencair. Vial diseka dengan etanol 70% dan ditempatkan dalam lemari biosafety
di mana 1mL media yang telah dihangatkan sebelumnya ditambahkan dengan cara
tetes demi tetes ke vial yang dicairkan sebagian untuk meminimalkan tekanan
osmotik yang dikenakan pada sel ketika DMSO diencerkan. Isi vial yang sekarang
sudah benar-benar dicairkan dipindahkan juga dengan cara tetes demi tetes ke 9
mL media lengkap yang tersisa dan disentrifugasi pada 300 × g selama 3 menit.
Setelah menyedot super natant, pelet sel dapat dicuci sekali dalam medium untuk
menghilangkan sisa pengawet cryo. Sel kemudian disuspensikan kembali dalam
media lengkap dan dipindahkan ke bejana kultur sel. Lampiran sel harus terjadi dalam 24 jam.

Catatan: Kelangsungan hidup sel setelah kriopreservasi dipengaruhi oleh kemampuannya untuk
mengatasi stres akibat pembekuan dan pencairan. Oleh karena itu disarankan untuk melakukan
proses pencairan secepat mungkin. Saat menangani cryovial yang telah dibekukan dengan
gliserol sebagai cryoprotectant, proses pencairan dapat disederhanakan dengan mengencerkan
sel cryopreserved sepuluh kali langsung ke dalam media yang telah dihangatkan sebelumnya,
menghindari langkah sentrifugasi dan pencucian.
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 167

APLIKASI

Sistem Model dalam Kesehatan dan Penyakit

Kultur sel adalah salah satu teknik terpenting dalam biologi seluler dan molekuler karena
menyediakan platform untuk menyelidiki biologi, biokimia, fisiologi (misalnya, penuaan)
dan metabolisme sel tipe liar dan sel berpenyakit.
Interaksi dan rute infeksi antara sel tipe liar dan agen patogen (misalnya, bakteri dan
virus) juga dapat dipelajari dalam kokultur spesifik.
Selain itu, garis sel kanker yang diabadikan telah memberi para peneliti wawasan
tentang biologi kanker dan melalui pengobatan selektif sel tipe liar dengan radiasi UV,
virus, dan racun, agen penyebab tumorigenisitas telah diidentifikasi. Akhirnya, sel punca
pluripoten yang diinduksi manusia (hIPSCs) telah diturunkan dari individu dengan
kelainan bawaan dan dibedakan menjadi tipe sel yang terkena di mana penyakit tersebut
bermanifestasi. Sel somatik yang diturunkan dari hIPSC ini adalah platform yang cocok
untuk mempelajari mekanisme molekuler suatu penyakit dalam cawan.

Pengembangan Obat dan Pengujian Obat

Alat kultur sel juga dapat diterapkan untuk menyaring bahan kimia baru, kosmetik, dan
senyawa obat untuk kemanjurannya dan menilai sitotoksisitas obat dalam jenis sel
tertentu. Jenis sel detoksifikasi seperti hepatosit dan sel ginjal sering kali sangat diminati
untuk tujuan ini. Saat menggunakan kokultur sel atau sel sakit yang diperoleh dari
masing-masing pasien, juga memungkinkan untuk menyaring obat-obatan untuk secara
selektif menargetkan jenis sel tertentu (misalnya, dalam pengobatan kanker), dengan
dosis yang tidak beracun dan dengan efek samping yang diminimalkan untuk pasien.
Selain itu, kultur sel skala besar dapat digunakan untuk menghasilkan protein, antibodi,
hormon yang direkayasa secara genetik. dan biofarmasi yang dapat diisolasi dan
digunakan secara terapeutik.

Virologi dan Produksi Vaksin

Kultur sel dengan sel mamalia menawarkan inang bagi virus untuk bereplikasi,
memungkinkan peneliti untuk mempelajari tingkat pertumbuhan, perkembangan, dan
kondisi yang diperlukan untuk siklus infeksi mereka. Selain itu, virus yang dilemahkan
yang digunakan dalam vaksin polio, campak, cacar air, rabies, dan hepatitis B
ditumbuhkan dalam kultur sel hewan.

Regenerasi Jaringan dan Transplantasi

hIPSC, sel punca embrionik, dan sel punca dewasa memiliki kapasitas untuk
beregenerasi dan berdiferensiasi menjadi jenis sel khusus yang dapat digunakan
sebagai jaringan atau organ pengganti. Kultur sel ini seringkali dilakukan dalam matriks
protein 3D yang memungkinkan sel mengatur dirinya sendiri menjadi kelompok sel fungsional (organoid)
Machine Translated by Google

168 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

Rekayasa Genetika dan Terapi Gen

Ekspresi gen spesifik dan dampaknya pada sel dapat dipelajari dengan memasukkan materi
genetik baru (misalnya, DNA, RNA) ke dalam nukleus sel mamalia yang dikultur. Demikian
pula, pentingnya gen dalam mengatur jalur tertentu dapat diamati dengan membungkamnya.
Seringkali, vektor virus atau enzim khusus digunakan untuk melakukan tugas ini. Mengubah
genom sel juga dapat membantu memulihkan gen disfungsional pada pasien.

Manfaat menyeluruh dari penggunaan teknik kultur sel untuk menjawab pertanyaan
penelitian ilmiah dan translasi dasar ini adalah homogenitas dan reproduktifitas data yang
dapat dihasilkan menggunakan garis sel klon.
Mempelajari sistem seluler yang terisolasi dan disederhanakan dalam lingkungan yang
terdefinisi dengan baik dan terkontrol membatasi paparan efek perancu yang melekat pada
sistem in vivo dan oleh karena itu memungkinkan pembuatan set data yang disederhanakan
namun kuat.

SKENARIO
Membudidayakan hIPSC untuk mempelajari penyakit hati yang diturunkan: Potongan kecil
biopsi kulit yang diperoleh dari pasien dengan penyakit hati yang diturunkan dapat dikultur
dalam cawan Petri dengan media pertumbuhan fibroblast. Kultur fibroblas primer akan
muncul dari jaringan kulit setelah 2-3 hari. Setelah mencapai ~ 80% pertemuan, fibroblas
primer yang tumbuh dapat diisolasi dari jaringan kulit menggunakan pencernaan enzimatik
dengan kolagenase dan disubkultur dalam pembuluh baru. Ini menghasilkan populasi
fibroblas murni, yang dapat ditingkatkan dan ditransduksi secara viral untuk mengekspresikan
gen pluripoten (misalnya, OCT4, NANOG, TRA-1-60), dengan demikian "pemrograman
ulang" sel somatik menjadi hIPSCs [8]. hIPSCs dalam kultur akan tersusun rapat dalam
koloni datar dengan tepi tajam dan dicirikan oleh rasio nukleositoplasma yang tinggi,
kemampuan untuk memperbaharui diri, dan kapasitas untuk membentuk sel dari ketiga
lapisan germinal. Dengan demikian, hIPSCs dapat dibedakan menjadi endoderm definitif
menggunakan aktivasi jalur Wnt dan Activin A. Sel pada tahap diferensiasi ini akan
bermigrasi dari koloni mereka ke dalam monolayer, menurunkan gen pluripotensi mereka
dan mengekspresikan penanda nasib endoderm mereka (misalnya, SOX17 , CXCR4, GSC).
Perubahan lebih lanjut dalam komposisi media dan faktor pertumbuhan eksogen yang
ditambahkan ke sel endoderm definitif akan mengarahkannya ke endoderm usus depan
dan spesifikasi selanjutnya ke endoderm hepatik.
Tahap akhir dari media diferensiasi hati menghasilkan sel mirip hepatosit yang mengeluarkan
albumin dan protein serum lainnya, mengambil lipoprotein densitas rendah (LDL),
menyimpan glikogen, dan memetabolisme obat. Yang penting, sel-sel ini juga akan
menampilkan fenotipe penyakit yang diamati pada pasien yang awalnya dilakukan biopsi
kulit. Sementara proses ini memungkinkan para peneliti untuk mempelajari dan
menyelamatkan mekanisme penyakit ex vivo [9], proses ini juga menyoroti perkembangan
hati dan munculnya penyakit dalam rahim.
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 169

BATASAN KUNCI

Perbedaan antara Lingkungan Seluler in vitro dan in vivo

Salah satu pilar penelitian kultur sel adalah desain lingkungan seluler yang
ditentukan di mana variabel tunggal dapat dimanipulasi untuk memantau respons
seluler. Untuk mencapai tujuan ini, lingkungan seluler in vitro seringkali terlalu
disederhanakan dan bergantung, misalnya, pada jenis sel tunggal yang dibiakkan
dalam lapisan tunggal. Namun, data yang dihasilkan dari sistem seluler semacam
itu tidak benar-benar menyalin interaksi seluler yang rumit antara berbagai jenis sel
dan matriks ekstraseluler dari lingkungan in vivo. Untuk mengatasi kelemahan ini,
saat ini ada penelitian signifikan ke dalam desain kokultur sel yang memungkinkan
pensinyalan parakrin antara sel yang tinggal bersama di ruang in vivo, serta matriks
bioartifisial yang memfasilitasi pertumbuhan sel dalam orientasi 3D asli mereka.
Tujuannya adalah desain sistem seluler yang meniru kompleksitas ceruk in vivo
multiseluler, namun juga memungkinkan standardisasi untuk pengujian kultur sel.

Perbedaan antara Ekspresi Gen dalam Sel Primer dan

Garis Sel Abadi
Jenis sel yang seringkali paling relevan untuk menjawab pertanyaan penelitian
translasi—sel primer—pada kenyataannya sangat sulit diisolasi dan dibiakkan
secara in vitro karena terbatasnya proliferasi dan kapasitas fungsional ex vivo.
Untuk menunda penuaan, transfeksi virus dari sel primer dapat menyita protein
penekan tumor, sehingga memperpanjang jumlah jalur yang memungkinkan dan
memungkinkan munculnya garis sel yang abadi. Meskipun ini memfasilitasi kultur
ex vivo mereka, teknik ini juga memperkenalkan ekspresi gen karsinogenik. Selain
itu, garis sel yang diabadikan dapat memperoleh mutasi selama subkultur yang
selanjutnya dapat mengganggu fenotipe seluler dan menciptakan sistem kultur sel nonfisiologis.

PENYELESAIAN MASALAH

Masalah Kemungkinan Alasan Solusi yang Disarankan

Kurangnya sel yang Penyimpanan salah Dapatkan stok baru yang disimpan dalam nitrogen
hidup saat pencairan cair yang belum dicairkan

Pencairan yang salah Mencairkan sel dengan cepat tetapi bertahap, encerkan
sel beku tetes demi tetes dengan media yang telah
dihangatkan sebelumnya, tangani sel dengan lembut, dan
hanya sentrifus dengan kecepatan rendah

Paparan gliserol terhadap Jika agen cryopreservative gliserol digunakan dan terkena
cahaya cahaya, akrolein produk sampingannya mungkin beracun
bagi sel.
Machine Translated by Google

170 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

Masalah Kemungkinan Alasan Solusi yang Disarankan

Kurangnya Sisa aktivitas enzim Cuci sel secara menyeluruh dalam media yang
perlekatan sel pencernaan sudah dihangatkan sebelum diganti
ke wadah kultur
Pencernaan sel yang Kurangi waktu pencernaan dan blokir
setelah subkultur
berlebihan aktivitas enzimatik menggunakan inhibitor (FBS for
Tripsin)

kontaminasi Lakukan tes Mycoplasma PCR rutin pada kultur

mikoplasma

Pertumbuhan sel yang lambat Media pertumbuhan Media pertumbuhan harus sesuai dengan
yang tidak tepat persyaratan garis sel biakan dan (jika ada)
mengandung serum yang telah disaring

Penipisan atau Pastikan adanya faktor pemacu pertumbuhan

kerusakan kultur dan gantikan komponen yang tidak stabil
sel esensial seperti glutamin dengan
komponen GlutaMax

Penyimpanan media Ikuti petunjuk produsen dengan cermat

dan suplemen yang
salah

Nomor bagian terlalu tinggi Laju proliferasi kultur sel dapat berhenti dengan
subkultur terus-menerus—sel harus diganti dengan
stok aliran rendah

Confluency terlalu rendah Tingkatkan konsentrasi densitas pelapisan awal

Konfluensi terlalu Sel harus dilewati dalam fase log mereka

tinggi (sekitar ~ 80% pertemuan)

kontaminasi Lakukan tes Mycoplasma PCR rutin pada kultur

mikoplasma

Pergeseran cepat Ketegangan CO2 salah Sesuaikan konsentrasi CO2 inkubator

dalam pH medium berdasarkan HCO3 ÿ konsentrasi medium:
2,0g/L membutuhkan tingkat CO2 5%,
sedangkan 3,7g/L bergantung pada 10%
CO2 tambahan

Kurangnya pertukaran gas Longgarkan tutup labu kultur jaringan

Penyangga Tambahkan HEPES (10–25mM)

bikarbonat tidak cukup
dalam media

Kontaminasi Selidiki kultur di bawah mikroskop

bakteri cahaya
Machine Translated by Google

Kultur Sel: Menumbuhkan Sel sebagai Model Sistem In Vitro Bab | 9 171

Masalah Kemungkinan Alasan Solusi yang Disarankan

Kematian sel Kurangnya Pantau tingkat CO2 dan suhu inkubator dan
CO2 atau suhu jangan tinggalkan sel di luar inkubator untuk
yang berfluktuasi waktu yang lama

Akumulasi racun Ganti media kultur sel secara teratur

osmotik salah Tinjau osmolalitas media kultur sel dan efek

tekanan potensial dari senyawa obat tambahan atau HEPES

KESIMPULAN

Bab ini telah menjelaskan kemungkinan besar untuk menggunakan teknik kultur
sel untuk menjawab pertanyaan penelitian dasar dan translasi dan telah menjelaskan
pertimbangan yang diperlukan untuk mendirikan laboratorium kultur sel. Ini juga
menunjukkan praktik dan teknik penting untuk berhasil bekerja dengan garis sel dan
menjelaskan kondisi yang diperlukan untuk menciptakan lingkungan seluler yang
meniru ceruk in vivo mereka.

REFERENSI

[1] HSE/ACDP. Agen biologis: mengelola risiko di laboratorium dan tempat perawatan kesehatan.
2005.
[2] Drexler HG, Uphoff CC. Kontaminasi Mycoplasma kultur sel: Insiden, sumber, efek, deteksi, eliminasi,
pencegahan. Cytotechnology 2002;39:75–90.
[3] Kontaminasi Merten O. Virus pada kultur sel – Pandangan bioteknologi. Sitoteknologi
2002;39:91–116.
[4] Pan C, Kumar C, Bohl S, Klingmueller U, Mann M. Perbandingan Proteomik Fenotip Garis Sel dan Sel Primer
untuk Menilai Pelestarian Fungsi Khusus Jenis Sel. Proteomik Sel Mol 2009;8(3):443–50.

[5] Schwartz MA, Keduanya G, Lechene C. Efek penyebaran sel pada pH sitoplasma normal dan
fibroblas yang berubah. Proc Natl Acad Sci USA 1989;86:4525–9.
[6] Uji eksklusi Strober W. Trypan blue terhadap viabilitas sel. Protokol Terkini dalam Imunologi, Lampiran 3B
2001.
[7] Lovelock JE, Uskup MW. Pencegahan kerusakan akibat pembekuan pada sel hidup oleh diemthyl sulphox
ide. Alam 1959;16(183):1394–5.
[8] Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, dkk. Induksi sel punca ripoten plu dari
fibroblas manusia dewasa oleh faktor-faktor tertentu. Sel 2007;131(5):861–72.
[9] Rashid ST, Corbineau S, Hannan N, Marciniak SJ, Miranda E, Alexander G, dkk. Pemodelan gangguan
metabolisme hati yang diwariskan menggunakan sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia. Jurnal

Clin Investasikan 2010;120(9):3127–36. http://dx.doi.org/10.1172/JCI43122DS1.

Machine Translated by Google

172 Metode Sains Dasar untuk Peneliti Klinis

GLOSARIUM
Kultur sel Ex vivo pemeliharaan sel dalam lingkungan steril dan di bawah menguntungkan
kondisi yang meniru relung seluler in vivo.

Asepsis Teknik kultur sel steril yang mencegah kontak infeksius yang tidak diinginkan
organisme dengan sel kultur.
Sel primer Sel diisolasi langsung dari jaringan manusia atau hewan.
Garis sel yang diabadikan Sel yang telah diperkenalkan secara alami atau eksperimental
mutasi(-mutasi) yang mengatasi penuaan sel dan membuat mereka mampu melakukan pembelahan sel
tanpa batas.
Penuaan Penangkapan proliferasi sel.
Teknik Subkultur untuk memperpanjang dan memperluas sel dalam kultur dengan mentransfer sel dari
budaya sebelumnya ke kapal baru dengan media segar.
Hemacytometer Alat untuk penghitungan manual sel yang tersuspensi dalam cairan menggunakan lampu
mikroskop.

DAFTAR AKRONIM DAN SINGKATAN

Virus Hepatitis B VHB
HIV Virus imunodefisiensi manusia
Komite Penasihat ACDP tentang Patogen Berbahaya
Eksekutif Kesehatan dan Keselamatan HSE
BSL Tingkat keamanan hayati

APD Alat pelindung diri

Lembar Data Keamanan Bahan MSDS
Reaksi berantai polimerase PCR
Uji imunosorben terkait-enzim ELISA
FBS Serum janin sapi

DMSO Dimethylsulfoxide hIPSC

Sel induk berpotensi majemuk yang diinduksi manusia