Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Topik 3 - Struktur, Fungsi, dan Replikasi Makromolekul Pembawa Informasi II

Anggota Kelompok:
● Cholifah Dinda (2206092014)
● Ellen Ashiana Djojo (2206027841)
● Felincia Kusuma Wijaya (2206024663)
● Jennifer Violla (2206022903)
● Mariska Eka Putri (2206026731)
● Shalina Diandraissa Suyudi (2206092121)
● Shofi Respati Sito Resmi (2206029260)
● Rafi Anugrah Firdausi (2206031971)
● Rightman Gultom (2206091951)

01. Sintesis, Pemrosesan, dan Modifikasi DNA

Oleh: Jennifer Violla

[Slide 4]
Pertama yang akan kita bahas yaitu Sintesis, Pemrosesan, dan Modifikasi DNA.

[Slide 5]
Peran Biomedis, ada tiga tahapan umum untuk mensintesis transkripsi primer yaitu inisiasi,
elongasi, dan terminasi.

Organisme Prokariot dan Eukariotik, untuk prokariot sendiri dia masih sederhana dan belum
terlindungi dengan membran inti sehingga tidak ada batas tegas antara inti dengan sitoplasma
sel. Maka dari itu, tidak ada batas yang memisahkan transkripsi dan translasi, sehingga kedua
proses bisa terjadi hampir serentak. Sebelum transkripsi selesai/rampung, translasi sudah
dapat dimulai (proses caping, poly a-tail, dan splicing tidak terjadi).

Eukariotik dia sudah memiliki membran inti, sehingga pada proses transkripsi di nukleus
harus rampung terlebih dahulu baru masuk ke translasi di sitoplasma. Jeda waktu antara
transkripsi dan translasi yang disebut fase pasca transkripsi

[Slide 6]
Selanjutnya ada Kelas Utama RNA
Semua sel eukariotik memiliki dua kelas utama RNA yaitu:
1. coding (cRNA)
2. RNA noncoding (ncRNA). Ada dua jenis ncRNA, yaitu:
- ncRNA housekeeping (tRNA dan rRNA) dan
- ncRNA regulatory, yang diklasifikasikan lebih lanjut menurut ukurannya. yaitu:
1. ncRNA besar (lncRNA) memiliki ≥ 200 nukleotida
2. ncRNA kecil memiliki < 200 nukleotida.
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

ncRNA kecil dibagi lagi menjadi beberapa bagian yaitu:

- RNA mikro (miRNA) yang adalah regulasi gen di sebagian besar
eukariotik, yaitu menghambat ekspresi gen dengan mengikat mRNA
target dan menghambat translasi, sehingga mencegah produksi protein
fungsional. miRNA dapat mengatur gen target unik, yang mengarah ke
tumorigenesis dan perkembangan tumor.
- RNA nukleolar kecil (snoRNA),
- RNA nuklir kecil (snRNA),
- RNA small interfering (siRNA) untuk memediasi silencing gen
pasca-transkripsi sebagai akibat dari proses degradasi mRNA
- RNA yang berinteraksi dengan PIWI (piRNA) yaitu 26-31 nukleotida
dan ada di sebagian besar hewan. Mengatur ekspresi transposon (gen
yang bisa melompat/pindah) yaitu dengan menjaga gen supaya tidak
ditranskripsi dalam sel germinal.

[Slide 7]
Berikutnya yang akan saya bahas adalah Transkripsi Untai Cetakan DNA. Sekuens
ribonukleotida dalam suatu molekul RNA itu dia bersifat komplementer terhadap sekuens
deoksiribonukleotida di salah satu untai molekul DNA untai-ganda.

Gen dapat mentranskripsikan kedua untai DNA. Panah menunjukkan arah transkripsi
(polaritas). Untai cetakan/antisense selalu dibaca dari arah 3′ hingga 5′. Untai yang
berlawanan disebut untai pengkode/sense karena identik dengan transkrip mRNA (kecuali
pengubahan T menjadi U) yang mengkode produk protein gen.

ini adalah istilah-istilah yang ada pada gambar :

Sense: untai nontemplate/pengkode
Antisense: untai template/cetakan
Kodon: kode genetik yang dibawa mRNA
Antikodon: triplet basa nitrogen yang terikat dengan mRNA

[Slide 8]
DNA → Gen → rantai nukleotida yang mengandung daerah untuk dikode molekul RNA

Sintesis protein mencakup 2 tahap

Transkripsi pada nukleus : salinan mRNA dari DNA
Translasi pada sitoplasma : penerjemahan mRNA menjadi protein

TRANSKRIPSI : salinan mRNA

Promotor: titik awal tempat menempelnya RNA Polimerase
Terminator: titik akhir tempat pemberhentian proses transkripsi
1. Inisiasi/permulaan
- Wilayah promotor menjadi situs pengenalan RNA Polimerase berikatan
- RNA Polimerase yang berikatan akan membuka kedua untai DNA terbuka
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

2. Elongasi/pemanjangan
- Terjadi elongasi di sepanjang untai DNA antisense/cetakan
- Basa nitrogen DNA akan berpasangan membentuk mRNA
- RNA Polimerase akan menambahkan nukleotida dari ujung 5’ ke 3’ pada RNA yang
dielongasi
3. Terminasi/pemutusan
- Setelah RNA Polimerase sampai di situs pemutusan/terminator, proses transkripsi
mRNA selesai
- RNA Polimerase, DNA, mRNA akan saling berpisah
- Untaian mRNA terdiri dari Exons (wilayah pengkode protein) dan Intron
(non-coding)
- mRNA yang digunakan hanya Exons, sehingga bagian Intron harus diputus
- Penghapusan Intron disebut Intron Splicing yang dilakukan oleh spliceosome
(kompleks protein dan RNA)
- Kompleks spliceosome akan menghilangkan bagian Intron dan Exons akan
berdekatan/bergabung membentuk untai mRNA utuh

Oleh: Rafi Anugrah Firdausi

[Slide 9]
Pembahasan berikutnya adalah tentang kompleks transkripsi RNA pada sel eukariotik,
dimana yang kita kenal sebenarnya ada tiga: RNA Pol I, RNA Pol II, dan RNA Pol III.
DImana masing-masing polimerase memiliki peran sendirinya, namun yang kita fokuskan
pada pembahasan ini adalah Pol II yang berperan dalam transkripsi mRNA.

RNA Polymerase pada eukariot tidak dapat membedakan antara sekuens promoter dengan
region lain pada DNA. Jadi berbeda dengan pada prokariot yang dia bisa langsung transkripsi
tanpa menggunakan faktor transkripsi.

Sehingga pada sel eukariotik dibutuhkan suatu kompleks protein lain yang disebut faktor
transkripsi (General Transcription Factor, atau GTF)

Untuk terjadinya transkripsi, perlu terbentuk terlebih dahulu suatu kompleks yang disebut
sebagai Pre-initiation complex atau PIC, bukan Person in Charge ya teman-teman. Dengan
terbentuknya kompleks ini, baru transkripsi pada template akan terjadi.

Beberapa TF yang digunakan untuk membentuk PIC ini ada 6 jumlahnya, dimana
masing-masing TF masuk menempel pada kompleks pada urutan yang berbeda. Sebelum
masuk ke TF II, perlu diketahui penamaan TF pada RNA Pol di sel eukariot, dimana TF II
berarti dia transcription factor untuk RNA Pol II, kemudian untuk TF I berarti dia berperan
untuk PIC RNA Pol I, dan demikian pun pada RNA Pol III. Jadi ini sebenarnya biar kalian
gak pusing aja.

Untuk TF yang masuk pertama adalah TFII D, dimana dia memiliki suatu bagian enzim yang
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

unik bernama TATA Binding Protein atau TBP, dia akan menempel pada template paling
pertama.

Kedua yang masuk adalah TFII A yang berfungsi sebagai stabilizer TFII D. Ketiga adalah
TFII B yang akan promosi menempelnya RNA Pol II. Keempat adalah TFII F yang akan
berikatan pada TFII D dan RNA Pol II agar RNA Pol II tidak usil transkripsi DNA lain.

Setelah menempelnya TFII F, terbentuklah PIC kita untuk transkripsi. Dilanjut dengan
penempelan TFII E yang tugasnya mempromosikan binding dari TFII H, dimana TFII H
berperan sebagai semacam helikase selama transkripsi.

[Slide 10]
Berikut adalah gambar apabila PIC sudah dalam bentuk akhirnya yang siap untuk melakukan
proses transkripsinya. Yang perlu kita garis bawahi pada kompleks ini adalah dua TF yang
paling penting kita ketahui, yakni TFII D, dan TFII H. TFII D karena dia memiliki subunit
TBP yang mengawali proses transkripsi.

Untuk TFII H dia merupakan enzim yang besar memiliki total 9 subunit, dimana dia akan
menyebabkan transisi PIC menjadi Open Complex, yang berperan dalam fosforilasi ekor dari
RNA Pol II sehingga elongasi dapat terjadi.

[Slide 11]
Pemrosesan RNA merupakan sebuah rangkaian tahap pada mRNA setelah transkripsi. Proses
ini terjadi di dalam nukleus dimana beberapa tahapan penting akan dilalui oleh RNA sebelum
dia menjadi produk jadi:
1. Quality Control dan Exporting
2. Methyl capping
3. Poliadenilasi
4. Splicing

Koaktivator P/CAF berkaitan erat dengan regulasi transkripsi dan kromatin remodelling.
P/CAF memiliki Histone Acetyl transferase yang berperan dalam relaksasi struktur kromatin
sehingga transkripsi lebih efektif.

P/CAF menghubungkan pengaktifan transkripsi dengan pemrosesan RNA melalui kompleks

kedua yang disebut TREX.

TREX (transcription-export) merupakan penghubung molekular antara kompleks elongasi

transkripsi, perangkat untuk menggabungkan RNA, dan ekspor dari nukleus

TREX akan meningkatkan ketepatan dan laju pemrosesan dan pergerakan mRNA secara
drastis ke sitoplasma untuk translasi
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

[Slide 12]
Peran TREX menyeluruh dalam pemrosesan RNA, dan gambar ini kurang lebih
menjelaskannya dengan cukup. Selain ia merekrut export mRNA dari nukleus menuju
sitoplasma, TREX juga berperan dalam methyl capping, poliadenilasi, dan splicing.

[Slide 13]
Proses RNA Splicing jika dijelaskan secara verbal akan membingungkan, jadi untuk
membantu saya menambahkan color code untuk setiap proses agar kalian dapat lebih mudah
mengikuti presentasi

untuk Pre-mRNA ditandakan warna biru muda: Ujung 5' intron dipotong dan terbentuk suatu
"tali jerat" antara G di ujung 5' intron melalui serangan nukleofilik residu adenilil

selanjutnya ditandakan warna oranye Terminal 5' yang bebas kemudian membentuk suatu
lengkung atau struktur tali jerat/laso yang disatukan oleh ikatan tak lazim 5'-2' fosfodiester ke
A reaktif di sekuens cabang PyNPyPyPuAPy (sekuens konsensus mamalia, Py adalah
pirimidin, Pu adalah purin, dan N adalah nukleotida)

pada fase Intron dipotong ditandakan warna ungu: Ujung 3' (kanan) intron kemudian
dipotong. Pemotongan ini membebaskan intron yang akan diurai lagi menjadi basa untuk
pembentukan RNA berikutnya

selanjutnya warna hijau penyambungan ekson: Ekson 1 disatukan ke ekson 2 di residu G

menjadi mRNA dewasa lalu masuk ke tahap translasi di sitoplasma.

[Slide 14]
Dalam capping, struktur tudung mRNA, berupa molekul 7-metilguanosin (m7G)

Metilasi atau penambahan gugus metil yang sebagian besar terakumulasi di ujung 5’ mRNA.
Pertanyaannya adalah mengapa demikan? mengapa tidak terakumulasi pada ujung 3’? Hal ini
dikarenakan secara evolusi, ujung 5’ dan 3’ memiliki fungsi yang berbeda. 5’ berperan
selanjutnya dalam proses translasi, kemudian untuk ujung 3’ poliadenilasi berperan dalam
export dan juga stabilitas mRNA

Struktur tudung ditambahkan ke ujung 5' prekursor mRNA yang baru terbentuk di nukleus
sebelum dipindahkan ke sitoplasma

Tudung 5' transkrip RNA diperlukan untuk inisiasi translasi yang efisien, melindungi ujung 5'
mRNA dari aktivitas enzim eksonuklease, dan membantu proses binding dari ribosom
(subunit 40S) selama inisiasi proses translasi

[Slide 15]
Ekor poli(A) ditambahkan pada ujung 3' molekul mRNA pasca transkripsi menggunakan
enzim poli(A)-polimerase
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Poli(A) polimerase akan menambahkan ekor poli(A) yang kemudian dipanjangkan hingga
200 A residu.

Ekor poli(A) melindungi ujung 3' mRNA dari aktivitas enzim eksonuklease, memfasilitasi
translasi, meningkatkan stabilitas mRNA dan melindungi RNA dari degradasi sel (umur lebih
panjang)

02. Sintesis Protein dan Kode Genetik

Oleh: Cholifah Dinda

[Slide 16]
Topik berikutnya adalah Sintesis Protein dan Kode Genetik.

[Slide 17]
Yang pertama, kita akan membahas bagaimana peran kode genetik terhadap biomedis.
Sebelumnya, kita review sedikit mengenai kode genetik. Huruf A, G, T, dan C menyatakan
nukleotida yang terdapat dalam DNA, susunan tiga hurufnya membentuk kodon, dan
kumpulan kodon disebut dengan kode genetik.

Sebelum ditemukannya kode genetik, sintesis protein dan mutasi sulit dipahami. Hingga kode
genetik menjadi dasar penjelasan bagaimana kelainan protein dapat menimbulkan penyakit
genetik dan terapinya. Misalnya antibiotik, dapat bekerja efektif karena secara selektif
mengganggu sintesis protein sel bakteri, tetapi tidak memengaruhi sintesis protein sel
eukariot.

[Slide 18]
Selanjutnya kita bahas mengenai sifat-sifat kode genetik, yang pertama adalah degenerasi,
artinya beberapa kodon menyandi asam amino yang sama. Sebelumnya kita udah belajar
bahwa kodon tersusun dari 3 nukleotida dan ada 4 huruf (A, G, T, dan C) sehingga dari 4^3
dapat membentuk 64 kodon spesifik. 3 dari 64 kodon tidak menyandi asam amino tertentu,
yaitu UAA, UAG, UGA, ketiganya disebut kodon nonsense sebagai sinyal terminasi. 61
kodon sisanya menyandi 20 asam amino. Nukleotida ketiga dalam kodon bersifat kurang
penting dibanding dua kodon yang pertama dalam menentukan asam amino spesifik, hal
inilah yang menjadi alasan utama degenerasi kode genetik.

[Slide 19]
Sifat yang kedua adalah nonambigu, yaitu kodon spesifik hanya akan membentuk satu asam
amino tertentu karena setiap molekul tRNA hanya dapat dimuati oleh satu jenis asam amino.

Sifat yang ketiga adalah tidak tumpang tindih kodon pada pembacaan kode genetik selama
proses sintesis protein.
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Sifat keempat adalah tanpa jeda, artinya, ketika proses translasi dimulai, pesan dibaca dalam
rangkaian kontinu triplet nukleotida hingga tiba di kodon stop.

[Slide 20]
Berikutnya adalah mengenai aminoasil-tRNA. Proses pengenalan dan pemuatan yang
membutuhkan energi pada translasi berlangsung dalam dua tahap dan dikatalisis oleh satu
enzim untuk masing-masing 20 asam amino. Enzim-enzim ini disebut aminoasil-tRNA sinte-
tase. Enzim ini membentuk suatu zat antara aktif kompleks arninoasil-AMP-enzim.
Kompleks spesifiknya spesifik kemudian mengenali tRNA spesifik tempat kompleks ini
melekatkan gugus aminoasil ke terminal 3'-hidroksil adenosil. Asam amino tetap melekat
pada tRNA spesifiknya dalam ikatan ester sampai asam amino mengalami polimerisasi di
posisi spesifik dalam pembentukan prekursor polipeptida molekul protein.

[Slide 21]
- Lengan ribotimidin pseudouridin sitidin (TψC) berperan dalam pengikatan
aminoasil-tRNA pada permukaan ribosom di tempat sintesis protein.
- Lengan D adalah salah satu tempat yang penting untuk pengenalan spesies tRNA oleh
aminoasil-tRNA sintetase padanannya.
- Lengan akseptor yang terletak di terminal 3'- hidroksil adenosil adalah tempat
melekatnya asam amino spesifik.
Regio antikodon (arm) terdiri dari tujuh nukleotida, dan regio ini mengenali kodon tiga-huruf
di mRNA. Sekuens yang dibaca adalah dari arah 3' ke 5'.

[Slide 22]
Selanjutnya mengenai mutasi, mutasi merupakan perubahan urutan DNA yang dapat
dihasilkan dari substitusi, delesi, dan insersi. Pertama, kita bahas tentang substitusi. Substitusi
(penggantian) satu nukleotida dengan yang lainnya disebut mutasi titik, yang terjadi pada
urutan gen.
Mutasi titik dapat berupa transisi atau transversi
Transisi → purin berubah menjadi purin lainnya atau pirimidin berubah menjadi pirimidin
lainnya
Transversi → purin berubah menjadi pirimidin atau sebaliknya

[Slide 23]
Mutasi titik dapat menimbulkan efek: silent mutation, missense mutation, dan nonsense
mutation.
- Silent mutation artinya tidak ada efek yang dapat dideteksi karena adanya degenerasi
kode. Kemungkinan terjadinya silent mutation ini meningkat jika basa yang berubah
di molekul mRNA adalah nukleotida ketiga kodon.
- Missense mutation akan menyebabkan terjadinya perubahan asam amino dalam
molekul protein, dan terbagi menjadi 3: Acceptable (Protein yang terbentuk mungkin
tidak dapat dibedakan dari protein normal), Partially Acceptable (Menghasilkan
protein yang fungsinya parsial tetapi abnormal), Unacceptable (Protein yang terbentuk
tidak mampu berfungsi normal)
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

- Nonsense mutation, yaitu munculnya kode nonsense (UAA, UAG, atau UGA) →
menyebabkan terminasi dini

[Slide 24]
Berikut merupakan contoh tiga jenis mutasi missense yang menghasilkan rantai hemoglobin
abnormal.
- Missense yang dapat diterima: Mutasi rantai β, hemoglobin Hikari tidak
menyebabkan kelainan fisiologis, tetapi menyebabkan perubahan gambaran
elektroforesis.
- Missense yang sebagian dapat diterima: Mutasi rantai β, hemoglobin S mengikat
oksigen tetapi mengendap jika mengalami deoksigenasi, menyebabkan sel darah
merah berbentuk sabit. (Merupakan dasar selular dan molekular penyakit sel sabit
- Missense yang tidak dapat diterima: Mutasi di rantai α, Hemoglobin M Boston
menyebabkan oksidasi besi fero heme menjadi feri sehingga sama sekali tidak dapat
mengikat oksigen.

[Slide 25]
Contoh 1 : Delesi satu nukleotida dari untai penyandi sebuah gen menyebabkan perubahan
rangka baca di mRNA. Ribosom tidak menyadari ada sebuah basa yang hilang karena tidak
ada jeda dalam pembacaan kodon. Oleh sebab itu, terjadi perubahan besar dalam sekuens
asam amino yang dipolimerisasikan.
Contoh 2: Jika rangkaian tiga nukleotida atau kelipatannya terdelesi dari suatu regio
penyandi, mRNA padanannya—jika ditranslasikan—akan menghasilkan protein dengan
jumlah asam amino berkurang sesuai delesi

[Slide 26]
contoh 3: Sekuens asam amino yang di sebelah distal delesi tidak saja mengalami kekacauan,
tetapi juga dapat muncul kodon nonsense dalam pembacaan sehingga produksi polipeptida
mengalami kekacauan dan penghentian dini
contoh 4: Setelah terjadi delesi di suatu gen, insersi (atau sebaliknya) dapat memulihkan
rangka baca menjadi normal

Oleh : Mariska Eka Putri

[Slide 27]
Baik selanjutnya saya akan menjelaskan tentang sintesis protein, dimulai dari tahapan hingga
pemanfaatannya. Jadi, sintesis protein adalah suatu proses mentranslasikan mRNA menjadi
rangkaian asam amino yang nantinya dapat menjadi sebuah protein.

Pada organisme eukariot, sintesis protein berlangsung di ribosom sitoplasma. Pembacaan

proses translasi dimulai dari 5’ ke 3’ dan terbagi menjadi 3 proses.

[Slide 28]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Tahapan pertama, yaitu inisiasi, tahapan ini memerlukan adanya tRNA, rRNA, mRNA, dan
10 faktor inisiasi eukariot (eIF)
Dalam proses inisiasi tahapan terbagi lagi menjadi 4 tahap yang selanjutnya akan saya
jelaskan satu per satu

[Slide 29]
Yang pertama adalah proses disosiasi ribosom, dimana subunit ribosom 40S dan 60s akan
terdisosiasi dengan melekatnya dua faktor inisiasi, e1F-3 dan eIF-1A pada subunit ribosom
40S.

Dua faktor inisiasi tersebut akan mencegah reasosiasi 2 subunit tersebut sehingga dapat di
gunakan untuk proses translasi lain

Untuk gambaran prosesnya bisa dilihat di sebelah kanan, disini saya pakai gambar ilustrasi
yang lebih mudah dipahami dibanding yang ada di buku harper

[Slide 30]
kedua, proses pembentukan kompleks prainisiasi 43S

Proses ini dimulai dengan pengikatan GTP oleh eIF-2 dan dilanjutkan dengan pengikatan
metionin-tRNAi sehingga terbentuk kompleks tripel menjadi GTP-eIF-2-tRNAi seperti pada
gambar disamping.

Kompleks ini kemudian berikatan dengan subunit ribosom 40S sehingga terbentuk kompleks
prainisiasi 43S

[Slide 31]
Nah selanjutnya adalah proses pembentukan kompleks inisiasi 48S
Singkatnya, kompleks 48S adalah kompleks 43S yang telah berikatan dengan mRNA yang
akan ditranslasi

Umumnya ujung 5’ rantai mRNA memiliki sebuah tudung atau cap yang mempermudah
pengikatan mRNA ke kompleks prainisiasi 43S . Saat proses, tudung akan berikatan dengan
kompleks eIF-4F (4F)

Selanjutnya elF-4B (4B) akan mengikat dan mereduksi ujung 5' mRNA sehingga kompleks
mengalami translokasi dan memindai mRNA untuk mendeteksi kodon inisiasi yang sesuai,
yaitu kodon AUG

[Slide 32]
Tahap terakhir dalam proses inisiasi adalah pembentukan kompleks 80S dengan
penggabungan subunit ribosom 60S dengan kompleks inisiasi 48S . Pada proses
penggabungan terjadi proses hidrolisis GTP menjadi GDP sehingga menyebabkan
pembebasan faktor-faktor inisiasi pada kompleks inisiasi 48S seperti pada gambar disamping.
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Inilah yang dapat kita sebut sebagai ribosom 80S

Di tahap ini, met-RNAi terletak di tempat P ribosom, siap untuk memulai siklus elongasi

[Slide 33]
Nah ini dia tahap elongasi
Setelah proses inisiasi, selanjutnya terjadi penambahan asam amino satu per satu pada rantai
peptida yang melibatkan EF atau faktor elongasi, EF ini adalah protein dan berfungsi untuk
mengkatalisis reaksi
Tahapan pada elongasi terbagi menjadi 3

[Slide 34]
Tahapan pertama adalah pengikatan aminoasil-tRNA
Tetapi sebelum itu, perlu diketahui bahwa ribosom 80S terbagi menjadi 3 bagian
○ yang pertama adalah A : merupakan tempat masuk atau akseptor tRNA yang
membawa asam amino
○ kedua, P : merupakan situs tempat peptidil tRNA berikatan dengan asam
amino yang sedang di elongasi
○ terakhir adalah E : yang merupakan tempat keluar tRNA dan asam amino

Nah pada situs A ini telah terbentuk kompleks tripel antara faktor elongasi 1A (EF1A), GTP,
dengan aminoasil-tRNA. Kalau kita lihat di gambar sebelah sini terlihat kompleks tripel
tersebut yang akan berikatan dengan tempat A.

Setelah aminoasil tRNA melekat, terjadi pembentukan ikatan peptida.

Terjadi reaksi dimana gugus amina asam amino baru pada tempat A berikatan dengan gugus
karboksil pada asam amino yang terdapat pada tempat P. Reaksi ini dikatalisis oleh peptidil
transferase

[Slide 35]
Terakhir ada proses translokasi

Untuk dapat menggerakan mRNA maju satu kodon, terdapat hidrolisis kompleks EF2-GTP
menjadi EF2-GDP. Selanjutnya faktor elongasi 2 (EF2)ini akan mengikat dan menggeser
peptidil tRNA dari tempat A ke tempat P. Lalu tRNA yang telah terdeasilasi di tempat E akan
pergi untuk meninggalkan ribosom.

Siklus tersebut akan terus berlangsung hingga terdapat kodon stop saat proses translasi

[Slide 36]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Baik tahap terakhir dari proses translasi adalah terminasi. Seperti yang telah dijelaskan
sebelumnya, terminasi dapat terjadi jika pada tempat A dijumpai kodon stop (UAA, UAG,
atau UGA).

Saat terminasi ikatan antara peptida dengan tRNA akan terlepas akibat reaksi hidrolisis oleh
protein faktor pembebas dan ribosom 80S akan terurai kembali menjadi subunit 60S dan 40S
sehingga siklus dapat dimulai kembali.

[Slide 37]
Setelah proses translasi, protein yang dihasilkan tidak dapat langsung bekerja begitu saja.

Banyak protein yang dihasilkan dari proses translasi hanyalah berupa prekursor sehingga
harus dimodifikasi lagi untuk memperoleh bentuk yang dapat memberikan aktivitas biologis.
Contoh modifikasi yang umum dijumpai adalah asetilasi, fosforilasi, metilasi, ubikuitilasi,
dan glikosilasi

Dibawah ini bisa kita lihat adalah hormon insulin yang masih berupa struktur proinsulin pada
manusia. Molekul insulin awalnya hanya berupa prekursor rantai tunggal. Kemudian suatu
protease spesifik memotong segmen yang menghubungkan kedua rantai sehingga terbentuk
molekul insulin yang fungsional.

[Slide 38]
Proses sintesis yang kompleks dan esensial bagi tubuh kerap dimanfaatkan. Pemanfaatan
tersebut dapat berupa pemanfaatan yang merugikan dan menguntungkan.

Contoh pemanfaatan yang merugikan adalah virus yang memanfaatkan sel host untuk
melakukan replikasi dengan proses translasi mRNA miliknya.

Hal tersebut dapat terjadi karena umumnya mRNA virus jauh lebih banyak dan lebih efisien
untuk disintesis dibandingkan sel host. Beberapa virus juga menghambat pengikatan ribosom
dengan subunit 40s.

Selanjutnya pemanfaatan yang menguntungkan adalah sintesis protein bakteri yang dihambat
oleh antibiotik. Antibiotik hanya bersifat toksik pada sintesis bakteri, hal ini dikarenakan
ribosom bakteri berukuran lebih kecil dan memiliki komponen yang lebih sederhana dari
manusia.

Lalu untuk antibiotik yang umum digunakan untuk menghambat sintesis protein bakteri
adalah :
● Tetrasiklin : yakni mencegah pengikatan aminoasil-tRNA ke tempat A bakteri, lalu
● Kloramfenikol dan antibiotik golongan makrolid lainnya : yang mengikat rRNA 23S
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

03. Regulasi Ekspresi Gen

Oleh: Shofi Respati Sito Resmi

[Slide 40]
Selanjutnya akan membahas sub topik 2 yaitu tentang Regulasi Ekspresi Gen.

[Slide 41]
Organisme mengatur ekspresi gen dalam menanggapi isyarat perkembangan, diferensiasi, dan
adaptasi. Contohnya: organisme dapat beradaptasi dengan lingkungan dan menghemat energi
harus menyesuaikan ekspresi informasi genetik dengan sinyalnya sehingga akan terjadi
respon jika diperlukan.

Regulasi gen memiliki 2 tipe, yaitu regulasi positif dan regulasi negatif.
Regulasi Positif: jika ekspresi informasi genetik meningkat secara kuantitatif akibat elemen
regulatorik tertentu.
Regulasi negatif: jika ekspresi informasi genetik berkurang secara kuantitatif akibat elemen
regulatorik spesifik.

Elemen atau molekul yang memerantai regulasi positif dinamakan dengan regulator positif,
enhancer, atau aktivator. Sedangkan yang memerantai regulasi negatif disebut regulator
negatif, silencer, atau represor.

[Slide 42]
Dalam sistem biologis terdapat 3 jenis respon temporal terhadap suatu sinyal regutatorik,
yaitu:

Respons tipe A ditandai dengan meningkatnya derajat ekspresi gen yang bergantung pada
keberadaan sinyal penginduksi. Jika sinyal penginduksi hilang, jumlah ekspresi gen juga
menurun ke tingkat basal, tetapi jumlah ekspresi dapat kembali meningkat jika sinyal spesifik
kembali muncul.

Respons tipe B memperlihatkan peningkatan jumlah ekspresi gen yang sifatnya transien
meskipun sinyal regulatorik masih ada. Setelah sinyal regulatorik berhenti dan sel dibiarkan
pulih, terlihat adanya respons transien sekunder terhadap sinyal regulatorik berikutnya.

Respons tipe C menunjukkan respons terhadap sinyal regulatorik, peningkatan derajat

ekspresi gen yang menetap tanpa batas meskipun sinyal telah berhenti. Sinyal berfungsi
sebagai pemicu. Jika telah dimulai, ekspresi gen di sel tidak dapat dihentikan bahkan pada
sel anak sehingga respons bersifat ireversibel dan dapat diwariskan.

[Slide 43]
Selanjutnya akan dibahas mengenai ekspresi gen pada prokariot.
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Terdapat beberapa istilah khusus yang harus diketahui pada regulasi gen prokariot, yaitu:

Pertama adalah operon, pada prokariotik terdapat gen-gen yang terlibat dalam jalur metabolik
dalam susunan linier yang disebut operon. Operon adalah sekelompok gen yang akan
ditranskripsi bersama untuk menghasilkan molekul RNA pembawa pesan (mRNA) yang
kemudian akan mengkode banyak protein. Contohnya adalah operon lac.

mRNA polisistronik adalah satu mRNA yang menyandi lebih dari satu protein yang
ditranslasikan terpisah. Contohnya adalah mRNA operon lac polisistronik ditranslasikan
menjadi tiga protein terpisah.

Operon dan mRNA polisistronik ini umumnya dijumpai pada bakteri dan tidak pada eukariot.

[Slide 44]
Selanjutnya kita akan membahas tentang regulasi ekspresi gen pada lac operon.
Sebelum kita membahas tentang mekanismenya kita harus mengetahui tentang struktur lac
operon. Jadi, Jacob dan Monod melaporkan model operon terhadap regulasi metabolisme
laktosa oleh bakteri usus E. coli. Berikut ini strukturnya.

Operon lac berisi tiga gen, yaitu lacZ, lacY, dan lacA yang akan ditranskripsikan sebagai
mRNa tunggal dan dikendalikan oleh satu promotor.

lacZ berfungsi untuk mengkodekan enzim beta galaktosidase yang memecah laktosa menjadi
monosakarida glukosa dan galaktosa yang akan dimasukkan dalam glikolisis. lacY
mengkodekan transporter yang membantu membawa laktosa ke dalam sel, sementara itu lacA
menyandi tiogalaktosida transasetilase.

Terdapat pula promotor, operator, dan situs pengikatan CAP.

Promotor merupakan tempat pengikatan RNA polimerase, yaitu enzim yang melakukan
transkripsi. Operator tumpang tindih dengan promotor, merupakan situs regulasi negatif oleh
represor lac. Ketika represor lac terikat pada situs ini maka RNA polimerase tidak dapat
berikatan dengan promotor untuk memulai transkripsi. Selanjutnya ada situs pengikatan CAP
yang merupakan situs regulasi positif yang dapat mengikat protein aktivator katabolit (CAP).
Ketika CAP berikatan dengan situs ini maka akan mendorong RNA polimerase berikatan
dengan promotor dan melakukan transkripsi.

[Slide 45]
Setelah mengetahui tentang struktur operon lac, mari kita bahas mengenai mekanisme
regulasi ekspresi gen pada operon lac.

Dapat dilihat pada gambar ini merupakan mekanismenya. Pada keadaan pertama ini tidak
adanya keberadaan inducer. Gen lacI mensintesis molekul represor yang mengikat lokus
operator. Ikatan represor-operator ini mengakibatkan RNA polimerase tidak dapat mengikat
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

promotor sehingga menghambat transkripsi gen lacZ, lacY, dan lacA untuk menjadi mRNA
polisistronik.

keadaan kedua terjadi ketika adanya penginduksi, tetapi terdapat glukosa. Molekul represor
tetramer diubah konformasinya oleh penginduksi sehingga menjadi inaktif dan tidak dapat
mengikat lokus operator. Keberadaan glukosa menghambat adenil siklase sehingga
kurangnya cAMP yang dapat berikatan dengan CAP dan menyebabkan RNA polimerase pun
juga tidak dapat mengikat promotor dengan efisien sehingga transkripsi tidak berjalan.

[Slide 46]

Keadaan ketiga terjadi ketika adanya keberadaan penginduksi dan tidak adanya glukosa.
Adenil siklase diaktifkan dan akan memproduksi cAMP. cAMP akan berikatan dengan CAP
(Catabolite Activator Protein). Kompleks cAMP-CAP akan berikatan di situs pengenalannya
sehingga meningkatkan pengikatan RNA polimerase pada promotor sehingga terjadi
transkripsi gen-gen struktural lacZ, lacY, dan lacA serta molekul RNA polisistronik yang
terbentuk dapat ditranslasikan menjadi protein beta galaktosidase, permease, dan
transasetilase dan laktosa dapat dikatabolisme menjadi sumber untuk pertumbuhan.

Jadi, regulator CAP-cAMP bekerja sebagai regulator positif karena keberadaannya

dibutuhkan untuk ekspresi gen yang optimal. Karena itu, operon lac dikontrol oleh dua faktor
trans pengikat-DNA berbeda yang dimodulasi oleh ligan; satu yang bekerja secara positif
(kompleks cAMP-CRP) untuk memfasilitasi pengikatan RNA polimerase ke promotor dan
satu yang bekerja secara negatif (represor lacI) yang mengantagonis ikatan promotor RNA
polimerase. Aktivitas maksimal operon lac terjadi jika kadar glukosa rendah (cAMP tinggi
disertai pengaktifan CAP) dan terdapat laktosa (lacl tidak dapat berikatan dengan operator).

Oleh: Felincia Kusuma Wijaya

[Slide 47]

Berikutnya saya akan menjelaskan mengenai regulasi ekspresi gen pada eukariot. Tentunya
eukariot merupakan organisme yang jauh lebih kompleks dibandingkan prokariot.

Setiap sel, jaringan, dan organ pada suatu organisme eukariot memiliki fungsi yang khusus.
Namun, tiap sel memiliki salinan DNA yang sama. Maka, ekspresi gen harus bersifat
diferensial, artinya gen-gen tertentu yang diaktivasi dan diinaktivasi berbeda-beda tergantung
lokasi dan fungsi sel tersebut. Regulasi ekspresi gen tersebut memungkinkan karena adanya
fenomena epigenetik.

Epigenetik adalah perubahan ekspresi gen (fenotipe) tanpa mengubah sekuens DNA dengan
melibatkan modifikasi struktur DNA atau komponen penyusunnya yang diwariskan kepada
sel anak. Perubahan epigenetik bersifat reversibel dipengaruhi oleh lingkungan dan gaya
hidup.
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

[Slide 48]
Bagaimana epigenetik bisa terjadi? Berikut adalah mekanisme epigenetik:
- Pertama adalah asetilasi histon yang akan mengaktivasi transkripsi. Penambahan
gugus asetil pada residu lisin ekor histon akan mengurangi muatan positif sehingga
afinitas histon terhadap DNA yang bersifat negatif juga berkurang. Hal ini
menyebabkan kromatin menjadi longgar dan perubahan dari struktur kromatin ini
akan menyediakan docking sites kompleks protein remodelling untuk berikatan
dengan kromatin sehingga memicu pembukaan daerah promotor dan daerah regulatori
untuk dijalankannya transkripsi.
- Kedua, adalah metilasi DNA yang akan menyebabkan inaktivasi transkripsi. Metilasi
terjadi pada dinukleotida CpG menghasilkan 5-metil-sitidin. Akibatnya, kromatin
menjadi terkondensasi atau padat sehingga DNA tidak bisa ditempeli oleh protein
regulatori dan transkripsi dihambat.

[Slide 49]
- Ketiga, long noncoding RNA menyebabkan inaktivasi transkripsi. Cara kerja pertama
yaitu seperti yang ditunjukkan oleh gambar di sebelah kanan yaitu dengan merekrut
remodelling complexes yang memfasilitasi metilasi histon sehingga terjadi inhibisi
ekspresi gen ALX4. Cara kedua yaitu dengan merekrut RBP yang mengganggu
deasetilasi histon sehingga mencegah pelanggaran kromatin yang akan menghambat
pengikatan faktor transkripsi pada daerah promotor.
- Gambar di bawah juga menunjukkan mekanisme lcRNA yang menstabilkan protein
represor sehingga transkripsi gen CCND1 terrepresikan.

[Slide 50]
Epigenetic memiliki peran yang penting dalam menetapkan, mempertahankan, dan
mengembalikan keadaan on/off dari transkripsi gen. Agar mekanisme epigenetik dapat
terjadi, dibutuhkan suatu sinyal yang bisa diteruskan.

Sinyal epigenetik berupa:

1. Trans-epigenetic signal berupa protein transkativator yang dapat berdifusi bebas.
Gambar A menunjukkan suatu kromosom yang memiliki gen pengkode protein
sinyal. Ketika terjadi pembelahan sel, protein sinyal akan berdifusi bebas di antara
sitosol sel induk dan sel anak. Sinyal ini kemudian akan kembali memasuki nukleus,
berikatan pada promotor gen, menginduksi ekspresi gennya kembali, dan
memproduksi sinyal protein lebih banyak sehingga terjadi feedback positif. Pada
akhirnya, sinyal dipertahankan pada sel anak.
Karena sinyal trans-epignetic berupa protein yang dapat berdifusi, maka target
sekuens yang dipengaruni dapat berada di lokasi manapun dalam genom

2. Cis-epigenetic signal
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Sinyal Cis epigenetik berupa struktur molekuler DNA yang khas atau yang disebut
juga tanda epigenetik yang diwariskan melalui segregasi kromosom, yaitu pemisahan
kromosom menjadi dua sel anak.
Gambar di samping menunjukkan suatu gen pada kromosom yang membawa sinyal
cis-epigenetik pada daerah regulatori yang akan mempengaruhi transkripsi gen.
Berbeda dengan trans, cis spigeneik hanya mempengaruhi DNA/RNA pada molekul
kromatid yang sama.

[Slide 51]
Selanjutnya, sinyal-sinyal epigenetik tersebut juga harus bisa dipropagasikan atau
ditransmisikan kepada sel anaknya setelah tiap putaran pembelahan sel agar tetap dapat stabil
dan dipertahankan dalam satu organisme. Untuk itu, ada 3 cara propagasi sinyal epigenetik
yang meliputi:
1. Propagasi DNA 5MeC
Setelah replikasi DNA, untai lama DNA yang memiliki tanda epigenetik berupa
5MeC akan menginduksi aktivitasi DNA metilase sehingga untai baru DNA
termetilasi dan kedua untai memiliki tanda epigenetik.
2. Propagasi nukleosomal histone PTM
Contohnya, propagasi Lysine K-27 trimethylated histone H3; H3K27me3 yang
melibatkan pengikatan polycomb repressive complex 2 (PRC2) pada histon. Interaksi
ini akan menstimulasi aktivitas metilase subunit EZH2 sehingga terjadi metilasi H3
pada kedua kromatid.
3. lncRNAs berinteraksi dengan target sekuens DNA membentuk kompleks RNA-DNA
yang dikenali oleh RBP (RNA-binding protein). Lalu, merekrut chromatin modifying
complex (CMC) yang memodifkikasi histon.

[Slide 52]
Selanjutnya saya akan menjelaskan mengenai dua elemen protein pengikat DNA yang
penting yaitu enhancer dan insulator. Enhancer merupakan elemen DNA yang memfasilitasi
atau meningkatkan inisiasi transkripsi pada promotor. Enhancer memiliki karakteristik
sebagai berikut:
● Memiliki banyak binding sites untuk protein transaktivator
● Dapat bekerja dalam jarak jauh dari promotor, pada lebih dari satu promotor
● Dapat bekerja ke arah upstream (5’) atau downstream (3’) dari the promotor
● Berinteraksi dengan chromatin-modifying coregulatory complexes dan kompleks
transkripsi RNA polimerase sehingga terjadinya peningkatan aktivitas transkripsi
Enhancer bersama dengan protein regulator, seperti aktivator, koaktivator, dan faktor
transkrispsi lainnya akan membentuk kompleks enhanceosome yang berikatan pada daerah
promotor. Sebagai contoh, gen ß-interferon pada sel mamalia diinduksi saat terjadi infeksi
virus. Interferon yang diproduksi akan berinteraksi dengan sel tetangga dan menginhibisi
replikasi virus. Dengan pembentukan kompleks enhanceosome, akan terjadi penigngkatan
drastis transkripsi gen interferon yang sangat membantu melawan infeksi virus.

[Slide 53]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Tadi telah dibahas mengenai enhancer dan karakteristiknya. Namun, jika enhancer dapat
bekerja dan mempengaruhi gen yang terletak pada lokasi jauh sekalipun, bagiamana caranya
agar enhancer tidak meningkatkan transkripsi semua gen pada kromatin. Untuk itu,
diperlukan insulator yang dapat membatasi daerah-daerah tertentu di sepanjang kromatin agar
tidak diaktifkan oleh enhancer.

Insulator adalah elemen DNA yang terletak di daerah antara 2 gen yang mencegah kerja
enhancer pada promotor gen yang berada di sisi lain insulator.

Mari kita perhatikan gambar berikut. Insulator menjadi fungsional jika ia tidak termetilasi
sehingga bisa diikat oleh protein CTCF. Gambar atas memperlihatkan Enhancer hanya
memiliki akses pada promotor H19 karena promotor Igf2 diblokir oleh insulator. Pada
gambar di bawah, metilasi terjadi pada insulator menjadi tidak fungsional dan promotor H19
sehingga menjadi terblokir dan enhancer hanya bisa mengakses Igf2.

Oleh: Rightman Gultom

[Slide 54]

Berikutnya saya akan menjelaskan mengenai beberapa motif pada protein faktor transkipsi.

Protein-protein regulatorik yang berperan dalam kontrol transkripsi berikatan dengan afinitas
dan spesifisitas tinggi pada bagian DNA yang tepat. Disini akan ada tiga motif unik yang
akan dibahas: helix-turn-helix, zinc finger, dan leucine zipper.

Pembandingan aktivitas pengikatan protein protein yang mengandung motif-motif tersebut

menghasilkan beberapa generalisasi penting, seperti bisa dilihat pada tabel di samping. Pada
tabel disamping, dijabarkan motif-motif protein, organisme, dan faktor protein transkripsi
yang mempunyai motif tersebut. Pengikatan berlangsung dengan afinitas tinggi pada tempat
spesifik dan dengan afinitas rendah pada DNA lain. Interaksi protein-DNA ini dipertahankan
oleh ikatan hidrogen, interaksi ionik, dan gaya van der Waals. Motif-motif ini dapat juga
digunakan untuk ‘identifikasi’ atau lebih tepatnya memperkirakan apakah protein tersebut
berikatan dengan DNA.

Pada tabel disamping, dijabarkan ketiga motif, beserta dengan organisme-organismenya juga
protein faktor transkripsi yang memiliki motif tersebut.

[Slide 55]

Untuk motif pertama, ada motif protein helix-turn-helix. Motif ini terdiri dari dua heliks yang
dipisahkan oleh putaran. Faktor dengan motif ini ditemukan pada protein-protein yang
berperan dalam regulasi transkripsi pada prokariota dan eukariota. Pada prokariota, motif ini
ditemukan pada protein repressor dan activator, sedangkan pada eukariota ditemukan pada
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

protein homeodomain. Heliks pertama berfungsi sebagai domain pengenalan DNA,

sedangkan heliks kedua berfungsi sebagai domain pengikat DNA.

Bisa dilihat pada ilustrasi disamping bahwa heliks α3 dan α3 tersusun 90° satu sama lain dan
dipisahkan oleh sumbu simetri dua kali lipat.

[Slide 56]

Selanjutnya, ada motif zinc finger, atau dalam bahasa indonesia daoat diterjemahkan
langsung sebagai “jari seng”. Sesuai namanya, motif jari seng terdiri dari satu atau beberapa
ikatan kompleks antara ion zinc dan asam amino tertentu. Setiap inti jari seng berbentuk
koordinasi tetrahedral dengan seng (Zn) yang menstabilkan ikatan.

Pada gambar disamping, ion seng dikordinasi oleh dua rantai histidin dan dua rantai sistein.
Jari seng juga bisa dikoordinasi oleh hanya rantai sistein (Cys-Cys Zinc Finger)

[Slide 57]

Untuk motif terakhir, ada motif leucine zipper. Leucine zippers adalah heliks α yang
mengandung residu leusin setiap asam amino ketujuh. Terdiri dari dua heliks yang dipisahkan
oleh sekuens asam amino yang kaya akan leusin. memungkinkan dua monomer identik atau
nonidentik untuk menyatu dalam kumparan yang bergelung dan membentuk kompleks
dimerik yang ketat.

Bisa dilihat di samping bahwa gambar “A” memperlihatkan roda heliks di mana motif
leucine zippers dimana leusin “L” terdapat di setiap posisi ketujuh. Sedangkan pada gambar
“B” diperlihatkan dua rantai polipeptida yang identik disatukan dalam bentuk dimer oleh
domain leucine zipper masing-masing.

[Slide 58]

Selanjutnya, kita akan membahas tentang domain pengikat DNA dan domain pengikat
trans-aktivasi.

Pada pertukaran domain, saat faktor transkripsi GAL4 mengikat penguat/UAS GAL1, terjadi
aktivasi transkripsi gen GAL aktif, seperti gambar (A) disamping. Saat DNA Binding
Domain (DBD) normal diganti dengan DBD protein LexA E. coli (LexA DBD) (E,F), proses
gagal karena DBD gagal mengikat UAS (Upstream Activation Sequence) GAL1, dimaan
pada gambar disamping diilustrasikan dengan bentuk yang berbeda. Sebaliknya, fusi protein
LexA DBD -Gal4 AD, yang mempunyai activator domain, mengaktivasi transkripsi GAL1
ketika operator LexA diinsersi ke promotor GAL1, menggantikan enchancer UASGAL
normal (H).

[Slide 59]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Faktor transkripsi hipotetis ini memiliki sebuah domain pengikat DNA (DBD) yang berbeda
dari domain pengikat ligan (LBD) dan beberapa domain aktivasi (AD) (1-4), seperti gambar
di samping. Protein lain mungkin tidak memiliki DBD atau LBD dan semua dapat memiliki
domain (dengan jumlah bervariasi) yang berkontak dengan protein lain, termasuk
ko-regulator dan protein pada kompleks transkripsi basal.

[Slide 60]

Untuk topik selanjutnya, akan dibahas tentang perbedaan regulasi gen pada sel prokariot dan
eukariot. Atau, mungkin lebih tepatnya, apa saja mekanisme ekspresi gen lain yang dilakukan
pada sek eukariot, diluar hanya proses transkripsi saja, seperti sel prokariot.

Dibandingkan dengan gen prokariot, dalam ekspresi gen eukariot lebih banyak tahap
berperan, terutama dalam pemrosesan RNA, dan tahap-tahap ini memberikan tempat
tambahan bagi pengaruh regulatorik yang tidak terdapat pada prokariot. Mekanisme ini antara
lain: amplifikasi gen, tata ulang gen, pemrosesan RNA, alternate splicing mRNA, transpor
mRNA, stabilitas mRNA, dan lain-lain, seperti yang didaftarkan di tabel di samping.

04. Genetika Molekular, DNA Rekombinan, dan Teknologi Genomik

Oleh: Shalina Diandraissa Suyudi

[Slide 61]
Selanjutnya adalah materi bahasan mengenai genetika molekuler, DNA rekombinan, dan
teknologi genomik.

[Slide 62]
Sebenarnya DNA Rekombinan itu apa si? DNA Rekombinan adalah proses manipulasi DNA
dan molekul kimerik yang dapat membantu kami mempelajari bagaimana bagian tertentu
DNA mengontrol fungsi seluler. Alat genetika molekuler memungkinkan peneliti untuk
menanyakan dan memanipulasi urutan genom. RNA, protein, bahkan sel tunggal.

Tapi kenapa kita harus memahami sampai ke tingkat molekuler?

[Slide 63]
Pertama, tentunya menawarkan pendekatan untuk memahami dasar molekul suatu penyakit,
pemahaman dapat membantu juga untuk memanfaatkan protein manusia yang bisa digunakan
untuk terapi dan penyiapan vaksin. Selain itu bisa juga untuk bidang forensik.

[Slide 64]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Lalu bagaimana kerjanya Teknologi Rekombinan DNA? Jadi, dalam prosesnya melibatkan
isolasi dan manipulasi DNA untuk membuat molekul chimera. Hal ini juga melibatkan
beberapa teknik dan reagen yang tertentu.

Pemeran pertamanya enzim restriksi. Enzim restriksi atau endonuklease, biasa disingkat
RE’s. memotong DNA dari sumber manapun menjadi potongan kecil yang unik, dengan cara
yang sequence specific. Keberadaannya juga bacterium restricted. atau mencegah
pertumbuhan virus bakteri tertentu yang disebut bakteriofag. Kenapa dia dapat memotong
DNA bakteriofage dan tidak memotong DNA inangnya? Karena enzim restriksi ini hanya
bisa memotong DNA yang TIDAK termetilasi, sedangkan DNA inangnya itu termetilasi

Defense enzim ini memproteksi DNA bakteri inang dari genom DNA organisme asing
dengan menginvasi fage DNA dengan digesti.

Tabel di sebelah sini menunjukkan beberapa enzim restriksi yang dinamakan berdasarkan
bakteri dari mana mereka diisolasi. Contohnya EcoRI. E itu huruf pertama dari genusnya, co
itu 2 huruf dari spesiesnya, R itu strain nya, kemudian ada roman numeral itu berdasarkan
urutan penemuannya.

Setiap enzim mengenali dan memotong urutan DNA beruntai ganda tertentu. Pemotongan ini
menghasilkan ujung yang tumpul atau tumpang tindih (lengket atau kohesif).

Pertanyaannya adalah, kapan terjadi pemotongannya? Jadi sebenernya bisa dihitung dengan
rumus 4n, misalnya ada enzim restriksi yang mengenali sequence 6bp. Jadi enzim restriksi itu
memotong setiap 46 atau 4096bp.

[Slide 65]
Kemudian ini ada tabel mengenai berbagai enzim lain yang bereaksi dengan DNA dan RNA
dan merupakan bagian penting dari teknologi DNA Rekombinan. Contohnya ada DNA ligase
dimana dia digunakan untuk menggabungkan molekul DNA.

[Slide 66]
Lalu disini kita ada salah satu DNA gene regulating system yang disebut CRISPR-Cas 9 atau
Clustered regularly interspersed short palindromic repeats-association gene 9. Ditemukan
pada 2012, telah merevolusi studi DNA genom. Jadi sistem itu banyak ditemukan di dalam
bakteri, sebagai imunitas adaptif untuk untuk mencegah infeksi ulang suatu bakteri oleh
bakteriofag tertentu. Sistem ini bersifat komplementer dengan endonuklease restriksi.
Mekanismenya bagaimana??

Ilmuwan mengidentifikasi sekuen DNA yang menyebabkan suatu penyakit, dan membuat
guide RNA yang spesifik → RNA digabungkan dengan enzim pemotongan DNA atau as-9
→ kompleks dimasukin ke sel target → melokasikan sekuens huruf dan memotong DNA →
ilmuwan dapat mengedit genom yang ada dengan insersi, delesi atau modifikasi sekuens yang
ada
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

[Slide 67]
Klon merupakan populasi besar identik molekul, sel, atau organisme yang memiliki nenek
moyang yang sama.

Kloning molekuler memungkinkan produksi sejumlah besar molekul DNA identik, yang
kemudian dapat dikarakterisasi atau digunakan untuk tujuan lain.

Mekanismenya adalah, pertama untuk kloning ini kita membutuhkan suatu vektor, biasanya
plasmid atau phage bakteri. Disini juga ada beberapa vektor yang bisa digunakan berdasarkan
ukuran DNA.

Mekanismenya adalah:
Awalnya plasmid bentuknya circular seperti ini dan umumnya terdiri atas 3 komponen:
cloning cite, drug resistant gene (contohnya Ampicilin), dan replication origin. → Kemudian
EcoR1 memotong plasmid dan menghasilkan DNA plasmid yang linear dengan sticky ends
→ DNA asing dengan sekuens kita inginkan di klon di digesti oleh EcoR1 yang kemudian
digabungkan dengan vektor yang sudah terpotong → sticky ends terhibridisasi dan
digabungkan oleh ligase → menghasilkan plasmid rekombinan → a library or pool of
recombinant plasmid is created

Anggap saja insertnya bukan DNA manusia tapi insert yang memang diinginkan dan
dibutuhkan oleh bakteri tersebut → Plasmid rekombinan digabungkan ke dalam bakteri
E.Coli menggunakan Kalsium klorida untuk membuatnya permeable kepada molekul DNA.
→ tetapi tidak semua sel bisa istilahnya “mengambil” plasmid rekombinan ini → Jika diuji
menggunakan agar yang berisi Ampicilin pada suhu 37oC, hanya E.Coli yang memiliki
plasmid dapat berkembang.

[Slide 68]
Anggap saja insertnya bukan DNA manusia tapi insert yang memang diinginkan dan
dibutuhkan oleh bakteri tersebut → Plasmid rekombinan digabungkan ke dalam bakteri host
menggunakan Kalsium klorida untuk membuatnya permeable kepada molekul DNA. →
tetapi tidak semua sel bisa istilahnya “mengambil” plasmid rekombinan ini → Jika diuji
menggunakan agar yang berisi Ampicilin pada suhu 37oC, hanya host yang tidak mengambil
plasmid rekombinan yang dapat berkembang. Karena insertnya menahan atau merusak fungsi
dari ampicilin resistance gene tersebut.

[Slide 69]
Probe, Molekul yang digunakan untuk “menyelidiki” library of recombinant plasmid untuk
mencari gen atau molekul cDNA tertentu. Umumnya merupakan potongan DNA atau RNA
yang diberi label dengan nukleotida yang mengandung 32P

Probe cDNA/oligonukleotida/cRNA digunakan untuk mendeteksi fragmen DNA di Southern

blot transfers dan untuk mendeteksi kuantitas RNA di Northern blot transfers
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Prosedur ini berguna dalam menentukan berapa banyak salinan suatu gen dalam jaringan
tertentu atau apakah ada perubahan pada gen (delesi, insersi, atau modifikasi).

Ketiga prosedur ini menggunakan teknik elektroforesis yang kemudian di blot ke membran,
di renaturasi, dan dianalisis untuk interaksi dengan urutan DNA atau RNA tertentu atau
protein melalui inkubasi dengan probe asam nukleat berlabel spesifik

[Slide 70]
Segmen molekul DNA spesifik yang diperoleh berdasarkan rekomendasi teknologi DNA
binan dapat dianalisis untuk menentukannya urutan nukleotida.

Metode Sanger enzimatik manual menggunakan dideoksinukleotida spesifik yang

menghentikan sintesis untai DNA pada nukleotida tertentu saat untai disintesis pada
pemurnian DNA cetakan beruntai tunggal

Oleh: Ellen Ashiana Djojo

[Slide 71]

Selanjutnya, saya akan menjelaskan metode PCR (Polymerase Chain Reaction), yaitu metode
amplifikasi suatu sekuens DNA tertentu dengan cepat, sensitif, dan selektif. Gambar di PPT
adalah cara kerja PCR untuk memperbanyak sekuens gen tertentu, yaitu mula-mula sampel
DNA dipanaskan lebih dari 90 C untuk memisahkan kedua untai DNA. Kemudian primer
dibiarkan menempel pada DNA sekuens komplementernya dan masing-masing untai disalin
oleh suatu DNA polimerase yang menghasilkan perbanyakan eksponensial segmen DNA
dengan panjang tertentu (digandakan setiap satu siklus). Siklus ini diulang beberapa kali
sampai menghasilkan produk dengan panjang dan sekuens tertentu.

[Slide 72]

Kemudian, apa manfaat dari PCR? Kenapa kita perlu mempelajarinya? Manfaatnya adalah
sebagai berikut:
● Memungkinkan DNA diperbanyak dan dianalisis, contoh pada sebuah sel, folikel
rambut, atau spermatozoa
● Mendeteksi agen infeksi terutama virus laten
● Menegakkan diagnosis genetika pranatal
● Mendeteksi polimorfisme alel
● Menentukan tipe jaringan yang tepat untuk transplantasi
● Meneliti evolusi dengan menggunakan DNA dari sampel arkeologis, dll

[Slide 73]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Kemudian mari kita mulai membahas mengenai teknologi untuk mengetahui lokasi gen
spesifik pada kromosom tertentu, yaitu teknik FISH (Fluorescence In Situ Hybridization),
suatu teknik sitogenetik untuk mendeteksi jika adanya perubahan struktur atau jumlah pada
suatu kromosom. Teknik ini memanfaatkan fluorescence probes yang hanya akan berikatan
dengan segmen DNA tertentu. Tujuan penggunaan FISH adalah untuk mendeteksi lokasi
kelainan / mutasi pada kromosom (penyakit). Selain itu, FISH juga dapat digunakan untuk uji
onkologi karena dapat memprediksi sifat sel tumor, uji ketidaknormalan genetik pada
leukemia, dan dapat mendeteksi infeksi bakteri secara cepat di laboratorium klinis. Namun
kekurangan dari teknik ini adalah alatnya yang mahal dan labor-intensive (proses yang cukup
lama).

[Slide 74]

Setelah membahas mengenai teknologi untuk mendeteksi penyakit pada kromosom, perlu
diingat kembali bahwa kromosom tersusun atas untaian DNA dengan nukleotidanya.
Bagaimana dengan kelainan pada tingkat nukleotida? Kita perlu mengenal istilah
polimorfisme nukleotida tunggal / single nucleotide polymorphism (SNP), yaitu variasi dalam
sekuens DNA ketika sebuah nukleotida dalam sebuah sekuens berbeda dari biasanya (terjadi
pada sekitar 1 dari setiap 500-1000 nukleotida). Normalnya, perubahan ini terjadi di
regio-regio DNA yang tidak mengkode protein. Polimorfisme struktur DNA ini dapat
diwariskan, yang berarti dapat berkaitan dengan penyakit tertentu. Polimorfisme terjadi
karena adanya perubahan sekuen gen yang disebabkan oleh delesi, insersi, atau perubahan
asam nukleotida. SNP dapat dideteksi dengan metode PCR yang sensitif.

[Slide 75]

Sebagian besar penyakit genetik disebabkan oleh mutasi titik. Tapi dapat juga ditimbulkan
oleh gangguan oleh salah satu tahap dari replikasi, transkripsi, transpor RNA, hingga protein
sintesis. Kemudian bisa juga karena keadaan fisik seperti agregasi dan polimerisasi.

● Mutasi titik: Contohnya seperti penyakit sel sabit, yaitu terjadinya substitusi DNA T
ke A, yang menyebabkan perubahan A ke U pada mRNA. Kodon yang berubah ini
mengkode asam amino yang berbeda, menyebabkan agregasi hemoglobin dan sickling
pada sel darah merah.
● Delesi, insersi, dan tata ulang DNA: Dapat menyebabkan perubahan ekspresi gen dan
berakibatkan timbulnya penyakit. Tabel pada PPT menunjukkan perubahan struktur
gen β-globin yang mempengaruhi fungsi-fungsi tertentu, sehingga mengakibatkan
timbulnya beberapa penyakit tertentu. Untuk mendeteksi delesi atau insersi DNA,
digunakan prosedur blot Southern (jika delesi / insersi DNA > 50 bp), atau assay
berbasis PCR (delesi / insersi DNA < 50 bp).

[Slide 76]

Masih berkaitan dengan penyakit genetik, kita perlu mengenal pedigree chart atau analisis
silsilah, contohnya pada penyakit yang disebabkan oleh delesi dan insersi, yaitu penyakit sel
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

sabit (sickle cell). Penyakit ini ditandai oleh adanya penggantian T oleh A di untai cetakan
DNA dalam gen β-globin.

Gambar bagian A di PPT adalah fragmen DNA yaitu gen β-globin dan tempat enzim restriksi
(Mstll), dengan panjang 1,15 kb dan 0,2 kb pada orang normal. Adanya perubahan T ke A
pada orang dengan penyakit sel sabit menghilangkan satu dari tiga tempat Mstll di sekitar gen
β-globin, menghasilkan fragmen dengan panjang 1,35 kb.

Kemudian gambar bagian B memperlihatkan analisis silsilah dengan genotipe AA yaitu

kondisi normal (gambar tak diarsir), AS yaitu heterozigot (gambar setengah diarsir), dan SS
yaitu homozigot (gambar diarsir).

[Slide 77]

Selanjutnya mari kita membahas teknik untuk mengidentifikasi adanya mutasi pada alel.
RFLP adalah teknik molekuler yang menggunakan enzim restriksi untuk mengidentifikasi
variasi dalam sekuens DNA homolog.

Prinsip kerjanya adalah mengisolasi suatu genom DNA dan memotongnya menjadi
fragmen-fragmen menggunakan enzim restriksi, yang nantinya akan dipisah dengan agarose
gel electrophoresis.

[Slide 78]

Setelah itu, fragmen-fragmen DNA tersebut didenaturasi oleh alkali seperti NaOH, yang akan
memecah ikatan hidrogen dan alhasil menjadi single-stranded DNA. Fragmen DNA
kemudian ditransfer ke atas membran menggunakan tekanan (weight).

[Slide 79]

Selanjutnya, fragmen yang diinginkan akan dideteksi menggunakan single-stranded probe

yang merupakan komplementernya. Sekuens pada DNA yang komplementer dengan probe
disebut sebagai probe binding sequence. Setelah itu, X-Ray film ditempatkan diatas membran
untuk mendeteksi probe. Segala variasi panjang gen dapat terdeteksi oleh autoradiogram.

[Slide 80]

Selanjutnya saya akan membahas mengenai gene knockout dan knockin. Gene knockout
berarti menghapus atau menonaktifkan genom DNA, sedangkan gene knockin berarti
menambah atau mengganti gen. Untuk melakukannya digunakan metode CRISPR, yaitu
metode yang memotong double stranded DNA secara spesifik. Prinsip kerja dari CRISPR
adalah memilih lokasi target DNA yang diinginkan, kemudian memotongnya secara
sempurna. Setelah itu, para peneliti bisa menambahkan sekuens DNA baru di antara bekas
potongan tersebut.

[Slide 81]
Naskah Topik 3 Kelompok 2 Biokimia

Teknik terakhir yang akan dibahas adalah teknik chromatin immunoprecipitation (ChIP),
yang memungkinkan analisis lokasi suatu protein spesifik pada sekuens DNA di kromatin.
Kromatin terdiri atas DNA yang bermuatan negatif (-) dan histon yang bermuatan positif (+).
Di antara DNA dan histon kadang terdapat protein. Jika kita ingin mencari lokasi binding
protein tertentu pada DNA, digunakanlah ChIP.

[Slide 82]

Prinsip kerja ChIP pertama adalah memfiksasi protein pada DNA menggunakan formaldehid.
Kemudian, digunakan enzim restriksi atau sonication untuk memotong DNA menjadi
fragmen yang lebih kecil. Langkah selanjutnya adalah memanfaatkan antibodi spesifik untuk
menargetkan dan mengikat protein tertentu, dan menggunakan magnet yang dapat menarik
kepala antibodi untuk memisahkan protein yang terikat padanya dari protein-protein lainnya
yang terdapat pada DNA yang sama. Setelah itu, dilakukan inkubasi panas atau digesti
komponen protein untuk mengisolasi sekuens DNA dari protein spesifik tersebut.

[Slide 83]

Berikut adalah referensi-referensi yang kami gunakan untuk menyusun materi 3 Biokimia
mengenai struktur, fungsi, dan replikasi makromolekul pembawa informasi (2).

[Slide 84 - 85]

Dan sekian presentasi dari kelompok kami untuk topik 3 Biokimia. Mohon maaf apabila
terdapat salah kata dan sebagainya. Terima kasih dan diperbolehkan untuk bertanya jika
masih ada yang kebingungan.