BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Jenis penelitian yang digunakan dalam penelitian ini merupakan

penelitian observasional (non-eksperimental) dengan kriteria deskriptif

menggunakan pendekatan cross sectional.

B. Rancangan Penelitian

Desain penelitian yang digunakan pada penelitian ini adalah observasional

(non-eksperimen) yang bersifat deskriptif. Dengan rancangan sebagai
berikut :
1. Pemeriksaan sampel dengan kode A1, A2, A3, A4 dan A5

diinokulasikan pada media EMB hasil positif ditunjukkan dengan

perubahan warna koloni yaitu hijau mengkilap

2. Hasil sampel pada media EMB Agar yang positif dilanjutukan

dengan penghitungan jumlah koloni yang berwarna hijau

mengkilat (koloni yang diduga bakteri Escherichia coli).

3. Hasil koloni yang berwarna hijau mengkilap setelah dihitung lalu

dilanjutkan dengan uji konfirmasi dengan menginokulasikan koloni

yang berwarna hijau mengkilap pada media IMVIC.

4. Jumlah koloni yang menunjukkan positif bakteri Escherichia coli

setelah dikonfirmasi lalu dicocokan dengan persyaratan Peraturan

Kepala Badan Pengawas Obat dan Makanan Republik Indonesia

Nomor 16 Tahun 2016 tentang kriteria mikrobiologi dalam pangan

37
 olahan yang mensyaratkan jumlah Escherichia coli khususnya

pada manisan buah.

C. Definisi Operasional

1. Analisa Jumlah Bakteri Escherichia coli

Mendeteksi adanya bakteri Escherichia coli pada rujak buah yang

dijual pada pedagang rujak buah dengan menunjukan adanya koloni

bakteri Escherichia coli pada media EMB Agar yang dinyatakan dalam

1 gram sampel dan dilanjutkan dengan uji penegas yaitu IMVIC

(Indole, Methyl red, Voges-proskauer, Citrat test).

2. Rujak buah

Makanan segar yang berisi potongan/parutan beberapa macam buah

segar yang terdiri dari buah mangga, buah semangka, buah pepaya,

buah belimbing, buah nanas, buah melon, buah bengkoang, dan buah

kedondong yang disertai bumbu rujak (bumbu kacang).

D. Populasi dan Sampel

1. Populasi

Semua rujak buah yang dijual disekitar Jalan Tlogosari Raya tepatnya

di Kecamatan Tlogosari Kota Semarang, yang dijual oleh pedagang

rujak buah dengan menggunakan gerobak sebagai sarana penjualan

dan menjajankan rujak buah tersebut disekitar Jalan Tlogosari Raya

Kota Semarang. Populasi dalam penelitian ini berjumlah 5 sampel

rujak buah. Letak Pedagang rujak buah berjualan adalah :

a) Sampel 1 : Lokasi berjualan terletak di depan Gereja Benthel

Jalan Tlogosari Raya no 134 Semarang.

38
 b) Sampel 2 : Lokasi berjualan terletak disebelah tugu bumi

Tlogosari Raya Semarang.

c) Sampel 3 : Lokasi berjualan terletak di depan kantor kelurahan

Tlogosari Raya Semarang.

d) Sampel 4 : Lokasi berjualan terletak di jembatan ketiga Jalan

Tlogosari Raya Semarang.

e) Sampel 5 : Lokasi berjualan terletak di jembatan keempat

Jalan Tlogosari Raya Semarang.

2. Sampel

Sampel yang diambil adalah keseluruhan dari populasi dimana sampel

rujak buah dalam bentuk rujak buah yang telah dikupas dan sudah di

potong kecil – kecil atau dalam bentuk parutan dalam 1 porsi dan

dalam bentuk kemasan plastik yang disediakan oleh pedagang rujak

buah tersebut. Sampel tersebut kemudian dilakukan pengujian secara

duplo.

E. Lokasi dan Waktu Penelitian

1. Tempat

a. Pengambilan sampel penelitian dilakukan di sekitar Jalan Tlogosari

Raya Kota Semarang.

b. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Terpadu

Politeknik Kesehatan Semarang di Jalan Wolter Monginsidi 115

Pedurungan Semarang.

39
 2. Waktu Penelitian

a. Penyusunan Proposal : November 2016 - Januari 2017.

b. Penelitian : Februari 2017.

c. Analisis Data : Juni-Juli 2017.

F. Prosedur Pengumpulan Data

1. Data Utama

Data yang diperoleh dari hasil pemeriksaan analisa jumlah bakteri

Escherichia coli pada rujak buah yang dilakukan pemeriksaan di

laboratorium.

2. Data Pendukung

Data yang diperoleh dari observasi dengan mengamati proses dan

tempat penjual rujak buah di Jalan Tlogosari Raya Kota Semarang.

G. Instrument Penelitian

1. Peralatan Untuk Pemeriksaan Sampel

a. Lembar Observasi

b. Blender

c. Cawan Petri

d. Jarum ose

e. Tabung reaksi

f. Erlenmayer

g. Inkubator

h. Lampu spirtus

40
 i. Cool box

j. Autoklaf

k. Vortex

l. Kapas

m. Spatula

n. Triangle

o. Allumunium foil

p. Mikropipet

q. Blue tip

r. Rak tabung reaksi

s. Timbangan analitik

2. Bahan dan Media Pemeriksaan Sampel

a. Sampel rujak buah yang meliputi buah mangga, buah semangka,

buah pepaya, buah belimbing, buah nanas, buah melon, buah

bengkoang, dan buah kedondong.

b. EMB agar

c. Media uji IMVIC

d. Indol dan reagen kovach

e. Merah metil (methyl red)

f. VP (voges proskauer)

g. Simon citrate

h. Alfa naftol dan KOH

i. Phenol red

j. Aquades

41
H. Langkah-Langkah Penelitian

1. Melakukan observasi pada tempat penjualan rujak buah di sekitar Jalan

Tlogosari Raya Kota Semarang.

2. Melakukan sterilisasi alat dan bahan yang akan digunakan.

3. Pembuatan media.

4. Melakukan pengambilan sampel rujak buah.

5. Melakukan pengujian sampel rujak buah.

I. Prosedur Pemeriksaan

1. Melakukan Observasi dengan cara mengamati atau melihat pada

tempat penjualan rujak buah dan juga proses pembuatan makanan

rujak buah yang dilakukan oleh pedagang tersebut.

2. Sterilisasi Alat dan Bahan

a. Sterilisasi Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini dibersihkan terlebih

dahulu dengan air sabun dan air mengalir. Kemudian dibilas sampai

bersih dan dikeringkan. Setelah kering, pipet ukur dan cawan petri

dibungkus dengan menggunakan kertas pembungkus. Sedangkan

tabung reaksi, tabung durham, dan botol sampel disumbat dengan

menggunakan kapas. Semua alat gelas tersebut dimasukkan

kedalam oven dan disterilisasi pada suhu 100 – 1200C selama 2 jam.

42
 b. Sterilisasi Media

Media yang akan digunakan dalam penelitian disterilisasi dengan

menggunakan autoklaf pada suhu 121 ⁰C tekanan 1-2 atm selama

15 menit.

3. Pembuatan media

1. Pembuatan Media EMB Agar

1.1 Menimbang 37,5 gram bubuk EMB agar, dilarutkan dalam

1000 ml aquadest, dipanaskan menggunakan hot plate;

1.2 Mengaduk perlahan hingga homogen dan jernih

menggunakan magnetic stirrer atau batang pengaduk.

Kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada

suhu 1210C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit;

1.3 Mendistribusikan ke dalam cawan petri steril masing-

masing 15 – 20 ml secara aseptis.

2. Pembuatan Simon Citrate (SC) agar

2.1 Menimbang 4,5 gram bubuk SC, dilarutkan dalam 200 ml

aquadest, dipanaskan menggunakan hot plate;

2.2 Mengaduk perlahan hingga homogen dan jernih

menggunakan magnetic stirrer atau batang pengaduk.

Kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada

suhu 1210C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit;

2.3 Mendistribusikan ke dalam tabung reaksi steril masing-

masing sebanyak 3 - 5 ml secara aseptis dan dibiarkan

hingga membeku dalam posisi miring.

43
 3. Pembuatan SIM (Sulfide Indol Motilty) agar

3.1 Menimbang 6 gram bubuk SIM, dilarutkan dalam 200 ml

aquadest, dipanaskan menggunakan hot plate;

3.2 Mengaduk perlahan hingga homogen dan jernih

menggunakan magnetic stirrer atau batang pengaduk.

Kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada

suhu 1210C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit;

3.3 Mendistribusikan ke dalam tabung reaksi steril masing-

masing sebanyak 3 - 5 ml secara aseptis.

4. Pembuatan Methyl Red-Voges Proskauer (MR-VP) media

4.1 Menimbang 4,25 gram bubuk MR-VP, dilarutkan dalam

250 ml aquadest dipanaskan menggunakan hot plate;

4.2 Mengaduk perlahan hingga homogen dan jernih

menggunakan magnetic stirrer atau batang pengaduk.

Kemudian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada

suhu 1210C dengan tekanan 1 atm selama 15 menit;

4.3 Mendistribusikan ke dalam tabung reaksi steril masing-

masing sebanyak 3 - 5 ml secara aseptis.

4. Teknik Pengambilan Sampel

(1) Lakukan pengambilan sampel rujak buah pada masing-masing

warung;

(2) Memberikan kode pada setiap sampel yang diambil;

(3) Memasukkan sampel ke dalam cool box yang suhunya dipertahankan 2 -

80C.

44
 (4) Membawa sampel ke laboratorium untuk dilakukan pemeriksaan

5. Prosedur Kerja

1.1) Penanganan sampel dan Cara pemeriksaan

1.1) Rujak buah dari wadah plastik yang sudah dipotong kecil

kecil atau diparut lalu dimasukkan pada blender yang telah

disterilkan dengan alcohol 70% kemudian dihomogenkan.

Setelah dihomogenkan tuang pada erlenmayer steril.

1.2) Membuat larutan suspensi dengan cara sampel yang sudah

di homogenkan dengan blender ditimbang 25 gram, lalu

dimasukkan ke dalam erlenmeyer secara aseptis dan

ditambah larutan Natrium Fisiologis 0,9% 225 mL untuk

mendapatkan pengenceran 10-1.

1.3) Pipet 1,0 mL dari pengenceran 10-1 kemudian masukkan ke

dalam tabung yang berisi 9 mL larutan Natrium Fisiologis

0,9% steril, lalu larutan dihomogenkan sehingga didapatkan

pengenceran 10-2.

1.4) Pipet 1,0 mL dari pengenceran 10-2 kemudian masukkan

ke dalam tabung reaksi yang berisi 9 mL larutan Natrium

Fisiologis 0,9% steril, lalu larutan dihomogenkan sehingga

didapatkan pengenceran 10-3.

(2) Penanaman menggunakan media EMB Agar:

2.1) Menyiapkan 6 cawan petri yang berisi media EMB Agar

45
2.2) Pipet 0,5 mL sampel dari pengenceran 10-1 , kemudian

masukkan kedalam dua cawan yang berisi media EMB

Agar, Media dan biakan lalu dihomogenkan dengan cara

melakukan penggoresan secara merata.

2.3) Pipet 0,5 mL sampel dari pengenceran 10-2 , kemudian

masukkan kedalam dua cawan yang berisi media EMB

Agar, Media dan biakan lalu dihomogenkan dengan cara

melakukan penggoresan secara merata.

2.4) Pipet 0,5 mL sampel dari pengenceran 10-1 , kemudian

masukkan kedalam dua cawan yang berisi media EMB

Agar, Media dan biakan lalu dihomogenkan dengan cara

Media dan biakan lalu dihomogenkan dengan cara

melakukan penggoresan secara merata.

2.5) Inkubasi di dalam incubator pada suhu 37 ⁰C selama 24-48

jam;

2.6) Hasil positif jika koloni berwarna hijau metalik

2.7) Hasil dari media EMB Agar yang positif kemudian

dilanjutkan dengan uji IMVIC;

2.8) Kemudian kontrol positifnya pada media EMB agar

tersebut ditanam dengan menggoreskan suspensi bakteri

Escherichia coli;

2.9) Kontrol negatifnya pada media EMB agar ditanam dengan

meneteskan 0,5ml Aquadest steril, lalu melakukan

penggoresan secara merata .

46
(3) Penanaman dengan IMVIC

3.1) Uji SC (simmon citrate)

a. Koloni yang berwarna hijau mengkilap diinokulasikan

ke media Simmon Citrate dengan cara digores pada

media miring;

b. Diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 24-48 jam;

c. Hasil positif bila media SC berubah warna menjadi biru

tetapi bila hasil negatif menunjukkan warna tetap hijau;

d. Umumnya Escherichia coli berwarna hijau pada media

Simmon Citrat.

3.2) Uji produksi SIM (Sulfid Indole Motility)

a. Koloni yang berwarna hijau mengkilap diinokulasikan

ke media SIM dengan cara tusuk;

b. Diinkubasikan pada suhu 370C selama 24-48 jam;

c. Ditambahkan 2-3 tetes pereaksi Indol (Kovach);

d. Hasil reaksi positif ditandai dengan adanya bentuk

cincin merah pada lapisan atas media;

e. Umumnya Escherichia coli bersifat indol positif.

3.3) Uji MR (Methyl Red)

a. Koloni yang berwarna hijau mengkilap diinokulasikan ke

dalam media Methyl Red

b. Diinkubasikan pada suhu 370C selama 24-48 jam;

47
 c. Ditambahkan 2-5 tetes indikator Phenol Red pada

tabung;

d. Hasil reaksi positif ditandai dengan adanya warna kuning

dan hasil reaksi negatif ditandai dengan warna merah;

e. Umumnya Escherichia coli menunjukkan hasil positif

untuk uji Methyl Red.

3.4) Uji VP (Voges Proskauer)

a. Koloni yang berwarna hijau mengkilap diinokulasikan

ke dalam media Voges Proskauer;

b. Diinkubasikan pada suhu 370C selama 24-48 jam;

c. Ditambahkan 2-5 tetes reagen alpha naftol dan larutan

KOH pada tabung;

d. Hasil reaksi positif ditandai dengan adanya warna cincin

merah;

e. Umumnya Escherichia coli menunjukkan hasil negatif

untuk uji Voges Proskauer.

48
(4) Dari hasil yang menunjukkan ciri – ciri bakteri Escherichia coli

dibandingkan dengan biakan murni bakteri Escherichia coli pada

media EMB Agar, media IMVIC dengan prosedur kerja yang

sama dengan hasil sebagai berikut :

Tabel 3. 1.Hasil positif dan negatif adanya bakteri Escherichia

coli

Jenis Bakteri Escherichia coli

Pengujian Positif Negatif
(+) (-)

EMB agar Hijau metalik Tidak Hijau metalik

Indol Tidak terbentuk

Cincin merah
cincin merah

MR Warna merah Warna kuning

VP Warna Merah Warna kuning

Citrat Warna biru Warna hijau

Sumber : Agnes, 2012.

(5) Perhitungan koloni

a. Penghitungan koloni dilakukan setelah biakan diinkubasi selama

48 jam ± 3 jam

b. Penghitungan Escherichia coli dilakukan terhadap koloni

berwarna hijau mengkilap yang tumbuh pada media EMB

Agar(EMB)

c. Koloni pada cawan yang dipilih adalah cawan yang ditumbuhi

30-300 koloni

d. Hasilnya dilaporkan dalam jumlah bakteri (koloni/gram)

49
 e. Hitungan jumlah bakteri yang diperoleh diperhitungkan dengan

rumus sebagai berikut :

koloni/gram = A x Faktor pengencer x Faktor pengkali

Keterangan :

A = Jumlah bakteri Escherichia coli

Faktor Pengali = faktor pengali yaitu 2, karena volume

yang digunakan adalah 0,5ml.

J. Pengolahan dan Analisis Data

Data yang diperoleh dari pemeriksaan laboratorium diolah dan disajikan

dalam bentuk tabulasi untuk menentukan jumlah Escherichia coli

kemudian data dideskripsikan.

50